Uji Toksisitas Senyawa Bioaktif dari Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons
UJI TOKSISITAS SENYAWA BIOAKTIF DARI BAKTERI
YANG BERASOSIASI DENGAN SPONS
ANNISA WULAN AGUS UTAMI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi yang berjudul “Uji Toksisitas
Senyawa Bioaktif dari Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons” adalah benar karya
saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk
apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Juli 2013
Annisa Wulan Agus Utami
NIM G34090001
ABSTRAK
ANNISA WULAN AGUS UTAMI. Uji Toksisitas Senyawa Bioaktif dari Bakteri
yang Berasosiasi dengan Spons. Dibimbing oleh ARIS TRI WAHYUDI dan DUDI
TOHIR.
Senyawa bioaktif dari bakteri yang berasosiasi dengan spons telah diteliti
bermanfaat sebagai sumber berbagai senyawa bioaktif. Uji toksisitas senyawa
bioaktif dilakukan sebagai uji awal untuk menentukan potensi senyawa bioaktif
dalam pengembangan obat-obatan. Penelitian ini bertujuan mengekstraksi dan
memfraksionasi senyawa bioaktif dari bakteri yang berasosiasi dengan spons serta
menguji toksisitasnya terhadap Artemia salina. Isolat bakteri yang diisolasi dari
spons dengan kode SAB E-31, SAB E-41, SAB E-57, HAL-13, HAL-74, dan
HAA-01 masing-masing diekstraksi menggunakan pelarut etil asetat. Ekstrak etil
asetat isolat SAB E-31, SAB E-41, SAB E-57, HAL-13, HAA-01 bersifat bioaktif
dengan nilai LC50 ekstrak etil asetat terendah yaitu 251.18 µg mL-1 dari ekstrak
isolat SAB E-41 . Sebanyak tiga ekstrak etil asetat terbaik dengan kode SAB E31, SAB E-41, dan SAB E-57 difraksionasi menggunakan kromatografi lapis tipis
preparatif (KLTP) dengan eluen n-butanol: etil asetat (3:7). Hasil fraksionasi dari
tiga ekstrak etil asetat terbaik diperoleh 19 fraksi yang diantaranya terdapat 9
fraksi yang bersifat bioaktif dengan nilai LC50 terendah yaitu fraksi P SAB E-57
sebesar 46.74 µg mL-1.
Kata kunci : ekstraksi, fraksionasi, senyawa bioaktif, toksisitas,.
ABSTRACT
ANNISA WULAN AGUS UTAMI. Toxicity of Bioactive Compounds from
Bacteria
Associated
with
Sponges. Supervised
by ARIS
TRI
WAHYUDI and DUDI TOHIR.
Marine bacteria associated with sponges have been known as a source of
bioactive compounds. Toxicity test of this compounds was done as initial test to
determine the potency of bioactive compounds in pharmaceuticals development.
The aim of this study was to extract and fractionate bioactive compounds from
marine bacteria associated with sponges and to test its toxicity toward Artemia
salina. Bacterial isolate of SAB E-31, SAB E-41, SAB E-57, HAL-13, HAL-74,
and HAA-01 isolated from sponge were used as source of bioactive compounds.
The bioactive compounds were extracted by using ethyl acetate. The ethyl acetate
extract of SAB E-31, SAB E-41, SAB E-57, HAL-13, and HAA-01 were active
with the lowest LC50 was 251.18 µg mL-1 from ethyl acetate extract of SAB E-41.
The three of best ethyl acetate extract, SAB E-31, SAB E-41, and SAB E-57 were
fractionated by preparative thin layer chromatography (PTLC) using eluent of nbutanol: ethyl acetate (3:7). Fractionation results of the three best ethyl acetate
extract obtained 19 fractions, and 9 fraction among them were active fraction with
the lowest LC50 from the fraction was 46.74 µg mL-1 come from SAB E-57.
Keywords: bioactive compounds, extraction, fractionation, toxicity.
UJI TOKSISITAS SENYAWA BIOAKTIF DARI BAKTERI
YANG BERASOSIASI DENGAN SPONS
ANNISA WULAN AGUS UTAMI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi: Uji Toksisitas Senyawa Bioaktif dan Bakten yang Berasosiasi
dengan Spons
: Annisa Wulan Agus Utami
Nama
: 034090001
NIM
Disetujui oleh
ｾ＠
Prof Dr Aris Tri Wahyudi, MSi
Pembimbing I
Tanggal Lulus: 22 JUL 7013
t.
Drs Dudi To ir, MS
Pembimbing II
Judul Skripsi : Uji Toksisitas Senyawa Bioaktif dari Bakteri yang Berasosiasi
dengan Spons
Nama
: Annisa Wulan Agus Utami
NIM
: G34090001
Disetujui oleh
Drs Dudi Tohir, MS
Pembimbing II
Prof Dr Aris Tri Wahyudi, MSi
Pembimbing I
Diketahui oleh
Dr Ir Iman Rusmana, MSi
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karuniaNya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Desember 2012 sampai Mei
2013 ini ialah mikrobiologi medis, dengan judul “Uji Toksisitas Senyawa Bioaktif
dari Bakteri yang berasosiasi dengan Spons”.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Prof Dr Aris Tri Wahyudi,
MSi dan Bapak Drs Dudi Tohir, MS selaku pembimbing karya ilmiah ini serta
kepada Ibu Dr Triadiarti, MSi selaku komisi penguji wakil Komisi Pendidikan.
