Optimasi Media Produksi Β-Glukanase Dari Bakteri Penghambat Cendawan Patogen Kelapa Sawit Dengan Response Surface Methodology

OPTIMASI MEDIA PRODUKSI β-GLUKANASE DARI BAKTERI
PENGHAMBAT CENDAWAN PATOGEN KELAPA SAWIT
DENGAN RESPONSE SURFACE METHODOLOGY

RIKE TRI KUMALA DEWI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul “Optimasi Media
Produksi β-Glukanase dari Bakteri Penghambat Cendawan Patogen Kelapa Sawit
dengan Response Surface Methodology” adalah benar karya saya dengan arahan
dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada
perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.

Bogor,

Februari 2015

Rike Tri Kumala Dewi
NIM P051120091

RINGKASAN
RIKE TRI KUMALA DEWI. Optimasi Media Produksi β-Glukanase dari Bakteri
Penghambat Cendawan Patogen Kelapa Sawit dengan Response Surface
Methodology. Dibimbing oleh NISA RACHMANIA MUBARIK dan MAGGY
THENAWIJAYA SUHARTONO.
Enzim β-glukanase dapat mendegradasi polisakarida β-glukan menjadi
oligomer sakarida dan monomer glukosa. Aplikasi dari enzim ini salah satunya
digunakan sebagai agens biokontrol karena kemampuannya dalam mendegradasi
β-glukan yang merupakan senyawa terbesar kedua (setelah kitin) pada dinding sel
cendawan patogen. Curvularia affinis dan Colletotrichum gloeosporioides adalah
cendawan patogen yang menyebabkan bercak daun dan antraknosa pada saat fase

pembibitan kelapa sawit yang dapat menurunkan nilai jual. Beberapa bakteri
dikenal mampu menghasilkan enzim β-glukanase yang dapat menghambat
pertumbuhan cendawan patogen. Produksi β-glukanase bergantung pada sumber
nutrisi serta kondisi fisik pada saat proses kultivasi. Penelitian ini bertujuan untuk
mendapatkan kondisi optimum media pada produksi enzim β-glukanase dari
bakteri penghambat cendawan patogen kelapa sawit dengan menggunakan
Response Surface Methodology (RSM). Pengendapan β-glukanase dengan
amonium sulfat juga dilakukan untuk mengetahui efektivitas β-glukanase dalam
menghambat cendawan patogen.
Hasil seleksi isolat bakteri menunjukkan bahwa isolat SAHA 32.6 memiliki
indeks glukanolitik terbesar (6.50) dari kedelapan isolat dan mampu menghambat
pertumbuhan kedua cendawan patogen dengan persentase 82.78% terhadap
C. gloeosporioides dan 60.60% terhadap C. affinis. Sekuen gen penyandi 16S
rRNA menunjukkan bahwa isolat SAHA 32.6 memiliki kemiripan 99% dengan
Bacillus subtilis galur SCKB1444. Isolat SAHA 32.6 mensekresikan β-glukanase
pada awal fase logaritmik dan aktivitas spesifiknya mencapai nilai maksimum
pada saat sel mulai memasuki fase stasioner yaitu pada jam ke-12 inkubasi dengan
nilai sebesar 0.242 U mg-1, setelah itu aktivitas spesifiknya menurun. Optimasi
media produksi β-glukanase isolat SAHA 32.6 menggunakan RSM dengan
rancangan percobaan Central Composite Design (CCD) pada tiga variabel

(β-glukan oat, ekstrak khamir, dan inokulum bakteri) dan lima taraf kombinasi.
Hasil analisis statistik menunjukkan bahwa produksi β-glukanase isolat SAHA
32.6 sangat dipengaruhi oleh inokulum bakteri dibandingkan β-glukan oat dan
ekstrak khamir. Produksi β-glukanase isolat SAHA 32.6 maksimum pada media
dengan konsentrasi β-glukan oat 2.99%, ekstrak khamir 0.28%, dan inokulum
3.28%, dengan prediksi aktivitas spesifik β-glukanase sebesar 0.365 U mg-1, dan
nilai aktual 0.360 U mg-1. Pengendapan menggunakan amonium sulfat 60% dapat
meningkatkan aktivitas spesifik β-glukanase sebesar 0.515 U mg-1. β-Glukanase
yang diproduksi pada media yang telah dioptimasi dapat menghambat kedua
cendawan patogen, namun β-glukanase hasil pengendapan amonium sulfat
menunjukkan penghambatan yang lebih baik terhadap kedua cendawan patogen.
Kata kunci: β-Glukanase, Biokontrol, Optimasi, Response Surface Methodology

SUMMARY
RIKE TRI KUMALA DEWI. Medium Optimization of β-Glucanase Production
by Bacteria Used as Biocontrol for Oil Palm Pathogenic Fungi Using Response
Surface Methodology. Supervised by NISA RACHMANIA MUBARIK and
MAGGY THENAWIJAYA SUHARTONO.
β-Glucanase enzyme can degrade β-glucan polysaccharide to saccharide
oligomers and glucose monomers. One application of this enzyme is used as a

biocontrol agent for its ability to degrade β-glucan which is the second major
polysaccharide (after chitin) in the cell wall of fungal pathogens. Curvularia
affinis and Colletotrichum gloeosporioides are fungal pathogens that cause leaf
spot and anthracnose during the nursery phase of oil palm which decrease its
economic value. Some bacteria have known produce β-glucanase which could
inhibit the growth of fungal pathogens. β-Glucanase production depends on
nutrition sources and physical conditions during the cultivation process. The aim
of this study was to determine optimum media for the production of β-glucanase
enzyme by bacteria used as biocontrol for oil palm pathogenic fungi by using
Response Surface Methodology (RSM). Precipitation of β-glucanase with
ammonium sulphate was also conducted to determine the effectiveness of
β-glucanase in inhibiting the fungal pathogens.
The selection of bacterial isolates result indicated that isolate SAHA 32.6
showed the largest of glucanolytic index (6.50) from eight isolates, and able to
inhibit the growth of fungal pathogens C. gloeosporioides and C. affinis with
percentage respectively 82.78% and 60.60%. Sequence of genes encoding 16S
rRNA showed that isolate SAHA 32.6 has 99% similarity with Bacillus subtilis
strain SCKB1444. Isolate SAHA 32.6 secreted β-glucanase in the beginning of
logarithmic phase and the specific activity achieved maximum at the time of the
cell began to enter the stationary phase, i.e. at 12 h incubation with a value of

0.242 U mg-1, furthermore the specific activity decreased. Medium optimization
of β-glucanase production by isolate SAHA 32.6 was carried out using RSM with
Central Composite Design (CCD) on three variables (oat β-glucan, yeast extract,
and bacterial inoculum) and five level combinations. Statistical analysis showed
that β-glucanase production of isolate SAHA 32.6 strongly influenced by bacterial
inoculum than oat β-glucan and yeast extract. β-Glucanase production of isolate
SAHA 32.6 maximum at 2.99% oat β-glucan, 0.28% yeast extract, and 3.28%
bacterial inoculum, resulting in β-glucanase predicted specific activity of 0.365 U
mg-1, and the actual value of 0.360 U mg-1. Precipitation using 60% ammonium
sulphate was able to increase β-glucanase specific activity to 0.515 U mg-1.
β-Glucanase produced by optimum media could inhibit these fungal pathogens,
but the precipitated β-glucanase could inhibit these fungal pathogens better.
Keywords:

