UJI ANTIINFLAMASI EKSTRAK ETANOL DAUN SALAM (Syzygium polyanthum wight) DENGAN METODE IN VIVO DAN IN SILICO PADA SENYAWA KUERSITRIN

xiv

INTISARI

Radang atau inflamasi adalah respon perlindungan setempat yang ditimbulkan oleh cedera atau kerusakan pada jaringan,penghambatan terhadap COX-2 menyebabkan reaksi tersebut tidak terjadi. Pengobatan inflamasi yang umumnya menggunakan obat sintetik memiliki kekurangan yaitu harga yang relatif mahal dan efek samping yang cukup banyak.Dalam perkembangannya di bidang medis daun salam dapat dimanfaatkan sebagai ramuan obat tradisional, Kandungan kimia daun salam diantaranya yaitu flavonoid yang dapat digunakan sebagai antiinflamasi. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui skor penambatan senyawa penanda yang ada dalam daun salam (Syzygium polyanthum wight) yaitu kuersitrin sebagai antiinflamasi melalui uji in silico serta uji in vivo untuk mengetahui kesesuaian antara hasil uji in silico dengan hasil uji in vivo pada tikus terinduksi karagenan.

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorissecara in silico disertai pengujian secara in vivo. Metode in silico pada penelitian ini menggunakan ligan uji kuersitrin dari daun salam (syzygium polyanthum wight), S58 native ligand 6COX serta ligan pembanding natrium diklofenak menggunakan metode molecular docking Autodock Vina, sedangkan metode in vivo menggunakan tikus jantan galur wistar sebagai hewan uji. Sebanyak 15 ekor tikus, dibagi dalam 5 kelompok. Kelompok I: tanpa perlakuan. Kelompok II: senyawa pembanding Natrium Diklofenak dosis4,5 mg/Kg BB. Kelompok III, IV, V: ekstrak daun salam dengan dosis 33,3; 100 dan 300 mg/kgBB. Analisis data menggunakan uji One-Way ANOVA dan LSD test.

Hasil penelitian in silico menunjukkan bahwa ligan yang paling stabil terhadap protein 6COX adalah kuersitrin dari Syzygium polyanthum wight dengan nilai energi ikatan yaitu -8.6 kkl/mol. Secara in vivo hasil dari pemberian ekstrak daun salam dosis 300mg/KgBB memiliki persen daya antiinflamasi yaitu sebesar 26,05% sedangkan persen daya antiinflamasi kelompok kontrol positif memiliki persen daya antiinflamasi yaitu sebesar 36,82%sehingga dapat disimpulkan daya antiinflamasi yang dihasilkan dari aktivitas kuersitrin sebagai penanda dalam Syzygium polyanthum wight berpotensi sebagai agen antiinflamasi pada tikus jantan galur wistar.

Kata Kunci: Antiinflamasi, In Silico, In Vivo, Kuersitrin, Syzygium polyanthum wight.

xv

medication of inflammation use synthetic drugs but the cost are relatively expensive and has more side effect. Development of medical research, salam leaves can be used as traditional medicine. One of the most chemical contains in it, is flavonoid which is can be used as antiinflammatory. The aim of this research are to find out binding score of chemical marker in salam leaves or Syzygium polyanthum wight (quercitrin) as antiinflammatory through in silico and in vivo to find out conformity between in silico and in vivo in paw Rats induced carragenan. This research used experimental laboratories method (in vivo) with in silico method. In silico method used quercitrin ligand from salam leaves (Syzygium polyanthum wight), S58 as native ligand 6COX and ligand of natrium diclofenac as compared ligan through molecular docking Autodock Vina. In vivo method used Wistar male rats. 15 Rats, divided by 5 groups. Group I: without experiment. Group II: Natrium diclofenac as compared compound. Group III, IV, V: extract Syzygium polyanthum wight leaves with different doses 33,3; 100 and 300 mg/KgBB. Data analysis used One-Way ANOVA and LSD test.

The result from this research are in silico method showed quercitrin is most stable ligand to 6COX than native ligand and compared ligand with binding score -8,6 kkl/mol. In vivo method showed that extract salam leaves 300 mg/KgBB had antiinflamatory strengh is 26,05% whereas antiinflamatory strengh of positive control is 36,82% with the result that it can be conclude that antiinflammatory strengh from activity quercitrin has potential to be antiinflammatory agent in male wistar rats induced carragenan.

Keywords: Antiiflammatory, In Silico, In Vivo, Quercitrin, Syzygium polyanthum wight.

1 BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Radang atau inflamasi adalah respon perlindungan setempat yang ditimbulkan oleh cedera atau kerusakan pada jaringan yang berfungsi untuk mengurangi, menghancurkan atau melokalisasi agen pencedera maupun jaringan yang tercedera (Dorland, 2002). Ekspresi COX-2 (cyclooksigenase-2) meningkat selama proses peradangan akut sebagai respon terhadap rangsangan sitokin dan mitogenik, peningkatan ini terjadi baik di medula spinalis maupun korteks sehingga dapat meningkatkan sensitivitas terhadap nyeri. Ekspresi COX-2 meningkat melalui mekanisme sentral yang memodulasi nyeri hiperalgesia sekunder, maupun melalui mekanisme perifer yang memodulasi nyeri hiperalgesia primer. Penghambatan terhadap COX-2 menyebabkan reaksi tersebut tidak terjadi (Schug, 2005).

Obat golongan AINS (antiinflamasi non steroid) dan analgesik antipiretik adalah salah satu golongan obat yang banyak digunakan tanpa resep dokter. Mekanisme kerja AINS sendiri yaitu menghambat enzim cyclooxygenase (COX) sehingga konversi asam arakhidonat menjadi PGG2 terganggu.Pengobatan inflamasi umumnya menggunakan obat sintetik, namun pengobatan dengan obat sintetik memiliki kekurangan yaitu harga yang relatif mahal dan efek samping yang cukup banyak. Salah

satu cara untuk mengatasi hal tersebut adalah dengan alternatif herba yaitu memanfaatkan tanaman yang berkhasiat obat.

Indonesia dikenal sebagai pusat keanekaragaman hayati yang terbesar di dunia. Sampurno (2007) dalam Drianti (2012) menyatakan bahwa terdapat sekitar 70.000 jenis tumbuhan dan 7.000 diantaranya memiliki potensi sebagai obat. Menurut Badan POM RI lebih dari 1.800 jenis tanaman telah diidentifikasi, namun pemanfaatannya belum optimal. Jumlah tanaman obat yang dimanfaatkan oleh masyarakat yaitu sekitar 1.000 sampai 1.200 jenis dan yang rutin digunakan oleh industri obat tradisional baru sekitar 300 jenis salah satunya daun salam (Syzygium polyanthum wight).

Santosaningsih et al (2011) dalam Sudirman 2014 menyebutkan bahwa daun salam (Syzygium polyanthum wight) adalah salah satu jenis rempah yang sudah tidak asing lagi bagi masyarakat indonesia, daun salam banyak dimanfaatkan sebagai bahan pelengkap dan penyedap alami pada masakan namun selain manfaatnya sebagai penyedap, daun salam juga dapat digunakan sebagai bahan obat untuk beberapa penyakit.

Dalam perkembangannya di bidang medis daun salam dapat dimanfaatkan sebagai ramuan obat tradisional. Daun salam(Syzygium polyanthum wight) memiliki khasiat yang dapat digunakan sebagai obat untuk terapi hipertensi, diabetes melitus, asam urat, diare, maag, serta sakit gigi (Sudirman, 2014). Kandungan kimia daun salam diantaranya

3

yaitu flavonoid, dari berbagai jurnal diketahui bahwa flavonoid dapat digunakan sebagai antiinflamasi (Agustina et al, 2015).

Flavonoid diketahui memiliki beberapa golongan derivat diantaranya yaitu golongan flavonol, flavon, flavanon, flavanol, katekin, isoflavon dan antocyanin. Kuersetin merupakan contoh dari flavonoid golongan flavonol. Tipe kuersetin yang ditemukan di dalam tanamancontohnya yaitu seperti rutin dan thuljin. Rutin diketahui disebut sebagai quersetin-3-rutinoside serta thuljin diketahui disebut sebagai kuersitrin (Lakhanpal & Rai, 2007).

Dalam Farmakope Herbal Indonesia disebutkan bahwa daun salam atau Syzygium Polyanthum Wight mengandung flavonoid 0,40% dengan senyawa penanda adalah kuersitrin.

Penelitian dengan menggunakan bahan alam seperti tumbuhan akan menambah keyakinan terhadap karunia yang diberikan oleh Allah SWT seperti yang telah di jelaskan dalam penggalan ayat berikut:

Artinya: Dia menumbuhkan bagi kamu dengan air hujan itu tanam-tanaman; zaitun, korma, anggur dan segala macam buah-buahan. Sesungguhnya pada yang demikian itu benar-benar ada tanda (kekuasaan Allah) bagi kaum yang memikirkan (QS. An Nahl : 11).

Makna dari ayat diatas adalah berbagai spesies dari tumbuhan yang ada di dunia ini diciptakan dengan manfaatnya masing-masing untuk menambah keyakinan akan kuasa Allah SWT. Mengingat bahwa peran COX-2 dalam proses inflamasi dan kanker cukup besar maka berdasarkan ayat tersebut, dilakukanlah penelitian terhadap daun salam sebagai tanaman obat yang berpotensi sebagai antiinflamasi secara in silico dan in vivo.

B. Rumusan Masalah

1. Berapakah skor penghambatan kuersitrin yang berpotensi sebagai antiinflamasi melalui uji in silico?

2. Adakah kesesuaian antara hasil uji in silico dengan hasil uji in vivo pada tikus terinduksi karagenan?

C. Keaslian Penelitian

Beberapa penelitian terkait daun salam (Syzygium polyanthum wight) dan senyawa flavonoidnya pernah dilakukan. Uji secara in vivo aktivitas ekstrak daun salam sebagai antiinflamasi pada tikus putih (Rattus Novergicus) menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun salam dosis 50 mg/kgBB, 150 mg/KgBB dan 250 mg/kgBB memiliki aktivitas antiinflamasi pada tikus putih yang diinduksi karagenan (Agustina et al, 2015). Selain itu uji analgetik ekstrak air daun salam (Syzygium polyanthum) pada mencit dengan metode geliat menunjukkan bahwa ekstrak air daun salam dosis 25, 50, 100 dan 200 mg/kgBB mempunyai daya analgetik sebesar 49,20 ± 7,06 %; 52,00 ± 6,51% ; 48,00 ± 2,60%

5

dan 45,60 ±7,52 % (Wijayanti, 2013). Penelitian yang akan dilakukan berbeda dengan penelitian yang pernah ada sebelumnya karena penelitian ini menggunakan dua metode yaitu in silico dengan melakukan penambatan senyawa penanda yang ada pada daun salam (kuersitrin) dengan protein siklooksigenase-2 (6COX) yang kemudian dilanjutkan dengan pengujian secara in vivo.

D. Tujuan Penelitian

1. Mengetahui skor penghambatan senyawa kuersitrin sebagai penanda dalam daun salamyang berpotensi sebagai antiinflamasi melalui uji in silico.

2. Mengetahui kesesuaian antara hasil uji in silico dengan hasil uji in vivo pada tikus terinduksi karagenan.

E. Manfaat Penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan mampu memberikan informasi kepada masyarakat bahwa daun salam yang ada di lingkungan sekitar dapat dimanfaatkan sebagai obat tradisional khususnya sebagai antiinflamasi atau antiradang yang potensial.