Penelitian ini dibiayai oleh Penelitian Unggulan Strategis IPB 2013 kepada Prof Dr
Aris Tri Wahyudi, MSi, untuk itu penulis mengucapkan terima kasih. Penulis juga
menyampaikan penghargaan kepada Bapak Jaka dan Ibu Heni sebagai laboran
Mikrobiologi, Bapak Sobur sebagai laboran Kimia Organik, serta rekan kerja di
laboratorium Mikrobiologi dan Kimia Organik yang telah banyak membantu dan
memberikan saran dalam proses penelitian. Ungkapan terima kasih juga
disampaikan kepada ayah, ibu, serta seluruh keluarga, atas doa dan kasih
sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Juli 2013
Annisa Wulan Agus Utami
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
viii
DAFTAR GAMBAR
viii
DAFTAR LAMPIRAN
viii
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
1
2
2
2
1
METODE
Bahan
Alat
Prosedur
3
3
3
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Pembahasan
4
4
10
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
13
13
13
DAFTAR PUSTAKA
13
LAMPIRAN
16
RIWAYAT HIDUP
17
DAFTAR TABEL
1 Ekstraksi dan toksisitas (LC50) ekstrak etil asetat dari isolat bakteri yang
berasosiasi dengan spons
2 Nilai Probit ekstrak etil asetat dari isolat bakteri yang berasosiasi
dengan spons
3 Toksisitas (LC50) fraksi isolat bakteri yang berasosiasi dengan spons
5
5
10
DAFTAR GAMBAR
1 Hubungan mortalitas probit dengan log konsentrasi ekstrak etil asetat
2 Fraksionasi menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) analitik
3 Fraksionasi dari ekstrak etil asetat SAB E-57 menggunakan
kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP)
6
8
9
DAFTAR LAMPIRAN
1 Komposisi medium sea water complete (SWC)
2 Larva Artemia salina umur 24 jam
15
15
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Senyawa bioaktif dari spons telah diteliti memiliki potensi sebagai
antibakteri, anticendawan, antikanker, antiviral, dan antiinflamasi (Thakur &
Muller 2004; Thakur et al. 2005; Taylor et al. 2007). Senyawa bioaktif tersebut
umumnya merupakan turunan dari asam amino dan nukleosida, flavonoid,
alkaloid, terpenoid, makrolid, porfirin, peroksida alifatik, dan sterol (Thakur &
Muller 2004; Taylor et al. 2007). Spons menjadi fokus penelitian saat ini karena
kelompok hewan ini membentuk asosiasi yang erat dengan berbagai mikroba dan
menjadi sumber berbagai senyawa bioaktif. Spons mendominasi produksi
senyawa bioaktif yang berasal dari laut dengan laporan lebih dari 200 senyawa
metabolit baru dilaporkan tiap tahunnya (Taylor et al. 2007).
Pengembangan senyawa bioaktif yang berasal dari spons mengalami
hambatan karena memerlukan biomassa spons yang besar untuk mengekstraksi
senyawa bioaktif dalam aplikasinya di bidang medis (Proksch et al. 2002). Wang
(2006) melaporkan bahwa spons menjadi inang dari berbagai jenis mikroba secara
umum yang dapat mencapai 50-60% dari volume jaringan spons. Komunitas
mikroba yang beragam dan berjumlah besar pada hewan spons diduga merupakan
sumber dari berbagai senyawa bioaktif tersebut. Isolasi bakteri yang bersimbiosis
dengan spons, karakterisasi molekuler, dan karakterisasi senyawa bioaktif yang
dihasilkan bakteri tersebut merupakan strategi yang dapat digunakan untuk
memproduksi berbagai senyawa bioaktif dalam jumlah besar (Proksch et al.
2002).
Tokasaya (2010) telah berhasil mengisolasi bakteri dengan kode HAL-13,
HAL-74, dan HAA-01 dari spons Haliclona sp. Isolat tersebut telah dilaporkan
memiliki kemampuan untuk menghambat pertumbuhan bakteri patogen
enteropatogenik Escherichia coli K1-1, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus
aureus, serta khamir Candida albicans dan Candida tropicalis. Isolat bakteri
tersebut kemudian diteliti lebih lanjut oleh Banoet (2011) yang melaporkan bahwa
ekstrak etil asetat yang dihasilkan oleh isolat HAL-13, HAL-74, maupun HAA-01
memiliki aktivitas antimikrob berspektrum luas terhadap bakteri patogen maupun
khamir patogen. Pemurnian senyawa antimikrob dari ekstrak etil asetat yang
dihasilkan oleh salah satu isolat, yaitu HAL-13, menghasilkan tujuh senyawa
bioaktif yang memiliki aktivitas antimikrob terhadap strain uji EPEC K1-1.
Isolat bakteri dengan kode SAB E-31, SAB E-41 dan SAB E-57 telah
berhasil diisolasi oleh Abubakar et al. (2011) dari spons Jaspis sp. Isolat tersebut
telah dilaporkan memiliki kemampuan untuk menghambat pertumbuhan bakteri
patogen S. aureus, E. coli, enteropatogenik E. coli K1-1, P. aeruginosa, C.
albicans dan C. tropicalis. Ketiga isolat tersebut memiliki kluster gen pengkode
kompleks enzim poliketid sintase (PKS) dan non-ribosomal poliketid sintase
(NRPS) yang menyandikan pembentukan senyawa bioaktif Effendi (2011).
Karakteristik morfologi isolat bakteri SAB E-31, SAB E-41, SAB E-57, HAL-13,
HAL 74 dan HAA-01 merupakan gram positif, berbentuk batang, dan membentuk
2
endospora. Isolat tersebut memiliki karakteristik genetik yang berasal dari genus
Bacillus dengan jenis berbeda-beda yaitu SAB E-31 jenis Bacillus pumilus; SAB
E-41 jenis Bacillus amyloliquefaciens; SAB E-57, HAL-13, HAL-74 dan HAA-01
jenis Bacillus subtilis (Tokasaya 2010; Effendi 2012).
Penelitian tentang toksisitas senyawa bioaktif dari isolat bakteri SAB E-31,
SAB E-41, SAB E-57, HAL-13, HAL-74, dan HAA-01 hingga saat ini belum
pernah dilakukan. Salah satu uji toksisitas adalah dengan uji bioaktivitas brine
shrimp lethality test (BSLT) menggunakan larva udang Artemia salina untuk
menentukan nilai kematian 50% atau disebut LC50 sebagai kadar minimum
toksiksitas suatu zat. Ekstrak yang diperoleh difraksionasi menggunakan
kromatografi untuk mendapatkan nilai LC50 yang lebih rendah. Penelitian ini
bertujuan memperoleh ekstrak dan fraksi bioaktif dari bakteri yang berasosiasi
dengan spons.
Perumusan Masalah
Salah satu manfaat penting yang dihasilkan spons yaitu kemampuannya
dalam menghasilkan senyawa metabolit sekunder yang bersifat senyawa bioaktif.
Pemanfaatan spons laut saat ini untuk produk komersial senyawa bioaktif
umumnya dilakukan dengan cara mengambil langsung di alam. Apabila hal
tersebut dilakukan secara berkelanjutan dapat mengakibatkan penurunan populasi
secara signifikan. Oleh karena itu dibutuhkan metode produksi senyawa bioaktif
yang tetap mempertahankan kelestarian sumber daya alam secara
berkesinambungan salah satunya dengan mengekstraksi senyawa bioaktif dari
mikrob yang berasosiasi dengan spons. Analisis suatu senyawa bioaktif baru yang
berpotensi sebagai senyawa sitotoksik terhadap sel hidup ataupun sel kanker dapat
menggunakan metode brine shrimp lethality test (BSLT).
