Disain Nested Primer Gen Hemolisin Untuk Mendeteksi Vibrio harveyi pada Udang Penaeid Melalui PCR
DISAIN NESTED PRIMER GEN HEMOLISIN UNTUK
MENDETEKSI Vibrio harveyi PADA UDANG PENAEID
MELALUI PCR
WAWAN ABDULLAH SETIAWAN
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Disain Nested Primer
Gen Hemolisin untuk Mendeteksi Vibrio harveyi pada Udang Penaeid Melalui
PCR adalah benar karya saya bersama dengan komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2014
Wawan Abdullah Setiawan
NRP P051100031
RINGKASAN
WAWAN ABDULLAH SETIAWAN. Disain Nested Primer Gen Hemolisin
untuk Mendeteksi Vibrio harveyi pada Udang Penaeid Melalui PCR. Dibimbing
oleh UTUT WIDYASTUTI dan MUNTI YUHANA.
Litopenaeus vannamei atau udang putih merupakan salah satu komoditas
unggulan dalam budidaya perikanan di Indonesia. Spesies penaeid ini memiliki
beberapa keunggulan dibanding spesies udang lainnya, antara lain
produktivitasnya yang tinggi dapat mencapai lebih dari 13.600 kg/ha, masa
panennya lebih cepat, serta lebih resisten terhadap penyakit. Meskipun lebih
resisten, penyakit bakterial vibrio berpendar yang disebabkan oleh Vibrio harveyi
masih menjadi kendala dalam usaha pembenihan udang putih di Indonesia.
Aplikasi teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) memungkinkan untuk
melakukan deteksi dini suatu penyakit yang disebabkan oleh bakteri, termasuk
vibriosis pada udang. Nested PCR merupakan variasi dari reaksi PCR biasa. Pada
nested PCR dilakukan 2 kali reaksi PCR dimana hasil dari PCR pertama menjadi
DNA cetakan bagi PCR kedua. Keuntungan dari nested PCR adalah
meminimalkan kesalahan amplifikasi gen dengan menggunakan 2 pasang primer
yang sekaligus juga dapat meningkatkan sensitivitas PCR. Gen hemolisin
diketahui mempunyai spesifisitas dan sensitivitas yang lebih baik dibanding gen
toxR dan gen gyrB sebagai penanda molekuler dalam mendeteksi V. harveyi.
Penelitian ini bertujuan untuk mendisain primer nested PCR menggunakan gen
hemolisin untuk mendeteksi Vibrio harveyi pada udang penaeid.
Sekuen gen hemolisin dari sampel V. harveyi MR5339 dan V. harveyi 275
dideteksi menggunakan primer yang didisain dari sekuen gen lengkap hemolisin
V. harveyi strain VIB 391 (nomor akses: DQ640264) mulai dari urutan ke-133
sampai urutan ke-756. Primer nested PCR didesain dari sekuen gen hemolisin
isolat V. harveyi MR 5339 yang berhasil teramplifikasi oleh primer awal. PCR I
nested PCR didesain untuk mengamplifikasi urutan ke-52 sampai urutan ke-405
dan PCR II nested PCR didesain untuk mengamplifikasi urutan ke-204 sampai
urutan ke-405. Hasil uji spesifisitas menunjukkan bahwa primer nested PCR hasil
disain hanya mampu mengamplifikasi isolat-isolat V. harveyi. Hasil PCR bagi
isolat-isolat bakteri V. parahaemolyticus, V. campbelli, Salmonella sp.,
Edwardsiella tarda, Aeromonas hydrophila, dan Streptococcus iniae yang juga
diujikan diketahui tidak terdapat hasil amplifikasi. Berdasarkan uji sensitivitas
diketahui bahwa primer nested PCR hasil disain mampu menDisain Primer V.
harveyi sampai kepadatan 100 cfu/ml atau konsentrasi DNA sampai 101 fg/µ l.
Melalui uji surveillance diketahui bahwa deteksi terendah adalah pada sampel hari
ke-3 ekstrak DNA udang mati suspect V. harveyi MR 5339 infeksi awal sebanyak
101 cfu/ml.
Kata kunci: V. harveyi, L. vannamei, hemolisin, DNA, nested PCR.
SUMMARY
WAWAN ABDULLAH SETIAWAN. Nested Primer Design of Haemolysin
Gene to Detect Vibrio harveyi in Penaeid Shrimp By PCR. Under direction of
UTUT WIDYASTUTI and MUNTI YUHANA.
Litopenaeus vannamei or white shrimp is one of the most important
aquaculture commodity in Indonesia. This penaeid species have several
advantages compared to other shrimp species, such as higher productivity that can
reach more than 13,600 kg/ha, growth faster and at beginning of introduction it
was believed more resistant against diseases. However the later it was known that
luminous Vibrio disease still becomes problem in white shrimp hatchery in
Indonesia.
Application of PCR (Polymerase Chain Reaction) could allow early
detection of disease caused by bacteria, including Vibriosis in shrimp. Nested
PCR is a modification of the regular PCR reaction, which use two successive runs
of PCR. The first PCR fragment product is used as template for the second PCR.
The advantage of nested PCR is to minimize error by using 2 pairs of primers
which also means increasing the PCR sensitivity. Haemolysin gene was known
has better specificity and sensitivity than toxR gene and gyrB gene as molecular
marker to detect V. harveyi. The aim of this study was to design nested PCR
primers using haemolysin gene to detect V. harveyi in penaeid shrimp.
Haemolysin gene sequences from V. harveyi MR5339 and V. harveyi 275
samples was detected by primer pair that designed from complete sequence of V.
harveyi VIB391 haemolysin gene (accesion number: DQ640264) from 133 to 756
sequence. Nested PCR primers was designed from sequencing result of V. harveyi
MR5339 haemolysin gene which have been successfully amplified by the initial
primers. Primer pairs I of nested PCR was designed to amplified the DNA
fragment from positions 52 to 405. Primer pairs II of nested PCR was designed to
amplified the positions 204 to 405. Specificity test showed that nested PCR
primers just only amplified V. harveyi isolates. PCR results for isolates V.
parahaemolyticus, V. campbelli, Salmonella sp., Edwardsiella tarda, Aeromonas
hydrophila, dan Streptococcus iniae was known has no amplification. Based on
sensitivity test was known that nested PCR primers designed was able to detect V.
harveyi cells density of 100 cfu/ml or at concentration of 101 fg/µ l extracted DNA.
From surveillance test, it was observed that lowest concentration was detected on
dead shrimp DNA extract suspect V. harveyi MR 5339 initial infected 101 cfu/ml.
.
Keywords: V. harveyi, L. vannamei, haemolysin, DNA, nested PCR.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau
menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
DISAIN NESTED PRIMER GEN HEMOLISIN UNTUK
MENDETEKSI Vibrio harveyi PADA UDANG PENAEID
MELALUI PCR
WAWAN ABDULLAH SETIAWAN
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Bioteknologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Ir Iman Rusmana, MSi
: Disain Nested Primer Gen Hemolisin Untuk Mendeteksi
Judul Tesis
Vibrio harveyi pada Udang Penaeid Melalui PCR
Nama
: Wawan Abdullah Setiawan
NRP
: P051100031
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Dr Ir Utut Widyastuti, MSi
Dr Munti Yuhana, SPi, MSi
Ketua
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Dekan Sekolah Pascasarjana
Bioteknologi
Prof Dr Ir Suharsono, DEA
Dr Ir Dahrul Syah, MSc Agr
Tanggal Ujian: 30 Mei 2014
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia
dan rahmat-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Oktober 2011 sampai
bulan April 2013 ini ialah disain nested primer gen hemolisin untuk mendeteksi
Vibrio harveyi pada udang penaeid melalui PCR.
Penulis sangat menyadari bahwa proses penyelesaian penelitian dan
penulisan tesis ini tidak akan dapat berjalan dengan lancar tanpa dukungan banyak
pihak. Karena itu, pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang
tak terhingga kepada Ibu Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.S. dan Ibu Dr. Munti Yuhana,
S.Pi, M.Si. sebagai pembimbing atas ilmu, cara berfikir, dana dan fasilitas
penelitian kepada penulis. Terimakasih penulis haturkan juga atas waktu,
kesabaran, serta semangat, bimbingan dan semua masukan yang sangat berarti
mulai dari penyusunan proposal, pelaksanaan penelitian hingga penulisan tesis ini
yang insya Alloh akan penulis jadikan acuan dalam melangkah ke depan. Penulis
juga menyampaikan terima kasih kepada Bapak Dr. Ir. Iman Rusmana, M.S.
selaku penguji atas saran dan perbaikan untuk kesempurnaan tesis ini.
Terimakasih dan rasa hormat juga penulis sampaikan kepada Bapak Prof. Dr. Ir.
Suharsono, DEA sebagai ketua program studi Bioteknologi yang telah banyak
memberikan ilmu, saran, dan masukan sejak awal perkuliahan, penelitian, hingga
selesainya tesis ini.
Terima kasih penulis sampaikan pula kepada Kementerian Pendidikan dan
Kebudayaan Nasional, kepada Bapak Bambang Irawan, Bapak Sumardi, dan Ibu
C. N. Ekowati, serta Bapak/Ibu dosen Jurusan Biologi Universitas Lampung
sebagai orang tua penulis atas arahan, kesempatan, dan penyediaan beasiswa
sehingga penulis dapat melanjutkan pendidikan pada program Magister di Insitut
Pertanian Bogor. Semoga penulis dapat mengaplikasikan ilmu yang penulis
dapatkan bagi sebesar-besarnya kemajuan di tanah kelahiran penulis, tempat
orangtua penulis mencari penghidupan pada khususnya dan khasanah ilmu
pengetahuan pada umumnya.
Terimakasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya kepada Ibu Dr. Ince
Ayu Khairana Kadriah atas semua kebaikannya sehingga penulis dapat
mengerjakan penelitian ini. Terima kasih dan penghargaan juga penulis
sampaikan kepada Mbak Peppy Elvavina selaku teknisi di Laboratorium BIORIN
atas semua masukan, kemudahan, serta kebaikannya selama penelitian. Kepada
Pak Keresyanto, Pak Mulya, Pak Yanto, A’ Saeri, Mbak Nia, Mbak Ara, Pak
Asep, Mbak Pipit, Pak Ranta, dan Mas Rahman, penulis ucapkan banyak
terimakasih atas semua kebaikan dan kebersamaannya kepada penulis. Bapak/Ibu
dan rekan-rekan Lab. BIORIN: Pak Muzuni, Bu Ratna, Pak Radite, Bu Cinta, Pak
Ulung, Pak Asri, Pak Ilyas, Bu Ifa, Mbak Fajri, Mbak Nurul, Mbak Nuril, Ahya,
serta adik-adik tingkat PS Bioteknologi, penulis menyampaikan terima kasih
untuk semua kebersamaan yang telah memberi semangat, masukan, dan
pengalaman yang tak terlupakan. Terima kasih karena sudah berbagi kebahagiaan,
ilmu, dan menjadi pendukung di saat-saat tersulit dalam penyelesaian tesis ini.
Teman-teman PS BTK angkatan 2010 : Mbak Goli, Ratna, Seagames, Mbak
Atun, Stephani, Mas Asep, Rani, Ista, Mbak Cynthia, Ricky, Nanda, Evan, Mas
Aji, Mas Swastika, Mas Fajarudin, Delih, Mbak Anky, Mbak Neng, dan Mbak
Ihat, penulis menyampaikan terima kasih untuk semua kebersamaan yang telah
memberi semangat dan pengalaman yang tak terlupakan.
Terima kasih dan penghargaan yang tinggi penulis haturkan kepada istri
tersayang Ulia Fajriah, keempat orangtua, dan adik-adik tersayang untuk semua
cinta, kasih sayang, dukungan dan perhatiannya selama ini. Terimakasih juga
kepada semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu yang telah
membantu dan memberikan dukungan moril maupun materiil sehingga penulis
mampu menyelesaikan program S2 di Institut Pertanian Bogor.
Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari sempurna karena
keterbatasan pengetahuan dan wawasan penulis dalam bidang ini. Oleh karena
itu, penulis mengharapkan saran, masukan, dan kritikan untuk perbaikan
penulisan selanjutnya. Bagaimanapun, penulis berharap semoga tesis ini
bermanfaat bagi kemajuan ilmu pengetahuan.