β-Glucanase,
Methodology

Biocontrol,

Optimization,

Response

Surface

Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

OPTIMASI MEDIA PRODUKSI β-GLUKANASE DARI BAKTERI
PENGHAMBAT CENDAWAN PATOGEN KELAPA SAWIT
DENGAN RESPONSE SURFACE METHODOLOGY

RIKE TRI KUMALA DEWI

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Bioteknologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr I Made Artika, MAppSc

Judul Tesis

: Optimasi Media Produksi P-Glukanase dari Bakteri Penghambat
Cendawan Patogen Kelapa Sawit

dengn Response Surface

Methodology

Nama

: Rike Tri Kumala Dewi

NIM

:P051120091

Disetujui oleh
Komisi Pembimbing

Ketua

Diketahui oleh

Ketua Program Studi
Bioteknologi

Prof Dr r Suharsono, DEA

Dr lr Dahrul S yah, MScAgr

Tanggal Ujian: 04 Februari 2015

TanggalLulus:

0 4 MAR 2015

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam
penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Februari 2014 sampai Desember 2014
ini ialah Optimasi Produksi Enzim β-glukanase dari bakteri Penghambat
Cendawan Patogen Kelapa Sawit dengan Response Surface Methodology.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr Nisa Rachmania Mubarik, MSi
sebagai ketua komisi pembimbing dan Prof Dr Ir Maggy T Suhartono sebagai
anggota komisi pembimbing yang telah banyak memberikan nasehat, saran,
motivasi, waktu konsultasi, serta solusi dari setiap permasalahan yang dihadapi

penulis selama melaksanakan penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Selain
itu penulis ucapkan terima kasih kepada penguji luar komisi Dr I Made Artika,
MappSc dan Wakil Ketua Program Studi Bioteknologi IPB Prof Dr Ir Khaswar
Syamsu, MSc yang telah memberikan masukan pada saat ujian sidang tesis, serta
kepada Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA selaku ketua Program Studi Bioteknologi
IPB yang telah banyak memberikan motivasi selama studi. Kepada DIKTI melalui
Beasiswa Unggulan selama menempuh pendidikan pascasarjana di IPB, dan
terima kasih atas hibah penelitian ABS Funds dari kerjasama CRC-IPB tahun
2014 a.n. Dr Nisa Rachmania Mubarik MSi sehingga penelitian yang penulis
lakukan dapat terlaksana dengan baik.
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Ibu Heni dan Bapak Jaka
selaku staf Laboratorium Mikrobiologi IPB, Nurleni, Nur Antriana, Nezharia,
Asril, Eliya, Hadi, Dina, Fentri, Zulvia, Desy, Ismi, Nurtika, Asahedi, serta
seluruh teman-teman di Laboratorium Mikrobiologi IPB, atas dukungan, motivasi,
dan bantuannya selama penelitian ini. Ucapan terima kasih tak terhingga juga
penulis ucapkan kepada ayah Sunyoto, ibu Dedeh Mulyaningsih, kakak tercinta
Ratna Furi Noviani, SE, dan Rani Dwi Safitri, AMd, serta saudara kembar Rika
Tri Kumala Sari, SE tersayang, atas doa, dukungan, kasih sayang, dan semangat
yang diberikan. Terima kasih untuk teman-teman seperjuangan di Sekolah
Pascasarjana Bioteknologi IPB angkatan 2012 serta seluruh pihak yang telah

memberikan doa dan dukungannya, penulis ucapkan terima kasih.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor,

Februari 2015

Rike Tri Kumala Dewi

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL

viii

DAFTAR GAMBAR

viii

DAFTAR LAMPIRAN

viii

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian

1
1
2
2
2
2

TINJAUAN PUSTAKA
Penyakit pada Kelapa Sawit
Struktur Dinding Sel Cendawan Patogen
β-Glukan
Enzim β-Glukanase
Bakteri Glukanolitik dan Perannya sebagai Agens Biokontrol
Response Surface Methodology

3
3
4
5
6
7
7

METODE
Kerangka Penelitian
Waktu dan Tempat Penelitian
Ekstraksi β-Glukan dari Oat
Peremajaan Isolat Bakteri dan Cendawan Patogen
Seleksi Isolat Bakteri Glukanolitik
Uji Antagonis Isolat Bakteri tehadap Cendawan Patogen
Identifikasi Bakteri Terpilih
Pembuatan Kurva Pertumbuhan dan Produksi β-Glukanase Ekstrak Kasar
Pengukuran Aktivitas β-Glukanase dan Kadar Protein
Optimasi Media Produksi β-Glukanase
Pengendapan β-Glukanase dengan Amonium Sulfat

9
9
9
10
10
10
10
11
12
12
13
14

HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Pembahasan

14
14
23

SIMPULAN

28

DAFTAR PUSTAKA

29

LAMPIRAN

34

RIWAYAT HIDUP

41

DAFTAR TABEL
1 Faktor-faktor yang mempengaruhi produksi enzim β-glukanase dari
berbagai mikrob dengan Response Surface Methodology
2 Kisaran dan tingkat variabel independen yang diuji dalam matriks
rancangan komposit terpusat (Central Composite Design)
3 Seleksi bakteri glukanolitik dan kemampuannya dalam menghambat
cendawan patogen pada kondisi pH 7 dan suhu 30 ºC
4 Analisis homologi sekuen gen 16S rRNA isolat SAHA 32.6 dengan data
pada GeneBank menggunakan program BLAST-N
5 Hasil pengendapan protein β-glukanase B. subtilis SAHA 32.6
6 Perbandingan aktivitas β-glukanase yang dihasilkan beberapa bakteri

8
13
15
16
21
27

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14

Peranan MAP kinase CMK1 dan cAMP-protein kinase CST1 dalam proses
infeksi tanaman inang oleh cendawan patogen
3
Struktur dinding sel cendawan
4
Struktur β-glukan yang terdiri atas ikatan β-1,3 dan β-1,6-glikosidik
5
Tahapan yang terjadi pada dinding sel cendawan: pembentukan, perpanjangan, dan pendegradasian rantai glukan
6
Kerangka penelitian
9
Zona bening yang dihasilkan isolat bakteri
15
Pita gen 16S rRNA dan hasil pewarnaan Gram isolat SAHA 32.6
15
Konstruksi pohon filogenetik isolat SAHA 32.6 menggunakan metode
Neighbour Joining dengan nilai ulangan bootstrap 1 000 kali
16
Pertumbuhan sel dan produksi β-glukanase isolat SAHA 32.6 pada media
produksi 1% glukan cair
17
Respons permukaan 3D dan plot kontur aktivitas spesifik β-glukanase
isolat SAHA 32.6 sebagai respons dari interaksi dua variabel, variabel
lainnya berada tetap di level centre point
19
Pengaruh penambahan konsentrasi amonium sulfat terhadap pengendapan
β-glukanase B. subtilis SAHA 32.6
20
Peningkatan aktivitas spesifik β-glukanase B. subtilis SAHA 32.6
21
Efektivitas penghambatan pertumbuhan C. affinis dan C. gloeosporioides
oleh β-glukanase B. subtilis SAHA 32.6 pada media PDA yang diinkubasi
selama 7 hari
22
Penghambatan pertumbuhan cendawan patogen oleh β-glukanase
B. subtilis SAHA 32.6
22