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan menguji toksisitas ekstrak dan fraksi senyawa
bioaktif dari bakteri yang berasosiasi dengan spons terhadap larva udang Artemia
salina.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan mendapatkan ekstrak dan fraksi senyawa bioaktif
yang memiliki nilai toksisitas yang cukup rendah dan berpotensi sebagai senyawa
bioaktif.
3
METODE
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Desember 2012 – Mei 2013 di
Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi dan Laboratorium Kimia
Organik Departemen Kimia, FMIPA, IPB.
Bahan
Bahan yang digunakan adalah isolat-isolat terbaik bakteri yang berasosiasi
dengan spons yaitu SAB E-31, SAB E-41, SAB E-57 (Abubakar et al. 2011),
HAL-13, HAL-74, dan HAA-01 (Tokasaya 2010), larva Artemia salina (Nauplii),
media sea water complete (SWC) (Lampiran 1), etil asetat, metanol, n-butanol,
tween-80, alkohol 70%, dan silica gel 60F254.
Alat
Alat laboratorium yang digunakan adalah pelat kaca, chamber kaca, pipet
serologis, lampu ultra violet (UV) 254 nm, vorteks, laminar, autoklaf, hot plate,
inkubator bergoyang, rotavapor, botol vial, pipet mikro, dan tabung mikro.
Prosedur
Ekstraksi Senyawa bioaktif
Isolat bakteri asal spons dikulturkan dalam 1 L medium SWC cair. Kultur
diinkubasi pada mesin penggoyang (100 rpm; 30 °C) selama 72 jam (fase
stasioner), kemudian ditambahkan 1 L etil asetat kemudian diaduk selama 12 jam.
Lapisan etil asetat dievaporasi. Ekstrak yang diperoleh disimpan pada suhu 5 °C
(Muller et al. 2004).
Fraksionasi senyawa bioaktif.
Ekstrak etil asetat difraksionasi menggunakan kromatografi lapis tipis
preparaftif (KLTP) dengan eluen terbaik yaitu n-butanol:etil asetat (3:7). Ekstrak
etil asetat senyawa bioaktif diteteskan secukupnya pada lempeng gel silica 60F254.
Lempeng KLTP kemudian diletakkan secara tegak pada chamber kaca berisi
larutan eluen. Setelah eluen bergerak sampai garis batas atas, pelat dikeluarkan
dan dikeringkan. Komponen senyawa organik yang terpisah akan berbentuk fraksi
di sepanjang pelat, kemudian dilihat dan ditandai di bawah sinar UV dengan
4
panjang gelombang 254 nm (Zheng et al. 2005). Fraksi senyawa bioaktif
dilarutkan dalam metanol kemudian dipekatkan menggunakan rotavapor.
Uji toksisitas ekstrak etil asetat dan fraksi menggunakan metode brine
shrimp letality test (BSLT).
Telur A. salina sebanyak 100 mg ditetaskan di dalam gelas piala ukuran 1 L
yang diisi air laut dilengkapi dengan aerator dan lampu penerangan selama 24 jam
telur akan menetas menjadi larva A. salina (Lampiran 2). Sebanyak 20 larva A.
salina ditambahkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi ekstrak etil asetat
atau fraksi dan 3 tetes Tween-80 dengan berbagai konsentrasi dan kontrol, lalu
ditambahkan air laut hingga volume akhir adalah 5 ml. Konsentrasi akhir dalam
tabung setelah penambahan air laut adalah 750 µg mL-1, 500 µg mL-1, 250 µg mL1
, 100 µg mL-1, 10 µg mL-1, dan kontrol. Selanjutnya tabung diinkubasi selama 24
jam. Kematian larva pada setiap konsentrasi dihitung dan dibandingkan dengan
kontrol.
(%) Kematian=
Σ kematian- Σ kematian kontrol
x 100%
Σ larva awal
Nilai kematian organisme 50% (LC50) ditentukan dengan menggunakan
kurva hubungan antara logaritma konsentrasi ekstrak (x) dan nilai probit dari
persentase kematian larva udang (y). Analisis probit yang digunakan berdasarkan
dari metode Finney dan Stevens (1948).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Ekstraksi dan Toksisitas Ekstrak Etil Asetat Senyawa Bioaktif dari Bakteri
yang Berasal dari Spons
Hasil uji toksisitas ekstrak etil asetat senyawa bioaktif yang berasal dari
bakteri yang berasosiasi dengan spons menunjukkan bahwa hampir semua ekstrak
memiliki kemampuan bioaktif kecuali isolat HAL-74. Rendemen ekstrak etil
asetat senyawa bioaktif yang berasal dari bakteri SAB E-31, SAB E-41, SAB E57 menghasilkan jumlah rendemen tertinggi (Tabel 1). Hasil analisis probit
ekstrak etil asetat isolat SAB E-31, SAB-E41, SAB E-57 yang bersifat bioaktif
(Tabel 2).
5
Tabel 1 Rendemen dan toksisitas (LC50) ekstrak etil asetat dari isolat bakteri yang
berasosiasi dengan spons
Kode Isolat
Rendemen (% b/v)
Nilai LC50 (µg mL-1)
SAB E-31
0.02
328.04
SAB E-41
0.02
251.40
SAB E-57
0.02
390.50
HAL-13
0.01
369.00
HAL-74
0.01
2144.07
HAA-01
0.01
954.99
*Nilai LC50 adalah hasil rata-rata 3 kali ulangan menggunakan larva A. Salina (nauplii).
Tabel 2 Nilai Probit ekstrak etil asetat dari isolat bakteri yang berasosiasi dengan
spons
Kode Konsentrasi
Ulangan
Isolat (µg mL-1)
0
10
100
SAB
E-31
250
500
750
0
10
SAB
E-41
100
250
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
Σ Larva
A. salina
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
Σ Larva
%
Mortalitas
mati
Mortalitas
Probit
0
0
0
2
2
3
5
6
6
8
8
9
10
11
11
14
14
14
0
0
0
2
3
3
5
5
6
8
8
10
0
0
0
10
10
15
25
30
30
40
40
45
50
55
55
70
70
70
0
0
0
10
15
15
25
25
30
40
40
50
3.72
3.72
3.96
4.33
4.48
4.48
4.75
4.75
4.87
5.00
5.13
5.13
5.52
5.52
5.52
3.72
3.96
3.96
4.33
4.33
4.48
4.75
4.75
5.00
Rerata
Probit
-
3.80
4.43
4.79
5.09
5.52
-
3.88
4.38
4.83
6
Tabel 2 Nilai Probit ekstrak etil asetat dari isolat bakteri yang berasosiasi dengan spons
(lanjutan)
500
750
0
10
100
SAB
E-57
250
500
750
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
12
12
13
15
15
15
0
0
0
1
1
2
4
4
4
5
6
6
11
11
11
15
15
15
60
65
65
75
75
75
0
0
0
5
5
10
20
20
20
40
40
50
55
55
55
75
75
75
5.25
5.25
5.39
5.67
5.67
5.67
3.36
3.36
3.72
4.16
4.16
4.16
4.33
4.48
4.48
5.13
5.13
5.13
5.67
5.67
5.67
5.29
5.67
-
3.48
4.16
4.43
5.13
5.67
Mortalitas probit
Nilai kematian organisme 50% (LC50) ditentukan dengan menggunakan
kurva hubungan antara logaritma konsentrasi ekstrak (x) dan nilai probit dari
persentase kematian larva udang (y). Hubungan konsentrasi berbanding lurus
dengan mortalitas probit (Gambar 1.1-1.3).