Bogor, Agustus 2014
Wawan Abdullah Setiawan
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR ISI ...................................................................................................... ix
DAFTAR GAMBAR ................................................................................ xi
DAFTAR TABEL ............................................................................................. xii
DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................... xiii
1 PENDAHULUAN ........................................................................................... 1
1.1 Latar Belakang ................................................................................... 1
1.2 Tujuan Penelitian ............................................................................... 2
2 TINJAUAN PUSTAKA ................................................................................... 3
2.1 Vibriosis pada Udang Putih ................................................................ 3
2.2 Nested PCR ........................................................................................ 5
2.3 Disain Primer ..................................................................................... 6
3 BAHAN DAN METODE
8
3.1 Bahan ................................................................................................. 8
3.2 Peremajaan Isolat Bakteri ................................................................... 8
3.3 Ekstraksi DNA Bakteri ....................................................................... 8
3.4 Analisa DNA Vibrio dengan Elektroforesis ........................................ 9
3.5 Uji Kemurnian dan Penghitungan Konsentrasi DNA ........................... 9
3.6 Desain Primer Awal Gen Hemolisin V. harveyi ................................ 10
3.7 PCR Menggunakan Primer Awal Gen Hemolisin V. harveyi ............ 10
3.8 Elusi Sekuen Gen Hemolisin V. harveyi dan Pengurutan Sekuen
Gen Hemolisin ................................................................................. 11
3.9 Disain Primer Nested PCR ............................................................... 11
3.10 Nested PCR ...................................................................................... 11
3.11 Uji Sensitivitas Primer Nested PCR .................................................. 12
3.12 Uji Spesifisitas Primer Nested PCR .................................................. 12
3.13 Surveillance Test .............................................................................. 12
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
14
4.1 PCR Menggunakan Primer Awal Gen Hemolisin V. harveyi MR5339
dan Pengurutan Sekuen Gen Hemolisin .............................................. 14
4.2 Disain Primer Nested PCR ................................................................. 16
4.3 Uji Sensitivitas Primer Nested PCR .................................................... 16
4.4 Uji Spesifisitas Primer Nested PCR .................................................... 19
4.5 Surveillance Test ................................................................................ 22
5 SIMPULAN DAN SARAN
25
5.1 Simpulan ............................................................................................ 25
5.2 Saran .................................................................................................. 25
DAFTAR PUSTAKA
26
LAMPIRAN
29
RIWAYAT HIDUP
34
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Hasil uji aktivitas hemolisin isolat V. harveyi, V. parahaemolyticus,
Salmonella sp., Edwardsiella tarda, Aeromonas hydrophila, dan
Streptococcus iniae pada medium agar darah ................................................... 4
2 Visualisasi hasil PCR dengan primer awal ...................................................... 15
3 Uji sensitivitas primer nested PCR menggunakan DNA V. harveyi
MR5339 ......................................................................................................... 17
4 Uji sensitivitas primer nested PCR menggunakan DNA V. harveyi 275 .......... 18
5 Hasil uji spesifisitas pada kepadatan bakteri 105 cfu/ml s.d 100 cfu/ml ........... 19
6 Hasil uji spesifisitas pada ekstrak DNA konsentrasi 102 ng/µ l s.d 101 fg/µ l..... 21
7 Visualisasi hasil PCR dengan nested PCR bagi surveillance test .................... 22
8 Visualisasi hasil PCR dengan nested PCR bagi surveillance test
sampel ke-7 ..................................................................................................... 23
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Komposisi pereaksi PCR ................................................................................ 10
2 Program awal pada alat thermocycler ............................................................. 10
3 Hasil penghitungan uji kemurnian dan konsentrasi DNA isolat bakteri ........... 14
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Similaritas sekuen gen hemolisin V harveyi MR5339 ...................................... 29
2 Similaritas sekuen gen hemolisin V harveyi 275 .............................................. 31
3 Daerah amplifikasi primer nested PCR hasil disain ......................................... 33
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Disain Nested Primer
Gen Hemolisin untuk Mendeteksi Vibrio harveyi pada Udang Penaeid Melalui
PCR adalah benar karya saya bersama dengan komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2014
Wawan Abdullah Setiawan
NRP P051100031
RINGKASAN
WAWAN ABDULLAH SETIAWAN. Disain Nested Primer Gen Hemolisin
untuk Mendeteksi Vibrio harveyi pada Udang Penaeid Melalui PCR. Dibimbing
oleh UTUT WIDYASTUTI dan MUNTI YUHANA.
Litopenaeus vannamei atau udang putih merupakan salah satu komoditas
unggulan dalam budidaya perikanan di Indonesia. Spesies penaeid ini memiliki
beberapa keunggulan dibanding spesies udang lainnya, antara lain
produktivitasnya yang tinggi dapat mencapai lebih dari 13.600 kg/ha, masa
panennya lebih cepat, serta lebih resisten terhadap penyakit. Meskipun lebih
resisten, penyakit bakterial vibrio berpendar yang disebabkan oleh Vibrio harveyi
masih menjadi kendala dalam usaha pembenihan udang putih di Indonesia.
Aplikasi teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) memungkinkan untuk
melakukan deteksi dini suatu penyakit yang disebabkan oleh bakteri, termasuk
vibriosis pada udang. Nested PCR merupakan variasi dari reaksi PCR biasa. Pada
nested PCR dilakukan 2 kali reaksi PCR dimana hasil dari PCR pertama menjadi
DNA cetakan bagi PCR kedua. Keuntungan dari nested PCR adalah
meminimalkan kesalahan amplifikasi gen dengan menggunakan 2 pasang primer
yang sekaligus juga dapat meningkatkan sensitivitas PCR. Gen hemolisin
diketahui mempunyai spesifisitas dan sensitivitas yang lebih baik dibanding gen
toxR dan gen gyrB sebagai penanda molekuler dalam mendeteksi V. harveyi.
Penelitian ini bertujuan untuk mendisain primer nested PCR menggunakan gen
hemolisin untuk mendeteksi Vibrio harveyi pada udang penaeid.
Sekuen gen hemolisin dari sampel V. harveyi MR5339 dan V. harveyi 275
dideteksi menggunakan primer yang didisain dari sekuen gen lengkap hemolisin
V. harveyi strain VIB 391 (nomor akses: DQ640264) mulai dari urutan ke-133
sampai urutan ke-756. Primer nested PCR didesain dari sekuen gen hemolisin
isolat V. harveyi MR 5339 yang berhasil teramplifikasi oleh primer awal. PCR I
nested PCR didesain untuk mengamplifikasi urutan ke-52 sampai urutan ke-405
dan PCR II nested PCR didesain untuk mengamplifikasi urutan ke-204 sampai
urutan ke-405. Hasil uji spesifisitas menunjukkan bahwa primer nested PCR hasil
disain hanya mampu mengamplifikasi isolat-isolat V. harveyi. Hasil PCR bagi
isolat-isolat bakteri V. parahaemolyticus, V. campbelli, Salmonella sp.,
Edwardsiella tarda, Aeromonas hydrophila, dan Streptococcus iniae yang juga
diujikan diketahui tidak terdapat hasil amplifikasi. Berdasarkan uji sensitivitas
diketahui bahwa primer nested PCR hasil disain mampu menDisain Primer V.
harveyi sampai kepadatan 100 cfu/ml atau konsentrasi DNA sampai 101 fg/µ l.
Melalui uji surveillance diketahui bahwa deteksi terendah adalah pada sampel hari
ke-3 ekstrak DNA udang mati suspect V. harveyi MR 5339 infeksi awal sebanyak
101 cfu/ml.
Kata kunci: V. harveyi, L. vannamei, hemolisin, DNA, nested PCR.
SUMMARY
WAWAN ABDULLAH SETIAWAN. Nested Primer Design of Haemolysin
Gene to Detect Vibrio harveyi in Penaeid Shrimp By PCR. Under direction of
UTUT WIDYASTUTI and MUNTI YUHANA.
Litopenaeus vannamei or white shrimp is one of the most important
aquaculture commodity in Indonesia. This penaeid species have several
advantages compared to other shrimp species, such as higher productivity that can
reach more than 13,600 kg/ha, growth faster and at beginning of introduction it
was believed more resistant against diseases. However the later it was known that
luminous Vibrio disease still becomes problem in white shrimp hatchery in
Indonesia.
Application of PCR (Polymerase Chain Reaction) could allow early
detection of disease caused by bacteria, including Vibriosis in shrimp. Nested
PCR is a modification of the regular PCR reaction, which use two successive runs
of PCR. The first PCR fragment product is used as template for the second PCR.
The advantage of nested PCR is to minimize error by using 2 pairs of primers
which also means increasing the PCR sensitivity. Haemolysin gene was known
has better specificity and sensitivity than toxR gene and gyrB gene as molecular
marker to detect V. harveyi. The aim of this study was to design nested PCR
primers using haemolysin gene to detect V. harveyi in penaeid shrimp.
Haemolysin gene sequences from V. harveyi MR5339 and V. harveyi 275
samples was detected by primer pair that designed from complete sequence of V.
harveyi VIB391 haemolysin gene (accesion number: DQ640264) from 133 to 756
sequence. Nested PCR primers was designed from sequencing result of V. harveyi
MR5339 haemolysin gene which have been successfully amplified by the initial
primers. Primer pairs I of nested PCR was designed to amplified the DNA
fragment from positions 52 to 405. Primer pairs II of nested PCR was designed to
amplified the positions 204 to 405. Specificity test showed that nested PCR
primers just only amplified V. harveyi isolates. PCR results for isolates V.
parahaemolyticus, V. campbelli, Salmonella sp., Edwardsiella tarda, Aeromonas
hydrophila, dan Streptococcus iniae was known has no amplification. Based on
sensitivity test was known that nested PCR primers designed was able to detect V.
harveyi cells density of 100 cfu/ml or at concentration of 101 fg/µ l extracted DNA.
From surveillance test, it was observed that lowest concentration was detected on
dead shrimp DNA extract suspect V. harveyi MR 5339 initial infected 101 cfu/ml.
.
Keywords: V. harveyi, L. vannamei, haemolysin, DNA, nested PCR.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau
menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
DISAIN NESTED PRIMER GEN HEMOLISIN UNTUK
MENDETEKSI Vibrio harveyi PADA UDANG PENAEID
MELALUI PCR
WAWAN ABDULLAH SETIAWAN
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Bioteknologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Ir Iman Rusmana, MSi
: Disain Nested Primer Gen Hemolisin Untuk Mendeteksi
Judul Tesis
Vibrio harveyi pada Udang Penaeid Melalui PCR
Nama
: Wawan Abdullah Setiawan
NRP
: P051100031
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Dr Ir Utut Widyastuti, MSi
Dr Munti Yuhana, SPi, MSi
Ketua
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Dekan Sekolah Pascasarjana
Bioteknologi
Prof Dr Ir Suharsono, DEA
Dr Ir Dahrul Syah, MSc Agr
Tanggal Ujian: 30 Mei 2014
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia
dan rahmat-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Oktober 2011 sampai
bulan April 2013 ini ialah disain nested primer gen hemolisin untuk mendeteksi
Vibrio harveyi pada udang penaeid melalui PCR.
Penulis sangat menyadari bahwa proses penyelesaian penelitian dan
penulisan tesis ini tidak akan dapat berjalan dengan lancar tanpa dukungan banyak
pihak. Karena itu, pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang
tak terhingga kepada Ibu Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.S. dan Ibu Dr. Munti Yuhana,
S.Pi, M.Si. sebagai pembimbing atas ilmu, cara berfikir, dana dan fasilitas
penelitian kepada penulis. Terimakasih penulis haturkan juga atas waktu,
kesabaran, serta semangat, bimbingan dan semua masukan yang sangat berarti
mulai dari penyusunan proposal, pelaksanaan penelitian hingga penulisan tesis ini
yang insya Alloh akan penulis jadikan acuan dalam melangkah ke depan. Penulis
juga menyampaikan terima kasih kepada Bapak Dr. Ir. Iman Rusmana, M.S.
selaku penguji atas saran dan perbaikan untuk kesempurnaan tesis ini.
Terimakasih dan rasa hormat juga penulis sampaikan kepada Bapak Prof. Dr. Ir.
Suharsono, DEA sebagai ketua program studi Bioteknologi yang telah banyak
memberikan ilmu, saran, dan masukan sejak awal perkuliahan, penelitian, hingga
selesainya tesis ini.
Terima kasih penulis sampaikan pula kepada Kementerian Pendidikan dan
Kebudayaan Nasional, kepada Bapak Bambang Irawan, Bapak Sumardi, dan Ibu
C. N. Ekowati, serta Bapak/Ibu dosen Jurusan Biologi Universitas Lampung
sebagai orang tua penulis atas arahan, kesempatan, dan penyediaan beasiswa
sehingga penulis dapat melanjutkan pendidikan pada program Magister di Insitut
Pertanian Bogor. Semoga penulis dapat mengaplikasikan ilmu yang penulis
dapatkan bagi sebesar-besarnya kemajuan di tanah kelahiran penulis, tempat
orangtua penulis mencari penghidupan pada khususnya dan khasanah ilmu
pengetahuan pada umumnya.
Terimakasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya kepada Ibu Dr. Ince
Ayu Khairana Kadriah atas semua kebaikannya sehingga penulis dapat
mengerjakan penelitian ini. Terima kasih dan penghargaan juga penulis
sampaikan kepada Mbak Peppy Elvavina selaku teknisi di Laboratorium BIORIN
atas semua masukan, kemudahan, serta kebaikannya selama penelitian. Kepada
Pak Keresyanto, Pak Mulya, Pak Yanto, A’ Saeri, Mbak Nia, Mbak Ara, Pak
Asep, Mbak Pipit, Pak Ranta, dan Mas Rahman, penulis ucapkan banyak
terimakasih atas semua kebaikan dan kebersamaannya kepada penulis. Bapak/Ibu
dan rekan-rekan Lab. BIORIN: Pak Muzuni, Bu Ratna, Pak Radite, Bu Cinta, Pak
Ulung, Pak Asri, Pak Ilyas, Bu Ifa, Mbak Fajri, Mbak Nurul, Mbak Nuril, Ahya,
serta adik-adik tingkat PS Bioteknologi, penulis menyampaikan terima kasih
untuk semua kebersamaan yang telah memberi semangat, masukan, dan
pengalaman yang tak terlupakan. Terima kasih karena sudah berbagi kebahagiaan,
ilmu, dan menjadi pendukung di saat-saat tersulit dalam penyelesaian tesis ini.
Teman-teman PS BTK angkatan 2010 : Mbak Goli, Ratna, Seagames, Mbak
Atun, Stephani, Mas Asep, Rani, Ista, Mbak Cynthia, Ricky, Nanda, Evan, Mas
Aji, Mas Swastika, Mas Fajarudin, Delih, Mbak Anky, Mbak Neng, dan Mbak
Ihat, penulis menyampaikan terima kasih untuk semua kebersamaan yang telah
memberi semangat dan pengalaman yang tak terlupakan.
Terima kasih dan penghargaan yang tinggi penulis haturkan kepada istri
tersayang Ulia Fajriah, keempat orangtua, dan adik-adik tersayang untuk semua
cinta, kasih sayang, dukungan dan perhatiannya selama ini. Terimakasih juga
kepada semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu yang telah
membantu dan memberikan dukungan moril maupun materiil sehingga penulis
mampu menyelesaikan program S2 di Institut Pertanian Bogor.
Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari sempurna karena
keterbatasan pengetahuan dan wawasan penulis dalam bidang ini. Oleh karena
itu, penulis mengharapkan saran, masukan, dan kritikan untuk perbaikan
penulisan selanjutnya. Bagaimanapun, penulis berharap semoga tesis ini
bermanfaat bagi kemajuan ilmu pengetahuan.
Bogor, Agustus 2014
Wawan Abdullah Setiawan
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR ISI ...................................................................................................... ix
DAFTAR GAMBAR ................................................................................ xi
DAFTAR TABEL ............................................................................................. xii
DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................... xiii
1 PENDAHULUAN ........................................................................................... 1
1.1 Latar Belakang ................................................................................... 1
1.2 Tujuan Penelitian ............................................................................... 2
2 TINJAUAN PUSTAKA ................................................................................... 3
2.1 Vibriosis pada Udang Putih ................................................................ 3
2.2 Nested PCR ........................................................................................ 5
2.3 Disain Primer ..................................................................................... 6
3 BAHAN DAN METODE
8
3.1 Bahan ................................................................................................. 8
3.2 Peremajaan Isolat Bakteri ................................................................... 8
3.3 Ekstraksi DNA Bakteri ....................................................................... 8
3.4 Analisa DNA Vibrio dengan Elektroforesis ........................................ 9
3.5 Uji Kemurnian dan Penghitungan Konsentrasi DNA ........................... 9
3.6 Desain Primer Awal Gen Hemolisin V. harveyi ................................ 10
3.7 PCR Menggunakan Primer Awal Gen Hemolisin V. harveyi ............ 10
3.8 Elusi Sekuen Gen Hemolisin V. harveyi dan Pengurutan Sekuen
Gen Hemolisin ................................................................................. 11
3.9 Disain Primer Nested PCR ............................................................... 11
3.10 Nested PCR ...................................................................................... 11
3.11 Uji Sensitivitas Primer Nested PCR .................................................. 12
3.12 Uji Spesifisitas Primer Nested PCR .................................................. 12
3.13 Surveillance Test .............................................................................. 12
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
14
4.1 PCR Menggunakan Primer Awal Gen Hemolisin V. harveyi MR5339
dan Pengurutan Sekuen Gen Hemolisin .............................................. 14
4.2 Disain Primer Nested PCR ................................................................. 16
4.3 Uji Sensitivitas Primer Nested PCR .................................................... 16
4.4 Uji Spesifisitas Primer Nested PCR .................................................... 19
4.5 Surveillance Test ................................................................................ 22
5 SIMPULAN DAN SARAN
25
5.1 Simpulan ............................................................................................ 25
5.2 Saran .................................................................................................. 25
DAFTAR PUSTAKA
26
LAMPIRAN
29
RIWAYAT HIDUP
34
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Hasil uji aktivitas hemolisin isolat V. harveyi, V. parahaemolyticus,
Salmonella sp., Edwardsiella tarda, Aeromonas hydrophila, dan
Streptococcus iniae pada medium agar darah ................................................... 4
2 Visualisasi hasil PCR dengan primer awal ...................................................... 15
3 Uji sensitivitas primer nested PCR menggunakan DNA V. harveyi
MR5339 ......................................................................................................... 17
4 Uji sensitivitas primer nested PCR menggunakan DNA V. harveyi 275 .......... 18
5 Hasil uji spesifisitas pada kepadatan bakteri 105 cfu/ml s.d 100 cfu/ml ........... 19
6 Hasil uji spesifisitas pada ekstrak DNA konsentrasi 102 ng/µ l s.d 101 fg/µ l..... 21
7 Visualisasi hasil PCR dengan nested PCR bagi surveillance test .................... 22
8 Visualisasi hasil PCR dengan nested PCR bagi surveillance test
sampel ke-7 ..................................................................................................... 23
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Komposisi pereaksi PCR ................................................................................ 10
2 Program awal pada alat thermocycler ............................................................. 10
3 Hasil penghitungan uji kemurnian dan konsentrasi DNA isolat bakteri ........... 14
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Similaritas sekuen gen hemolisin V harveyi MR5339 ...................................... 29
2 Similaritas sekuen gen hemolisin V harveyi 275 .............................................. 31
3 Daerah amplifikasi primer nested PCR hasil disain ......................................... 33
1
1 PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Litopenaeus vannamei atau udang putih merupakan salah satu komoditas
unggulan dalam budidaya perikanan di Indonesia dimana produksinya pada tahun
2014 ditargetkan sebesar 511 ribu ton (KKP 2010). Spesies ini memiliki beberapa
keunggulan dibanding spesies udang lainnya, antara lain produktivitasnya yang
tinggi dapat mencapai lebih dari 13.600 kg/ha, masa panennya lebih cepat, serta
lebih resisten terhadap penyakit (Boyd dan Clay 2002). Meskipun lebih resisten,
penyakit bakterial Vibrio berpendar masih menjadi kendala dalam usaha
pembenihan udang putih di Indonesia (Felix et al. 2011). Spesies bakteri Vibrio
yang sering menyebabkan kematian massal terutama pada larva udang di
Indonesia adalah Vibrio harveyi (Teo et al. 2000). Serangan bakteri Vibrio yang
mengakibatkan kematian udang dalam waktu yang cepat dan dalam jumlah yang
besar. Bakteri ini merupakan jenis patogen yang menginfeksi dan menyebabkan
penyakit pada saat kondisi udang lemah dan faktor lingkungan yang ekstrim
(Austin dan Zhang 2006).
Lightner (1996) menyatakan bahwa pemeriksaan Vibriosis pada udang saat
ini masih dilakukan secara konvensional yaitu dengan melihat gejala klinis pada
tubuh udang, mengisolasi bakteri penyebab penyakit, melakukan uji fisiologi dan
biokimia, yang kesemuanya membutuhkan waktu hingga beberapa hari. Jika hasil
pemeriksaan tersebut sudah positif menunjukkan Vibriosis, inipun sudah
terlambat karena biasanya populasi Vibrio sudah dalam kepadatan yang tinggi,
lebih dari 109 cfu/ml sehingga lebih sukar dikendalikan.
Aplikasi teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) memungkinkan untuk
melakukan deteksi dini suatu penyakit yang disebabkan oleh bakteri, termasuk
Vibriosis pada udang. PCR merupakan teknik yang digunakan untuk
mengamplifikasi sekuen asam nukleat menggunakan polimerisasi berulang dari
sekuen DNA (Kolmodin dan Birch. 2002). Nested PCR merupakan variasi dari
reaksi PCR biasa. Pada nested PCR, dilakukan 2 kali reaksi PCR dimana hasil
dari PCR pertama menjadi DNA cetakan bagi PCR kedua. Keuntungan dari
nested PCR adalah meminimalkan kesalahan amplifikasi gen dengan
menggunakan 2 pasang primer yang sekaligus juga dapat meningkatkan
sensitivitas PCR (Siebert et al. 1995).
Hemolisin merupakan eksotoksin yang diproduksi oleh bakteri Vibrio
berpendar yang menyerang membran sel darah inang dan menyebabkan sel darah
pecah (Zhang dan Austin 2005). Pada sebagian besar kasus, bukti epidemiologi
dan eksperimental menunjukkan bahwa hemolisin terlibat dalam patogenesis
penyakit Vibriosis (Shinoda 1999). Hemolisin disandikan oleh gen hemolisin
dimana urutan gennya telah banyak diketahui dan dapat diakses di GeneBank.
Kadriah et al. (2013) menjelaskan bahwa gen hemolisin mempunyai spesifisitas
dan sensitivitas yang lebih baik dibanding gen toxR dan gen gyrB sebagai penanda
molekuler dalam mendeteksi V. harveyi. Primer yang didisain dari penelitian
tersebut menunjukkan sensitivitas untuk mendeteksi V. harveyi pada kepadatan
100 cfu/ml dan konsentrasi DNA sebanyak 101 pg.
2
Sambrook dan Russel (2001) menerangkan bahwa teknik PCR
memungkinkan untuk mengamplifikasi 1 kopi cetakan DNA. Oleh karena itu,
dengan menggunakan teknik nested PCR diharapkan dapat ditemukan primer
nested PCR yang lebih spesifik dan sensitif bagi gen penyandi hemolisin V.
harveyi sehingga keberadaan bakteri Vibrio berpendar patogenik strain lokal pada
budidaya udang putih dapat dideteksi lebih dini.
1.2 Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mendisain nested primer gen hemolisin untuk
mendeteksi bakteri V. harveyi patogenik pada udang penaeid melalui PCR.
3
2 TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Vibriosis pada Udang Putih
Udang putih dengan nama ilmiah Litopennaeus vannamei merupakan salah
satu komoditas unggulan dalam budidaya perikanan di Indonesia. Selama periode
tahun 2003 s.d 2007 ekspor udang cenderung meningkat, yaitu dari 137.636 ton
menjadi 160.797 ton (Poernomo 2008). Produksi udang nasional mengalami
kenaikan sebesar 2,6% dari 338.060 ton tahun 2009 menjadi 352.600 ton pada
tahun 2010. Pemerintah melalui Kementrian Kelautan dan Perikanan menargetkan
produksi udang putih pada tahun 2014 sebesar 511 ribu ton (KKP 2010).
Udang putih memiliki beberapa keunggulan dibanding beberapa spesies
udang lainnya, diantaranya masa panennya yang lebih cepat, produktifitasnya
yang tinggi yang dapat mencapai lebih dari 13.600 kg/ha, dan lebih resisten
terhadap penyakit (Boyd dan Clay 2002). Walaupun udang putih lebih resisten
terhadap penyakit, penyakit bakterial Vibrio berpendar masih menjadi kendala
dalam usaha pembenihan udang putih di Indonesia (Felix et al. 2011).
Penyakit berpendar pada larva udang merupakan penyakit yang berbahaya
karena dapat menyebabkan kematian massal. Bakteri Vibrio berpendar sering
dilaporkan sebagai penyebab kematian massal pada berbagai ikan laut dan udang
di berbagai belahan dunia (Austin dan Zhang 2006). Bakteri Vibrio berpendar
juga dilaporkan sebagai agen penyebab utama penyakit Vibriosis pada udang
budidaya di wilayah Asia Tenggara yang menyebabkan kerugian yang besar
(Lavilla-Pitogo et al. 1998; Liu et al. 1996). Vibriosis telah menyebabkan
mortalitas pada berbagai stadia larva, pasca larva, juvenil, dan dewasa (Lightner
1996). Spesies bakteri Vibrio yang sering menyebabkan kematian massal terutama
pada larva udang di Indonesia adalah Vibrio harveyi (Teo et al. 2000).