6 Definisi

Radang atau inflamasi adalah respon fisiologis terhadap infeksi dan cedera jaringan, radang juga menginisiasi pembunuhan patogen, proses perbaikan jaringan dan membantu mengembalikan homeostasis pada tempat yang terinfeksi atau cedera. Jika respon antiinflamasi gagal beregulasi, dapat mengakibatkan cedera kronis dan membantu perkembangan penyakit yang terkait (Calder et al., 2009). Inflamasi dapat dibedakan menjadi dua yaitu akut dan kronik. Inflamasi akut mempunyai onset dan durasi yang lebih cepat. Inflamasi akut terjadi dengan durasi waktu beberapa menit sampai beberapa hari, ditandai dengan adanya cairan eksudat protein plasma maupun akumulasi leukosit neutrofilik yang dominan. Inflamasi kronik memiliki durasi yang lebih lama yaitu dalam hitungan hari hingga tahun. Menurut Kumar et al (2007) dalam Utami et al (2011) tipe inflamasi kronik ditentukan oleh peningkatan jumlah limfosit dan makrofag yang berhubungan dengan proliferasi vaskular dan fibrosis.

Patofisiologi

Terjadinya inflamasi adalah reaksi lokal dari jaringan atau sel terhadap suatu rangsangan. Jika ada cedera, terjadi rangsangan untuk

7

melepaskan zat kimia tertentu yang menstimulasi terjadinya perubahan jaringan sebagai manifestasi dari radang, diantaranya yaitu histamin, serotonin, bradikinin, leukotrien dan prostaglandin (Lumbanraja, 2009). Cyclooxygenase (COX) merupakan enzim yang terdapat pada jalur biosintetik dari prostaglandin, tromboksan dan prostasiklin.Menurut Kujubu et al (1991) dalam Multazar et al (2012) Enzim ini ditemukan tahun 1988 oleh Dr. Daniel Simmons, peneliti dari Harvard University. Cyclooxygenase terbagi dua yaitu COX-1 dan COX-2. COX-1 sebagai housekeeping gen pada hampir seluruh jaringan normal, sedangkan enzim COX-2 bertanggung jawab terhadap mekanisme inflamasi dan rasa nyeri (Multazar et al., 2012). COX-2 membentuk PGE2 dan PGI2 yang dapat menyebabkan terjadinya beberapa proses biologis yaitu peningkatan permeabilitas kapiler, agen piretik dan hiperalgesia (Stables &Gilroy, 2010).

Beberapa tanda inflamasi (Muliati, 2014) : a. Rubor atau kemerahan

Menurut Price & Wilson (1995) dalam Lumbanraja (2009) Kemerahan atau rubor biasanya merupakan hal pertama yang terlihat pada saat mengalami peradangan. Ketika reaksi peradangan mulai timbul maka arteri yang mensuplai darah ke daerah tersebut melebar, oleh karena itu darah mengalir lebih banyak ke dalam mikrosirkulasi lokal. Pembuluh darah yang sebelumnya kosong atau sebagian saja meregang dengan cepat dan terisi penuh oleh

darah. Keadaan ini dinamakan hiperemia atau kongesti menyebabkan warna merah lokal karena peradangan akut. Timbulnya hyperemia merupakan permulaan reaksi peradangan diatur oleh tubuh melalui pengeluaran zat mediator seperti histamin.

b. Kalor atau peningkatan suhu tubuh

Panas merupakan reaksi pada permukaan tubuh yakni kulit yang terjadi bersamaan dengan kemerahan akibat peradangan. Daerah peradangan pada kulit menjadi lebih panas dari sekelilingnya, hal ini terjadi karena darah dengan suhu 37oC lebih banyak disalurkan ke permukaan daerah yang terkena radang lebih banyak dibandingkan ke daerah normal.

c. Dolor atau nyeri

Rasa sakit atau dolor dari reaksi peradangan dihasilkan dengan berbagai mekanisme. Perubahan pH lokal atau konsentrasi ion-ion tertentu dapat merangsang ujung-ujung saraf untuk mengeluarkan zat kimia tertentu misalnya mediator histamin atau mediator lainnya yang menyebabkan pembengkakan dan peradangan pada jaringan sehingga mengakibatkan peningkatan tekanan lokal dapat menimbulkan rasa sakit (Lumbanraja, 2009). d. Tumor atau pembengkakan

Gejala dari peradangan akut adalah tumor atau pembengkakan. Hal ini terjadi akibat meningkatnya permeabilitas

9

dinding kapiler serta adanya penyaluran cairan dan sel-sel dari sirkulasi darah ke jaringan yang cedera. Pada peradangan, dinding kapiler tersebut menjadi lebih permeabel dan lebih mudah dilalui oleh leukosit dan protein terutama albumin yang diikuti oleh molekul yang lebih besar sehingga plasma jaringan mengandung lebih banyak protein yang kemudian meninggalkan kapiler dan masuk ke dalam jaringan sehingga menyebabkan jaringan menjadi bengkak.

e. Functio Laesa

Functio laesa adalah reaksi peradangan yang ditandai dengan nyeri disertai adanya sirkulasi yang abnormal akibat penumpukan dan aliran darah yang meningkat sehingga menghasilkan lingkungan kimiawi lokal yang abnormal dan menjadikan jaringan yang terinflamasi tersebut tidak berfungsi normal (Dyaningsih, 2007).

B. Siklooksigenase-2 (COX-2)

Siklooksigenase atau prostaglandin H sintetase merupakan enzim utama dalam sintesis prostaglandin (PGE). Menurut Francon et al (2008) dalam Prasetya et al (2013) siklooksigenase-2 merupakan enzim yang diekspresikan sebagai respon terhadap agen proinflamasi seperti sitokin dan endotoksin. Enzim COX-2 berperan dalam pembentukan prostaglandin yang diikuti proses patofisiologis seperti edema dan hiperalgesia. Pembentukan COX-2 diawali dengan PGH sintase

mendonorkan dua molekul oksigen kepada asam arakhidonat untuk sintesis prostaglandin H2 (PGH2). Perubahan ini akan membentuk prostaglandin terutama prostaglandin E2 (PGE2). Prostaglandin E2 memiliki peran dalam proses inflamasi yaitu seperti vasodilatasi pembuluh darah, edema dan nyeri (Prasetya, 2015).

C. Obat Antiinflamasi

Menurut kamus Oxford antiinflamasi adalah segala sesuatu yang digunakan untuk mengurangi peradangan, utamanya obat. Mekanisme obat antiinflamasi terbagi menjadi dua yaitu:

1. Antiinflamasi Steroid

Mekanisme kerja dari obat ini adalah dengan menghambat fosfolipase, suatu enzim yang berperan menghambat asam arakhidonat dari membran lipid. Katzung (2006) dalam Walidah (2014) Beberapa contoh obat golongan ini yaitu hidrokortison, prednison, betametason, deksametason.

2. Antiinflamasi Non Steroid (AINS)

Mekanisme kerja dari golongan ini adalah menghambat enzim COX sehingga konversi asam arakhidonat menjadi prostaglandin terganggu. AINS terbagi menjadi beberapa turunan diantaranya:

a. Turunan Asam propionat : ibuprofen dan ketoprofen

b. Turunan Indol : indometacin

c. Turunan Asam pirolealkanoat : tolmetin d. Turunan Asam fenilasetat : diklofenak

11

e. Turunan Pirazolon : fenilbutazon

f. Klasfenamat : asam meklofenamat

g. Oksikam : piroksikam

h. Prodrug Asam naftilasetat : nabumeton (Katzung, 1998) Natrium diklofenak digunakan sebagai senyawa pembanding dengan nama kimia asam benzeneasetat, 2-[(2,6-diklorofenil)amino]-monosodium. Diklofenak adalah turunan asam fenilasetat yang secara kuat dapat menghambat siklooksigenase dengan efek antiinflamasi, analgesik dan antipiretik. Obat ini digunakan untuk peradangan kronis seperti artritis rematoid, osteoartritis serta untuk pengobatan nyeri otot rangka yang akut (Katzung, 2004). Menurut Goodman & Gilmans (1991) dalam Ekawati (2011) efek antiinflamasi natrium diklofenak sangat kuat dan memiliki efek samping yang lebih rendah dibandingkan obat lain seperti indometasin, piroksikam, sehingga obat ini sering digunakan untuk nyeri, migrain dan gout. Natrium diklofenak mempunyai waktu paruh 1-3 jam. D. Daun Salam (Syzygium polyanthum wight)

Daun salam secara ilmiah bernama Syzygium polyanthum wight dan memiliki nama ilmiah lain yaitu Eugenia polyantha wight dan Eugenia lucidula Miq. Tanaman salam termasuk di dalam suku myrtaceae (Sudirman, 2014).

Tanaman salam berupa pohon yang memiliki tinggi sekitar 20 meter dan dapat dibudidayakan dengan sangat baik pada daerah berketinggian 5 - 1000 meter dari permukaan laut. Pemeliharaan tanaman

dapat dilakukan dengan lahan yang memiliki jumlah air di dalam tanah yang cukup serta dapat tumbuh di daerah terbuka dengan unsur hara yang seimbang (Winarto, 2004).

Farmakope Herbal Indonesia menyebutkan bahwa Syzygium Polyanthum Wight dari suku Myrtacea mengandung flavonoid total tidak kurang dari 0,40% dihitung sebagai kuersetin dengan senyawa identitas adalah kuersitrin. Kuersetin merupakan bentuk non glikosida (aglikon) dari kuersitrin.

Kuersetin maupun kuersitrin berpotensi berperan mencegah kematian sel beta melalui jalur mitokondria dan mencegah translokasi dari NFkB (Xiaoqian et al, 2012). Umumnya aktifitas anti inflamasi dari flavonoid adalah ikatan rangkap tidak jenuh, gugus hidroksil, gugus karbonil (gambar 2).

Gambar 2. Struktur kuersetin (ikatan tidak jenuh pada cincin C, nomor dan posisi dari gugus hidroksil pada cincin B, gugus karbonil pada C-4 merupakan syarat aktifitas anti inflamasi dari flavonoid

Gambar 2. Kuersitrin Gambar 1. Struktur Kuersitrin

13

E. Karagenan

Karagenan adalah polimer linear yang disusun oleh sekitar 25.000 turunan galaktosa yang strukturnya tergantung pada sumber dan kondisi ekstraksi. Karagenan dikelompokkan menjadi tiga yaitu karagenan kappa, karagenan theta, dan karagenan lamda. Karagenan diberi nama dari persentase kandungan ester sulfatnya, karagenan kappa mengandung 25-30%, karagenan theta mengandung 28-35% dan karagenan lamda 32-39% (Ekawati, 2011).

Karagenan akan menginduksi cedera pada sel kemudian sel yang cedera melepaskan mediator yang mengakibatkan terjadinya proses inflamasi. Penggunaan karagenan memiliki beberapa kelebihan yaitu tidak menimbulkan kerusakan jaringan, tidak menimbulkan bekas serta karagenan memberikan respon yang lebih peka terhadap antiinflamasi. Setelah pelepasan mediator inflamasi, terjadi edema yang akan bertahan selama 6 jam dan akan berkurang secara berangsur selama 24 jam setelah injeksi karagenan dilakukan. Setelah diinjeksikan karagenan, terjadi respon yang terbagi dalam dua fase, yaitu fase awal berhubungan dengan pelepasan histamin dan serotonin sedangkan fase kedua berhubungan dengan prostaglandin serta Slow Reacting Subtances yang mencapai puncak pada 3 jam setelah perlakuan. Pemberian karagenan sublantar dapat meningkatkan kadar COX-2 (Hidayati et al, 2008).

Ada beberapa jenis iritan yang digunakan untuk pengujian efek antiinflamasi, diantaranya adalah karagenan. Karagenan dapat merangsang

fosfolipida membran sel mast yang terdapat pada jaringan ikat di telapak kaki tikus untuk mensekresikan asam arakidonat dengan bantuan enzim fosfolipase A2 sehingga menghasilkan berbagai mediator inflamasi (Walidah, 2014).

Karagenan yang digunakan pada penelitian ini adalah karagenan kappa karena jenis ini mudah untuk diperoleh. Karagenan juga dipilih karena dapat mempengaruhi obat antiinflamasi secara spesifik dan memiliki respon yang lebih sensitif terhadap obat–obat tersebut dibandingkan dengan iritan lain (Winter et al, 1962).