6
5
4
3
2
1
0
y = 0.854x + 2.851
R² = 0.948
0
1
2
3
4
Log Konsentrasi
Gambar 1.1 Hubungan mortalitas probit dengan log konsentrasi ekstrak etil asetat
SAB E-31
Mortalitas probit
7
6
5
4
3
2
1
0
y = 0.912x + 2.808
R² = 0.914
0
1
2
3
4
Log konsentrasi
Mortalitas probit
Gambar 1.2 Hubungan mortalitas probit dengan log konsentrasi ekstrak etil asetat
SAB E-41
6
5
4
3
2
1
0
y = 1.029x + 2.271
R² = 0.857
0
1
2
3
4
Log konsentrasi
Gambar 1.3 Hubungan mortalitas probit dengan log konsentrasi ekstrak etil asetat
SAB E-57
Fraksionasi dan Toksisitas Senyawa Bioaktif dari Bakteri yang Berasal dari
Spons
Jumlah fraksi hasil kromatografi lapis tipis analitik ekstrak etil asetat isolat
SAB E-31, SAB E-41, dan SAB E-57 dipisahkan berdasarkan nilai Rf
(Retardaction factor). Fraksionasi ekstrak etil asetat SAB E-31 menghasilkan 6
fraksi dengan nilai Rf yaitu 0.17, 0.42, 0.51, 0.65, 0.75, dan 0.86. Ekstrak etil
asetat SAB E-41 menghasilkan 6 fraksi dengan nilai Rf yaitu 0.17, 0.44, 0.52,
0.62, 0.74, dan 0.87. Ekstrak etil asetat SAB E-57 menghasilkan 6 fraksi dengan
nilai Rf yaitu 0.14, 0.24, 0.50, 0.61, 0.73, dan 0.87 (Gambar 2).
8
(a)
Gambar 2
(b)
(c)
Fraksionasi menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) analitik (a)
SAB E-31; (b) SAB E-41; (c) SAB E-57
Fraksionasi ekstrak etil asetat SAB E-31 menghasilkan 6 fraksi dengan kode
fraksi A, B, C, D, E, dan F. Ekstrak etil asetat isolat kode SAB E-41
menghasilkan 7 fraksi dengan kode fraksi G, H, I, J, K, L, dan M. Ekstrak etil
asetat SAB E-57 menghasilkan 6 fraksi dengan kode fraksi N, O, P, Q, R dan S
(Gambar 3). Fraksi yang telah diperoleh kemudian diuji toksisitasnya (LC50)
dengan menentukan nilai probit masing-masing fraksi. Fraksi isolat SAB E-31
memiliki nilai LC50 antara 68.20 µg mL-1–1433.00 µg mL-1 dan diperoleh 2 fraksi
yang bersifat bioaktif yaitu fraksi A (131.55 µg mL-1) dan F (68.20 µg mL1).
Fraksi isolat SAB E-41 memiliki nilai LC50 antara 88.29 µg/mL–1305.18 µg/mL
dan diperoleh 3 fraksi yang bersifat bioaktif yaitu fraksi H (88.29 µgmL-1), J
(188.09 µg mL-1), dan M (189.30 µg mL-1). Isolat SAB E-57 menghasilkan 6
fraksi dengan nilai LC50 antara 46.74 µg mL-1 –323.45 µg mL-1 dan diperoleh 4
fraksi yang bersifat bioaktif yaitu fraksi P, Q, R, dan S (Tabel 2). Rendemen
terbanyak diperoleh dari fraksi M ekstrak etil asetat SAB E-41 sebesar 32.62%
(b/b) (Tabel 3).
9
Fraksi A
Fraksi B
Fraksi C
Fraksi D
Fraksi E
1(a)
2(a)
Fraksi F
Penetesan
Ekstrak
Fraksi G
Fraksi H
Fraksi I
Fraksi J
Fraksi K
Fraksi L
Fraksi M
Penetesan
Ekstrak
1(b)
2(b)
Fraksi N
Fraksi O
Fraksi P
Fraksi Q
Fraksi R
Fraksi S
Penetesan
Ekstrak
1(c)
2(c)
Gambar 3 Fraksionaasi menggunakan kromatografi lapis tipis prreparatif (KLTP) 1)
Hasil frakksionasi pada UV 254 nm isolat kode (a) SAB
S
E-31; (b) SAB
E-41; (c) SAB E-57, 2) Ilustrasi hasil fraksionasi pada
p
UV 254 nm
isolat kodde (a) SAB E-31; (b) SAB E-41; (c) SAB E-557
10
Tabel 3 Toksisitas (LC50) fraksi isolat bakteri yang berasosiasi dengan spons
Ekstrak etil asetat
Isolat kode
SAB E-31
Jumlah
fraksi
6
SAB E-41
7
SAB E-57
6
Fraksi
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
L
M
N
O
P
Q
R
S
Rendemen (%
b/b)
16.59
16.80
24.92
7.20
12.29
22.20
5.93
9.86
4.71
5.53
29.17
12.18
32.62
2.94
7.69
6.04
24.49
27.89
30.95
Nilai LC50 (µg
mL-1)
131.55
1433.50
415.95
213.83
340.11
68.20
381.62
88.29
365.65
188.09
254.17
1305.18
189.30
323.45
212.48
46.74
97.55
62.20
174.80
*Nilai LC50 adalah hasil rata-rata 3 kali ulangan menggunakan larva A. Salina (nauplii).
Pembahasan
Senyawa bioaktif dari bakteri yang berasosiasi dengan spons diekstraksi
menggunakan pelarut etil asetat. Etil asetat digunakan karena etil asetat bersifat
tidak larut terhadap air dan memiliki koefisien partisi yang tinggi terhadap
substrat cair sehingga mudah dipisahkan dari kultur cair bakteri (Jeffery et al.