Pada sebagian besar kasus, bukti epidemiologi dan eksperimental
menunjukkan bahwa hemolisin terlibat dalam patogenesis penyakit Vibriosis
(Shinoda 1999). Hemolisin merupakan enzim yang bertanggung jawab terhadap
kerusakan membran sel darah (hemolisis) dan dilaporkan bahwa gen hemolisin
terdapat pada beberapa genus Vibrio termasuk V. harveyi (Zhang dan Austin
2005). Kadriah (2013) menerangkan bahwa selain V. harveyi, bakteri V.
parahaemolyticus, Salmonella sp., Edwardsiella tarda, Aeromonas hydrophila,
dan Streptococcus iniae diketahui mempunyai aktivitas α hemolisin setelah
ditumbuhkan di medium agar darah. Hasil uji aktivitas hemolisin disajikan pada
gambar 1.
Lebih lanjut menurut Zhang dan Austin (2005), sekuen gen hemolisin
bervariasi pada spesies bakteri yang berbeda sehingga gen ini dapat digunakan
untuk mendeteksi keberadaan bakteri Vibrio sampai pada tingkat spesifik spesies,
antara lain spesies V. harveyi. Hemolisin merupakan jenis toksin yang terdistribusi
paling banyak pada bakteri Vibrio patogen. Berbagai jenis hemolisin yang
diproduksi oleh bakteri genus Vibrio mempunyai kemiripan satu sama lain, tetapi
tidak identik. Gen hemolisin yang dimiliki V. harveyi termasuk dalam kategori α
hemolisin yang melisis sel darah secara tidak sempurna. Hemolisin V. harveyi
dinamai Vhh yang termasuk dalam famili thermolable haemolysin/TLH.
4
Gambar 1 Hasil uji aktivitas hemolisin isolat V. harveyi, V. parahaemolyticus,
Salmonella sp., Edwardsiella tarda, Aeromonas hydrophila, dan
Streptococcus iniae pada medium agar darah. (A) P-275 = V. harveyi,
AH: A. hydrophila, SM = Salmonella sp., Si = S. iniae. (B) P-275 = V.
harveyi, Si = S. iniae, ES = E. tarda, AH = A. hydrophila. (C) Vp =
V. parahaemolyticus, Vh = V. harveyi. (D) Vh = V. harveyi, Vp = V.
parahaemolyticus (Kadriah 2013).
Kadriah (2013) menjelaskan bahwa spesifisitas dan sensitivitas gen
hemolisin lebih baik dibanding gen toxR dan gen gyrB sebagai penanda molekuler
dalam mendeteksi V. harveyi. Ketiga gen tersebut merupakan gen-gen yang aktif
dalam mekanisme patogenitas bakteri genus Vibrio (Pang et al. 2005; Conejero
dan Hedreyda 2004; Thaithongnum et al. 2006). Gen-gen yang bertanggung
jawab dalam mekanisme patogenitas V. harveyi diekspresikan setelah kondisi
kuorum bakteri ini tercapai (Madigan et al. 2012). Dengan kata lain, gen-gen
tersebut termasuk dalam gen-gen yang sifat ekspresinya inducible yang
terekspresi melalui pengaturan tertentu (Weaver 2012). Primer gen hemolisin hasil
disain Kadriah mampu mendeteksi V. harveyi sampai kepadatan 100 cfu/ml dan
konsentrasi DNA sebanyak 101 pg.
Conejero dan Hedreyda (2004) juga sudah pernah menggunakan gen
hemolisin V. harveyi sebagai penanda untuk deteksi vibrioisis. Primer tersebut
mempunyai spesifisitas yang tinggi karena hanya mendeteksi V. harveyi, namun
dalam penelitiannya tidak disajikan data yang menjelaskan sensitivitasnya.
Deteksi patogen V. harveyi melalui PCR juga dilakukan oleh Thaitongnum et al.
5
(2006) yang menghasilkan sensitivitas sebesar 1,5 x 101 cfu/ml. Primer hasil
disain Thongkao et al. (2013) hanya mampu mendeteksi V. harveyi sampai
kepadatan 1,1 x 102 cfu/ml.
Robertson et al. (1998a) pernah mendeteksi V. harveyi menggunakan
metode enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), namun tingkat
sensitivitasnya hanya sebesar 105 cfu/ml. Buchatip et al. (2010) mendeteksi V.
harveyi menggunakan imunosensor berbasis quartz crystal microbalance (QCM)
dimana tingkat sensitivitasnya hanya sampai kepadatan 103 cfu/ml, walaupun
spesifisitasnya tinggi.
2.2 Nested PCR
PCR merupakan teknik yang digunakan untuk mengamplifikasi sekuen asam
nukleat menggunakan polimerisasi berulang dari sekuen DNA. Teknik ini disusun
dan dipraktikkan oleh Kary B. Mullis pada pertengahan tahun 1985.
Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan amplifikasi sekuen DNA yang
diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas penggunaannya (Saiki et al.
1988). Dalam melakukan PCR, ekstrak DNA, enzim DNA polimerase, dan primer
direaksikan dalam larutan buffer yang sesuai. Reaksi PCR dilakukan dengan
bantuan alat thermocycle (Saiki et al. 1988).
Ekstrak DNA yang digunakan harus murni. Kemurnian ekstrak DNA
mempengaruhi hasil PCR dimana jika pada ekstrak DNA banyak pengotornya,
maka akan mengganggu proses PCR yang mengakibatkan kesalahan dalam
menganalisa. DNA dikatakan murni jika rasio OD260/OD280 berkisar antara 1,8
sampai 2,0 (Sambrook dan Russel 2001). Enzim DNA polimerase saat ini sudah
banyak diproduksi oleh perusahaan yang bergerak di bidang molekuler sehingga
lebih memudahkan pengguna dalam melakukan PCR (Apte dan Singh 2007).
Reaksi PCR merupakan sebuah siklus yang berlangsung dalam tiga tahapan.
Siklus diawali dengan tahap denaturasi pada suhu tinggi (90-95°C) yang
mengakibatkan untai ganda DNA mengalami pemisahan menjadi untai tunggal.
Tahap selanjutnya adalah penempelan primer (annealing) yang biasanya terjadi
pada suhu 45-55°C, primer akan melekat pada DNA cetakan sesuai dengan
komplementasi basa nukleotidanya. Tahap yang terakhir yaitu pemanjangan
nukleotida (elongation), pembentukan molekul DNA menggunakan molekulmolekul dNTP yang merupakan komponen dari cetakan pada suhu 70-75°C
(Kolmodin dan Birch. 2002).
Nested PCR adalah suatu teknik perbanyakan (replikasi) sampel DNA
menggunakan bantuan enzim DNA polymerase yang menggunakan 2 pasang
primer untuk mengamplifikasi fragmen. Pasangan primer yang pertama akan
mengamplifikasi sekuen yang cara kerjanya mirip dengan PCR pada umumnya.
Pasangan primer yang kedua biasanya disebut nested primer yang berikatan di
dalam sekuen produk PCR yang pertama untuk memungkinkan terjadinya
amplifikasi produk PCR yang kedua dimana hasilnya lebih pendek dari yang
pertama. Waktu yang diperlukan dalam reaksi nested PCR lebih lama daripada
PCR biasa karena pada nested PCR dilakukan 2 kali reaksi PCR sedangkan pada
PCR biasa hanya 1 kali reaksi PCR (Siebert et al. 1995).
6
Dengan menggunakan nested PCR, jika ada sekuen yang salah diamplifikasi
maka kemungkinan bagian tersebut diamplifikasi untuk kedua kalinya oleh primer
yang kedua sangat rendah. Dengan demikian, nested PCR sangat spesifik dalam
melakukan amplifikasi karena meminimalkan kesalahan amplifikasi gen dengan
menggunakan 2 pasang primer (Siebert et al. 1995). Lebih lanjut Nandagopal et
al. (2010) melaporkan bahwa nested PCR dengan target sekuen IS6110 pada
Mycobacterium tuberculosis mempunyai tingkat sensitivitas dan spesifisitas yang
lebih tinggi dibandingkan dengan PCR biasa untuk mendeteksi bakteri tersebut
dari fraksi leukosit sampel darah.
2.3 Disain Primer
Primer adalah oligonukleotida spesifik yang komplemen dengan daerah
yang ditentukan pada DNA target sebagai tempat dimulainya sintesis DNA baru
dengan PCR. Untuk mendapatkan daerah tertentu pada DNA target diperlukan
disain primer forward dan reverse dari daerah tersebut. Khusus untuk primer
reverse diperoleh dari sekuen antisensenya. Jadi nukleotida yang didapat dari
sekuen ujung 3 daerah DNA target tadi dicari komplemennya baru kemudian
dibalik (Glick dan Pasternak 2003).
Disain primer spesifik merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi
keberhasilan amplifikasi DNA dengan PCR. Keakuratan sekuen yang dijadikan
acuan dalam pembuatan primer PCR mampu meminimalisir kesalahan amplifikasi
yang berupa positif palsu maupun negatif palsu yang akan mengurangi sensitivitas
dan atau spesifisitas primer (Apte dan Singh 2007). Ukuran, komposisi, dan
homologi primer terhadap DNA target harus ditentukan dengan baik agar
diperoleh produk amplifikasi yang diinginkan saat melakukan PCR (Glick dan
Pasternak 2003).
Kolmodin dan Birch (2002) menyatakan bahwa primer yang digunakan bisa
berukuran antara 20 sampai 30 nukleotida. Sambrook dan Russel (2001)
menyatakan bahwa sebaiknya kandungan basa G+C adalah sekitar 50%. Apabila
basa G dan C terdapat dalam jumlah banyak pada ujung 3’ akan memungkinkan
terjadinya kesalahan, misalnya terbentuk struktur “jepit rambut” (hair pin). Dalam
penentuan primer, diusahakan agar tidak terjadi perpasangan sendiri (self priming)
dan dimer-duplex. Primer yang rendah kandungan basa G dan C nya masih
memungkinkan untuk dipilih asalkan primernya berukuran lebih panjang untuk
menghindari temperatur melting (Tm) yang terlalu rendah.
Sambrook dan Russel (2001) lebih jauh menerangkan bahwa T m
berhubungan dengan suhu annealing atau suhu dimana dimulainya
hibridisasi/penempelan primer dengan komplemennya pada template. Suhu
annealing biasanya lebih rendah 5 oC dari T m. Sesuai dengan peraturan Wallace,
temperatur melting (Tm) dapat ditentukan dengan rumus:
Tm = 4°C (G+C) + 2°C (A+T), dimana
G+C merupakan banyaknya basa G dan C dalam primer yang didisain, sedangkan
A+T merupakan banyaknya basa A dan T.
Penentuan homologi primer dapat dilakukan melalui penelusuran data
sekuen di Genebank seperti website NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), EBI
http://www.ebi.ac.uk, maupun DDBJ http://www.ddbj.nig.ac.jp (Claverie dan
7
Notredame 2003). Sekuen gen dari organisme target dijadikan sebagai acuan
dalam mendisain primer untuk memperoleh akurasi yang maksimal (Apte dan
Singh 2007).
Setelah sekuen gen target didapatkan, selanjutnya sekuen tersebut
dibandingkan dengan sekuen lainnya yang telah tersedia di Genebank.
Pembandingan ini dapat dilakukan melalui website NCBI. Pada website NCBI
dapat diakses program BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) yang
merupakan program untuk menganalisa kesamaan yang didisain dalam
mengekplorasi semua database sekuen yang diminta, baik berupa DNA maupun
protein (Claverie dan Notredame 2003). Setelah sekuen-sekuen hasil BLAST
didapatkan, selanjutnya dapat dianalisis penjajaran dengan metode clustalW
menggunakan software BIOEDIT (Hall 1999). Berdasarkan hasil clustalW dapat
terlihat daerah sekuen yang conserved maupun yang tidak conserved. Menurut
Apte dan Singh (2007), area conserved merupakan daerah spesifik gen dan area
yang tidak conserved merupakan daerah spesifik spesies. Dalam mendisain
primer, terlebih bagi pendeteksian patogen, spesifisitas maupun sensitivitas primer
merupakan hal yang sangat penting untuk meminimalisir hasil positif palsu dan
negatif palsu.
8
3 BAHAN DAN METODE
3.1 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi isolat V. harveyi
MR5339 dari koleksi Laboratorium Kesehatan Ikan (LKI) Program Studi
Budidaya Perairan Fakultas Perikanan IPB dan isolat V. harveyi 275, V.
parahaemolyticus, V. campbelli, Salmonella sp., Edwardsiella tarda, Aeromonas
hydrophila, dan Streptococcus iniae dari Laboratorium Karantina Ikan Makassar.
Semua isolat bakteri yang digunakan telah diverifikasi (Kadriah 2013). Isolatisolat V. harveyi dan V. parahaemolyticus diremajakan menggunakan medium Sea
Water Complete. Isolat V. campbelli, Salmonella sp., Edwardsiella tarda,
Aeromonas hydrophila, dan Streptococcus iniae masing-masing ditumbuhkan
dalam medium Luria Bertani.