F. Penambatan Molekul (Molecular Docking)

Penambatan molekul adalah proses komputasi pencarian ligan yang cocok secara geometris beserta energinya ke situs pengikatan protein. Tujuan penambatan molekul adalah untuk mendapatkan konformasi yang optimal untuk protein dan ligan sehingga energi bebas dari sistem secara keseluruhan dapat diminimalkan. Penambatan molekul membantu dalam mempelajari ligan atau interaksi reseptor dan protein dengan mengidentifikasi situs aktif yang cocok pada protein, menemukan posisi terbaik dari ligan-reseptor secara geometri dan mengkalkulasi energi interaksi dari ligan yang berbeda untuk mendapatkan ligan yang lebih efektif (Mukesh & Rakesh, 2011). Docking sering digunakan untuk memprediksi ikatan ligan terhadap target proteinnya untuk memperkirakan afinitas dan aktivitas molekulnya sehingga docking berperan penting dalam desain obat yang rasional (Mukesh & Rakesh, 2011).

15

Beberapa aplikasi yang umum digunakan untuk melakukan penapisan virtual dengan metode molecular docking, yaitu Protein-Ligand Ant System(PLANTS), GOLD, Molegro Virtual Docking (MVD), Molecular Operating Environment (MOE) dan Autodock (Korb et al., 2006).

Autodock Vina merupakan salah satu perangkat lunak yang tersedia untuk penambatan molekul, penemuan obat dan virtual screening. Software ini dapat dioperasikan dengan bantuan Autodock Tools (Sandeep et al, 2011). Autodock merupakan program penambatan molekuler yang efektif dalam memprediksi konformasi dan energi dari ikatan target dan ligan. Program utama Autodock terbagi dua yaitu Autodock dan Autodock grid. Autodock berfungsi melakukan penambatan molekuler protein target dan ligan dengan set grid yang telah ditetapkan. Menurut Morris et al ( 2009) dalam Apriani (2015) untuk mencari informasi Autodock membutuhkan ruang atau area pencarian dalam sistem koordinat yang memprediksiposisi terikatnya ligan.

G. Maserasi

Maserasi adalah proses ekstraksi simplisia dengan menggunakan pelarut serta beberapa kali pengadukan pada suhu ruangan. Maserasi bertujuan untuk menarik zat berkhasiat pada simplisia. Secara teknologi maserasi termasuk ekstraksi dengan prinsip metode pencapaian konsentrasi pada keseimbangan (Depkes RI, 2000).

Maserasi adalah ekstraksi yang palingsederhana. Dasar dari maserasi yaitu melarutnya bahan kandungan simplisia dari sel yang rusak pada saat penghalusan. Selama maserasi atau proses perendaman dilakukan pengadukan berulang, hal ini ditujukan agar terjadi keseimbangan konsentrasi bahan ekstraksi yang lebih cepat didalam cairan. Sedangkan keadaan diam selama maserasi menyebabkan difusi bahan aktif. Voigh (1994) dalam Istiqomah (2013) semakin besar perbandingan simplisia terhadap cairan penyari, maka akan semakin banyak hasil yang didapatkan.

H. Senyawa Penanda

Menurut Swatantra et al (2010) penanda atau marker dikategorikan menjadi dua yaitu:

1. Penanda DNA

Penanda DNA digunakan untuk mendapatkan informasi polimorfisme seperti komposisi gen yang berbeda pada setiap spesies. DNA dapat diperoleh dari ekstraksi jaringan kering atau basah dari tumbuhan.

2. Penanda Kimia

Penanda kimia adalah komponen biokimia yaitu senyawa hasil metabolit primer, metabolit sekunder dan makromolekul lain termasuk asam nukleat.

17

Senyawa hasil metabolit primer contohnya karbohidrat, protein, lemak, asam nukleat dan enzim. Senyawa metabolit sekunder contohnya terpenoid, alkaloid dan flavonoid (Widodo, 2007).

a. Alkaloid

Alkaloid adalah suatu golongan senyawa organik yang terbanyak ditemukan di alam. Sebagian besar alkaloid terdapat pada tumbuhan dikotil sedangkan untuk tumbuhan monokotil dan pteridofita mengandung alkaloid dengan kadar yang kecil. Alkaloid mampu meningkatkan daya tahan tubuh, alkaloid akan mengaktifkan dan memperbaiki struktur maupun fungsi dari sel tubuh (Haryani, 2012).

b. Terpenoid

Terpenoid merupakan senyawa golongan hidrokarbon yang banyak ditemukan di tanaman obat. Terpenoid adalah metabolit sekunder pada tumbuhan yang memiliki efek farmakologis seperti antivirus, antibakteri, antimalaria, antiradang, serta penghambat sintesis kolesterol dan antikanker (Nassar et al., 2011).

c. Flavonoid

Flavonoid adalah golongan polifenolik yang bersumber dari buah, sayur, dan bahan alam lainnya yang dapat digunakan sebagai bahan baku obat herbal. Dari berbagai penelitian diketahui flavonoid memiliki efek antioksidan, antiradang,

antimutagenik dan antikanker (Tapas et al, 2008). Flavonoid dalam tubuh dapat menghambat enzim lipooksigenase yang berperan dalam biosintesis prostaglandin. ekstrak etanol daun tempuyung yang mengandung steroid dan flavonoid diketahui mampu menghambat pembentukan radang (Lumbanraja, 2009). Kandungan flavonoid dalam bunga rosela dapat dimanfaatkan sebagai obat antiinflamasi topikal atau obat kumur yang sekaligus berperan sebagai antibiotik untuk penderita periotodontis (Pratiwi, 2012).

19

I. Kerangka Konsep Penelitian

Inflamasi

Ligan Pembanding

(Natrium Diklofenak) Ligan Kuersitrin Siklooksigenase 2

(6COX)

In Silico

Ligan Asli Protein 6COX

In Vivo

Perbandingan Hasil Uji In Silico dan In

J. Hipotesis

Daun salam dengan senyawa penanda kuersitrin yang termasuk ke dalamgolongan flavonoid berpotensi sebagai antiinflamasi, sehingga dapat diprediksi akan terdapat kesesuaian antara uji in silico dan in vivo.

21 BAB III

METODE PENELITIAN

A. Desain Penelitian

Desain penelitian yang digunakan yaitu penelitian eksperimental laboratoris secara in silico dari senyawa penanda daun salam (Syzygium polyanthum wight) terhadap COX-2 menggunakan aplikasi molecular docking Autodock Vina disertai dengan pengujian secara in vivo terhadap tikus terinduksi karagenan.

B. Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan di laboratorium Teknologi Farmasi dan Laboratorium Penelitian Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Muhammadiyah Yogyakarta.

C. Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan pada bulan Juni 2015 - Februari 2016 D. Variabel Penelitian

Variabel Bebas :Konsentrasi ekstrak etanolik daun salam (Syzygium polyanthum wight)

Variabel Tergantung : Penurunan udem pada kaki tikus Variabel Terkendali : Tikus putih jantan galur wistar berumur

3 bulan dengan berat 130 - 200 g dan sehat, natrium diklofenak, karagenan

E. Definisi Operasional 1.Konformasi

Konformasi adalah bentuk perubahan rotasi pada atom-atom yang terdapat pada suatu senyawa akibat perubahan energi.

2.Skor Penambatan

Berdasarkan teori energi bebas Gibbs yaitu nilai energi bebas yang kecil menunjukkan bahwa konformasi tersebut stabil sedangkan nilai energi bebas yang besar menunjukkan kompleks yang terbentuk tidak stabil (Funkhouser, 2007). Hal itu menandakan bahwa semakin kecil nilai energinya maka ikatan tersebut akan semakin stabil senyawa tersebut.

3.Penurunan Udem

Edema atau udem adalah penimbunan cairan secara berlebihan di antara sel-sel tubuh atau di dalam berbagai rongga tubuh. Pada penelitian ini digunakan iritan atau bahan penginduksi udem yaitu karagenan. Penelitian ini dilakukan dengan mengukur penurunan atau pengurangan volume edema. Perlakuan dengan penurunan volume edema yang lebih cepat dibandingkan dengan perlakuan kontrol positif (natrium diklofenak) dianggap potensial sebagai antiinflamasi.

F. Instrumen Penelitian 1. Alat Penelitian

a. Alat yang digunakan untuk penambatan molekul:

Personal Computer (PC/Laptop) Toshiba Satellite C-40 B yang dilengkapi dengan perangkat lunak seperti sistem operasi dan

23

aplikasi pendukung. Sistem operasi yang digunakan adalah Windows 7 dan aplikasi pendukung yang digunakan adalah ChemDraw 2010, AutoDock 4.2, Autodock Vina, Accelrys Discovery Studio 4.1.

b. Alat yang digunakan untuk uji in vivo:

Plethysmometer 37140 UGO BASILE yaitu alat yang digunakan untuk mengukur perubahan volume pada bagian tubuh, timbangan tikus (Lion Star), spuit injeksi untuk insulin 1,0 ml (Terumo), spuit oral ukuran 18 gauge (Terumo) untuk tikus serta SPSS versi 15 sebagai pengolah data.

c. Alat yang digunakan untuk ekstraksi:

Bejana stainless steel, penangas air (waterbath Memmert), vaccum rotary evaporator (IKA® RV 10 basic), alat–alat gelas (Iwaki Pyrex®), timbangan analitik (Mettler Toledo AL-204), cawan porselen.

2. Bahan Penelitian a. Uji in silico

Protein 6COX dalam bentuk file yang diunduh dari situs resmi protein data bank (www.rcsb.org), senyawa penanda daun salam (Syzygium polyanthum wight) dan senyawa natrium diklofenak dalam bentuk file sebagai pembanding.

Tikus putih jantan galur Wistar dengan berat badan 150 - 200 gram, karagenan kappa (Lansida), larutan saline (NaCl 0,9%), CMC Na (Lansida), ekstrak etanol daun salam (Syzygium polyanthum wight) serta Natrium Diklofenak (Voltaren) dalam bentuk sediaan tablet.

c. Ekstraksi dengan metode maserasi

Etanol 70% (Brataco), simplisia serbuk daun salam (Herbal Anugrah Alam).

G. Cara Kerja Uji In Silico

a. Penyiapan senyawa penanda

Senyawa penanda dibuat dalam bentuk berkas dengan menggambar ligan secara manual menggunakan aplikasi ChemDraw 2010 kemudian disimpan dengan format file .cdx. b. Penyiapan Protein dan Ligan Uji

Sebelum dilakukan uji penambatan molekul, protein dan ligan pembanding terlebih dahulu diunduh dalam berkas .pdb pada situs www.rcsb.org untuk protein dan situs www.drugbank.ca untuk ligan pembanding. Pada penelitian ini protein yang diunduh adalah protein COX-2 (6COX) yang dimana penghambatan protein ini mengakibatkan tidak timbulnya reaksi inflamasi.

Setelah berkas protein sudah terunduh, dilakukan penggambaran senyawa ligan yang akan diuji dengan menggunakan aplikasi

25

ChemDraw yang kemudian disimpan dalam bentuk berkas .cdx.Dalam penelitian ini ligan yang digunakan untuk pembanding adalah ligan dari senyawa natrium diklofenak. Ligan diunduh pada situs resmi yaitu http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ atau http://www.drugbank.ca/ dalam bentuk konformasi 3D dengan berkas SDF. Hasil dari unduhan tersebut dibuka dengan menggunakan DS Visualizer kemudian berkas tersebut diubah dalam bentuk format file .pdb.

c. Seleksi dan Validasi Protein

1) Preparasi Protein Uji dan Ligan Asli

Preparasi protein uji menggunakan aplikasi Accelrys Discovery Studio 4.1 (DS Visualizer), tahapan ini bertujuan untuk mendapatkan ligan yang akan digunakan untuk tempat uji senyawa yang lain pada saat dilakukan proses penambatan molekul (molecular docking). Berkas unduhan 6COX dalam format file.gz diubah menjadi berkas dengan format 6COX.pdb dengan menggunakan DS Visualizer. Berkas 6COX.pdb dibuka kembali menggunakan DS Visualizer, pengotor dihapus pada residu protein dan disimpan kembali dengan nama berkas target.pdb setelah itu lakukan preparasi kembali untuk menseleksi ligan asli (S58). Autodock hanya membaca berkas dengan format

berkas.pdb sehingga target dan ligan harus dengan format file.pdb.