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4

Skema metode aktivitas β-glukanase
Prosedur pembuatan reagen yang digunakan dalam penelitian
Skema metode pengukuran kadar protein
Penentuan batas atas dan batas bawah variabel berdasarkan
metode konvensional (one factor at a time)
5 Rancangan CCD (Central Composite Design) untuk aktivitas
β-glukanase isolat SAHA 32.6
6 Indeks glukanolitik pada media glukan dan persentase penghambatan
pertumbuhan cendawan patogen
7 Hasil amplifikasi dari gen penyandi 16S rRNA isolat SAHA 32.6
8 Nilai log sel, aktivitas β-glukanase, dan kadar protein isolat B. subtilis
SAHA 32.6 berdasarkan waktu inkubasi
9 Analisis ragam model kuadratik terhadap aktivitas enzim β-glukanase
B. subtilis SAHA 32.6
10 Pengaruh konsentrasi amonium sulfat terhadap aktivitas spesifik
β-glukanase B. subtilis SAHA 32.6
11 Penghambatan pertumbuhan cendawan patogen oleh kultur sel dan
β-glukanase B.subtilis SAHA 32.6

34
35
36
36
37
37
38
38
39
39
40

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Enzim β-glukanase adalah enzim hidrolitik yang dapat mendegradasi
polisakarida β-glukan menjadi monomer glukosa ataupun oligomer (Pitson et al.
1993). Salah satu aplikasi dari enzim ini dapat digunakan sebagai agens
biokontrol terhadap beberapa cendawan patogen karena kemampuannya dalam
mendegradasi β-glukan. β-Glukan adalah senyawa polisakarida utama yang
menyusun dinding sel cendawan setelah kitin (Pitson et al. 1993), dan terdapat
pada semua cendawan kecuali kelompok Oomycetes yang memiliki selulosa
sebagai komponen utama penyusun dinding selnya (Lorraque et al. 2012).
Curvularia affinis dan Colletrotrichum gloeosporioides adalah cendawan
patogen yang menyebabkan bercak daun dan antraknosa pada saat fase
pembibitan kelapa sawit. Serangan kedua cendawan ini menyebabkan bibit
menjadi kerdil, memperlama umur pembibitan, dan meningkatkan kematian saat
penanaman sehingga menurunkan nilai jual (Solehudin et al. 2012). Penyakit
bercak daun pada kelapa sawit dilaporkan pertama kali di Indonesia pada tahun
1920 dan semakin menyebar secara masif ke seluruh wilayah Indonesia (Suwandi
et al. 2012). Selain itu, penyakit antraknosa dilaporkan telah menyerang India
sejak 10 tahun terakhir (Gautam 2014).
Enzim β-glukanase dihasilkan oleh sejumlah bakteri, diantaranya Bacillus
circulans (Aono et al. 1995), Bacillus subtilis (Tang et al. 2004; Manjula dan
Podile 2005; Leelasuphakul et al. 2006), Bacillus halodurans (Akita et al. 2005),
Bacillus licheniformis (Chaari et al. 2012), Bacillus clausii (Miyanishi et al. 2003),
Arthrobacter sp. (Pang et al. 2004), Pseudomonas cepacia (Fridlender et al. 1993).
Beberapa penelitian menyebutkan enzim β-glukanase yang diproduksi bakteri
dapat secara efektif menghambat pertumbuhan cendawan patogen (Aono et al.
1995; Manjula dan Podile 2005; Leelasuphakul et al. 2006). Bacillus subtilis dan
Pseudomonas adalah bakteri yang biasa digunakan sebagai agens biokontrol
berbagai penyakit tanaman yang disebabkan cendawan (Saharan dan Nehra 2011).
β-Glukan dan ekstrak khamir merupakan nutrisi penting bagi bakteri dalam
peningkatan produksi β-glukanase (Tang et al. 2004; Khare dan Uphadyay 2011),
demikian pula dengan konsentrasi inokulum (He et al. 2003), serta kondisi fisik
dan kimia seperti pH, aerasi, dan suhu. Optimasi kondisi diperlukan untuk
meningkatkan produktivitas enzim β-glukanase supaya dapat mendegradasi
dinding cendawan patogen lebih baik. Optimasi dengan metode konvensional
banyak menghabiskan waktu dan biaya, tidak dapat melihat pengaruh interaksi
antar variabel, dan tidak dapat mencapai nilai optimum yang sebenarnya (He et al.
2003). Response Surface Methodology (RSM) ialah suatu model yang
menggunakan teknik statistika dan matematika untuk keperluan perkembangan,
perbaikan, dan optimasi dalam suatu proses dengan cara mengestimasi hubungan
antara variabel bebas dengan hasil (respon) yang diamati sehingga mendapatkan
informasi optimum variabel-variabel independen yang mempengaruhi respon
(Carley et al. 2004). Penelitian-penelitian sebelumnya banyak mengaplikasikan
RSM pada optimasi media untuk meningkatkan produksi enzim dalam industri
biomedik, pangan, pakan, dan bioenergi (He et al. 2003; Tang et al. 2004;

2
Patel et al. 2011; Jabasingh dan Nachiyar 2012; Kahar et al. 2014). Narasimhan et
al. (2013) melakukan optimasi produksi β-glukanase untuk agens biokontrol
namun hanya melalui pendekatan konvensional (one-factor at a time). Penelitian
mengenai optimasi produksi enzim β-glukanase yang dihasilkan bakteri sebagai
agens biokontrol dengan RSM belum banyak dilaporkan sehingga sangat menarik
untuk dikaji.
Perumusan Masalah
β-Glukan adalah komponen terbesar kedua setelah kitin pada dinding sel
cendawan patogen. Enzim β-glukanase yang dihasilkan bakteri dapat dijadikan
agens biokontrol terhadap cendawan patogen penyebab bercak daun dan
antraknosa kelapa sawit berdasarkan kemampuannya dalam mendegradasi
β-glukan. Produktivitas enzim β-glukanase bergantung pada ketersediaan sumber
nutrisi, dan kondisi fisik lingkungan pada proses kultivasi. Penelitian mengenai
optimasi produksi enzim β-glukanase yang dihasilkan bakteri sebagai agens
biokontrol dengan Response Surface Methodology belum banyak dilakukan.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan kondisi optimum media
produksi enzim β-glukanase dari bakteri penghambat cendawan patogen kelapa
sawit dengan menggunakan Response Surface Methodology.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai bakteri
yang dapat menghasilkan enzim β-glukanase dan kondisi optimum media
produksi enzim β-glukanase yang dihasilkannya. Manfaat penelitian ini bagi
masyarakat antara lain kelak dapat diaplikasikan untuk mengendalikan cendawan
patogen penyebab penyakit bercak daun dan antraknosa pada kelapa sawit.
Ruang Lingkup Penelitian
Ruang lingkup dalam penelitian ini meliputi seleksi isolat bakteri yang
potensial menghasilkan enzim β-glukanase dan mampu menghambat
pertumbuhan cendawan patogen; identifikasi secara morfologi dan molekuler
bakteri terpilih; optimasi media untuk produksi enzim β-glukanase dengan
Response Surface Methodology; dan pengendapan enzim dengan amonium sulfat.
Analisis kemampuan biokontrol terhadap cendawan patogen dilakukan dengan
pengujian ekstrak kasar enzim β-glukanase hasil kultivasi dari media sebelum
dioptimasi, media setelah dioptimasi, dan hasil pengendapan dengan amonium
sulfat terhadap cendawan patogen secara in vitro.