Sebelum dilakukan disain primer nested PCR, sekuen gen hemolisin V.
harveyi sampel dideteksi menggunakan primer awal yang didisain dari gen
lengkap hemolisin V. harveyi strain VIB 391 (nomor akses: DQ640264) mulai
dari
MENDETEKSI Vibrio harveyi PADA UDANG PENAEID
MELALUI PCR
WAWAN ABDULLAH SETIAWAN
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Disain Nested Primer
Gen Hemolisin untuk Mendeteksi Vibrio harveyi pada Udang Penaeid Melalui
PCR adalah benar karya saya bersama dengan komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2014
Wawan Abdullah Setiawan
NRP P051100031
RINGKASAN
WAWAN ABDULLAH SETIAWAN. Disain Nested Primer Gen Hemolisin
untuk Mendeteksi Vibrio harveyi pada Udang Penaeid Melalui PCR. Dibimbing
oleh UTUT WIDYASTUTI dan MUNTI YUHANA.
Litopenaeus vannamei atau udang putih merupakan salah satu komoditas
unggulan dalam budidaya perikanan di Indonesia. Spesies penaeid ini memiliki
beberapa keunggulan dibanding spesies udang lainnya, antara lain
produktivitasnya yang tinggi dapat mencapai lebih dari 13.600 kg/ha, masa
panennya lebih cepat, serta lebih resisten terhadap penyakit. Meskipun lebih
resisten, penyakit bakterial vibrio berpendar yang disebabkan oleh Vibrio harveyi
masih menjadi kendala dalam usaha pembenihan udang putih di Indonesia.
Aplikasi teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) memungkinkan untuk
melakukan deteksi dini suatu penyakit yang disebabkan oleh bakteri, termasuk
vibriosis pada udang. Nested PCR merupakan variasi dari reaksi PCR biasa. Pada
nested PCR dilakukan 2 kali reaksi PCR dimana hasil dari PCR pertama menjadi
DNA cetakan bagi PCR kedua. Keuntungan dari nested PCR adalah
meminimalkan kesalahan amplifikasi gen dengan menggunakan 2 pasang primer
yang sekaligus juga dapat meningkatkan sensitivitas PCR. Gen hemolisin
diketahui mempunyai spesifisitas dan sensitivitas yang lebih baik dibanding gen
toxR dan gen gyrB sebagai penanda molekuler dalam mendeteksi V. harveyi.
Penelitian ini bertujuan untuk mendisain primer nested PCR menggunakan gen
hemolisin untuk mendeteksi Vibrio harveyi pada udang penaeid.
Sekuen gen hemolisin dari sampel V. harveyi MR5339 dan V. harveyi 275
dideteksi menggunakan primer yang didisain dari sekuen gen lengkap hemolisin
V. harveyi strain VIB 391 (nomor akses: DQ640264) mulai dari urutan ke-133
sampai urutan ke-756. Primer nested PCR didesain dari sekuen gen hemolisin
isolat V. harveyi MR 5339 yang berhasil teramplifikasi oleh primer awal. PCR I
nested PCR didesain untuk mengamplifikasi urutan ke-52 sampai urutan ke-405
dan PCR II nested PCR didesain untuk mengamplifikasi urutan ke-204 sampai
urutan ke-405. Hasil uji spesifisitas menunjukkan bahwa primer nested PCR hasil
disain hanya mampu mengamplifikasi isolat-isolat V. harveyi. Hasil PCR bagi
isolat-isolat bakteri V. parahaemolyticus, V. campbelli, Salmonella sp.,
Edwardsiella tarda, Aeromonas hydrophila, dan Streptococcus iniae yang juga
diujikan diketahui tidak terdapat hasil amplifikasi. Berdasarkan uji sensitivitas
diketahui bahwa primer nested PCR hasil disain mampu menDisain Primer V.
harveyi sampai kepadatan 100 cfu/ml atau konsentrasi DNA sampai 101 fg/µ l.
Melalui uji surveillance diketahui bahwa deteksi terendah adalah pada sampel hari
ke-3 ekstrak DNA udang mati suspect V. harveyi MR 5339 infeksi awal sebanyak
101 cfu/ml.
Kata kunci: V. harveyi, L. vannamei, hemolisin, DNA, nested PCR.
SUMMARY
WAWAN ABDULLAH SETIAWAN. Nested Primer Design of Haemolysin
Gene to Detect Vibrio harveyi in Penaeid Shrimp By PCR. Under direction of
UTUT WIDYASTUTI and MUNTI YUHANA.
Litopenaeus vannamei or white shrimp is one of the most important
aquaculture commodity in Indonesia. This penaeid species have several
advantages compared to other shrimp species, such as higher productivity that can
reach more than 13,600 kg/ha, growth faster and at beginning of introduction it
was believed more resistant against diseases. However the later it was known that
luminous Vibrio disease still becomes problem in white shrimp hatchery in
Indonesia.
Application of PCR (Polymerase Chain Reaction) could allow early
detection of disease caused by bacteria, including Vibriosis in shrimp. Nested
PCR is a modification of the regular PCR reaction, which use two successive runs
of PCR. The first PCR fragment product is used as template for the second PCR.
The advantage of nested PCR is to minimize error by using 2 pairs of primers
which also means increasing the PCR sensitivity. Haemolysin gene was known
has better specificity and sensitivity than toxR gene and gyrB gene as molecular
marker to detect V. harveyi. The aim of this study was to design nested PCR
primers using haemolysin gene to detect V. harveyi in penaeid shrimp.
Haemolysin gene sequences from V. harveyi MR5339 and V. harveyi 275
samples was detected by primer pair that designed from complete sequence of V.
harveyi VIB391 haemolysin gene (accesion number: DQ640264) from 133 to 756
sequence. Nested PCR primers was designed from sequencing result of V. harveyi
MR5339 haemolysin gene which have been successfully amplified by the initial
primers. Primer pairs I of nested PCR was designed to amplified the DNA
fragment from positions 52 to 405. Primer pairs II of nested PCR was designed to
amplified the positions 204 to 405. Specificity test showed that nested PCR
primers just only amplified V. harveyi isolates. PCR results for isolates V.
parahaemolyticus, V. campbelli, Salmonella sp., Edwardsiella tarda, Aeromonas
hydrophila, dan Streptococcus iniae was known has no amplification. Based on
sensitivity test was known that nested PCR primers designed was able to detect V.
harveyi cells density of 100 cfu/ml or at concentration of 101 fg/µ l extracted DNA.
From surveillance test, it was observed that lowest concentration was detected on
dead shrimp DNA extract suspect V. harveyi MR 5339 initial infected 101 cfu/ml.
.
Keywords: V. harveyi, L. vannamei, haemolysin, DNA, nested PCR.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau
menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
DISAIN NESTED PRIMER GEN HEMOLISIN UNTUK
MENDETEKSI Vibrio harveyi PADA UDANG PENAEID
MELALUI PCR
WAWAN ABDULLAH SETIAWAN
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Bioteknologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Ir Iman Rusmana, MSi
: Disain Nested Primer Gen Hemolisin Untuk Mendeteksi
Judul Tesis
Vibrio harveyi pada Udang Penaeid Melalui PCR
Nama
: Wawan Abdullah Setiawan
NRP
: P051100031
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Dr Ir Utut Widyastuti, MSi
Dr Munti Yuhana, SPi, MSi
Ketua
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Dekan Sekolah Pascasarjana
Bioteknologi
Prof Dr Ir Suharsono, DEA
Dr Ir Dahrul Syah, MSc Agr
Tanggal Ujian: 30 Mei 2014
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia
dan rahmat-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Oktober 2011 sampai
bulan April 2013 ini ialah disain nested primer gen hemolisin untuk mendeteksi
Vibrio harveyi pada udang penaeid melalui PCR.
Penulis sangat menyadari bahwa proses penyelesaian penelitian dan
penulisan tesis ini tidak akan dapat berjalan dengan lancar tanpa dukungan banyak
pihak. Karena itu, pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang
tak terhingga kepada Ibu Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.S. dan Ibu Dr. Munti Yuhana,
S.Pi, M.Si. sebagai pembimbing atas ilmu, cara berfikir, dana dan fasilitas
penelitian kepada penulis. Terimakasih penulis haturkan juga atas waktu,
kesabaran, serta semangat, bimbingan dan semua masukan yang sangat berarti
mulai dari penyusunan proposal, pelaksanaan penelitian hingga penulisan tesis ini
yang insya Alloh akan penulis jadikan acuan dalam melangkah ke depan. Penulis
juga menyampaikan terima kasih kepada Bapak Dr. Ir. Iman Rusmana, M.S.
selaku penguji atas saran dan perbaikan untuk kesempurnaan tesis ini.
Terimakasih dan rasa hormat juga penulis sampaikan kepada Bapak Prof. Dr. Ir.
Suharsono, DEA sebagai ketua program studi Bioteknologi yang telah banyak
memberikan ilmu, saran, dan masukan sejak awal perkuliahan, penelitian, hingga
selesainya tesis ini.
Terima kasih penulis sampaikan pula kepada Kementerian Pendidikan dan
Kebudayaan Nasional, kepada Bapak Bambang Irawan, Bapak Sumardi, dan Ibu
C. N. Ekowati, serta Bapak/Ibu dosen Jurusan Biologi Universitas Lampung
sebagai orang tua penulis atas arahan, kesempatan, dan penyediaan beasiswa
sehingga penulis dapat melanjutkan pendidikan pada program Magister di Insitut
Pertanian Bogor. Semoga penulis dapat mengaplikasikan ilmu yang penulis
dapatkan bagi sebesar-besarnya kemajuan di tanah kelahiran penulis, tempat
orangtua penulis mencari penghidupan pada khususnya dan khasanah ilmu
pengetahuan pada umumnya.
Terimakasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya kepada Ibu Dr. Ince
Ayu Khairana Kadriah atas semua kebaikannya sehingga penulis dapat
mengerjakan penelitian ini. Terima kasih dan penghargaan juga penulis
sampaikan kepada Mbak Peppy Elvavina selaku teknisi di Laboratorium BIORIN
atas semua masukan, kemudahan, serta kebaikannya selama penelitian. Kepada
Pak Keresyanto, Pak Mulya, Pak Yanto, A’ Saeri, Mbak Nia, Mbak Ara, Pak
Asep, Mbak Pipit, Pak Ranta, dan Mas Rahman, penulis ucapkan banyak
terimakasih atas semua kebaikan dan kebersamaannya kepada penulis. Bapak/Ibu
dan rekan-rekan Lab. BIORIN: Pak Muzuni, Bu Ratna, Pak Radite, Bu Cinta, Pak
Ulung, Pak Asri, Pak Ilyas, Bu Ifa, Mbak Fajri, Mbak Nurul, Mbak Nuril, Ahya,
serta adik-adik tingkat PS Bioteknologi, penulis menyampaikan terima kasih
untuk semua kebersamaan yang telah memberi semangat, masukan, dan
pengalaman yang tak terlupakan. Terima kasih karena sudah berbagi kebahagiaan,
ilmu, dan menjadi pendukung di saat-saat tersulit dalam penyelesaian tesis ini.
Teman-teman PS BTK angkatan 2010 : Mbak Goli, Ratna, Seagames, Mbak
Atun, Stephani, Mas Asep, Rani, Ista, Mbak Cynthia, Ricky, Nanda, Evan, Mas
Aji, Mas Swastika, Mas Fajarudin, Delih, Mbak Anky, Mbak Neng, dan Mbak
Ihat, penulis menyampaikan terima kasih untuk semua kebersamaan yang telah
memberi semangat dan pengalaman yang tak terlupakan.
Terima kasih dan penghargaan yang tinggi penulis haturkan kepada istri
tersayang Ulia Fajriah, keempat orangtua, dan adik-adik tersayang untuk semua
cinta, kasih sayang, dukungan dan perhatiannya selama ini. Terimakasih juga
kepada semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu yang telah
membantu dan memberikan dukungan moril maupun materiil sehingga penulis
mampu menyelesaikan program S2 di Institut Pertanian Bogor.
Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari sempurna karena
keterbatasan pengetahuan dan wawasan penulis dalam bidang ini. Oleh karena
itu, penulis mengharapkan saran, masukan, dan kritikan untuk perbaikan
penulisan selanjutnya. Bagaimanapun, penulis berharap semoga tesis ini
bermanfaat bagi kemajuan ilmu pengetahuan.