1989). Uji aktivitas sitotoksik menggunakan metode brine shrimp lethality test
(BSLT) dengan hewan uji larva Artemia salina. BSLT digunakan sebagai
penapisan awal dalam upaya pencarian senyawa yang berpotensi sebagai
antikanker, antioksidan dan pengobatan lainnya. BSLT merupakan uji toksisitas
yang umum digunakan sebagai tahapan awal (prescreening) dalam penapisan
senyawa bioaktif. Keuntungan menggunakan metode BSLT yaitu prosedurnya
sederhana, cepat, tidak memerlukan biaya yang besar dan hasilnya akurat
(Sorgeloos et al. 1978).
Larva Artemia salina digunakan sebagai hewan uji karena sifatnya yang
peka terhadap bahan uji, waktu siklus hidup yang cepat, mudah dibiakkan dan
harganya yang murah. Sifat peka A. salina disebabkan oleh keadaan membran
kulitnya yang sangat tipis sehingga memungkinkan terjadinya difusi zat dari
lingkungan yang mempengaruhi metabolisme dalam tubuhnya (Meyer et al.
1982). Penambahan ekstrak yang diduga mengandung senyawa bioaktif
berpotensi sebagai obat diharapkan mampu mengganggu metabolisme dan
menyebabkan kematian larva udang. Respon hewan uji terhadap toksik selalu
11
binomial (mati/tidak mati). Hubungan antara respon dan konsentrasi toksik selalu
berbentuk sigmoid (Gambar 1.1-1.3). Analisis probit digunakan untuk mengubah
bentuk kurva yang sigmoid ke bentuk linear sehingga mudah untuk dianalisis
(Finney & Stevens 1948).
National Cancer Institute (NCI) di Amerika Serikat melaporkan bahwa
terdapat hubungan yang signifikan antara uji toksisitas yang menggunakan larva
A. salina dengan penghambatan pertumbuhan beberapa jenis sel tumor secara in
vitro. Larva A. salina yang digunakan sebagai hewan uji BSLT yang berumur 24
jam karena pembelahan A. salina pada rentang waktu 0-24 jam mengalami
pembelahan sel yang cepat seperti pembelahan sel kanker (Anderson et al. 1991).
A. salina yang telah berumur 48 jam akan membentuk membran sel yang
kompleks sehingga ekstrak yang diberikan tidak dapat masuk ke dalam sel larva
A. salina. Selain itu jika umur A. salina yang digunakan lebih dari 48 jam,
dikhawatirkan kematian A. salina bukan disebabkan toksisitas ekstrak melainkan
oleh terbatasnya persediaan makanan (Sorgeloos et al. 1978).
Ekstrak yang bersifat toksik berpotensi sebagai senyawa bioaktif yang dapat
mematikan minimal 50% organisme uji dengan konsentrasi ≤ 1000 g mL-1
(Meyer et al. 1982). Suatu ekstrak atau senyawa yang bersifat toksik memiliki
kemampuan bioaktif yang berpotensi sebagai obat-obatan. Nilai LC50 ekstrak etil
asetat SAB E-31, SAB E-41, SAB E-57, HAL-13, dan HAA-01 memiliki nilai
LC50 dibawah 1000 g mL-1 yang berarti ekstrak etil asetat tersebut bersifat
bioaktif. Hasil dari nilai LC50 terbaik diperoleh dari isolat kode SAB E-41 sebesar
251.40 g mL-1. Penelitian tentang uji toksisitas ekstrak dan fraksi dari bakteri
belum banyak dilakukan. Issanto (2012) melaporkan bahwa toksisitas ekstrak dari
bakteri yang berasosiasi dengan spons Jaspis sp. dengan kode SAB E-8, SAB-35,
SAB E-38, SAB E-40, SAB E-43 bersifat bioaktif dengan nilai LC50 terendah
81.00 g mL-1.
Persentase mortalitas pada kontrol (0 µg mL-1) sebesar 0% yang
menunjukkan bahwa kondisi lingkungan tempat hidup A. salina dinilai cukup baik
dan tidak menyebabkan kematian sehingga dapat disimpulkan larva A. salina yang
mati disebabkan oleh bioaktivitas senyawa toksik pada ekstrak (Tabel 2). Ekstrak
yang bersifat bioaktif dihasilkan oleh bakteri dalam bentuk metabolit sekunder
ekstraseluler yang dihasilkan pada saat fase stasioner. Senyawa bioaktif umumnya
yang dihasilkan oleh bakteri merupakan turunan dari asam amino dan nukleosida,
flavonoid, alkaloid, terpenoid, makrolid, porfirin, peroksida alifatik, dan sterol
(Thomas et al. 2010).
Ekstrak etil asetat isolat SAB E-31, SAB-E41, HAL-13, SAB E-57
merupakan isolat yang paling aktif tetapi karena rendemen ekstrak etil asetat isolat
HAL-13 sangat sedikit maka dipilih 3 fraksi yang memiliki nilai rendemen cukup
banyak dan memiliki nilai LC50 yang rendah (Tabel 1). Rendemen ekstrak dapat
digunakan sebagai parameter standar mutu ekstrak pada produksi maupun
efisiensi ekstraksi. Senyawa bioaktif isolat terpilih SAB E-31, SAB E-41, dan
SAB E-57 difraksionasi menggunakan metode kromatografi lapis tipis preparatif
(KLTP) untuk memisahkan campuran senyawa dari sampel berdasarkan fraksinya
yang selanjutnya fraksi-fraksi tersebut dikumpulkan dan digunakan untuk analisa
berikutnya. Fraksi dilarutkan menggunakan pelarut organik metanol karena
pelarut ini dapat melarutkan hampir semua senyawa dan mudah menguap. Fraksi-
12
fraksi hasil fraksionasi kemudian diuji toksisitasnya dengan metode BSLT
menggunakan larva A. salina.