2) Menjalankan Proses Penambatan Molekul

Setelah berkas ligan asli, ligan dan protein target sudah disiapkan, berkas tersebut dikumpulkan ke dalam satu folder. Aplikasi Autodock vina dijalankan pada windows melalui terminal dengan mengetik “cd ../../vina” kemudian pada terminal diketik perintah “vina –config conf.txt –log log.txt”dan ditekan “enter” pada keyboard.

Maserasi Simplisia Daun Salam (Syzygium polyanthum wight)

Sebelum dilakukan maserasi, simplisia terlebih dahulu diidentifikasi untuk memastikan bahwa bahan yang digunakan terbukti murni. Identifikasi dilakukan oleh Laboran yang terpercaya di Laboratorium Biologi Farmasi Universitas Gadjah Mada.

Langkah selanjutnya yaitu melakukan ekstraksi dengan metode maserasi untuk mendapatkan ekstrak dari daun salam (Syzygium polyanthum wight). Simplisia serbuk ditambahkan etanol 70% dengan perbandingan 1:10 (Atsani & Sri, 2015). Maserasi pertama dengan perbandingan 1:7,5 bagian. Sebanyak 500 gram serbuk ditambahkan etanol 3,75 L etanol 70%. Dilakukan pengadukan setiap hari selama 5 hari, campuran disaring menggunakan kain flanel sehingga diperoleh filtrat yang jernih (maserat), ampas penyarian diremaserasi dengan

27

menggunakan etanol 1:2,5 atau etanol sisa sebanyak 1,25 L selama 2 hari dengan tetap melakukan pengadukan setiap hari, setelah itu campuran tersebut disaring kembali. Ekstrak dikentalkan dengan menguapkan ekstrak cair dengan waterbath 50°C agar kandungan senyawa tidak rusak (Anief,2000).

Uji In Vivo

a. Penyiapan Hewan Uji

Tikus dikondisikan terlebih dahulu dengan lingkungan baru, kurang lebih 7 hari dalam kandang Laboratorium Hewan Uji Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UMY. Selama masa pengkondisian, dilakukan pemberian makanan dan dilakukan penimbangan berat badan rutin. Tikus yang kondisinya menurun (sakit) memiliki ciri-ciri bulu berdiri, kurang aktif dan warna mata gelap/ tidak jernih tidak digunakan dalam penelitian.

b. Penetapan Dosis Bahan Uji

Berdasarkan penelitian sebelumnya, dosis ekstrak etanol daun salam yang digunakan yaitu 100 mg/kgbb, dosis ini sudah cukup menurunkan inflamasi pada tikus sebesar 20-30% (Sugarlini et al, 2001). Sehingga berdasarkan penelitian tersebut, pada penelitian ini dosis ekstrak daun salam yang digunakan dibuat dalam tiga perlakuandengan dosis berbeda.

Sejumlah 0,1 gram karagenan ditimbang lalu dilarutkan dalam 10 ml larutan Natrium Klorida 0,9% steril di dalam beaker glass. Kemudian diaduk dengan vortex selama ± 5 menit untuk menghomogenkan suspensi.

d. Pembuatan Suspensi CMC Na 0,5%

Sebanyak 0,5 gram CMC Na ditimbang kemudian suspensikan dengan larutan NaCl 0,9% sebanyak 100 ml. Kemudian diaduk dengan vortex selama ± 5 menit untuk menghomogenkan suspensi. e. Pembuatan Suspensi Natrium Diklofenak

Untuk pembuatan suspensi natriumdiklofenak, digunakan dosis sekali pemberian sebagai acuan yaitu 50 mg/70 KgBB. Langkah perhitungan yaitu dosis yang ditetapkan sebesar 50 mg dikalikan dengan konversi dosis manusia ke hewan uji dalam hal ini tikus mempunyai konversi sebesar 0,018/200 gram bobot Tikus sehingga didapatkan dosis sebesar 0,9 mg/200 gram yaitu 0,0045 mg/gram atau 4,5 mg/KgBB.

f. Perlakuan Terhadap hewan uji

Pada awalnya hewan uji dipuasakan selama 6_–8 jam. Pengosongan lambung bermanfaat terhadap proses absorbsi, adanya makanan dalam gastrik dapat mengganggu proses absorbsi sehingga dapat membuat terjadinya manipulasi obat. Perlakuan yang diberikan kepada masing- masing kelompok yaitu:

29

2) Kontrol Positif Natrium Diklofenak 4,5 mg/KgBB 3) Ekstrak Etanol Daun Salam 33,3 mg/KgBB 4) Ekstrak Etanol Daun Salam 100 mg/KgBB 5) Ekstrak Etanol Daun Salam 300 mg/KgBB

Masing- masing tikus diberikan bahan uji dengan dosis yang sudah dihitung sesuai dengan berat badan tikus. Setelah 10-15 menit kemudian masing-masing tikus diberi induksi edema menggunakan suspensi karagenin 1% sebanyak 0,1 ml yang diinjeksikan secara sublantar pada telapak kaki tikus. Volume kaki tikus diukur tiap interval 30 menit selama 6 jam.

H. Skema Langkah Kerja

Uji In Silico

Kelompok Perlakuan 2

(Dosis 2 ekstrak) Ligan Syzygium

Polyanthum wight (Kuersitrin)

Maserasi

Uji In Vivo

Kelompok Kontrol Positif (Na Diklofenak)

Kelompok Perlakuan 1

(Dosis 1 ekstrak) Kelompok

Kontrol Negatif

Kelompok Perlakuan 3

(Dosis 3 Ekstrak)

Pengukuran Volume Udem

selama 6 jam Ligan Asli Protein

6COX (S58)

Ligan Pembanding (Natrium Diklofenak)

31

I. Analisis Data

1. Analisis Skor Penambatan Senyawa Uji dan Senyawa Pembanding Data yang didapat pada uji in silico dari senyawa penanda daun salam (Syzygium polyanthum wight) yaitu kuersitrin dan senyawa pembanding berupa skor penambatan senyawa terhadap protein 6COX. Hasil penambatan dari kuersitrin dianggap lebih baik dan berpotensi sebagai inhibitor COX-2 jika skor penambatan lebih rendah dibandingkan dengan skor penambatan senyawa pembanding dalam hal ini natrium diklofenak.

2. Analisis Data In Vivo

Data yang diperoleh dari uji in vivo tikus galur Wistar terinduksi karagenan yaitu berupa waktu penurunan udema pada kaki tikus yang sudah diberi perlakuan sesuai dengan kelompoknya. Data tersebut akan dianalisis menggunakan aplikasi Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) versi 15, jika data tersebut terdistribusi normal maka akan dilanjutkan dengan uji ANOVA dengan taraf kepercayaan 95% dan uji LSD untuk melihat perbedaan antar kelompok (Destyka, 2012).

Menurut Imam Ghazali (2011) dalam Apriyono & Taman (2013) uji normalitas adalah pengujian untuk melihat suatu populasi data terdistribusi normal atau tidak. Suatu populasi data dinyatakan terdistribusi normal jika nilai Sig lebih besar dari level of significant 0,05 sedangkan jika lebih kecil dari 0,05 maka distribusi data tersebut

dinyatakan tidak normal (Apriyono & Taman, 2013). Analisis data ini bertujuan untuk memvalidasi hasil dari data in vivoyang sudah yang dilakukan.

33 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Validasi Metode Docking dengan Autodock Vina

Sebelum dilakukan proses seleksi ligan pada penelitian ini, terlebih dahulu dilakukan validasi dengan cara menambatkan ulang ligan asli (S58) pada reseptor asal (6COX). 6COX.pdb merupakan kompleks kode protein antara native ligand/ ligan asli dan enzim COX-2. Parameter yang digunakan yaitu RMSD (Root Mean Square Deviation), metode docking

dikatakan valid jika memiliki nilai RMSD ≤ 2Å (Ruswanto,2015).

Tabel 1. Hasil Validasi Ligan Asli terhadap Protein 6COX

Nilai RMSD dihitung dari konformasi ligan-protein yang terbaik, dua tipe dari RMSD yaitu RMSD l.b (lower bound) dan RMSD u.b (upper bound). RMSD u.b menjelaskan perbedaan nilai dari jarak antara setiap atom pada satu konformasi dengan konformasi yang lainnya, sedangkan RMSD l.b dapat didefinisikan sebagai RMSD/lb(c1,c2)=

nilai jarak atom pada satu konformasi dengan atom terdekat yang memiliki tipe yang sama dengan atom tersebut pada konformasi lain (Ferencz & Muntean, 2015).

Semakin kecil nilai RMSD menunjukkan bahwa posisi ligan yang diperkirakan semakin baik karena semakin mendekati konformasi asal (Dany et al., 2013). Hasil validasi antara ligan asli yaitu S58 (1-phenylsulfonamide-3 trifluoromethyl-5-parabromophenylpyrazole) dengan protein 6COX pada konformasi ke-9 didapatkan nilai RMSD sebesar 1.161 Å dengan energi sebanyak -7.3 kcal/mol yang menandakan bahwa secara teori, ligan dan protein yang divalidasi telah memenuhi kriteria valid.

35

B. Hasil Uji In Silico Senyawa Penanda Daun Salam (Kuersitrin) dengan

Senyawa Pembanding dan Native Ligand Protein 6COX dengan Metode Molekular Docking Autodock Vina

Tabel 2. Energi Interaksi Ikatan Ligan dan Protein

Hasil dari proses docking yaitu prediksi aktivitas interaksi ligan dengan reseptornya berupa nilai energi ikatan antara ligan-reseptor. Menurut teori energi Gibbs apabila semakin kecil energi yang dihasilkan dari ikatan suatu ligan dengan reseptornya maka semakin stabil ikatan antara ligan dan reseptor tersebut. Dari tabel 2 dapat diketahui hasil dari uji in silico aktivitas senyawa penanda daun salam yaitu kuersitrin dengan senyawa pembanding dan native ligand (S58) protein 6COX memprediksikan bahwa ligan yang lebih stabil terhadap protein 6COX adalah kuersitrin dari daun salam dengan nilai energi ikatan yaitu -8,6

kkl/mol. Posisi kuersitrin ketika berikatan dengan protein 6COX dapat dilihat pada gambar 3.

Gambar 3. Posisi Kuersitrin ketika terikat dengan protein 6COX

Kuersitrin diduga memiliki efek inhibisi inflamasi akut (Taguchi et al, 1993) juga diketahui kuersitrin dapat melepaskan kuersetin dalam mekanismenya sebagai antiinflamasi melalui inhibisi jalur NFkB (Monica et al, 2005).

Natrium diklofenak merupakan AINS yang tidak selektif dikarenakan menghambat COX-1 dan COX-2. Pada hasil uji in silico yang telah dilakukan, diprediksi energi ikatan natrium diklofenak terhadap COX-2 sebesar -7.6 kkl/mol (gambar 4).

Gambar 4. Posisi Natrium Diklofenak ketika terikat dengan protein 6COX Ligan asli (native ligand) diketahui berikatan dengan enzim COX-2 melalui residu asam amino Arg61, Thr62, Arg44, Asn43, Lys468, Lys79

37

sedangkan natrium diklofenak berikatan dengan residu His388, His214 dan kuersitrin berikatan dengan residu His214, His207, Val447, His386, His388, Trp387, Tyr385 (Tabel 2). Sehingga dapat diketahui bahwa aktivitas kuersitrin sebagai penghambat inflamasi terhadap protein 6COX dapat diprediksi melalui residu asam amino penting yang sama pada kantung ikatan His388 dan His214 sebagaimana ikatan antara protein 6COX dengan natrium diklofenak.