3

TINJAUAN PUSTAKA
Penyakit pada Kelapa Sawit
Perkembangan perkebunan kelapa sawit di Indonesia mengalami banyak
hambatan, diantaranya karena hama dan penyakit. Mikrooganisme yang biasa
menyerang kelapa sawit berasal dari cendawan, yaitu Phytium sp., Fussarium,
Alternaria spp., Cladosporium, Penicillium sp., Ganoderma, Curvularia,
Colletrotrichum, Ceratocyctis paradoxa (Omamor et al. 2007; Suwandi 2012).
Curvularia dan Colletotrichum adalah cendawan patogen yang serangannya telah
lama menyebar di Indonesia sejak tahun 1920 (Suwandi et al. 2012) dan di India
sejak 10 tahun terakhir (Gautam et al. 2014). Penyakit ini menyerang daun ketika
kelapa sawit sedang dalam fase pembibitan. Curvularia menyebabkan bercak
daun dengan gejala berupa bercak kecil seperti tombak berwarna kuning
transparan dan semakin meluas (Lubis dan Widanarko 2011). Colletotrichum
penyebab penyakit antraknosa yang menyebabkan bintik-bintik cekung pada daun
kelapa sawit yang menyebabkan nekrosis sehingga tidak dapat berfotosintesis;
muncul warna coklat dan hitam di antara tulang daun (Agrios 2005; Gautam
2014).
Infeksi cendawan pada tanamang inang dimulai dari tahap penempelan
spora, germinasi, pembentukan apresorium, penetrasi, dan kolonisasi pada
tanaman inang (Kubo et al. 2005). Cendawan dapat mengenali tanaman inang
karena adanya feromon/sinyal nutrien berupa asam lemak alifatik yang ditangkap
oleh reseptor pasangan protein G (G-protein coupled resceptor /GPCRs) (Knogge
1998). Sinyal tersebut merupakan secondary messengers bagi cendawan untuk
meregulasi ekspresi gen virulensi sebagai respons seluler (Gao et al. 2014). Pada
mulanya spora menempel pada jaringan tanaman inang dengan gaya adesif yang
lemah, ketika spora bergeminasi gaya adhesifnya menjadi kuat (Kan 2005).
Gen CMK1

Gen CST1

Germinasi Pembentukan
apresorium

Melanisasi

Penetrasi

Pertumbuhan
hifa

Gambar 1 Peranan MAP kinase CMK1 dan cAMP-protein kinase CST1 dalam
proses infeksi tanaman inang oleh cendawan patogen (Kubo et al.
2005)

4
Spora menempel kuat pada tanaman inang disebabkan senyawa mucilage
dan hidrofobin yang dikeluarkan oleh patogen sebelum terbentuknya tabung
germinasi (germ tube) (Yoder dan Turgeon 1996). Tabung germinasi tersusun dari
matriks fibrillar yang berfungsi melindungi spora dari dehidrasi dan sistem
pertahanan tanaman inang (Kan 2005). Pembentukan apresorium diatur oleh gen
pembentuk MAP kinase (Mitotic Activated Protein kinase), yaitu PMK1 atau
CMK1, dan kemampuan berpenetrasinya diatur oleh gen pembentuk cAMP
dependent protein kinase, yaitu CST1 (Gambar 1) (Kubo et al. 2005; Gao et al.
2014). Kemampuan berpenetrasi juga dibantu oleh melanin yang berfungsi
memberikan tekanan turgor bagi apresorium (Kubo et al. 2005). Selama penetrasi
spora patogen mengeluarkan enzim kutinase yang mendegradasi kutikula inang,
kemudian mengkolonisasi jaringan tanaman inang dengan mengeluarkan enzim
pendegradasi dinding sel tanaman inang (selulase, pektinase, protease, amilase,
xilanase, mannosidase, rhamnosidase) yang produk hidrolisisnya digunakan
sebagai sumber nutrisi bagi patogen (Mendgen dan Hahn 2002; Gao et al. 2014)
sehingga sel tanaman inang mengalami nekrosis dan muncul bercak-bercak coklat
pada selnya (Kan 2005).
Struktur Dinding Sel Cendawan
Dinding sel cendawan terdiri atas polisakarida berupa kitin dan glukan
sebagai komponen penyusun utama, dan glikoprotein sebagai komponen minor
(Bowman dan Free 2006) kecuali kelompok cendawan Oomycetes yang memiliki
selulosa sebagai komponen utama penyusun dinding selnya (Lorraque 2012;
Pitson et al. 1993). Cendawan patogen Curvularia dan Colletotrichum termasuk
ke dalam kelompok Ascomycota sehingga komponen dinding selnya sebagian
besar terdiri atas kitin, dan glukan. Cendawan Ascomycota memiliki 39% kitin,
29% glukan, 7% protein, dan 6% lemak pada dinding selnya (Webster dan Weber
2007). Komponen glukan, kitin, dan glikoprotein saling berikatan sehingga
membentuk ikatan kompleks yang membentuk struktur dasar dinding sel
cendawan (Gambar 2). Kitin berada dekat membran plasma, glukan membentang
diagonal di sepanjang dinding sel, dan glikoprotein berada vertikal dan terikat
pada membran plasma melalui GPI (Glicosylphosphatidyl-inositol) (Bowman dan
Free 2006).
Glikoprotein
Ikatan N dan O- oligosakarida
Glukan
Kitin
GPI anchor
Membran plasma
Gambar 2 Struktur dinding sel cendawan (Bowman dan Free 2006)

5
β-Glukan
Jumlah glukan pada cendawan sekitar 50-60% dari bobot keringnya, 6590% diantaranya berupa β-1,3-glukan dan 0-6% diantaranya berupa β-1,6-glukan
(disebut callosa/laminarin) (Bowman dan Free 2006). Beberapa cendawan
memiliki jenis glukan lainnya seperti β-1,6-glukan (disebut pustulan), β-1,3-1,4glukan (disebut lichenan), α-1,3- dan α-1,4-glukan (Gambar 3) (Tobisch et al.
1997; Bowman dan Free 2006; Muskhazali et al. 2009). Beberapa studi
menyebutkan bahwa dinding sel khamir memiliki β-1,3-glukan sebagai rantai
utama dan β-1,6-glukan sebagai rantai samping, sedangkan untuk cendawan
berfilamen hanya memiliki β-1,3-glukan (Bowman dan Free 2006; Muskhazali et
al. 2009).
β-Glukan adalah homopolimer dari D-glukosa yang membentuk rantai linier
dengan konfigurasi beta (Pitson et al. 1993). β-1,3-Glukan pada cendawan
disintesis oleh kompleks enzim glukan sintase yang terikat pada membran plasma
menggunakan UDP-glukosa (Uridin difosfat-glukosa) sebagai substrat. Rantai
β-1,3-glukan yang terbentuk kemudian ditransfer ke sepanjang dinding sel melalui
ruang periplasma (Gambar 4) (Mouyna et al. 2013). Rantai β-1,3-glukan memiliki
tiga struktur heliks yang menyebabkan dinding sel cendawan menjadi rigid (Kim
dan Yun 2006). Namun jika berikatan dengan rantai glukan lainnya menyebabkan
pengerutan sehingga mengubah sifat fisiknya seperti kelarutannya dalam air, dan
stabilitasnya (Pitson et al. 1993). Selain terdapat pada cendawan, β-glukan juga
banyak ditemukan pada beberapa sereal seperti oat, barley, wheat, rye dengan
jenis β-1,3-1,4-glukan (Beer et al. 1996). β-Glukan sereal adalah polisakarida
linier yang terdiri atas 70% unit β-1,4-glukopiranosil dan 30% unit β-1,3glukopiranosil. Sebagian besar β-1,3-glukan pada sereal terikat dengan unit
selotriosil dan selotetraosil (Wood 2007).