Ekstrak etil asetat hasil fraksionasi diperoleh nilai LC50 yang lebih aktif
dibandingkan LC50 ekstrak etil asetatnya. Hal ini disebabkan karena fraksi lebih
murni daripada ekstrak yang merupakan gabungan dari beberapa fraksi. Menurut
Meyer (1982) Suatu senyawa hasil fraksionasi bersifat bioaktif jika nilai LC50 ≤
200 µg mL-1. Sebanyak 9 fraksi dinyatakan bersifat bioaktif diantaranya yaitu
fraksi dengan kode A, F, H, J, M, P, Q, R, dan S dengan nilai LC50 terendah yaitu
46.74 µg mL-1. Suatu ekstrak tersusun atas beberapa fraksi yang memiliki
bioaktivitas berbeda-beda. Fraksi-fraksi tersebut ada yang memiliki nilai LC50
yang lebih rendah dan lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak. Ekstrak etil
asetat SAB E-31 memiliki 2 fraksi (fraksi A dan F) bersifat toksik dan 4 fraksi
(fraksi B, C, D, E) bersifat tidak toksik. Ekstrak etil asetat SAB E-41 memiliki 3
fraksi (fraksi H, I, M) bersifat toksik dan 4 fraksi (fraksi G, J, K, L) bersifat tidak
toksik. Ekstrak etil asetat SAB E-57 memiliki 4 fraksi (fraksi P, Q, R, S) bersifat
toksik dan 2 fraksi (fraksi N, O) bersifat tidak toksik. Hal ini diduga ada sifat
sinergis-antagonis antar fraksi-fraksi senyawa kimia dalam suatu ekstrak yang
menyebabkan peningkatan atau penurunan bioativitasnya. Pemberian nama fraksi
berdasarkan alfabet agar memudahkan dalam pengelompokan fraksi dari SAB E31, SAB E-41, dan SAB E-57 (Tabel 3).
Nilai keaktifan fraksi P SAB E-57 dengan nilai LC50 46.74 µg mL-1dapat
digolongkan aktif karena mendekati nilai standar keaktifan dari National Cancer
Institute (NCI) Amerika yang menyatakan standar efektifitas komponen bioaktif
untuk melawan sel kanker adalah ≤ 30 g/mL (Albuntana et al. 2011). Fraksi P
SAB E-57 diduga memiliki potensi sebagai antikanker dan antioksidan. Menurut
Setiani (2009) fraksi dari ekstrak etil asetat biji Mahoni dengan nilai LC50 74.30
µg mL-1yang kemudian diuji penghambatannya terhadap sel kanker T47D
menghasilkan nilai hambat 50% (IC50) sebesar 49.12 µg mL-1yang berpontensi
sebagai antikanker karena memiliki nilai IC50 kurang dari 50 µg mL-1 (Mans et al.
2000). Mahardika (2013) dalam penelitiannya melaporkan bahwa kulit petai
memiliki bahan bioaktif dengan nilai LC50 49.50 µg mL-1memiliki nilai IC50 2 µg
mL-1yang berpotensi sebagai antioksidan. Suatu senyawa dikatakan memiliki
aktivitas antioksidan yang tinggi bila nilai IC50-nya kurang dari 200 mg L-1 (Hanani et
al. 2005).
Faktor-faktor yang dapat mempengaruhi keberhasilan pengujian toksisitas
menggunakan BSLT, yaitu konsentrasi ekstrak dan air laut yang digunakan dalam
setiap pengujian harus konstan dan tepat, penambahan zat yang membantu
melarutkan ekstrak dalam air laut seperti Tween-80, ketepatan dan ketelitian
peneliti untuk menghitung jumlah larva awal dan yang mati serta pengulangan
minimal 2 kali pengulangan untuk dapat memberikan nilai ketepatan uji yang
tinggi (Septina 2005).
13
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Ekstrak etil asetat yang berasal dari bakteri yang berasosiasi dengan spons
menunjukkan bahwa hampir semuanya memiliki kemampuan bioaktif kecuali
isolat HAL-74. Hasil fraksionasi diperoleh jumlah fraksi pada masing-masing
isolat yaitu SAB E-31 (6 Fraksi), SAB E-41(7 fraksi), dan SAB E-57 (6 fraksi).
Ekstrak etil asetat isolat setelah difraksionasi diperoleh LC50 yang lebih aktif
dibandingkan LC50 ekstrak etil asetatnya. Sebanyak 9 fraksi dinyatakan bersifat
bioaktif diantaranya yaitu fraksi dengan kode A, F, H, J, M, P, Q, R, dan S dengan
nilai LC50 terendah yaitu 46.74 µg mL-1.
Saran
Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan analisis fitokimia untuk mengetahui
kandungan senyawa metabolit sekunder pada ekstrak dan fraksi aktif serta
pengujian antioksidan, antikanker, dan anti-inflamasi untuk aplikasi dalam bidang
medis sebagai obat-obatan.
DAFTAR PUSTAKA
Abubakar H, Wahyudi AT, Yuhana M. 2011. Skrining bakteri yang berasosiasi
dengan spons Jaspis sp. sebagai penghasil senyawa antimikroba. Ilmu
Kelautan. 16:35-40.
Albuntana A, Yasman, Wardhana W. 2011. Uji toksisitas ekstrak empat jenis
teripang suku Holothuriidae dari Kepulauan Penjaliran Timur, Kepulauan
Seribu, Jakarta menggunakan brine shrimp lethality test (BSLT). J Iltek
Keltrop. 3:65-72.
Anderson JE, Goetz CM, McLaughlin JL, Suffness M. 1991. A blind comparison
of simple bench-top bioassay and human tumour cell cytotoxicities as
antitumor prescreens. Phytochem Anal. 2:107-111.
Banoet Y. 2011. Aktivitas senyawa bioaktif antimikrob dari bakteri yang
berasosiasi dengan spons Haliclona sp. dan telaah genetiknya [tesis]. Bogor
(ID): Institut Pertanian Bogor.
Effendi. 2012. Antimicrobial activity of bioactive compounds isolated from
marine bacteria associated with sponge Jaspis sp. and their genetic analysis.
[tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
14
Finney DJ, Stevens WL. 1948. A table for the calculation of working probits and
weights in probit analysis. Biometrika 35: 191-201.
Hanani E, Abdul M, Ryany S. 2005. Identifikasi senyawa antioksidan dalam
Callyspongia sp dari Kepulauan Seribu. Maj Ilmu Kefarmasian. 2:127-133.
Issanto P. 2012. Ekstraksi dan bioaktivitas senyawa antimikrob dari bakteri yang
berasosiasi dengan spons Jaspis sp [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian
Bogor.
Jeffery GH, Bassett J, Mendham J, Denney RC. 1989. Textbook of Quantitative
Chemical Analysis. Fifth Edition. New York: John Wiley & Sons, Inc.
Mahardhika C. 2013. Fraksionasi ekstrak kulit petai berpotensi antioksidan.
[skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Mans DRA, Adriana Bd’R, Schwartsmann G. 2000. Anticancer drugs discovery
and development in Brazil: tergeted plants collection as a rational s trategy
to acquire candidate anticancer compound. Oncologys. 5:185-198.
Meyer BN, Ferigni NR, Putnam JE, Jacobsen RE, Nicholas, McLaughin JL. 1982.
Brine Shrimp : A Convenient Bioassay for Active Plant Constituent. Planta
Med. 45:31-34.