Gambar 5. Posisi Ligan Asli ketika terikat pada protein 6COX

Dibandingkan dengan ligan asli (native ligand), energi ikatan natrium diklofenak dan kuersitrin masih lebih rendah, hal tersebut dapat memprediksikan bahwa kompleks antara protein dengan kuersitrin dan natrium diklofenak merupakan kompleks yang lebih stabil sehingga kuersitrin sebagai senyawa identitas dalam daun salam diprediksi memiliki potensi aktivitas yang mirip dengan senyawa pembandingnya yaitu natrium diklofenak namun jika dilihat dari jumlah nilai energi ikatan dari kuersitrin yang lebih kecil dibandingkan natrium diklofenak dapat diprediksi kuersitrin memiliki aktivitas lebih potensial sebagai inhibitor enzim siklooksigenase-2 dibandingkan dengan natrium diklofenak sebagai antiinflamasi secara in silico (gambar 6).

Gambar 6. Visualisasi overlay antara ligan asli, kuersitrin dan natrium diklofenak. Keterangan: ligan asli divisualisasikan dengan warna kuning

C. Hasil Uji In Vivo Ekstrak Etanol Daun Salam (Syzygium polyanthum wight)

Pengujian in vivo pada penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah hasil dari uji in silico dapat dibuktikan secara nyata dengan melakukan pengukuran volume udem terhadap kaki tikus yang diberi karagenan secara sublantar sebagai agen induksi iritan.

Berdasarkan data hasil pengukuran volume udem pada setiap perlakuan (lampiran 1) dapat dihitung persen radang tiap interval waktu untuk mengetahui peningkatan radang pada telapak kaki tikus di setiap pengukuran. Rumus Perhitungan Persen Radang dan AUC yaitu sebagai berikut:

Dalam Utami (2011) persentase radang tiap interval waktu ditentukan dengan persamaan1 berikut (Mansjoer,1997):

%radang = Ut−U0

U0 x 100% (1)

Keterangan:

Ut = Volume telapak kaki tikus pada waktu t U0 = Volume telapak kaki tikus pada waktu ke 0

39

Setelah diperoleh kurva persen radang terhadap waktu, kemudian dihitung AUC (Area Under Curve)0-360 setiap individu dengan persamaan 2:

AUC = ��−1 + ��

2 x (tt - tt-1) (2)

Keterangan:

Rt-1 = persen radang pada waktu t-1 R t = persen radang pada waktu ke-t

Dari harga AUC0-360 pada masing - masing kelompok dapat dihitung nilai persen daya antiinflamasi dengan persamaan 3 (Hidayati, 2008):

%Daya Anti inflamasi = (���k−AUCp )

���� x 100% (3)

Keterangan:

AUCk = luas daerah dibawah kurva persentase radang terhadap waktu kelompok kontrol

AUCp = luas daerah di bawah kurva persentase radang terhadap waktu kelompok perlakuan rata _– rata

Setelah dilakukan perhitungan dengan rumus tersebut, untuk mengetahui perbedaan persen radang pada setiap perlakuan digunakan uji statistik (One Way) ANOVA. Uji (One Way) ANOVA memiliki kriteria yaitu data yang diuji harus independen, terdistribusi normal dan homogen.

Hasil dari uji normalitas data menunjukkan bahwa data persen radang pada setiap kelompok pengukuran terdistribusi normal dan homogen (lampiran 3). Data yang normal dan homogen kemudian dilakukan uji selanjutnya menggunakan uji (One Way) ANOVA.

Hasil uji statistik (One Way) ANOVA (lampiran 4) pada menit ke 30 hingga menit ke 360 terjadi perbedaan terhadap persen radang telapak kaki tikus yang bermakna antar kelompok dengan nilai Sig 0,03 atau (p<0,05) atau pada tingkat kepercayaan 95%. Untuk mengetahui kelompok yang memiliki persamaan atau perbedaan efek dari yang paling kecil ataupun yang paling besar antar kelompok yaitu digunakan uji LSD (Oktiwilianti et al., 2015).

Hasil Uji LSD (lampiran 5) memperlihatkan bahwa persen radang antara kelompok kontrol negatif dan kontrol positif berbeda signifikan (0,003<0,05). Sedangkan pada kelompok kontrol negatif dibandingkan dengan perlakuan dosis ekstrak 33,3 mg/KgBB dan dosis 100 mg/KgBB tidak berbeda signifikan yaitu (p>0,05) namun pada dosis 300 mg/KgBB memiliki beda signifikan yaitu (0,032<0,05), hal ini menunjukkan bahwa persen radang antara kontrol positif atau natrium diklofenak dengan dosis 50 mg tidak memiliki perbedaan yang signifikan dengan pemberian dosis ekstrak daun salam 300 mg/KgBB (0,395>0,05).

Hasil uji (One Way) ANOVA untuk rerata AUC dengan tingkat kepercayaan (P<0,05) pada menit ke 30 hingga menit ke 360 (lampiran 9) memiliki hasil berbeda pada tiap kelompok perlakuan yaitu Sig (0,029<0,05). Dijelaskan pada uji LSD untuk nilai AUC pada kelompok kontrol negatif dan kontrol positif memiliki perbedaan yang signifikan (0,003<0,05) sedangkan untuk kelompok kontrol positif dengan perlakuan pemberian ekstrak daun salam (Syzygium polyanthum) kelompok perlakuan dosis 33,3 mg/KgBB dan dosis 100 mg/KgBB memiliki perbedaan yang signifikan (p<0,05) namun untuk perlakuan

41

ekstrak daun salam dosis 300 mg/KgBB tidak berbeda signifikan (0,372>0,05). Sehingga dapat diketahui pada pemberian ekstrak daun salam dosis 300 mg/KgBB memiliki AUC yang tidak berbeda atau mirip dengan kontrol positifnya yaitu pemberian natrium diklofenak 50 mg.

Dari hasil uji tersebut dapat diketahui bahwa penambahan dosis ekstrak daun salam memiliki efek yang berbeda, untuk pemberiandosis ekstrak daun salam sebanyak 300 mg/kgBB memiliki efek yang tidak berbeda signifikan dengan kontrol positifnya sehingga ekstrak daun salam 300 mg/KgBB dianggap cukup untuk menurunkan radang akut yang diinduksi oleh karagenan pada tikus jantan galur wistar.

Gambar 7. Grafik Persen Radang berdasarkan Perlakuan Perkelompok Uji Dapat dilihat pada gambar 7 bahwa pada kelompok kontrol negatif, injeksi karagenan secara sublantar menghasilkan edema lokal yang meningkat pada menit ke 30 dan terus meningkat pada menit ke 360, hal ini disebabkan pada kelompok perlakuan kontrol negatif tidak dilakukan pemberian agen antiinflamasi.

Persentase radang pada kelompok kontrol positif terus meningkat sampai dengan menit ke 60, kemudian menurun dengan perlahan sampai pada menit

terakhir pengamatan. Persentase radang pada kelompok kontrol positif lebih kecil dibandingkan dengan kelompok negatif karena AINS seperti natrium diklofenak diketahui dapat menekan respon pada fase akhir yaitu fase PG, yang dapat menekan migrasi leukosit mononuklear ke jaringan yang mengalami peradangan (Hidayatiet al., 2008)

Persen radang kelompok perlakuan dosis 300 mg/KgBB secara statistik tidak berbeda signifikan dibandingkan dengan kelompok kontrol positif, persen radang terus meningkat hingga menit ke 150 dan mengalami penurunan perlahan hingga menit akhir pengamatan (gambar 7).

Tabel 3. Harga AUC dan Persen Daya Antiinflamasi tiap Perlakuan

Nilai AUC (Area Under Curve) dapat digunakan untuk mengetahui informasi potensi aktivitas kuersitrin dalam daun salam untuk menurunkan edema. Apabila AUC semakin besar maka efek penurunan volume edema menjadi semakin kecil begitu juga sebaliknya yaitu apabila AUC semakin kecil maka efek penurunan volume edema menjadi semakin besar (Wenny, 2008).

Diketahui bahwa AUC pemberian ekstrak daun salam dosis 300 mg/Kg BB secara statistik melalui uji LSD tidak berbeda signifikan dari perlakuan

Kelompok Harga AUC (ml/jam) (x + SE)

% Daya Antiinflamasi Kontrol Negatif 19,65 ± 1,49 0% Kontrol Positif 12,41 ± 1,10 37% Ekstrak Daun Salam

33,3 mg/KgBB 17,50 ± 1,29 10,9% Ekstrak Daun Salam

100 mg/KgBB 17,49 ± 1,60 11,0% Ekstrak Daun Salam

43

kontrol positif (tabel 3) sehingga dapat diketahui bahwa penurunan volume edema pada pemberian ekstrak daun salam dapat dikatakan setara dengan pemberian perlakuan kontrol positif yaitu natrium diklofenak 50 mg.

Persen daya antiinflamasi kelompok kontrol positif memiliki persen daya antiinflamasi sebesar 37% lebih besar dibandingkan kelompok ekstrak dosis 33,3 mg/KgBB dan dosis 100 mg/Kg BB yaitu sebesar 11% (tabel 3) namun untuk perlakuan ekstrak dosis 300 mg/kgBB tidak berbeda signifikan dengan kontrol positifnya sehingga daya antiinflamasi yang dimiliki oleh kuersitrin sebagai penanda dalam daun salam (Syzygium polyanthum wight) dapat dikatakan berpotensi sebagai antiinflamasi.

44

1. Dari hasil uji in silico dapat diprediksi bahwa daun salam (Syzygium polyanthum wight) dengan senyawa identitas kuersitrin memiliki aktivitas interaksi ikatan yang lebih stabil sebagai inhibitor siklooksigenase-2 dengan nilai energi ikatan -8,6 kkl/mol.

2. Hasil dari uji in vivo memiliki kesesuaian dengan hasil uji in silico yaitu ekstrak daun salam dosis 300 mg/KgBB memiliki daya antiinflamasi yang tidak berbeda signifikan dengan natrium diklofenak dosis 50 mg, yang berarti bahwa aktivitas kuersitrin sebagai senyawa penanda di dalam ekstrak daun salam memiliki potensi sebagai antiinflamasi pada tikus jantan galur Wistar.

B. Saran

Perlu dilakukan uji in vitro terhadap senyawa kuersitrin yang ada di dalam daun salam (Syzygium polyanthum wight) untuk mengetahui lebih dalam potensial antiinflamasi dari senyawa tersebut.

KARYA TULIS ILMIAH

UJI ANTIINFLAMASI EKSTRAK ETANOL DAUN SALAM (Syzygium polyanthum wight) DENGAN METODE IN VIVO DAN IN SILICO PADA

SENYAWA KUERSITRIN

Disusun untuk Memenuhi Sebagian Syarat Memperoleh Derajat Sarjana Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Universitas Muhammadiyah Yogyakarta

Disusun oleh

NAZILA AYU MUTHMAINNAH 20120350055

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH YOGYAKARTA

45

Anief, M., 2000, Ilmu Meracik Obat, Cetakan ke sembilan, 169, Gadjah Mada UI Press, Yogyakarta.

Apriani, F., 2015, Studi Penambatan Molekul Senyawa-Senyawa Amidasi Etil Para Metoksinamat pada Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-Gamma (PPARγ), Skripsi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Program Studi Farmasi, UIN Syarif Hidayatullah, Jakarta.

Apriyono Ari., Abdullah T., 2013, Analisis Overreaction pada saham perusahaan manufaktur di Bursa Efek Indonesia (BEI) Periode 2005-2009.

Calder, P.,C., Alberts, R., Antoine, J.,M., Blum, S.,S., Bourded S., R., Ferns, G.,A, et al,2009, Inflammatory disease proccesses and interactions with nutrition . Brit. J. Nutr, 101,S1-45.