Bogor, Agustus 2014
Wawan Abdullah Setiawan
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR ISI ...................................................................................................... ix
DAFTAR GAMBAR ................................................................................ xi
DAFTAR TABEL ............................................................................................. xii
DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................... xiii
1 PENDAHULUAN ........................................................................................... 1
1.1 Latar Belakang ................................................................................... 1
1.2 Tujuan Penelitian ............................................................................... 2
2 TINJAUAN PUSTAKA ................................................................................... 3
2.1 Vibriosis pada Udang Putih ................................................................ 3
2.2 Nested PCR ........................................................................................ 5
2.3 Disain Primer ..................................................................................... 6
3 BAHAN DAN METODE
8
3.1 Bahan ................................................................................................. 8
3.2 Peremajaan Isolat Bakteri ................................................................... 8
3.3 Ekstraksi DNA Bakteri ....................................................................... 8
3.4 Analisa DNA Vibrio dengan Elektroforesis ........................................ 9
3.5 Uji Kemurnian dan Penghitungan Konsentrasi DNA ........................... 9
3.6 Desain Primer Awal Gen Hemolisin V. harveyi ................................ 10
3.7 PCR Menggunakan Primer Awal Gen Hemolisin V. harveyi ............ 10
3.8 Elusi Sekuen Gen Hemolisin V. harveyi dan Pengurutan Sekuen
Gen Hemolisin ................................................................................. 11
3.9 Disain Primer Nested PCR ............................................................... 11
3.10 Nested PCR ...................................................................................... 11
3.11 Uji Sensitivitas Primer Nested PCR .................................................. 12
3.12 Uji Spesifisitas Primer Nested PCR .................................................. 12
3.13 Surveillance Test .............................................................................. 12
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
14
4.1 PCR Menggunakan Primer Awal Gen Hemolisin V. harveyi MR5339
dan Pengurutan Sekuen Gen Hemolisin .............................................. 14
4.2 Disain Primer Nested PCR ................................................................. 16
4.3 Uji Sensitivitas Primer Nested PCR .................................................... 16
4.4 Uji Spesifisitas Primer Nested PCR .................................................... 19
4.5 Surveillance Test ................................................................................ 22
5 SIMPULAN DAN SARAN
25
5.1 Simpulan ............................................................................................ 25
5.2 Saran .................................................................................................. 25
DAFTAR PUSTAKA
26
LAMPIRAN
29
RIWAYAT HIDUP
34
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Hasil uji aktivitas hemolisin isolat V. harveyi, V. parahaemolyticus,
Salmonella sp., Edwardsiella tarda, Aeromonas hydrophila, dan
Streptococcus iniae pada medium agar darah ................................................... 4
2 Visualisasi hasil PCR dengan primer awal ...................................................... 15
3 Uji sensitivitas primer nested PCR menggunakan DNA V. harveyi
MR5339 ......................................................................................................... 17
4 Uji sensitivitas primer nested PCR menggunakan DNA V. harveyi 275 .......... 18
5 Hasil uji spesifisitas pada kepadatan bakteri 105 cfu/ml s.d 100 cfu/ml ........... 19
6 Hasil uji spesifisitas pada ekstrak DNA konsentrasi 102 ng/µ l s.d 101 fg/µ l..... 21
7 Visualisasi hasil PCR dengan nested PCR bagi surveillance test .................... 22
8 Visualisasi hasil PCR dengan nested PCR bagi surveillance test
sampel ke-7 ..................................................................................................... 23
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Komposisi pereaksi PCR ................................................................................ 10
2 Program awal pada alat thermocycler ............................................................. 10
3 Hasil penghitungan uji kemurnian dan konsentrasi DNA isolat bakteri ........... 14
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Similaritas sekuen gen hemolisin V harveyi MR5339 ...................................... 29
2 Similaritas sekuen gen hemolisin V harveyi 275 .............................................. 31
3 Daerah amplifikasi primer nested PCR hasil disain ......................................... 33
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Disain Nested Primer
Gen Hemolisin untuk Mendeteksi Vibrio harveyi pada Udang Penaeid Melalui
PCR adalah benar karya saya bersama dengan komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2014
Wawan Abdullah Setiawan
NRP P051100031
RINGKASAN
WAWAN ABDULLAH SETIAWAN. Disain Nested Primer Gen Hemolisin
untuk Mendeteksi Vibrio harveyi pada Udang Penaeid Melalui PCR. Dibimbing
oleh UTUT WIDYASTUTI dan MUNTI YUHANA.
Litopenaeus vannamei atau udang putih merupakan salah satu komoditas
unggulan dalam budidaya perikanan di Indonesia. Spesies penaeid ini memiliki
beberapa keunggulan dibanding spesies udang lainnya, antara lain
produktivitasnya yang tinggi dapat mencapai lebih dari 13.600 kg/ha, masa
panennya lebih cepat, serta lebih resisten terhadap penyakit. Meskipun lebih
resisten, penyakit bakterial vibrio berpendar yang disebabkan oleh Vibrio harveyi
masih menjadi kendala dalam usaha pembenihan udang putih di Indonesia.
Aplikasi teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) memungkinkan untuk
melakukan deteksi dini suatu penyakit yang disebabkan oleh bakteri, termasuk
vibriosis pada udang. Nested PCR merupakan variasi dari reaksi PCR biasa. Pada
nested PCR dilakukan 2 kali reaksi PCR dimana hasil dari PCR pertama menjadi
DNA cetakan bagi PCR kedua. Keuntungan dari nested PCR adalah
meminimalkan kesalahan amplifikasi gen dengan menggunakan 2 pasang primer
yang sekaligus juga dapat meningkatkan sensitivitas PCR. Gen hemolisin
diketahui mempunyai spesifisitas dan sensitivitas yang lebih baik dibanding gen
toxR dan gen gyrB sebagai penanda molekuler dalam mendeteksi V. harveyi.
Penelitian ini bertujuan untuk mendisain primer nested PCR menggunakan gen
hemolisin untuk mendeteksi Vibrio harveyi pada udang penaeid.
Sekuen gen hemolisin dari sampel V. harveyi MR5339 dan V. harveyi 275
dideteksi menggunakan primer yang didisain dari sekuen gen lengkap hemolisin
V. harveyi strain VIB 391 (nomor akses: DQ640264) mulai dari urutan ke-133
sampai urutan ke-756. Primer nested PCR didesain dari sekuen gen hemolisin
isolat V. harveyi MR 5339 yang berhasil teramplifikasi oleh primer awal. PCR I
nested PCR didesain untuk mengamplifikasi urutan ke-52 sampai urutan ke-405
dan PCR II nested PCR didesain untuk mengamplifikasi urutan ke-204 sampai
urutan ke-405. Hasil uji spesifisitas menunjukkan bahwa primer nested PCR hasil
disain hanya mampu mengamplifikasi isolat-isolat V. harveyi. Hasil PCR bagi
isolat-isolat bakteri V. parahaemolyticus, V. campbelli, Salmonella sp.,
Edwardsiella tarda, Aeromonas hydrophila, dan Streptococcus iniae yang juga
diujikan diketahui tidak terdapat hasil amplifikasi. Berdasarkan uji sensitivitas
diketahui bahwa primer nested PCR hasil disain mampu menDisain Primer V.
harveyi sampai kepadatan 100 cfu/ml atau konsentrasi DNA sampai 101 fg/µ l.
Melalui uji surveillance diketahui bahwa deteksi terendah adalah pada sampel hari
ke-3 ekstrak DNA udang mati suspect V. harveyi MR 5339 infeksi awal sebanyak
101 cfu/ml.
Kata kunci: V. harveyi, L. vannamei, hemolisin, DNA, nested PCR.
SUMMARY
WAWAN ABDULLAH SETIAWAN. Nested Primer Design of Haemolysin
Gene to Detect Vibrio harveyi in Penaeid Shrimp By PCR. Under direction of
UTUT WIDYASTUTI and MUNTI YUHANA.
Litopenaeus vannamei or white shrimp is one of the most important
aquaculture commodity in Indonesia. This penaeid species have several
advantages compared to other shrimp species, such as higher productivity that can
reach more than 13,600 kg/ha, growth faster and at beginning of introduction it
was believed more resistant against diseases. However the later it was known that
luminous Vibrio disease still becomes problem in white shrimp hatchery in
Indonesia.
Application of PCR (Polymerase Chain Reaction) could allow early
detection of disease caused by bacteria, including Vibriosis in shrimp. Nested
PCR is a modification of the regular PCR reaction, which use two successive runs
of PCR. The first PCR fragment product is used as template for the second PCR.
The advantage of nested PCR is to minimize error by using 2 pairs of primers
which also means increasing the PCR sensitivity. Haemolysin gene was known
has better specificity and sensitivity than toxR gene and gyrB gene as molecular
marker to detect V. harveyi. The aim of this study was to design nested PCR
primers using haemolysin gene to detect V. harveyi in penaeid shrimp.
Haemolysin gene sequences from V. harveyi MR5339 and V. harveyi 275
samples was detected by primer pair that designed from complete sequence of V.
harveyi VIB391 haemolysin gene (accesion number: DQ640264) from 133 to 756
sequence. Nested PCR primers was designed from sequencing result of V. harveyi
MR5339 haemolysin gene which have been successfully amplified by the initial
primers. Primer pairs I of nested PCR was designed to amplified the DNA
fragment from positions 52 to 405. Primer pairs II of nested PCR was designed to
amplified the positions 204 to 405. Specificity test showed that nested PCR
primers just only amplified V. harveyi isolates. PCR results for isolates V.
parahaemolyticus, V. campbelli, Salmonella sp., Edwardsiella tarda, Aeromonas
hydrophila, dan Streptococcus iniae was known has no amplification. Based on
sensitivity test was known that nested PCR primers designed was able to detect V.
harveyi cells density of 100 cfu/ml or at concentration of 101 fg/µ l extracted DNA.
From surveillance test, it was observed that lowest concentration was detected on
dead shrimp DNA extract suspect V. harveyi MR 5339 initial infected 101 cfu/ml.
.
Keywords: V. harveyi, L. vannamei, haemolysin, DNA, nested PCR.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau
menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
DISAIN NESTED PRIMER GEN HEMOLISIN UNTUK
MENDETEKSI Vibrio harveyi PADA UDANG PENAEID
MELALUI PCR
WAWAN ABDULLAH SETIAWAN
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Bioteknologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Ir Iman Rusmana, MSi
: Disain Nested Primer Gen Hemolisin Untuk Mendeteksi
Judul Tesis
Vibrio harveyi pada Udang Penaeid Melalui PCR
Nama
: Wawan Abdullah Setiawan
NRP
: P051100031
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Dr Ir Utut Widyastuti, MSi
Dr Munti Yuhana, SPi, MSi
Ketua
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Dekan Sekolah Pascasarjana
Bioteknologi
Prof Dr Ir Suharsono, DEA
Dr Ir Dahrul Syah, MSc Agr
Tanggal Ujian: 30 Mei 2014
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia
dan rahmat-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Oktober 2011 sampai
bulan April 2013 ini ialah disain nested primer gen hemolisin untuk mendeteksi
Vibrio harveyi pada udang penaeid melalui PCR.
Penulis sangat menyadari bahwa proses penyelesaian penelitian dan
penulisan tesis ini tidak akan dapat berjalan dengan lancar tanpa dukungan banyak
pihak. Karena itu, pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang
tak terhingga kepada Ibu Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.S. dan Ibu Dr. Munti Yuhana,
S.Pi, M.Si. sebagai pembimbing atas ilmu, cara berfikir, dana dan fasilitas
penelitian kepada penulis. Terimakasih penulis haturkan juga atas waktu,
kesabaran, serta semangat, bimbingan dan semua masukan yang sangat berarti
mulai dari penyusunan proposal, pelaksanaan penelitian hingga penulisan tesis ini
yang insya Alloh akan penulis jadikan acuan dalam melangkah ke depan. Penulis
juga menyampaikan terima kasih kepada Bapak Dr. Ir. Iman Rusmana, M.S.
selaku penguji atas saran dan perbaikan untuk kesempurnaan tesis ini.
Terimakasih dan rasa hormat juga penulis sampaikan kepada Bapak Prof. Dr. Ir.
Suharsono, DEA sebagai ketua program studi Bioteknologi yang telah banyak
memberikan ilmu, saran, dan masukan sejak awal perkuliahan, penelitian, hingga
selesainya tesis ini.
Terima kasih penulis sampaikan pula kepada Kementerian Pendidikan dan
Kebudayaan Nasional, kepada Bapak Bambang Irawan, Bapak Sumardi, dan Ibu
C. N. Ekowati, serta Bapak/Ibu dosen Jurusan Biologi Universitas Lampung
sebagai orang tua penulis atas arahan, kesempatan, dan penyediaan beasiswa
sehingga penulis dapat melanjutkan pendidikan pada program Magister di Insitut
Pertanian Bogor. Semoga penulis dapat mengaplikasikan ilmu yang penulis
dapatkan bagi sebesar-besarnya kemajuan di tanah kelahiran penulis, tempat
orangtua penulis mencari penghidupan pada khususnya dan khasanah ilmu
pengetahuan pada umumnya.
Terimakasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya kepada Ibu Dr. Ince
Ayu Khairana Kadriah atas semua kebaikannya sehingga penulis dapat
mengerjakan penelitian ini. Terima kasih dan penghargaan juga penulis
sampaikan kepada Mbak Peppy Elvavina selaku teknisi di Laboratorium BIORIN
atas semua masukan, kemudahan, serta kebaikannya selama penelitian. Kepada
Pak Keresyanto, Pak Mulya, Pak Yanto, A’ Saeri, Mbak Nia, Mbak Ara, Pak
Asep, Mbak Pipit, Pak Ranta, dan Mas Rahman, penulis ucapkan banyak
terimakasih atas semua kebaikan dan kebersamaannya kepada penulis. Bapak/Ibu
dan rekan-rekan Lab. BIORIN: Pak Muzuni, Bu Ratna, Pak Radite, Bu Cinta, Pak
Ulung, Pak Asri, Pak Ilyas, Bu Ifa, Mbak Fajri, Mbak Nurul, Mbak Nuril, Ahya,
serta adik-adik tingkat PS Bioteknologi, penulis menyampaikan terima kasih
untuk semua kebersamaan yang telah memberi semangat, masukan, dan
pengalaman yang tak terlupakan. Terima kasih karena sudah berbagi kebahagiaan,
ilmu, dan menjadi pendukung di saat-saat tersulit dalam penyelesaian tesis ini.
Teman-teman PS BTK angkatan 2010 : Mbak Goli, Ratna, Seagames, Mbak
Atun, Stephani, Mas Asep, Rani, Ista, Mbak Cynthia, Ricky, Nanda, Evan, Mas
Aji, Mas Swastika, Mas Fajarudin, Delih, Mbak Anky, Mbak Neng, dan Mbak
Ihat, penulis menyampaikan terima kasih untuk semua kebersamaan yang telah
memberi semangat dan pengalaman yang tak terlupakan.
Terima kasih dan penghargaan yang tinggi penulis haturkan kepada istri
tersayang Ulia Fajriah, keempat orangtua, dan adik-adik tersayang untuk semua
cinta, kasih sayang, dukungan dan perhatiannya selama ini. Terimakasih juga
kepada semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu yang telah
membantu dan memberikan dukungan moril maupun materiil sehingga penulis
mampu menyelesaikan program S2 di Institut Pertanian Bogor.
Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari sempurna karena
keterbatasan pengetahuan dan wawasan penulis dalam bidang ini. Oleh karena
itu, penulis mengharapkan saran, masukan, dan kritikan untuk perbaikan
penulisan selanjutnya. Bagaimanapun, penulis berharap semoga tesis ini
bermanfaat bagi kemajuan ilmu pengetahuan.
Bogor, Agustus 2014
Wawan Abdullah Setiawan
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR ISI ...................................................................................................... ix
DAFTAR GAMBAR ................................................................................ xi
DAFTAR TABEL ............................................................................................. xii
DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................... xiii
1 PENDAHULUAN ........................................................................................... 1
1.1 Latar Belakang ................................................................................... 1
1.2 Tujuan Penelitian ............................................................................... 2
2 TINJAUAN PUSTAKA ................................................................................... 3
2.1 Vibriosis pada Udang Putih ................................................................ 3
2.2 Nested PCR ........................................................................................ 5
2.3 Disain Primer ..................................................................................... 6
3 BAHAN DAN METODE
8
3.1 Bahan ................................................................................................. 8
3.2 Peremajaan Isolat Bakteri ................................................................... 8
3.3 Ekstraksi DNA Bakteri ....................................................................... 8
3.4 Analisa DNA Vibrio dengan Elektroforesis ........................................ 9
3.5 Uji Kemurnian dan Penghitungan Konsentrasi DNA ........................... 9
3.6 Desain Primer Awal Gen Hemolisin V. harveyi ................................ 10
3.7 PCR Menggunakan Primer Awal Gen Hemolisin V. harveyi ............ 10
3.8 Elusi Sekuen Gen Hemolisin V. harveyi dan Pengurutan Sekuen
Gen Hemolisin ................................................................................. 11
3.9 Disain Primer Nested PCR ............................................................... 11
3.10 Nested PCR ...................................................................................... 11
3.11 Uji Sensitivitas Primer Nested PCR .................................................. 12
3.12 Uji Spesifisitas Primer Nested PCR .................................................. 12
3.13 Surveillance Test .............................................................................. 12
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
14
4.1 PCR Menggunakan Primer Awal Gen Hemolisin V. harveyi MR5339
dan Pengurutan Sekuen Gen Hemolisin .............................................. 14
4.2 Disain Primer Nested PCR ................................................................. 16
4.3 Uji Sensitivitas Primer Nested PCR .................................................... 16
4.4 Uji Spesifisitas Primer Nested PCR .................................................... 19
4.5 Surveillance Test ................................................................................ 22
5 SIMPULAN DAN SARAN
25
5.1 Simpulan ............................................................................................ 25
5.2 Saran .................................................................................................. 25
DAFTAR PUSTAKA
26
LAMPIRAN
29
RIWAYAT HIDUP
34
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Hasil uji aktivitas hemolisin isolat V. harveyi, V. parahaemolyticus,
Salmonella sp., Edwardsiella tarda, Aeromonas hydrophila, dan
Streptococcus iniae pada medium agar darah ................................................... 4
2 Visualisasi hasil PCR dengan primer awal ...................................................... 15
3 Uji sensitivitas primer nested PCR menggunakan DNA V. harveyi
MR5339 ......................................................................................................... 17
4 Uji sensitivitas primer nested PCR menggunakan DNA V. harveyi 275 .......... 18
5 Hasil uji spesifisitas pada kepadatan bakteri 105 cfu/ml s.d 100 cfu/ml ........... 19
6 Hasil uji spesifisitas pada ekstrak DNA konsentrasi 102 ng/µ l s.d 101 fg/µ l..... 21
7 Visualisasi hasil PCR dengan nested PCR bagi surveillance test .................... 22
8 Visualisasi hasil PCR dengan nested PCR bagi surveillance test
sampel ke-7 ..................................................................................................... 23
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Komposisi pereaksi PCR ................................................................................ 10
2 Program awal pada alat thermocycler ............................................................. 10
3 Hasil penghitungan uji kemurnian dan konsentrasi DNA isolat bakteri ........... 14
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Similaritas sekuen gen hemolisin V harveyi MR5339 ...................................... 29
2 Similaritas sekuen gen hemolisin V harveyi 275 .............................................. 31
3 Daerah amplifikasi primer nested PCR hasil disain ......................................... 33
1
1 PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Litopenaeus vannamei atau udang putih merupakan salah satu komoditas
unggulan dalam budidaya perikanan di Indonesia dimana produksinya pada tahun
2014 ditargetkan sebesar 511 ribu ton (KKP 2010). Spesies ini memiliki beberapa
keunggulan dibanding spesies udang lainnya, antara lain produktivitasnya yang
tinggi dapat mencapai lebih dari 13.600 kg/ha, masa panennya lebih cepat, serta
lebih resisten terhadap penyakit (Boyd dan Clay 2002). Meskipun lebih resisten,
penyakit bakterial Vibrio berpendar masih menjadi kendala dalam usaha
pembenihan udang putih di Indonesia (Felix et al. 2011). Spesies bakteri Vibrio
yang sering menyebabkan kematian massal terutama pada larva udang di
Indonesia adalah Vibrio harveyi (Teo et al. 2000). Serangan bakteri Vibrio yang
mengakibatkan kematian udang dalam waktu yang cepat dan dalam jumlah yang
besar. Bakteri ini merupakan jenis patogen yang menginfeksi dan menyebabkan
penyakit pada saat kondisi udang lemah dan faktor lingkungan yang ekstrim
(Austin dan Zhang 2006).
Lightner (1996) menyatakan bahwa pemeriksaan Vibriosis pada udang saat
ini masih dilakukan secara konvensional yaitu dengan melihat gejala klinis pada
tubuh udang, mengisolasi bakteri penyebab penyakit, melakukan uji fisiologi dan
biokimia, yang kesemuanya membutuhkan waktu hingga beberapa hari. Jika hasil
pemeriksaan tersebut sudah positif menunjukkan Vibriosis, inipun sudah
terlambat karena biasanya populasi Vibrio sudah dalam kepadatan yang tinggi,
lebih dari 109 cfu/ml sehingga lebih sukar dikendalikan.
Aplikasi teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) memungkinkan untuk
melakukan deteksi dini suatu penyakit yang disebabkan oleh bakteri, termasuk
Vibriosis pada udang. PCR merupakan teknik yang digunakan untuk
mengamplifikasi sekuen asam nukleat menggunakan polimerisasi berulang dari
sekuen DNA (Kolmodin dan Birch. 2002). Nested PCR merupakan variasi dari
reaksi PCR biasa. Pada nested PCR, dilakukan 2 kali reaksi PCR dimana hasil
dari PCR pertama menjadi DNA cetakan bagi PCR kedua. Keuntungan dari
nested PCR adalah meminimalkan kesalahan amplifikasi gen dengan
menggunakan 2 pasang primer yang sekaligus juga dapat meningkatkan
sensitivitas PCR (Siebert et al. 1995).
Hemolisin merupakan eksotoksin yang diproduksi oleh bakteri Vibrio
berpendar yang menyerang membran sel darah inang dan menyebabkan sel darah
pecah (Zhang dan Austin 2005). Pada sebagian besar kasus, bukti epidemiologi
dan eksperimental menunjukkan bahwa hemolisin terlibat dalam patogenesis
penyakit Vibriosis (Shinoda 1999). Hemolisin disandikan oleh gen hemolisin
dimana urutan gennya telah banyak diketahui dan dapat diakses di GeneBank.
Kadriah et al. (2013) menjelaskan bahwa gen hemolisin mempunyai spesifisitas
dan sensitivitas yang lebih baik dibanding gen toxR dan gen gyrB sebagai penanda
molekuler dalam mendeteksi V. harveyi. Primer yang didisain dari penelitian
tersebut menunjukkan sensitivitas untuk mendeteksi V. harveyi pada kepadatan
100 cfu/ml dan konsentrasi DNA sebanyak 101 pg.
2
Sambrook dan Russel (2001) menerangkan bahwa teknik PCR
memungkinkan untuk mengamplifikasi 1 kopi cetakan DNA. Oleh karena itu,
dengan menggunakan teknik nested PCR diharapkan dapat ditemukan primer
nested PCR yang lebih spesifik dan sensitif bagi gen penyandi hemolisin V.
harveyi sehingga keberadaan bakteri Vibrio berpendar patogenik strain lokal pada
budidaya udang putih dapat dideteksi lebih dini.
1.2 Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mendisain nested primer gen hemolisin untuk
mendeteksi bakteri V. harveyi patogenik pada udang penaeid melalui PCR.
3
2 TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Vibriosis pada Udang Putih
Udang putih dengan nama ilmiah Litopennaeus vannamei merupakan salah
satu komoditas unggulan dalam budidaya perikanan di Indonesia. Selama periode
tahun 2003 s.d 2007 ekspor udang cenderung meningkat, yaitu dari 137.636 ton
menjadi 160.797 ton (Poernomo 2008). Produksi udang nasional mengalami
kenaikan sebesar 2,6% dari 338.060 ton tahun 2009 menjadi 352.600 ton pada
tahun 2010. Pemerintah melalui Kementrian Kelautan dan Perikanan menargetkan
produksi udang putih pada tahun 2014 sebesar 511 ribu ton (KKP 2010).
Udang putih memiliki beberapa keunggulan dibanding beberapa spesies
udang lainnya, diantaranya masa panennya yang lebih cepat, produktifitasnya
yang tinggi yang dapat mencapai lebih dari 13.600 kg/ha, dan lebih resisten
terhadap penyakit (Boyd dan Clay 2002). Walaupun udang putih lebih resisten
terhadap penyakit, penyakit bakterial Vibrio berpendar masih menjadi kendala
dalam usaha pembenihan udang putih di Indonesia (Felix et al. 2011).
Penyakit berpendar pada larva udang merupakan penyakit yang berbahaya
karena dapat menyebabkan kematian massal. Bakteri Vibrio berpendar sering
dilaporkan sebagai penyebab kematian massal pada berbagai ikan laut dan udang
di berbagai belahan dunia (Austin dan Zhang 2006). Bakteri Vibrio berpendar
juga dilaporkan sebagai agen penyebab utama penyakit Vibriosis pada udang
budidaya di wilayah Asia Tenggara yang menyebabkan kerugian yang besar
(Lavilla-Pitogo et al. 1998; Liu et al. 1996). Vibriosis telah menyebabkan
mortalitas pada berbagai stadia larva, pasca larva, juvenil, dan dewasa (Lightner
1996). Spesies bakteri Vibrio yang sering menyebabkan kematian massal terutama
pada larva udang di Indonesia adalah Vibrio harveyi (Teo et al. 2000).