ikatan β-1,6-glikosidik

ikatan β-1,3-glikosidik
Gambar 3 Struktur β-glukan yang terdiri atas ikatan β-1,3 dan 1,6 glikosidik (Martin et al. 2007)

6
Enzim β-glukanase
Glukanase diklasifikasikan ke dalam famili glukosil hidrolase 16 (GH16)
(Pang et al. 2004; Mouyna et al. 2013). Penggolongan enzim ini cukup beragam,
salah satunya berdasarkan jenis ikatan glikosidik yang dihidrolisisnya. Enzim
β-glukanase yang menghidrolisis ikatan β-1,3 dikenal sebagai laminarinase, yang
menghidrolisis ikatan β-1,3-1,4 dikenal sebagai lichenase (Pang et al. 2004),
sedangkan yang menghidrolisis ikatan β-1,4 dikenal sebagai selulase (Sami et al.
2008). Enzim ekstraseluler β-1,3-glukanase yang berasal dari Bacillus circulans
IAM1165 memiliki berat molekul sebesar 28, 42, dan 91 kDa (Aono et al. 1995),
enzim selulase yang berasal dari B. subtilis YJ1 memiliki bobot molekul 32,5 kDa
(Yin et al. 2010), dan enzim lichenase yang berasal dari Paecilomyces
thermophila memiliki berat molekul sebesar 38,6 kDa (Yang et al. 2008). Baik
laminarin (β-1,3-glukan) maupun lichenan (β-1,3-1,4-glukan) dapat digunakan
sebagai substrat untuk aktivitas enzim β-glukanase dalam menghidrolisis
β-1,3-glukan (Aono et al. 1995).
Berdasarkan mekanisme kerjanya, enzim β-1,3-glukanase diklasifikasikan
menjadi 2, yaitu: enzim β-1,3-eksoglukanase (β-1,3-glukan glukanohidrolase
EC 3.2.1.58), dan enzim β-1,3-endoglukanase (β-1,3-glukan glukanohidrolase
EC 3.2.1.6 atau EC 3.2.1.39) (de la Cruz et al.1995). Enzim β-1,3-endo-glukanase
bekerja secara random menghidrolisis rantai β-1,3-glukan menjadi 2 sampai 6 unit
glukosa, sedangkan enzim β-1,3-eksoglukanase menghidrolisis rantai β-1,3glukan dengan melepaskan monomer glukosa dari sisi nonreduktif (Pitson et al.
1993). Ikatan yang dilepas pada saat hidrolisis adalah ikatan β-1,3-glukosidik
(Gambar 4). Mayoritas enzim ini ialah jenis endoglukanase (Aono et al. 1995).
Enzim ini dapat berperan sebagai agens biokontrol; digunakan untuk
mengkarakterisasi β-glukan yang berperan sebagai immunomodulator antikanker;
meningkatkan nutrisi pakan ternak; berperan dalam pembuatan bir pada proses
penggilingan, fermentasi dan penyimpanan; dan berperan dalam sintesis
oligosakarida (Pitson et al. 1993).
perpanjangan dari sisi rantai
β-1,3-glukan
rantai linier β-1,3-glukan
β-1,3-endoglukanase

β-1,3-eksoglukanase

Membran plasma

rantai cabang β-1,6-glukan

degradasi β-1,3-glukan

Gambar 4 Tahapan yang terjadi pada dinding sel cendawan: pembentukan,
perpanjangan, dan pendegradasian rantai glukan (Mouyna et al. 2013)

7
Bakteri Glukanolitik dan Perannya sebagai Agens Biokontrol
Bakteri glukanolitik merupakan bakteri yang memiliki aktivitas enzim
glukanase yakni kemampuan mendegradasi glukan. Glukanase yang dihasilkan
bakteri bersifat inducible dan disekresikan pada saat fase stasioner pertumbuhan
bakteri (Aono e al. 1995; Tang et al. 2004). Glukan digunakan bakteri sebagai
sumber karbon alternatif ketika ketersediaan glukosa terbatas (de La Cruz et al.
1995). Glukan didegradasi B. subtilis oleh produk dari gen licS menjadi
tetrasakarida yang ditangkap melalui PTS (Sugar Phosphotransferase System)
(Tobish et al. 1997). PTS adalah sistem penyerapan spesifik (specific uptake
system) pada bakteri yang berkaitan dengan protein transpor gula dan sistem
fosforilasi PEP (phosphoenolpyruvate) supaya produk dari hidrolisis glukan dapat
ditranspor ke dalam sel (Tobish et al. 1999).
Bakteri glukanolitik berperan sebagai agens biokontrol karena aktivitas
glukanolitiknya yang mendegradasi β-glukan pada dinding sel cendawan patogen
sebagai sumber nutrisi baginya. Oligomer yang dilepas dari rantai β-1,3-glukan
cendawan sebagian ditransportasikan ke dalam bakteri melalui sistem penyerapan
spesifik (specific uptake system) dan masuk ke jalur metabolisme (Tobisch et al.
1999), sebagiannya lagi berfungsi sebagai elisitor yang merangsang tanaman
inang untuk mengeluarkan fitoaleksin (senyawa antimikrob) sebagai sistem
pertahanan lebih lanjut dari serangan patogen sehingga membuat bagian tanaman
yang belum terinfeksi menjadi lebih tahan terhadap serangan patogen (Shetty et al.
2009; Leubner-Metzger dan Meins 1999). Elisitor terkecil dari rantai β-1,3-glukan
ialah β-1,3-β-1,6-heptaglukosida (Leubner-Metzger dan Meins 1999; Klarzynski
2000).
Beberapa bakteri yang dapat mensekresikan β-glukanase ialah Bacillus
cepacia untuk merusak integritas dinding sel dari Rhizoctonia solani, Sclerotium
roflsii, dan Pythium ultimum (Compant et al. 2005); B. subtilis NSRS 89-24
menghasilkan enzim β-1,3-glukanase yang efektif menghambat pertumbuhan
cendawan patogen Pyricularia grisea (Leelasuphakul et al. 2006); Pseudomonas
aeruginosa C32a menghasilkan β-1,3-glukanase yang dapat menghambat
pertumbuhan cendawan patogen Pyricularia oryzae (Suryadi et al. 2013);
B. subtilis menghasilkan enzim β-1,3-glukanase yang dapat menghambat
pertumbuhan cendawan patogen Colletotrichum gloeosporiodes OGC1 (Ashwini
dan Srividya 2014).
Response Surface Methodology (RSM)
Response Surface Methodology merupakan teknik statistik dan matematik
yang digunakan untuk pengembangan, perbaikan, dan optimasi proses dengan
cara mengestimasi hubungan antara variabel bebas dengan hasil (respon) yang
diamati sehingga mendapatkan informasi optimum variabel-variabel bebas yang
mempengaruhi respon (Carley et al. 2004). Menurut Myers dan Montgomery
(2002), pada dasarnya analisis respon permukaan adalah serupa dengan analisis
regresi yaitu menggunakan prosedur pendugaan parameter fungsi respons
berdasarkan metode kuadrat terkecil, hanya saja dalam analisis permukaan
respons diperluas dengan menerapkan teknik-teknik matematika untuk