Camuesco, D., Comalada, M., Rodríguez-Cabezas, M. E., Nieto, A., Lorente, M. D., Concha, A., Zarzuelo, A. and Gálvez, J. (2004), The intestinal anti-inflammatory effect of quercitrin is associated with an inhibition in iNOS expression. British Journal of Pharmacology, 143: 908–918. doi:10.1038/sj.bjp.0705941

Dany. P., Lattimer. J. M., Prakash. M., Steiner. A.W., 2013, Stellar Superfluids, Inspire, INT-PUB-009.

Destyka.. F., 2012, Uji Antiinflamasi Ekstrak Umbi Rumput Teki (Cyperus Rotundus L) padaKaki Tikus Wistar Jantan yang Diinduksi Karagen, Skripsi, Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Jember.

Dorland, 2002, Kamus Kedokteran. Jakarta: EGC

Drianti, A.,2012, Analisis Permintaan Tanaman Obat pada Industri Obat Tradisional di Kalimantan Selatan, Jurnal Ekonomi Manajemen Vol. 6 No.1.

46

Dyaningsih, D.,M., 2007, Pengaruh Pemaparan Entamoeba gingivalis Terhadap Jumlah Polimorfonuklear Neutrofil pada Tikus Wistar Jantan dengan Radang Gingiva, Skripsi, Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Jember, Jawa Timur.

Ekawati, G., 2011, Uji Efek Antiinflamasi Infus Rambut Jagung (Zea Mays L) ditinjau dari Penurunan Udem pada Telapak Kaki Tikus Putih Jantan yang Diinduksi Karaginan, Skripsi, Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Indonesia, Jakarta.

Ferencz, L., Muntean Daniella L., 2015, Identification of new superwarfarin-type rodenticides by structural similiarity The docking of ligands on the vitamin K epoxide reductase enzyme’s active site, ACTA Universitatis Sapientiae Agriculture and Environtment, DOI: 10.1515/ausae-2015-0010.

Funkhouser, T., 2007, Protein-Ligand Docking Methods. Princeton, New Jersey, U.S.A: Princeton University.

Haryani, A., Grandiosa, R., Buwono Ibnu, D., Santika, A., 2012, Uji Efektivitas daun Pepaya (Carica Papaya) untuk Pengobatan Infeksi Bakteri Aeromonas hydrophila pada Ikan Mas Koki (Carassius auratus), Jurnal Perikanan dan Kelautan, ISSN:2088-3137.

Hidayati N.A., Shanti. L., Ahmad. D. S., 2008, Kandungan Kimia Dan Uji Antiinflamasi Ekstrak Etanol Lantana Camaral Pada Tikus Putih (Rattus Norvegicus L) Jantan, Bioteknologi, 5 (1):10-17,

ISSN:0216-6887.

http://www.oxforddictionaries.com/definition/english/anti-inflammatory., Diakses pada Juli 2015.

Huey, Ruth, Garrett M. Morris, Arthur J. Olson, and David S. Goodsell., 2007, “A Semiempirical Free Energy Force Field with Charge -Based Desolvation.” Journal of Computational Chemistry 28, no. 6: 1145–52. doi:10.1002/jcc.20634.

Istiqomah, 2013, Perbandingan Metode Ekstraksi Maserasi dan Sokletasi terhadap Kadar Piperin Buah Cabe Jawa (Piperis retrofracti fructus), Skripsi, Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Univesitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah, Jakarta.

Jose I.A, María A.A, Jaime Arias, 2009, Journal of Translational Medicine 2009, 7:19

Katzung, B. G., (1998), Farmakologi Dasar dan Klinik, edisi VI , Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.

Katzung, B. G., 2004, Farmakologi Dasar dan Klinik, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta cit Setiawan, W.,R., 2014, Sintesis Asam 2-(2-(4-Bromo-N-(2,6-Diklorofenil)Benzamida)Fenil) Asetat sebagai Kandidat Obat Penghambat COX, Skripsi,Fakultas Farmasi Universitas Jember.

Korb, O., Stutzel, T., Exner, T.E, 2006. PLANTS:Application of Ant Colony Optimization to Structure-Based Drug Design, LNCS 4150, pp.247-258, 2006.

Kroemer, R.T., 2007, Structure-Based Drug Design: Docking and Scoring. Current Protein and Peptide Science, 8, 312-328.

Kurniawan B., Carolia N., Sukohar A., Thamrin APY., 2012, Jurnal Antiinflammatory Effectiveness of Binahong Leaves Extracts (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) in Male Sprague Dawley Rats Induced by Carrageenan, Medical Faculty of Lampung University, ISSN 2337-3776.

Lakhanpal P., Rai D.K., 2007, Quercetin: A Versatile Flavonoid, Internet Journal Medical

Lin, J.H., Lu, A.Y.H., 1997, Role of Pharmacokinetics and Metabolism in Drugs Discovery and Development. The American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutic.

Lumbanraja, L. B., 2009, Skrining Fitokimia dan Uji Efek Antiinflamasi Ekstrak Etanol Daun Tempuyung (Sonchus arvenis L.) terhadap Radang pada Tikus, Skripsi, Fakultas Farmasi, Universitas Sumatra Utara.

Manuel G.F., Miguel A. P.O., Maria C.F.C., Alba C., Maria L.G.M., Marta Monjo., Joana M.R, 2016, Quercitrin-nanocoated titanium surfaces favour gingival cells against oral bacteria, Sci Rep. 2016; 6: 22444. Published online 2016 Mar 1. doi: 10.1038/srep22444.

Miranti, L., 2009, Pengaruh Konsentrasi Minyak Atsiri Kencur (Kaempferia galanga L.) dengan Basis Salep Larut Air terhadap Sifat Fisik Salep dan Daya Hambat Bakteri Staphylococcus aureus secara In vitro. Skripsi. Universitas Muhamadiyah Surakarta.

48

Monica. C., Desiree. C., Sierra. S., Ballester. I., Jordi. X., Galves. J., Antonio. Z., 2005, In vivo quercitrin anti-inflammantory effect involves release of quercitin, which inhibits inflammation thorugh down-regulation of the NF-kB Pathway, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co KgaA, Weinheim.

Mukesh, B., & Rakesh, K. (2011). Molecular Docking : A Review. IJRAP. Mukhtasyam Z., Muhammad A., dan Subehan, 2012, Kajian Beberapa Senyawa Antiinflamasi : Docking Terhadap Siklooksigenase-2 secara in silico, Majalah Farmasi dan Farmakologi, Vol.16, No.1, pp 37-44.

Muliati, F., 2014, Uji Aktivitas Antiinflamasi Ekstrak Daun Paku Pyrrocia lanceolata (L.) Farw. Terhadap Penghambatan Denaturasi Protein Secara In Vitro, Skripsi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Program Studi Farmasi, UIN Syarif Hidayatullah, Jakarta.

Multazar, A., Nursiah, S., Rambe, A., Harahap Ida, S., 2012, Ekspresi cycloocygenase-2 (COX-2) pada Penderita Rinosinusitis Kronis, Laporan Penelitian, Fakultas Kedokteran Universitas Sumatra Utara, Medan.

Oktiwilianti winda., Umi Yurniarni., Ratu Choerisna, 2015, Uji Aktivitas Antiinflamasi dari Ekstrak Etanol Daun Asam Jawa (Tamarindus Indica L) terhadap Tikus Wistar Jantan, UNISBA, P2U-LPPM). Prasetya, R., C., 2015, Ekspresi dan Peran Siklooksigenase-2 dalam

Berbagai Penyakit di Rongga Mulut, Stomatognatic (J.K.G Unej) Vol.12 No.1: 16-19.

Prasetya, R.,C., Hasniastuti, T., Purwanti, N., 2013, Ekspresi COX-2 setelah pemberian Ekstrak Etanolik Kulit Manggis (Garcinia mangostana Linn) pada Tikus Wistar, Dental Journal, Vol.46 No.4.

Rezi R.S., 2012, Penapisan Virtual Basis Data Senyawa Tanaman Obat di Indonesia Sebagai Inhibitor Enzim–Enzim HIV, Tesis, Universitas Indonesia., Jakarta.

Ruswanto, 2015, Molecular docking empat turunan isonicotino hydrazide pada mycobacterium tuberculosis enoyl-acyl carrier protein reductase (InhA). Vol13, No 1 (2015).

Sandeep, G., Et al,2011, AUDocker LE: A GUI for virtual screening with autodock Vina, BMC Research Notes, 4:445.

Schug SA, 2005, Clinical Pharmachology of non-opioid and opioid Analgesics. Pain 2005 An Update Review. Seattle: IASP Press,h.34-6.

Stables M.,J., Derek W. Gilroy, Old and new generation lipid mediators in acute inflammation and resolution, Progress in Lipid Research, Volume 50, Issue 1, January 2011, Pages 35-51, ISSN 0163-7827, http://dx.doi.org/10.1016/j.plipres.2010.07.005.

Stables MJ, Gilroy DW., 2011, Old and new generation lipid mediators in acute inflammation and resolution. Prog Lipid Res, 50 (1):35-51. Sudirman Azhari, T., 2014, Uji Efektivitas Ekstrak Daun Salam (Eugenia

polyantha) Terhadap Pertumbuhan Staphylococcus aureus Secara In Vitro, Skripsi, Fakultas Kedokteran Gigi, Universitas Hasanuddin, Makassar.

Sugarlini, Soediro I., Soekrasno., Maria I., 2001, Telaah Fitokimia Bahan Aktif Antiradang Dari Daun Salam (Syzygium polyanthum (Wight) Walp., Myrtaceae) [Abstrak], Sekolah Farmasi ITB http://bahan-alam.fa.itb.ac.iddiakses pada juli 2015.

Sujono Azizah, T., Patimah, R., Yuliani, R.,2012, Efek Antiinflamasi Infusa Rimpang Temu Putih (Curcuma zedoaria (Berg)Roscoe) Pada Tikus Yang Diinduksi Karagenin, Biomedika, Vol: 4, No: 2. Swatantra, K., S., K., Neelottama, K., Neeleshwar, M., A.,K., Rai., 2010,

Role of Markers in the Standardization of Herbal Drugs: A Review, Scholars Research Library, ISSN 0975-508X.

Taguchi K., et al.(1993). Pharmacological Studies of Houttuyniae herba: the anti-inflammatory effect of Quercitrin [Abstrack]. Yakugaku Zasshi; 113(4);327-32.

Tutik Wresdiati.,Made Astawan., dan I Ketut Mudite Adnyane, 2003, Aktifitas Anti Inflamasi Oleoresin jahe (Zingiber Officinale) pada ginjal tikus yang mengalami perlakuan stres, Jurnal Teknologi dan Indutri Pangan, Vol.XIV No.2 Th 2003.

Utami, E.,T., Kuncoro, R., A., Hutami, R., I., Sari Finsa, T., Handajani, J., 2011, Efek Antiinflamasi Ekstrak Daun Sembukan (Paederia Scandeus) pada Tikus Wistar, Majalah Obat Tradisional, 16(2), 95-100.

50

Vyas, V., Jain A., Gupta, A., 2008, Virtual Screening: A Fast Tool for Drug Design. Sci Pharm.

Walidah, C., 2014, Uji Efek Antiinflamasi Ekstrak Etil Asetat Lumut Hati Mastigosphora diclados secara In Vivo, Skripsi,Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Program Studi Farmasi, UIN Syarif Hidayatullah, Jakarta.

Waszkowycz.B., Perkins T.D.J., Sykes R.A., Li J, 2001, Large-scale virtual screening for discovering leads in the postgenomic era, IBM Systems Journal, Vol 40, No 2.

Wenny. A., 2008, Efek Antiinflamasi Ekstrak Etanol Daun Jambu Biji (Psidium Guajava Linn) Pada Tikus Putih Jantan Galur Wistar, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta. Widodo, N., 2007, Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Alkaloid yang

terkandung dalam Jamur Tiram Putih, Tugas Akhir II, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Negeri Semarang.

Wijayanti, D., 2013, Efek Analgetik Ekstrak Air Daun Salam (Syzygium polyanthum) pada Mencit dengan Metode Geliat, Naskah Publikasi, Fakultas Farmasi, Universitas Muhammadiyah Surakarta, Surakarta.