Muller WEG, Grebenjuk VA, Thakur NL, Thakur AN, Batel R. 2004. Oxygencontrolled bacterial growth in the sponge Suberites domuncula: toward a
molecular understanding of the symbiotic relation-ships between sponge
and bacteria. Appl Environ Microbiol. 70:2332-2341.
Proksch P, Edrada RA, Ebel R. 2002. Drugs from the seas-current status and
microbial implications. Appl Microbiol Biotechnol. 59:125-134.
Sargeloos P, Van Der Wielen CR, Persoone G. 1978. The use Artemia nauplii for
toxicity test- a critical analysis. Ecotoxicol and Environ Safety. 2:249-255.
Septina YA. 2005. Identifikasi dan uji toksisitas asam tanat dalam ekstrak daun
ketapang (Terminalia catappa) [skripsi]. Semarang (ID): Universitas
Diponegoro.
Setiani RFC. 2009. Sitoksisitas fraksi aktif biji Mahoni (Swietenia mahagoni)
pada sel kanker payudara T47D. [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian
Bogor.
Taylor MW, Radax R, Steger D, Wagner M. 2007. Sponge-associated
microorganisms: evolution, ecology, and biotechnological potential.
Microbiol Mol Biol Rev. 71:295-347.
Thakur NL, Muller WEG. 2004. Bio-technological potential of marine sponges.
Curr Sci. 11:86.
Thakur AN, Thakur NL, Indap MM, Pandit RA, Datar VV, Műller WEG. 2005.
Antiangiogenik, antimicrobial, and citotoxic potential of sponges-associated
bacteria. Mar Biotechnol. 7:245-252.
Thomas TRA, Kavlekar DP, Lokabharathi PA. 2010. Marine drug from spongemicrobe association. Mar Drugs 8: 1417-1468.
Tokasaya P. 2010. Sponge-Associated Bacteria Producing Antimicrobial
Compounds and Their Genetic Diversity Analysis [tesis]. Bogor (ID):
Institut Pertanian Bogor.
Wang G. 2006. Diversity and biotechnological potential of the sponges-associated
microbial consortia. J Ind Microbiol Biotechnol. 33:545- 551.
15
Zheng L, H Chen, X Han, X Yan. 2005. Antimicrobial screening and active
compound isolation from marine bacterium NJ6-3-1 associated with the
sponge Hymeniacidon perleve. World J Microbiol Biotechnol. 21:201-206.
16
Lampiran 1 Komposisi meedium sea water complete (SWC)
Komposisi untuk 1000 mL
Pepton
Yeast Extract
Glicerol
Bacto Agar
Air laut steril
Aquades
5 graam
1 graam
3 mL
L
15 grram
750 mL
m
250 mL
m
Lampiran 2 Larva Artemia salina umur 24 jam
17
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 1 Agustus 1991 dari ayah Heru
Agus Sulistiawan dan ibu Eni Kurniasari Penulis adalah putri pertama dari empat
bersaudara. Tahun 2009 penulis lulus dari SMA Negeri 1 Jasinga. Selama di SMA
penulis memperoleh peringkat 1 Olimpiade Biologi tingkat SMA di Kabupaten
Bogor pada tahun 2008. Penulis lulus seleksi masuk Institut Pertania Bogor (IPB)
melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB dan diterima di Departemen Biologi,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Saat ini penulis sedang
mengikuti program FASTRACK sinergi S1 Biologi- S2 Mikrobiologi.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif sebagai staf Departemen
Advokasi dan Kesejahteraan Mahasiswa BEM FMIPA IPB 2011. Tahun 2011
Penulis melakukan penelitian Studi Lapangan dengan judul Inventarisasi Meniran
di Hutan Pendidikan Gunung Walat. Tahun 2012 penulis melaksanakan Praktik
Lapangan di Pusat Studi Biofarmaka IPB dengan judul Pemeriksaan Kualitas
Simplisia Kulit Kayu Manis Cina (Cinnamomum casia) dan Kayu Manis Padang
(Cinnamomum burmanii).
Penulis juga mendapatkan prestasi dalam Program Kreativitas Mahasiswa
(PKM) di bidang artikel ilmiah dengan judul “Keanekaragaman Meniran di Hutan
Pendidikan Gunung Walat” dari Dinas Pendidikan Tinggi (DIKTI) pada tahun
2012.
YANG BERASOSIASI DENGAN SPONS
ANNISA WULAN AGUS UTAMI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi yang berjudul “Uji Toksisitas
Senyawa Bioaktif dari Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons” adalah benar karya
saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk
apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Juli 2013
Annisa Wulan Agus Utami
NIM G34090001
ABSTRAK
ANNISA WULAN AGUS UTAMI. Uji Toksisitas Senyawa Bioaktif dari Bakteri
yang Berasosiasi dengan Spons. Dibimbing oleh ARIS TRI WAHYUDI dan DUDI
TOHIR.
Senyawa bioaktif dari bakteri yang berasosiasi dengan spons telah diteliti
bermanfaat sebagai sumber berbagai senyawa bioaktif. Uji toksisitas senyawa
bioaktif dilakukan sebagai uji awal untuk menentukan potensi senyawa bioaktif
dalam pengembangan obat-obatan. Penelitian ini bertujuan mengekstraksi dan
memfraksionasi senyawa bioaktif dari bakteri yang berasosiasi dengan spons serta
menguji toksisitasnya terhadap Artemia salina. Isolat bakteri yang diisolasi dari
spons dengan kode SAB E-31, SAB E-41, SAB E-57, HAL-13, HAL-74, dan
HAA-01 masing-masing diekstraksi menggunakan pelarut etil asetat. Ekstrak etil
asetat isolat SAB E-31, SAB E-41, SAB E-57, HAL-13, HAA-01 bersifat bioaktif
dengan nilai LC50 ekstrak etil asetat terendah yaitu 251.18 µg mL-1 dari ekstrak
isolat SAB E-41 . Sebanyak tiga ekstrak etil asetat terbaik dengan kode SAB E31, SAB E-41, dan SAB E-57 difraksionasi menggunakan kromatografi lapis tipis
preparatif (KLTP) dengan eluen n-butanol: etil asetat (3:7). Hasil fraksionasi dari
tiga ekstrak etil asetat terbaik diperoleh 19 fraksi yang diantaranya terdapat 9
fraksi yang bersifat bioaktif dengan nilai LC50 terendah yaitu fraksi P SAB E-57
sebesar 46.74 µg mL-1.
Kata kunci : ekstraksi, fraksionasi, senyawa bioaktif, toksisitas,.
ABSTRACT
ANNISA WULAN AGUS UTAMI. Toxicity of Bioactive Compounds from
Bacteria
Associated
with
Sponges. Supervised
by ARIS
TRI
WAHYUDI and DUDI TOHIR.