8
menentukan titik-titik optimum agar dapat ditemukan respons yang maksimum.
Rancangan faktorial diperlukan untuk mengombinasikan taraf terendah dan taraf
tertinggi masing-masing variabel bebas, sedangkan rancangan titik pusat
diperlukan untuk mengombinasikan nilai tengah dari variabel bebas (Dewi et al.
2013).
Optimasi dalam produksi enzim sangat penting dilakukan untuk mencari
nilai-nilai optimum variabel yang dapat menghasilkan respons maksimum..
Hubungan tersebut dapat dijelaskan dengan RSM melalui persamaan polinomial
yang terdiri atas efek linier, efek kuadratik, dan efek interaksi antar variabel
(Haliza et al. 2007). Produksi enzim oleh mikrob tergantung pada senyawa
penginduksi (inducer), sumber nutrisi dan kondisi fisik pada saat proses kultivasi.
Karbon dan nitrogen merupakan sumber nutrisi bagi bakteri agar dapat tumbuh.
Inducer merupakan senyawa yang dapat menginduksi dihasilkannya suatu enzim,
dalam kasus tertentu dapat berperan juga sebagai sumber karbon. Kondisi pH,
suhu, dan aerasi juga berpengaruh terhadap produksi enzim dalam hal stabilitas.
Beberapa penelitian menjelaskan bahwa produksi β-glukanase dipengaruhi oleh
faktor-faktor tersebut (Tabel 1).
Tabel 1 Faktor-faktor yang mempengaruhi produksi enzim β-glukanase dari
berbagai mikrob dengan Response Surface Methodology
Bakteri
Faktor yang
Faktor yang
Referensi
dioptimasi
berpengaruh
He et al. (2003)
Bacillus subtilis  Usia inokulum
 Suhu
ZJF-1A5
 Konsentrasi
 Usia inokulum
inokulum
 Konsentrasi
 Aerasi
inokulum
 Waktu kultivasi
 pH
 Suhu
Bacillus subtilis  Tepung barley
Tepung kedelai Tang et al. (2004)
ZJF-1A5
(Sumber N)
 Tepung jagung
Tepung
jagung
 Tepung kedelai
(Sumber C, N)
 KH2PO4
.
Tepung barley
 MgSO4 7H2O
(Sumber C, N)
 CaCl2
Bacillus
Chaari et al. (2012)
 Konsentrasi
 Waktu
licheniformis
inokulum
inkubasi
 Suhu
 Aerasi
 Waktu inkubasi
 aerasi
Trichoderma
Giese et al. (2011a)
 Waktu inkubasi  Waktu
harzianum Rifai  pH
inkubasi
 Aerasi

9

METODE
Kerangka Penelitian
Kerangka penelitian meliputi seleksi isolat penghasil enzim β-glukanase,
identifikasi isolat terpilih, optimasi produksi enzim β-glukanase serta pengujian
efektivitas β-glukanase dari isolat terhadap cendawan patogen secara in vitro.
Pengendapan enzim dengan amonium sulfat juga dilakukan.
Ekstraksi β-glukan dari
oat untuk substrat
Peremajaan dan seleksi
isolat glukanolitik

Penentuan kurva tumbuh
dan produksi enzim

Identifikasi isolat bakteri
terpilih

Pengukuran aktivitas
glukanase dan kadar protein
Optimasi media untuk
produksi glukanase dengan
RSM

Uji antagonis terhadap
cendawan patogen

Pengendapan enzim dengan
amonium sulfat
Gambar 5 Kerangka penelitian
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan pada bulan Februari 2014-Desember 2014 di
Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

10
Ekstraksi β-Glukan dari Oat
β-Glukan oat diekstraksi dari bubuk oat berdasarkan metode Beer et al.
(1996) menggunakan larutan basa Na2CO3 20%. Sebanyak 6 g bubuk oat
dilarutkan dalam 90 mL air pada suhu 40 ºC. pH larutan diatur hingga mencapai
10 dengan Na2CO3 20% diaduk selama 30 menit. Kemudian disentrifugasi pada
kecepatan 5 000 x g pada suhu 4 ºC selama 15 menit. Filtrat ditambahkan HCl
1 M sampai pH nya mencapai 4.5, disentrifugasi 6 000 x g pada suhu 4 ºC selama
25 menit. Filtrat ditambahkan etanol absolut dan diaduk dengan kecepatan tinggi
pada suhu 10 ºC, diendapkan semalam. Filtrat disentrifugasi kembali pada
kecepatan 6 000 x g pada suhu 4 ºC selama 25 menit. Pelet diambil dan disimpan
dalam bufer fosfat 50 mM pH 7 suhu 10 ºC.
Peremajaan Isolat Bakteri dan Cendawan Patogen
Isolat bakteri (SAHA 3.5, SAHA 2.2, SAHA 12.17, SAHA 2.1, SAHA 3.6,
SAHA 3.4, SAHN 13.26, dan SAHA 32.6) dan isolat cendawan patogen
(Curvularia affinis dan Colletotrichum gloeosporioides) yang digunakan adalah
isolat koleksi IPBCC (Institut Pertanian Bogor Culture Collection) hasil isolasi
dari tanah perkebunan kelapa sawit Jambi (Purnamasari 2013). Isolat bakteri
diremajakan pada media nutrient agar (NA) yang disuplementasi 1% β-glukan
selama 24 jam pada suhu 37 ºC dan disimpan pada suhu 4 ºC sebagai stok. Isolat
cendawan patogen diremajakan pada media Potato Dextrose Agar (PDA) dan
diinkubasi pada suhu ruang selama 7 x 24 jam.
Seleksi Isolat Bakteri Glukanolitik
Isolat bakteri hasil peremajaan ditotolkan dengan menggunakan tusuk gigi
steril ke dalam cawan petri yang berisi media agar glukan yang terdiri atas:
1% β-glukan; 0.15% KH2PO4; 0.065% K2HPO4; 0.25% NaCl; 0.05% (NH4)2SO4;
0.012% MgSO4.7H2O; 0.15% ekstrak khamir; dan 2% agar-agar bacto. Kemudian
diinkubasi pada suhu ruang selama 48 jam. Pembentukan zona bening dideteksi
dengan larutan pewarna congo-red (0,1% b/v congo-red: 1 g congo-red dalam 1 L
alkohol 96%) selama 15 menit, kemudian dicuci dengan 1 M larutan NaCl selama
15 menit (Teather dan Wood 1982). Zona bening yang terbentuk menunjukkan
adanya aktivitas enzim β-glukanase, kemudian dihitung indeks glukanolitiknya.
Indeks glukanolitik dihitung dengan menggunakan rumus: (A − B) B-1, A adalah
diameter zona bening, dan B adalah diameter koloni bakteri.
Uji Antagonis Isolat Bakteri terhadap Cendawan Patogen
Uji antagonis dilakukan dengan metode Fokkema (1973) yaitu
memasangkan inokulum cendawan (± 20 mm) dengan goresan bakteri pada jarak
3 cm di medium PDA. Pasangan kultur tersebut diinkubasi selama 6 hari
kemudian dihitung zona hambat bakteri terhadap cendawan. Kontrol