Pada sebagian besar kasus, bukti epidemiologi dan eksperimental
menunjukkan bahwa hemolisin terlibat dalam patogenesis penyakit Vibriosis
(Shinoda 1999). Hemolisin merupakan enzim yang bertanggung jawab terhadap
kerusakan membran sel darah (hemolisis) dan dilaporkan bahwa gen hemolisin
terdapat pada beberapa genus Vibrio termasuk V. harveyi (Zhang dan Austin
2005). Kadriah (2013) menerangkan bahwa selain V. harveyi, bakteri V.
parahaemolyticus, Salmonella sp., Edwardsiella tarda, Aeromonas hydrophila,
dan Streptococcus iniae diketahui mempunyai aktivitas α hemolisin setelah
ditumbuhkan di medium agar darah. Hasil uji aktivitas hemolisin disajikan pada
gambar 1.
Lebih lanjut menurut Zhang dan Austin (2005), sekuen gen hemolisin
bervariasi pada spesies bakteri yang berbeda sehingga gen ini dapat digunakan
untuk mendeteksi keberadaan bakteri Vibrio sampai pada tingkat spesifik spesies,
antara lain spesies V. harveyi. Hemolisin merupakan jenis toksin yang terdistribusi
paling banyak pada bakteri Vibrio patogen. Berbagai jenis hemolisin yang
diproduksi oleh bakteri genus Vibrio mempunyai kemiripan satu sama lain, tetapi
tidak identik. Gen hemolisin yang dimiliki V. harveyi termasuk dalam kategori α
hemolisin yang melisis sel darah secara tidak sempurna. Hemolisin V. harveyi
dinamai Vhh yang termasuk dalam famili thermolable haemolysin/TLH.
4
Gambar 1 Hasil uji aktivitas hemolisin isolat V. harveyi, V. parahaemolyticus,
Salmonella sp., Edwardsiella tarda, Aeromonas hydrophila, dan
Streptococcus iniae pada medium agar darah. (A) P-275 = V. harveyi,
AH: A. hydrophila, SM = Salmonella sp., Si = S. iniae. (B) P-275 = V.
harveyi, Si = S. iniae, ES = E. tarda, AH = A. hydrophila. (C) Vp =
V. parahaemolyticus, Vh = V. harveyi. (D) Vh = V. harveyi, Vp = V.
parahaemolyticus (Kadriah 2013).
Kadriah (2013) menjelaskan bahwa spesifisitas dan sensitivitas gen
hemolisin lebih baik dibanding gen toxR dan gen gyrB sebagai penanda molekuler
dalam mendeteksi V. harveyi. Ketiga gen tersebut merupakan gen-gen yang aktif
dalam mekanisme patogenitas bakteri genus Vibrio (Pang et al. 2005; Conejero
dan Hedreyda 2004; Thaithongnum et al. 2006). Gen-gen yang bertanggung
jawab dalam mekanisme patogenitas V. harveyi diekspresikan setelah kondisi
kuorum bakteri ini tercapai (Madigan et al. 2012). Dengan kata lain, gen-gen
tersebut termasuk dalam gen-gen yang sifat ekspresinya inducible yang
terekspresi melalui pengaturan tertentu (Weaver 2012). Primer gen hemolisin hasil
disain Kadriah mampu mendeteksi V. harveyi sampai kepadatan 100 cfu/ml dan
konsentrasi DNA sebanyak 101 pg.
Conejero dan Hedreyda (2004) juga sudah pernah menggunakan gen
hemolisin V. harveyi sebagai penanda untuk deteksi vibrioisis. Primer tersebut
mempunyai spesifisitas yang tinggi karena hanya mendeteksi V. harveyi, namun
dalam penelitiannya tidak disajikan data yang menjelaskan sensitivitasnya.
Deteksi patogen V. harveyi melalui PCR juga dilakukan oleh Thaitongnum et al.
5
(2006) yang menghasilkan sensitivitas sebesar 1,5 x 101 cfu/ml. Primer hasil
disain Thongkao et al. (2013) hanya mampu mendeteksi V. harveyi sampai
kepadatan 1,1 x 102 cfu/ml.
Robertson et al. (1998a) pernah mendeteksi V. harveyi menggunakan
metode enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), namun tingkat
sensitivitasnya hanya sebesar 105 cfu/ml. Buchatip et al. (2010) mendeteksi V.
harveyi menggunakan imunosensor berbasis quartz crystal microbalance (QCM)
dimana tingkat sensitivitasnya hanya sampai kepadatan 103 cfu/ml, walaupun
spesifisitasnya tinggi.
2.2 Nested PCR
PCR merupakan teknik yang digunakan untuk mengamplifikasi sekuen asam
nukleat menggunakan polimerisasi berulang dari sekuen DNA. Teknik ini disusun
dan dipraktikkan oleh Kary B. Mullis pada pertengahan tahun 1985.
Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan amplifikasi sekuen DNA yang
diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas penggunaannya (Saiki et al.
1988). Dalam melakukan PCR, ekstrak DNA, enzim DNA polimerase, dan primer
direaksikan dalam larutan buffer yang sesuai. Reaksi PCR dilakukan dengan
bantuan alat thermocycle (Saiki et al. 1988).
Ekstrak DNA yang digunakan harus murni. Kemurnian ekstrak DNA
mempengaruhi hasil PCR dimana jika pada ekstrak DNA banyak pengotornya,
maka akan mengganggu proses PCR yang mengakibatkan kesalahan dalam
menganalisa. DNA dikatakan murni jika rasio OD260/OD280 berkisar antara 1,8
sampai 2,0 (Sambrook dan Russel 2001). Enzim DNA polimerase saat ini sudah
banyak diproduksi oleh perusahaan yang bergerak di bidang molekuler sehingga
lebih memudahkan pengguna dalam melakukan PCR (Apte dan Singh 2007).
Reaksi PCR merupakan sebuah siklus yang berlangsung dalam tiga tahapan.
Siklus diawali dengan tahap denaturasi pada suhu tinggi (90-95°C) yang
mengakibatkan untai ganda DNA mengalami pemisahan menjadi untai tunggal.
Tahap selanjutnya adalah penempelan primer (annealing) yang biasanya terjadi
pada suhu 45-55°C, primer akan melekat pada DNA cetakan sesuai dengan
komplementasi basa nukleotidanya. Tahap yang terakhir yaitu pemanjangan
nukleotida (elongation), pembentukan molekul DNA menggunakan molekulmolekul dNTP yang merupakan komponen dari cetakan pada suhu 70-75°C
(Kolmodin dan Birch. 2002).
Nested PCR adalah suatu teknik perbanyakan (replikasi) sampel DNA
menggunakan bantuan enzim DNA polymerase yang menggunakan 2 pasang
primer untuk mengamplifikasi fragmen. Pasangan primer yang pertama akan
mengamplifikasi sekuen yang cara kerjanya mirip dengan PCR pada umumnya.
Pasangan primer yang kedua biasanya disebut nested primer yang berikatan di
dalam sekuen produk PCR yang pertama untuk memungkinkan terjadinya
amplifikasi produk PCR yang kedua dimana hasilnya lebih pendek dari yang
pertama. Waktu yang diperlukan dalam reaksi nested PCR lebih lama daripada
PCR biasa karena pada nested PCR dilakukan 2 kali reaksi PCR sedangkan pada
PCR biasa hanya 1 kali reaksi PCR (Siebert et al. 1995).
6
Dengan menggunakan nested PCR, jika ada sekuen yang salah diamplifikasi
maka kemungkinan bagian tersebut diamplifikasi untuk kedua kalinya oleh primer
yang kedua sangat rendah. Dengan demikian, nested PCR sangat spesifik dalam
melakukan amplifikasi karena meminimalkan kesalahan amplifikasi gen dengan
menggunakan 2 pasang primer (Siebert et al. 1995). Lebih lanjut Nandagopal et
al. (2010) melaporkan bahwa nested PCR dengan target sekuen IS6110 pada
Mycobacterium tuberculosis mempunyai tingkat sensitivitas dan spesifisitas yang
lebih tinggi dibandingkan dengan PCR biasa untuk mendeteksi bakteri tersebut
dari fraksi leukosit sampel darah.
2.3 Disain Primer
Primer adalah oligonukleotida spesifik yang komplemen dengan daerah
yang ditentukan pada DNA target sebagai tempat dimulainya sintesis DNA baru
dengan PCR. Untuk mendapatkan daerah tertentu pada DNA target diperlukan
disain primer forward dan reverse dari daerah tersebut. Khusus untuk primer
reverse diperoleh dari sekuen antisensenya. Jadi nukleotida yang didapat dari
sekuen ujung 3 daerah DNA target tadi dicari komplemennya baru kemudian
dibalik (Glick dan Pasternak 2003).
Disain primer spesifik merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi
keberhasilan amplifikasi DNA dengan PCR. Keakuratan sekuen yang dijadikan
acuan dalam pembuatan primer PCR mampu meminimalisir kesalahan amplifikasi
yang berupa positif palsu maupun negatif palsu yang akan mengurangi sensitivitas
dan atau spesifisitas primer (Apte dan Singh 2007). Ukuran, komposisi, dan
homologi primer terhadap DNA target harus ditentukan dengan baik agar
diperoleh produk amplifikasi yang diinginkan saat melakukan PCR (Glick dan
Pasternak 2003).
Kolmodin dan Birch (2002) menyatakan bahwa primer yang digunakan bisa
berukuran antara 20 sampai 30 nukleotida. Sambrook dan Russel (2001)
menyatakan bahwa sebaiknya kandungan basa G+C adalah sekitar 50%. Apabila
basa G dan C terdapat dalam jumlah banyak pada ujung 3’ akan memungkinkan
terjadinya kesalahan, misalnya terbentuk struktur “jepit rambut” (hair pin). Dalam
penentuan primer, diusahakan agar tidak terjadi perpasangan sendiri (self priming)
dan dimer-duplex. Primer yang rendah kandungan basa G dan C nya masih
memungkinkan untuk dipilih asalkan primernya berukuran lebih panjang untuk
menghindari temperatur melting (Tm) yang terlalu rendah.
Sambrook dan Russel (2001) lebih jauh menerangkan bahwa T m
berhubungan dengan suhu annealing atau suhu dimana dimulainya
hibridisasi/penempelan primer dengan komplemennya pada template. Suhu
annealing biasanya lebih rendah 5 oC dari T m. Sesuai dengan peraturan Wallace,
temperatur melting (Tm) dapat ditentukan dengan rumus:
Tm = 4°C (G+C) + 2°C (A+T), dimana
G+C merupakan banyaknya basa G dan C dalam primer yang didisain, sedangkan
A+T merupakan banyaknya basa A dan T.
Penentuan homologi primer dapat dilakukan melalui penelusuran data
sekuen di Genebank seperti website NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), EBI
http://www.ebi.ac.uk, maupun DDBJ http://www.ddbj.nig.ac.jp (Claverie dan
7
Notredame 2003). Sekuen gen dari organisme target dijadikan sebagai acuan
dalam mendisain primer untuk memperoleh akurasi yang maksimal (Apte dan
Singh 2007).
Setelah sekuen gen target didapatkan, selanjutnya sekuen tersebut
dibandingkan dengan sekuen lainnya yang telah tersedia di Genebank.
Pembandingan ini dapat dilakukan melalui website NCBI. Pada website NCBI
dapat diakses program BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) yang
merupakan program untuk menganalisa kesamaan yang didisain dalam
mengekplorasi semua database sekuen yang diminta, baik berupa DNA maupun
protein (Claverie dan Notredame 2003). Setelah sekuen-sekuen hasil BLAST
didapatkan, selanjutnya dapat dianalisis penjajaran dengan metode clustalW
menggunakan software BIOEDIT (Hall 1999). Berdasarkan hasil clustalW dapat
terlihat daerah sekuen yang conserved maupun yang tidak conserved. Menurut
Apte dan Singh (2007), area conserved merupakan daerah spesifik gen dan area
yang tidak conserved merupakan daerah spesifik spesies. Dalam mendisain
primer, terlebih bagi pendeteksian patogen, spesifisitas maupun sensitivitas primer
merupakan hal yang sangat penting untuk meminimalisir hasil positif palsu dan
negatif palsu.
8
3 BAHAN DAN METODE
3.1 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi isolat V. harveyi
MR5339 dari koleksi Laboratorium Kesehatan Ikan (LKI) Program Studi
Budidaya Perairan Fakultas Perikanan IPB dan isolat V. harveyi 275, V.
parahaemolyticus, V. campbelli, Salmonella sp., Edwardsiella tarda, Aeromonas
hydrophila, dan Streptococcus iniae dari Laboratorium Karantina Ikan Makassar.
Semua isolat bakteri yang digunakan telah diverifikasi (Kadriah 2013). Isolatisolat V. harveyi dan V. parahaemolyticus diremajakan menggunakan medium Sea
Water Complete. Isolat V. campbelli, Salmonella sp., Edwardsiella tarda,
Aeromonas hydrophila, dan Streptococcus iniae masing-masing ditumbuhkan
dalam medium Luria Bertani.
Sebelum dilakukan disain primer nested PCR, sekuen gen hemolisin V.
harveyi sampel dideteksi menggunakan primer awal yang didisain dari gen
lengkap hemolisin V. harveyi strain VIB 391 (nomor akses: DQ640264) mulai
dari