Winter CA, Risley EA, Nuss GW (1962). Carrageenan-induced oedema in the hind paw of rat as an assay for anti-inflammatory activity. ProcSoc. Exp. Biol. Ther. 111: 544-547.

i

SENYAWA KUERSITRIN

Disusun untuk Memenuhi Sebagian Syarat Memperoleh Derajat Sarjana Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Universitas Muhammadiyah Yogyakarta

Disusun oleh

NAZILA AYU MUTHMAINNAH 20120350055

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH YOGYAKARTA

iii

PERNYATAAN KEASLIAN

Saya yang bertanda tangan di bawah ini:

Nama : Nazila Ayu Muthmainnah

NIM : 2012 035 0055

Program Studi : Farmasi

Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Menyatakan dengan sebenarnya bahwa Karya Tulis Ilmiah yang saya tulis benar-benar merupakan hasil karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau kutipan dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan tercantumkan dalam Daftar Pustaka dibagian akhir Karya Tulis Ilmiah ini.

Apabila dikemudian hari terbukti atau dibuktikan Karya Tulis Ilmiah ini hasil jiplakan, maka saya bersedia menerima sanksi atas perbuatan tersebut.

Yogyakarta, November 2016 Yang membuat pernyataan

Nazila Ayu Muthmainnah NIM: 2012 035 0055

iv MOTTO

Jika kamu tidak sanggup menahan lelahnya belajar, maka kamu harus sanggup menahan perihnya kebodohan

(Imam Syafi’i)

A person who never made mistake never tried anything new (Albert Einstein)

Khoirunnas anfa’ uhum linnas

“Sebaik-baiknya manusia diantaramu adalah yang paling banyak memberi manfaat bagi orang lain”

v

HALAMAN PERSEMBAHAN

vi

KATA PENGANTAR Assalamu’alaikum Wr. Wb.

Segala puji bagi Allah SWT, tuhan semesta alam yang telah meridhoi dan memberikan kemudahan kepada hamba-Nya dalam menyelesaikan pembuatan karya tulis ilmiah yang berjudul “UJI ANTIINFLAMASI EKSTRAK ETANOL DAUN SALAM (Syzygium polyanthum wight) DENGAN METODE IN VIVO DAN IN SILICO PADA SENYAWA KUERSITRIN”. Sholawat serta salam untuk Nabi Besar Muhammad SAW, beserta keluarga, sahabat dan pengikutnya yang senantiasa istiqamah di jalan-Nya. Karya tulis ini dibuat sebagai salah satu persyaratan kelulusan mahasiswa Program Sarjana S1 Universitas muhammadiyah Yogyakarta. Namun, sebaik apapun karya tulis ini. Penulis menyadari bahwa Karya Tulis Ilmiah ini dibuat atas bantuan dari berbagai pihak. Untuk itu sudah sepantasnya penulis mengucapkan terima kasih kepada :

1. Bapak dr. Ardi Pramono Sp.An., M.Kes. selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Muhammadiyah Yogyakarta. 2. Ibu Sabtanti Harimurti, S.Si., M.Sc., Ph.D., Apt. selaku Ketua Program

Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Muhammadiyah Yogyakarta.

3. Ibu Indriastuti Cahyaningsih M.Sc., Apt selaku Dosen Pembimbing Akademik. Terimakasih untuk bimbingan selama penulis menempuh pendidikan.

vii

4. Bapak Hari Widada, M.Sc.,Apt selaku dosen pembimbing penulis. Terimakasih untuk kesabaran dalam memberikan bimbingan dan saran selama penelitian dan penulisan karya tulis ini.

5. Bapak/Ibu dosen pengajar yang telah mendidik penulis selama masa perkuliahan.

6. Sahabatku, Eka, Wanti, Resita, Aida, Linda, Imas, Mustika yang selalu memberikan dukungan dan semangat

7. Part of my life Endah dan Ciki terimakasih untuk tahun-tahun yang menyenangkan

8. Anak_–anak kos yang selalu memberi dukungan

9. Mas Satria dan Mbak Zelmi yang selalu bersedia membantu selama proses penelitian.

10.Teman seperjuangan Ratih, Indah, Tamam, Adit yang saling membantu serta bahu membahu dalam berjuang menyelesaikan penelitian

11.Ayin, Waralita yang telah bersedia berdiskusi dan selalu memberi semangat.

12.ASPARTIC Farmasi 2012 yang selama 4 tahun ini telah bersama dalam menempuh pendidikan.

13.Semua pihak yang terkait dalam penelitian ini. Terimakasih atas dukungan yang diberikan baik yang bersifat material maupun non material, alunan doa, dukungan serta bimbingan selama penulisan Karya Tulis Ilmiah.

viii

Penulis menyadari sepenuhnya bahwa penyusunan KTI ini masih jauh dari kesempurnaan. Oleh karena itu, penulis mengharapkan saran yang bersifat membangun dan mendukung kemanfaatan hasil penelitian ini.

Wassalamu‟alaikum Wr. Wb.

Yogyakarta, 02 November 2016 Penulis

ix DAFTAR ISI

HALAMAN PENGESAHAN ... Error! Bookmark not defined. PERNYATAAN KEASLIAN ... iii MOTTO... iv HALAMAN PERSEMBAHAN ... v KATA PENGANTAR ... vi DAFTAR ISI ... ix DAFTAR TABEL ... xi DAFTAR GAMBAR ... xii LAMPIRAN ... xiii INTISARI ... Error! Bookmark not defined. ABSTRACK ... Error! Bookmark not defined. BAB I ... Error! Bookmark not defined. A. Latar Belakang... Error! Bookmark not defined. B. Rumusan Masalah ... Error! Bookmark not defined. C. Keaslian Penelitian ... Error! Bookmark not defined. D. Tujuan Penelitian ... Error! Bookmark not defined. E. Manfaat Penelitian ... Error! Bookmark not defined. BAB II ... Error! Bookmark not defined. A. Radang ... Error! Bookmark not defined. 1. Definisi ... Error! Bookmark not defined. 2. Patofisiologi ... Error! Bookmark not defined. B. Siklooksigenase-2 (COX-2) ... Error! Bookmark not defined. C. Obat Antiinflamasi... Error! Bookmark not defined. D. Daun Salam (Syzygium polyanthum wight).. Error! Bookmark not defined. E. Karagenan... Error! Bookmark not defined. F. Penambatan Molekul (Molecular Docking) . Error! Bookmark not defined. G. Maserasi ... Error! Bookmark not defined.

x

J. Hipotesis ... Error! Bookmark not defined. BAB III... Error! Bookmark not defined. A. Desain Penelitian ... Error! Bookmark not defined. B. Tempat Penelitian ... Error! Bookmark not defined. C. Waktu Penelitian... Error! Bookmark not defined. D. Variabel Penelitian... Error! Bookmark not defined. E. Definisi Operasional ... Error! Bookmark not defined. F. Instrumen Penelitian ... Error! Bookmark not defined. G. Cara Kerja ... Error! Bookmark not defined. 1. Uji In Silico ... Error! Bookmark not defined. 2. Maserasi Simplisia Daun Salam (Syzygium polyanthum wight) ... Error! Bookmark not defined.

3. Uji In Vivo ... Error! Bookmark not defined. H. Skema Langkah Kerja ... Error! Bookmark not defined. I. Analisis Data ... Error! Bookmark not defined. BAB IV ... Error! Bookmark not defined. A. Validasi Metode Docking dengan Autodock Vina ... Error! Bookmark not defined.

B. Hasil Uji In Silico Senyawa Penanda Daun Salam (Kuersitrin) dengan Senyawa Pembanding dan Native Ligand Protein 6COX dengan Metode Molekular Docking Autodock Vina ... Error! Bookmark not defined. C. Hasil Uji In Vivo Ekstrak Etanol Daun Salam (Syzygium polyanthum wight) . ... Error! Bookmark not defined. BAB V ... Error! Bookmark not defined. A. Kesimpulan ... Error! Bookmark not defined. B. Saran ... Error! Bookmark not defined. DAFTAR PUSTAKA ... Error! Bookmark not defined. LAMPIRAN ... Error! Bookmark not defined.

NAZILA AYU M 20120350055 FARMASI UMY P a g e | 7

memiliki perbedaan yang signifikan (p<0,05) namun untuk perlakuan ekstrak daun salam dosis 300 mg/KgBB tidak berbeda signifikan (0,372>0,05). Sehingga dapat diketahui pada pemberian ekstrak daun salam dosis 300 mg/KgBB memiliki AUC yang tidak berbeda atau mirip dengan kontrol positifnya yaitu pemberian natrium diklofenak 50 mg.

Dari hasil uji tersebut dapat diketahui bahwa penambahan dosis ekstrak daun salam memiliki efek yang berbeda, untuk pemberian dosis ekstrak daun salam sebanyak 300 mg/kgBB memiliki efek yang tidak berbeda signifikan dengan kontrol positifnya sehingga ekstrak daun salam 300 mg/KgBB dianggap cukup untuk menurunkan radang akut yang diinduksi oleh karagenan pada tikus jantan galur wistar.

Nilai AUC (Area Under Curve) dapat digunakan untuk mengetahui informasi potensi aktivitas kuersitrin dalam daun salam untuk menurunkan edema. Apabila AUC semakin besar maka efek penurunan volume edema menjadi semakin kecil begitu juga sebaliknya yaitu apabila AUC semakin kecil maka efek penurunan volume edema menjadi semakin besar (Wenny, 2008).

Diketahui bahwa pada tabel 2 AUC pemberian ekstrak daun salam dosis 300 mg/Kg BB secara statistik melalui uji LSD tidak berbeda signifikan dari perlakuan kontrol positif sehingga dapat diketahui bahwa penurunan volume edema pada pemberian ekstrak daun salam dapat dikatakan setara dengan pemberian perlakuan kontrol positif yaitu natrium diklofenak 50 mg.

Tabel 2. Harga AUC dan Persen Daya Antiinflamasi tiap Perlakuan

KESIMPULAN

1. Dari hasil uji in silico dapat diprediksi bahwa daun salam (Syzygium polyanthum wight) dengan senyawa identitas kuersitrin memiliki aktivitas interaksi ikatan yang lebih stabil sebagai inhibitor siklooksigenase-2 dengan nilai energi ikatan -8,6 kkl/mol.

2. Hasil dari uji in vivo memiliki kesesuaian dengan hasil uji in silico yaitu ekstrak daun salam dosis 300 mg/KgBB memiliki daya antiinflamasi yang tidak berbeda signifikan dengan natrium diklofenak dosis 50 mg, yang berarti bahwa aktivitas kuersitrin sebagai senyawa penanda di dalam ekstrak daun salam memiliki potensi sebagai antiinflamasi pada tikus jantan galur Wistar.

SARAN

Perlu dilakukan uji in vitro terhadap senyawa kuersitrin yang ada di dalam daun salam (Syzygium polyanthum wight) untuk mengetahui lebih dalam potensial antiinflamasi dari senyawa tersebut.

Kelompok _{(ml/jam) (x + SE)}Harga AUC _{Antiinflamasi} % Daya Kontrol Negatif 19,65 ± 1,49 0% Kontrol Positif 12,41 ± 1,10 37% Ekstrak Daun Salam

33,3 mg/KgBB 17,50 ± 1,29 10,9% Ekstrak Daun Salam

100 mg/KgBB 17,49 ± 1,60 11,0% Ekstrak Daun Salam

NAZILA AYU M 20120350055 FARMASI UMY P a g e | 8

DAFTAR PUSTAKA

Agustina, R., Indrawati, T., D., Masruhin, M., A., 2015, Aktivitas Ekstrak Daun Salam (Eugenia Polyantha) sebagai Antiinflamasi pada Tikus Putih (Rattus Norvergicus), J.Trop. Pharm. Chem. Vol 3. No 2.

Anief, M., 2000, Ilmu Meracik Obat, Cetakan ke sembilan, 169, Gadjah Mada UI Press, Yogyakarta.