11
menggunakan akuades sebagai pengganti bakteri yang dihadapkan dengan
cendawan patogen. Persentase penghambatan pertumbuhan cendawan patogen
oleh bakteri dihitung dengan mengukur jari-jari cendawan ke arah tepi cawan (R1),
dan mengukur jari-jari cendawan ke arah bakteri (R2). Persentase Penghambatan
dihitung menggunakan rumus = (R1 – R2) R1-1 x 100%. Ekstrak kasar enzim
β-glukanase dari isolat bakteri juga dilakukan uji antagonisme terhadap cendawan
patogen dengan metode agar well diffusion. Ekstrak kasar β-glukanase diambil
pada waktu inkubasi yang memiliki aktivitas tertinggi.
Identifikasi Bakteri Terpilih
Bakteri ditumbuhkan pada media NA selama 24 jam, kemudian diamati
morfologinya yang meliputi bentuk, tepian, dan elevasi koloninya serta bentuk
dan jenis sel dengan pewarnaan Gram. Analisis genotipe isolat yang sudah
diseleksi diidentifikasi secara molekuler dilakukan berdasarkan analisis Deoxyribo
Nucleic Acid (DNA) secara parsial pada ribosomal DNA khususnya pada daerah
16S rRNA (Marchesi et al. 1998).
Isolat ditumbuhkan pada media NB selama 24 jam pada suhu 37 ºC. Proses
ekstraksi DNA total mengikuti prosedur PrestoTM Mini gDNA Bacteria Kit
(Geneaid). Tahap preparasi dimulai dengan 1.5 mL kultur bakteri disentrifugasi
pada kecepatan 12 000 rpm (Eppendorf MiniSpin dengan rotor jenis F-45-12-11)
selama 1 menit, pelet ditambahkan 180 µL GT bufer lalu diresuspensi,
ditambahkan 20 µL proteinase K, diinkubasi pada suhu 60 ºC selama 10 menit
dengan dibolak-balik setiap tiga menit sekali. Tahap lisis dilakukan dengan
menambahkan 200 µL GB bufer pada larutan DNA yang diinkubasi tadi, lalu
dikocok dengan vorteks selama 10 detik dan diinkubasi kembali pada suhu 70 ºC
selama 10 menit dengan dibolak-balik setiap 3 menit sekali. Sementara itu bufer
pre-heated disiapkan dengan menginkubasinya pada suhu 70 ºC. Tahap
pengikatan DNA dilakukan dengan menambahkan 200 µL etanol absolut secara
cepat dan dibolak-balik pada larutan yang diinkubasi tadi, kemudian campuran
dituang ke GD kolom yang dimasukkan ke dalam tabung koleksi, disentrifugasi
pada kecepatan 12 000 rpm selama 2 menit. Tabung koleksi diganti dengan yang
baru. Tahap pencucian dilakukan dengan menambahkan 400 µL WI bufer ke
dalam GD kolom kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12 000 rpm selama 30
detik. Cairan dibuang, lalu diletakkan GD kolom pada tabung koleksi kembali,
kemudian disentrifugasi kembali pada kecepatan 12 000 rpm selama 3 menit.
Tahap elusi dilakukan dengan memindahkan GD kolom pada tabung baru lalu
ditambahkan 30 µL bufer pre-heated, diamkan selama 3 menit, lalu disentrifugasi
pada kecepatan 12 000 rpm selama 30 menit. Didapatkan pelet berupa DNA.
DNA template diamplifikasi dengan Polymerase Chain Reaction (PCR)
(EBSCO) menggunakan dua primer universal spesifik untuk bakteri yaitu 63f (5’CAG GCC TAA CAC AGG CAA GTC) dan 1387r (5’-GGG CGG WGT GTA
CAA GGC). Volume reaksi PCR yang digunakan sebanyak 25 µL yang terdiri
atas 12.5 µL Go Taq Green Master Mix 2X (Promega, Madison, W1, USA); 2.5
µL primer 63f dan 1387r; 1 µL DNA template; dan 6.5 µL Nuclease Free Water,
kemudian dimasukkan ke dalam mesin PCR. PCR diprogram dengan gradien
Marchesi, yaitu dengan kondisi pre-denaturation (95 °C, 5 menit), denaturation

12
(95 °C, 1 menit), annealing (55 °C, 1 menit), elongation (72 °C, 1.5 menit),
extension (72 °C, 10 menit) sebanyak 30 siklus. Hasil PCR kemudian divisualisasi
dengan elektroforesis 0.8% gel agarosa untuk memeriksa keberadaan DNA.
Sebanyak 1 µL sampel DNA dimasukkan ke dalam sumur gel agarosa,
dielektroforesis dengan voltase 80 V selama 45 menit. Visualisasi DNA dilakukan
di atas UV tarnsluminator menggunakan pewarna Ethidium Bromida (EtBr).
Data sekuens diperoleh dari hasil sekuensing DNA yang dikirim ke 1st base
Singapura. Data mentah hasil sekuensing selanjutnya disejajarkan dengan data
GeneBank menggunakan program BLAST-N (Basic Alignment Search ToolNucleotide) pada situs online NCBI (National Center for Biotechnology
Information). Konstruksi pohon filogenetik dilakukan dengan menggunakan
program MEGA 6.06 (MegaSoftware, Inc, Tempe, Arizona, USA) dengan metode
Neighbour Joining (NJ) dengan bootstrap 1 000 kali.
Pembuatan Kurva Pertumbuhan dan Produksi
β-Glukanase Ekstrak Kasar
Kultur starter disiapkan dengan menginokulasikan isolat bakteri terpilih ke
dalam 50 mL kultur media β-glukan cair, diinkubasi pada suhu 37 ºC dan agitasi
130 rpm hingga kepadatan sel bakterinya mencapai 108 CFU mL-1. Selanjutnya,
sebanyak 1% inokulum dikultivasi ke dalam 100 mL media produksi β-glukan
cair pH 7 pada suhu 37 ºC dan agitasi 130 rpm. Setiap 3 jam sekali selama 24 jam
dilakukan pengambilan kultur sel untuk diukur densitas selnya pada panjang
gelombang 580 nm. Lalu nilai absorbansinya dimasukkan ke dalam persamaan
kurva standar sel. Sebanyak 6 mL kultur sel yang sama disentrifugasi dengan
kecepatan 10 000 rpm (Eppendorf MiniSpin dengan rotor jenis F-45-12-11)
selama 15 menit, supernatan yang diperoleh merupakan enzim ekstrak kasar
kemudian dipindahkan ke tabung mikro untuk diukur aktivitas enzim dan kadar
proteinnya.
Pengukuran Aktivitas β-Glukanase dan Kadar Protein
Aktivitas enzim β-glukanase ditentukan dengan metode Miller (1959), yaitu
mengukur jumlah gula pereduksi dengan asam 3,5-dinitrosalisilat (DNS) sebagai
hasil dari hidrolisis substrat β-glukan (Lampiran 1). Sebanyak 500 µL substrat
glukan 3% dalam bufer fosfat 50 mM pH 7 direaksikan dengan 500 µL enzim
ekstrak kasar kemudian diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 30 menit. Reaksi
dihentikan dengan penambahan 1 mL reagen DNS (Lampiran 2), kemudian
dipanaskan selama 15 menit pada air mendidih. Aktivitas enzim ditentukan
dengan mengukur absorbansi pada panjang gelombang 540 nm. Nilai absorbansi
kemudian dimasukkan ke dalam persamaan kurva standar glukosa. Satu unit
aktivitas didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan untuk
menghasilkan 1 μmol glukosa dalam satu menit. Kadar protein ditentukan dengan
metode Bradford (1976) (Lampiran 3) dan Bovine Serum Albumin (BSA)
digunakan sebagai standar. Aktivitas enzim spesifik dihitung berdasarkan
perbandingan aktivitas enzim β-glukanase dengan kadar proteinnya.