Apriani, F., 2015, Studi Penambatan Molekul Senyawa-Senyawa Amidasi Etil Para Metoksinamat pada Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-Gamma (PPARγ), Skripsi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Program Studi Farmasi, UIN Syarif Hidayatullah, Jakarta.

Apriyono Ari., Abdullah T., 2013, Analisis Overreaction pada

saham perusahaan

manufaktur di Bursa Efek Indonesia (BEI) Periode 2005-2009.

Calder, P.,C., Alberts, R., Antoine, J.,M., Blum, S.,S., Bourded S., R., Ferns, G.,A, et al,2009, Inflammatory disease proccesses and interactions with nutrition . Brit. J. Nutr, 101,S1-45. Camuesco, D., Comalada, M.,

Rodríguez-Cabezas, M. E., Nieto, A., Lorente, M. D., Concha, A., Zarzuelo, A. and Gálvez, J. (2004), The intestinal anti-inflammatory

effect of quercitrin is associated with an inhibition in iNOS expression. British Journal of Pharmacology,

143: 908_–918.

doi:10.1038/sj.bjp.0705941 Dany. P., Lattimer. J. M., Prakash.

M., Steiner. A.W., 2013, Stellar Superfluids, Inspire, INT-PUB-009.

Destyka.. F., 2012, Uji Antiinflamasi Ekstrak Umbi Rumput Teki (Cyperus Rotundus L) padaKaki Tikus Wistar Jantan yang Diinduksi Karagen, Skripsi, Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Jember. Dorland, 2002, Kamus Kedokteran.

Jakarta: EGC

Drianti, A.,2012, Analisis Permintaan Tanaman Obat pada Industri Obat Tradisional di Kalimantan Selatan, Jurnal Ekonomi Manajemen Vol. 6 No.1. Dyaningsih, D.,M., 2007, Pengaruh

Pemaparan Entamoeba gingivalis Terhadap Jumlah Polimorfonuklear Neutrofil pada Tikus Wistar Jantan dengan Radang Gingiva, Skripsi, Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Jember, Jawa Timur.

Ekawati, G., 2011, Uji Efek Antiinflamasi Infus Rambut Jagung (Zea Mays L) ditinjau dari Penurunan Udem pada Telapak Kaki Tikus Putih Jantan yang Diinduksi Karaginan, Skripsi, Fakultas Matematika Dan Ilmu

NAZILA AYU M 20120350055 FARMASI UMY P a g e | 9

Pengetahuan Alam

Universitas Indonesia, Jakarta.

Ferencz, L., Muntean Daniella L., 2015, Identification of new superwarfarin-type

rodenticides by structural similiarity The docking of ligands on the vitamin K epoxide reductase enzyme’s active site, ACTA Universitatis Sapientiae

Agriculture and

Environtment, DOI: 10.1515/ausae-2015-0010. Funkhouser, T., 2007,

Protein-Ligand Docking Methods. Princeton, New Jersey, U.S.A: Princeton University. Haryani, A., Grandiosa, R., Buwono

Ibnu, D., Santika, A., 2012, Uji Efektivitas daun Pepaya (Carica Papaya) untuk Pengobatan Infeksi Bakteri Aeromonas hydrophila pada Ikan Mas Koki (Carassius auratus), Jurnal Perikanan dan Kelautan, ISSN:2088-3137.

Hidayati N.A., Shanti. L., Ahmad. D. S., 2008, Kandungan Kimia Dan Uji Antiinflamasi Ekstrak Etanol Lantana Camaral Pada Tikus Putih (Rattus Norvegicus L) Jantan, Bioteknologi, 5 (1):10-17, ISSN:0216-6887.

Istiqomah, 2013, Perbandingan Metode Ekstraksi Maserasi dan Sokletasi terhadap Kadar Piperin Buah Cabe Jawa (Piperis retrofracti fructus), Skripsi, Program Studi

Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Univesitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah, Jakarta. Jose I.A, María A.A, Jaime Arias,

2009, Journal of Translational Medicine 2009, 7:19

Katzung, B. G., (1998), Farmakologi Dasar dan Klinik, edisi VI , Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.

Katzung, B. G., 2004, Farmakologi Dasar dan Klinik, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta cit Setiawan, W.,R., 2014, Sintesis Asam 2-(2-(4-

Bromo-N-(2,6-Diklorofenil)Benzamida)Feni l) Asetat sebagai Kandidat Obat Penghambat COX, Skripsi,Fakultas Farmasi Universitas Jember.

Korb, O., Stutzel, T., Exner, T.E, 2006. PLANTS:Application of Ant Colony Optimization to Structure-Based Drug Design, LNCS 4150, pp.247-258, 2006.

Kroemer, R.T., 2007, Structure-Based Drug Design: Docking and Scoring. Current Protein and Peptide Science, 8, 312-328.

Kurniawan B., Carolia N., Sukohar A., Thamrin APY., 2012, Jurnal Antiinflammatory Effectiveness of Binahong Leaves Extracts (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) in Male Sprague Dawley Rats Induced by Carrageenan,

NAZILA AYU M 20120350055 FARMASI UMY P a g e | 10

Medical Faculty of Lampung University, ISSN 2337-3776. Lakhanpal P., Rai D.K., 2007, Quercetin: A Versatile Flavonoid, Internet Journal Medical

Lin, J.H., Lu, A.Y.H., 1997, Role of Pharmacokinetics and Metabolism in Drugs Discovery and Development. The American Society for

Pharmacology and

Experimental Therapeutic. Lumbanraja, L. B., 2009, Skrining

Fitokimia dan Uji Efek Antiinflamasi Ekstrak Etanol Daun Tempuyung (Sonchus arvenis L.) terhadap Radang pada Tikus, Skripsi, Fakultas Farmasi, Universitas Sumatra Utara.

Miranti, L., 2009, Pengaruh Konsentrasi Minyak Atsiri Kencur (Kaempferia galanga L.) dengan Basis Salep Larut Air terhadap Sifat Fisik Salep dan Daya Hambat Bakteri Staphylococcus aureus secara In vitro. Skripsi. Universitas Muhamadiyah Surakarta. Monica. C., Desiree. C., Sierra. S.,

Ballester. I., Jordi. X., Galves. J., Antonio. Z., 2005, In vivo quercitrin anti-inflammantory effect involves release of quercitin, which inhibits inflammation thorugh down-regulation of the NF-kB Pathway, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co KgaA, Weinheim.

Mukesh, B., & Rakesh, K. (2011). Molecular Docking : A Review. IJRAP.

Mukhtasyam Z., Muhammad A., dan Subehan, 2012, Kajian

Beberapa Senyawa

Antiinflamasi : Docking Terhadap Siklooksigenase-2 secara in silico, Majalah Farmasi dan Farmakologi, Vol.16, No.1, pp 37-44. Multazar, A., Nursiah, S., Rambe,

A., Harahap Ida, S., 2012, Ekspresi cycloocygenase-2 (COX-2) pada Penderita Rinosinusitis Kronis, Laporan Penelitian, Fakultas Kedokteran Universitas Sumatra Utara, Medan. Oktiwilianti winda., Umi Yurniarni.,

Ratu Choerisna, 2015, Uji Aktivitas Antiinflamasi dari Ekstrak Etanol Daun Asam Jawa (Tamarindus Indica L) terhadap Tikus Wistar Jantan, UNISBA, P2U-LPPM). Prasetya, R., C., 2015, Ekspresi dan

Peran Siklooksigenase-2 dalam Berbagai Penyakit di Rongga Mulut, Stomatognatic (J.K.G Unej) Vol.12 No.1: 16-19.

Prasetya, R.,C., Hasniastuti, T., Purwanti, N., 2013, Ekspresi COX-2 setelah pemberian Ekstrak Etanolik Kulit Manggis (Garcinia mangostana Linn) pada Tikus Wistar, Dental Journal, Vol.46 No.4.

NAZILA AYU M 20120350055 FARMASI UMY P a g e | 11

Rezi R.S., 2012, Penapisan Virtual Basis Data Senyawa Tanaman Obat di Indonesia Sebagai Inhibitor Enzim– Enzim HIV, Tesis, Universitas Indonesia., Jakarta.

Ruswanto, 2015, Molecular docking empat turunan isonicotino

hydrazide pada

mycobacterium tuberculosis enoyl-acyl carrier protein reductase (InhA). Vol13, No 1 (2015).

Sandeep, G., Et al,2011, AUDocker LE: A GUI for virtual screening with autodock Vina, BMC Research Notes, 4:445.

Schug SA, 2005, Clinical Pharmachology of non-opioid and opioid Analgesics. Pain 2005 An Update Review. Seattle: IASP Press,h.34-6. Stables M.,J., Derek W. Gilroy, Old

and new generation lipid mediators in acute inflammation and resolution, Progress in Lipid Research, Volume 50, Issue 1, January 2011, Pages 35-51, ISSN 0163-7827,

http://dx.doi.org/10.1016/j.pli pres.2010.07.005.

Sudirman Azhari, T., 2014, Uji Efektivitas Ekstrak Daun Salam (Eugenia polyantha) Terhadap Pertumbuhan Staphylococcus aureus Secara In Vitro, Skripsi, Fakultas Kedokteran Gigi, Universitas Hasanuddin, Makassar.

Sugarlini, Soediro I., Soekrasno., Maria I., 2001, Telaah Fitokimia Bahan Aktif Antiradang Dari Daun Salam (Syzygium polyanthum (Wight) Walp., Myrtaceae) [Abstrak], Sekolah Farmasi

ITB

http://bahan-alam.fa.itb.ac.iddiakses pada juli 2015.

Sujono Azizah, T., Patimah, R., Yuliani, R.,2012, Efek Antiinflamasi Infusa Rimpang Temu Putih (Curcuma zedoaria (Berg)Roscoe) Pada Tikus Yang Diinduksi Karagenin, Biomedika, Vol: 4, No: 2. Swatantra, K., S., K., Neelottama,

K., Neeleshwar, M., A.,K., Rai., 2010, Role of Markers in the Standardization of Herbal Drugs: A Review, Scholars Research Library, ISSN 0975-508X.

Taguchi K., et al.(1993). Pharmacological Studies of Houttuyniae herba: the anti-inflammatory effect of Quercitrin [Abstrack].

Yakugaku Zasshi;

113(4);327-32.

Tutik Wresdiati.,Made Astawan., dan I Ketut Mudite Adnyane, 2003, Aktifitas Anti Inflamasi Oleoresin jahe (Zingiber Officinale) pada ginjal tikus yang mengalami perlakuan stres, Jurnal Teknologi dan Indutri Pangan, Vol.XIV No.2 Th 2003.

NAZILA AYU M 20120350055 FARMASI UMY P a g e | 12

Utami, E.,T., Kuncoro, R., A., Hutami, R., I., Sari Finsa, T., Handajani, J., 2011, Efek Antiinflamasi Ekstrak Daun Sembukan (Paederia Scandeus) pada Tikus Wistar, Majalah Obat Tradisional, 16(2), 95-100.

Vyas, V., Jain A., Gupta, A., 2008, Virtual Screening: A Fast Tool for Drug Design. Sci Pharm.

Walidah, C., 2014, Uji Efek Antiinflamasi Ekstrak Etil Asetat Lumut Hati Mastigosphora diclados

secara In Vivo,

Skripsi,Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Program Studi Farmasi, UIN Syarif Hidayatullah, Jakarta.

Wenny. A., 2008, Efek Antiinflamasi Ekstrak Etanol Daun Jambu Biji (Psidium Guajava Linn) Pada Tikus Putih Jantan Galur Wistar, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta.

Widodo, N., 2007, Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Alkaloid yang terkandung dalam Jamur Tiram Putih, Tugas Akhir II, Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam

Universitas Negeri Semarang. Wijayanti, D., 2013, Efek Analgetik

Ekstrak Air Daun Salam (Syzygium polyanthum) pada Mencit dengan Metode Geliat, Naskah Publikasi,

Fakultas Farmasi, Universitas Muhammadiyah Surakarta, Surakarta.