13
Optimasi Media Produksi β-Glukanase
Response Surface Methodology (RSM) digunakan dalam mengoptimasi
kondisi untuk produksi enzim β-glukanase yang dihasilkan dari bakteri terpilih.
Konsentrasi β-glukan oat (A), ekstrak khamir (B), dan konsentrasi inokulum (C)
dijadikan variabel independen pada percobaan yang didesain dengan rancangan
komposit terpusat (Central Composite Design) dengan 4 ulangan pada titik sentral
(center point) yang menghasilkan 18 total unit percobaan (Lampiran 4). Respons
yang diamati ialah aktivitas spesifik β-glukanase. Setiap variabel dipelajari pada 5
kode level (-2, -1, 0, +1, +2) (Tabel 2). Central composite design (CCD)
digunakan untuk menentukan model kuadratik, mengevaluasi efek kuadratik, dan
menggunakan titik sentral untuk mengestimasi variabel independen yang
mempengaruhi respon (produksi β-glukanase).
Uji pendahuluan secara konvensional (one factor at a time) dilakukan untuk
mengetahui kondisi variabel produksi β-glukanase sehingga dapat menentukan
nilai batas atas dan batas bawah. Dalam metode tersebut tiap variabel dicari nilai
optimumnya pada berbagai kisaran sementara variabel lainnya diatur pada nilai
yang tetap. Batas atas (+1) dan batas bawah (-1) konsentrasi β-glukan oat yang
digunakan adalah 2% dan 3%, sedangkan konsentrasi ekstrak khamir yang
digunakan adalah 0.2% dan 0.4%. Hasil uji pendahuluan menunjukkan bahwa
penambahan β-glukan oat terbaik sebesar 3% dan ekstrak khamir sebesar 0.3%
(Lampiran 5). Batas atas dan batas bawah inokulum bakteri ditentukan
berdasarkan penelitian He et al. (2003). Inokulum bakteri asal tanah pada
penelitian He et al. (2003) optimum pada konsentrasi 3.82% sehingga batas atas
ditentukan 2% dan batas bawah ditentukan 4% pada penelitian ini.
Tabel 2 Kisaran dan tingkat variabel independen yang diuji dalam matriks
rancangan komposit terpusat (Central Composite Design)
Variabel (variable)
Kode taraf (Level code)
-2
-1
0
+1
+2
β-glukan oat (% b/v)
1
2
3
4
5
Ekstrak khamir (% b/v)
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Inokulum [108 CFU mL-1] (% v/v)
1
2
3
4
5
Hubungan antara variabel independen dengan respons dijelaskan dengan
persamaan polinomial berikut:
Y = β0 + ∑ βi xi +∑ βij xi xj + ∑ βii xi2
Y adalah respons (aktivitas spesifik enzim β-glukanase), β0 adalah koefisien
intersep, βi(k) adalah koefisien untuk efek linier, βij(k) adalah koefisien untuk efek
interaksi, dan βii(k) adalah koefisien untuk efek kuadratik. Xi, Xj, ...., Xk adalah
variabel independen yang diuji.
Inokulum disiapkan dari isolat terseleksi yang diinokulasikan ke dalam
50 mL media glukan cair, kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C dengan agitasi
130 rpm hingga kepadatan selnya mencapai 108 CFU mL-1. Kemudian inokulum
diinokulasikan ke 100 mL media produksi, lalu diinkubasi pada suhu 37 °C
dengan agitasi 130 rpm selama waktu tertinggi pada kurva produksi. Kultur

14
disentrifugasi pada kecepatan 10 000 rpm selama 15 menit. Lalu dianalisis
aktivitas enzimnya. Komputasi rancangan dilakukan dengan menggunakan
software statistik Design Expert versi 9.03.1 (Stat-Ease Inc., Minneapolis, USA).
Koefisien regresi kuadrat (R2) diperoleh dari analisis ketepatan model persamaan
tersebut. Level optimum untuk ketiga variabel independen tersebut ditentukan dari
analisis persamaan regresi dan 3-D plot respon permukaan. Setelah dilakukan
pengolahan data berdasarkan rancangan penelitian menggunakan RSM,
selanjutnya dilakukan validasi kondisi optimum yang diperoleh berdasarkan solusi
terbaik yang direkomendasikan sotftware secara empiris dan enzim diujikan
kembali aktivitasnya pada cendawan patogen.
Pengendapan β-Glukanase dengan Amonium Sulfat
Pengendapan enzim ini dilakukan untuk memperoleh kondisi optimum
fraksinasi dengan berbagai persentase kejenuhan amonium sulfat (Scopes 1994).
Persentase amonium sulfat yang digunakan ialah pada kisaran (NH4)2SO4 0-80%
(b/v) (Leelasuphakul et al. 2006). Enzim diendapkan dalam keadaan dingin
sambil diaduk perlahan menggunakan pengaduk megnetik selama 1 jam. Enzim
ekstrak kasar disimpan dalam tabung sentrifuge selama semalam pada suhu 10 ºC.
Enzim selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan 6 000 rpm, suhu 4 °C selama
30 menit (sentrifuge Hermle dengan rotor 220.97). Endapan enzim dilarutkan
dalam bufer fosfat 50 mM pH 7, lalu diukur aktivitas dan kadar proteinnya.
Setelah itu endapan dengan aktivitas tertinggi diujikan pada cendawan patogen.

HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Seleksi isolat glukanolitik dan penapisan antagonis terhadap cendawan
patogen
Hasil pengujian aktivitas glukanase secara kualitatif terhadap delapan
bakteri didapatkan bahwa tiga isolat memiliki aktivitas glukanase yang
ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni isolat bakteri
setelah penambahan congo-red 0,1% dan pembilasan NaCl 1 M, yaitu isolat
SAHA 3.5, SAHA 12.17, dan SAHA 32.6 dengan indeks glukanolitik terbesar
dimiliki oleh isolat SAHA 32.6. Ketiga isolat dilakukan pengujian terhadap
cendawan patogen. Hasilnya menunjukkan bahwa isolat SAHA 12.17 hanya
mampu menghambat pertumbuhan Colletotrichum gloeosporioides, isolat SAHA
3.5 hanya mampu menghambat pertumbuhan Curvularia affinis, sedangkan isolat
SAHA 32.6 mampu menghambat pertumbuhan kedua cendawan tersebut (Tabel 3,
Gambar 6, Lampiran 6). Isolat SAHA 32.6 kemudian dipilih untuk diuji lebih
lanjut.

15
Tabel 3

Seleksi bakteri glukanolitik dan kemampuannya dalam menghambat
cendawan patogen pada kondisi pH 7 dan suhu 30 ºC
Isolat bakteri
Indeks
Penghambatan pertumbuhan cendawan
glukanolitik
patogen (%)
SAHA 12.17
1.17 ± 0.19
44.45 ± 0.00 terhadap C. gloeosporioides
SAHA 3.5
2.64 ± 0.00
75 ± 0.00 terhadap C. affinis
SAHA 32.6
6.50 ± 0.26
82.78 ± 0.26 terhadap C. gloeosporioides
60.60 ± 8.57 terhadap C. affinis

Gambar 6 Zona bening yang dihasilkan isolat bakteri: (a) SAHA 12.17; (b) SAHA
3.5; (c) SAHA 32.6 pada media β-glukan hasil ekstraksi bubuk oat pH 7
suhu 30 ºC yang diinkubasi selama 24 jam
Identifikasi bakteri isolat SAHA 32.6
Secara morfologi, isolat SAHA 32.6 memiliki koloni dengan bentuk tidak
beraturan dan menyebar, tepian yang berlekuk-lekuk, elevasi yang datar, dan
berwarna putih keruh. Hasil pewarnaan Gram menunjukkan Gram positif dan
memiliki bentuk sel batang dengan ukuran 4 µm (Gambar 7b). Hasil visualisasi
amplifikasi gen penyandi 16S rRNA pada gel agarosa 0.8% menghasilkan produk
pita DNA dengan ukuran ±1300 pasang basa (Gambar 7a, Lampiran 7). Analisis