Marine bacteria associated with sponges have been known as a source of
bioactive compounds. Toxicity test of this compounds was done as initial test to
determine the potency of bioactive compounds in pharmaceuticals development.
The aim of this study was to extract and fractionate bioactive compounds from
marine bacteria associated with sponges and to test its toxicity toward Artemia
salina. Bacterial isolate of SAB E-31, SAB E-41, SAB E-57, HAL-13, HAL-74,
and HAA-01 isolated from sponge were used as source of bioactive compounds.
The bioactive compounds were extracted by using ethyl acetate. The ethyl acetate
extract of SAB E-31, SAB E-41, SAB E-57, HAL-13, and HAA-01 were active
with the lowest LC50 was 251.18 µg mL-1 from ethyl acetate extract of SAB E-41.
The three of best ethyl acetate extract, SAB E-31, SAB E-41, and SAB E-57 were
fractionated by preparative thin layer chromatography (PTLC) using eluent of nbutanol: ethyl acetate (3:7). Fractionation results of the three best ethyl acetate
extract obtained 19 fractions, and 9 fraction among them were active fraction with
the lowest LC50 from the fraction was 46.74 µg mL-1 come from SAB E-57.
Keywords: bioactive compounds, extraction, fractionation, toxicity.
UJI TOKSISITAS SENYAWA BIOAKTIF DARI BAKTERI
YANG BERASOSIASI DENGAN SPONS
ANNISA WULAN AGUS UTAMI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi: Uji Toksisitas Senyawa Bioaktif dan Bakten yang Berasosiasi
dengan Spons
: Annisa Wulan Agus Utami
Nama
: 034090001
NIM
Disetujui oleh
ｾ＠
Prof Dr Aris Tri Wahyudi, MSi
Pembimbing I
Tanggal Lulus: 22 JUL 7013
t.
Drs Dudi To ir, MS
Pembimbing II
Judul Skripsi : Uji Toksisitas Senyawa Bioaktif dari Bakteri yang Berasosiasi
dengan Spons
Nama
: Annisa Wulan Agus Utami
NIM
: G34090001
Disetujui oleh
Drs Dudi Tohir, MS
Pembimbing II
Prof Dr Aris Tri Wahyudi, MSi
Pembimbing I
Diketahui oleh
Dr Ir Iman Rusmana, MSi
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karuniaNya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Desember 2012 sampai Mei
2013 ini ialah mikrobiologi medis, dengan judul “Uji Toksisitas Senyawa Bioaktif
dari Bakteri yang berasosiasi dengan Spons”.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Prof Dr Aris Tri Wahyudi,
MSi dan Bapak Drs Dudi Tohir, MS selaku pembimbing karya ilmiah ini serta
kepada Ibu Dr Triadiarti, MSi selaku komisi penguji wakil Komisi Pendidikan.
Penelitian ini dibiayai oleh Penelitian Unggulan Strategis IPB 2013 kepada Prof Dr
Aris Tri Wahyudi, MSi, untuk itu penulis mengucapkan terima kasih. Penulis juga
menyampaikan penghargaan kepada Bapak Jaka dan Ibu Heni sebagai laboran
Mikrobiologi, Bapak Sobur sebagai laboran Kimia Organik, serta rekan kerja di
laboratorium Mikrobiologi dan Kimia Organik yang telah banyak membantu dan
memberikan saran dalam proses penelitian. Ungkapan terima kasih juga
disampaikan kepada ayah, ibu, serta seluruh keluarga, atas doa dan kasih
sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Juli 2013
Annisa Wulan Agus Utami
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
viii
DAFTAR GAMBAR
viii
DAFTAR LAMPIRAN
viii
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
1
2
2
2
1
METODE
Bahan
Alat
Prosedur
3
3
3
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Pembahasan
4
4
10
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
13
13
13
DAFTAR PUSTAKA
13
LAMPIRAN
16
RIWAYAT HIDUP
17
DAFTAR TABEL
1 Ekstraksi dan toksisitas (LC50) ekstrak etil asetat dari isolat bakteri yang
berasosiasi dengan spons
2 Nilai Probit ekstrak etil asetat dari isolat bakteri yang berasosiasi
dengan spons
3 Toksisitas (LC50) fraksi isolat bakteri yang berasosiasi dengan spons
5
5
10
DAFTAR GAMBAR
1 Hubungan mortalitas probit dengan log konsentrasi ekstrak etil asetat
2 Fraksionasi menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) analitik
3 Fraksionasi dari ekstrak etil asetat SAB E-57 menggunakan
kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP)
6
8
9
DAFTAR LAMPIRAN
1 Komposisi medium sea water complete (SWC)
2 Larva Artemia salina umur 24 jam
15
15
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Senyawa bioaktif dari spons telah diteliti memiliki potensi sebagai
antibakteri, anticendawan, antikanker, antiviral, dan antiinflamasi (Thakur &
Muller 2004; Thakur et al. 2005; Taylor et al. 2007). Senyawa bioaktif tersebut
umumnya merupakan turunan dari asam amino dan nukleosida, flavonoid,
alkaloid, terpenoid, makrolid, porfirin, peroksida alifatik, dan sterol (Thakur &
Muller 2004; Taylor et al. 2007). Spons menjadi fokus penelitian saat ini karena
kelompok hewan ini membentuk asosiasi yang erat dengan berbagai mikroba dan
menjadi sumber berbagai senyawa bioaktif. Spons mendominasi produksi
senyawa bioaktif yang berasal dari laut dengan laporan lebih dari 200 senyawa
metabolit baru dilaporkan tiap tahunnya (Taylor et al. 2007).
Pengembangan senyawa bioaktif yang berasal dari spons mengalami
hambatan karena memerlukan biomassa spons yang besar untuk mengekstraksi
senyawa bioaktif dalam aplikasinya di bidang medis (Proksch et al. 2002). Wang
(2006) melaporkan bahwa spons menjadi inang dari berbagai jenis mikroba secara
umum yang dapat mencapai 50-60% dari volume jaringan spons. Komunitas
mikroba yang beragam dan berjumlah besar pada hewan spons diduga merupakan
sumber dari berbagai senyawa bioaktif tersebut. Isolasi bakteri yang bersimbiosis
dengan spons, karakterisasi molekuler, dan karakterisasi senyawa bioaktif yang
dihasilkan bakteri tersebut merupakan strategi yang dapat digunakan untuk
memproduksi berbagai senyawa bioaktif dalam jumlah besar (Proksch et al.
2002).
Tokasaya (2010) telah berhasil mengisolasi bakteri dengan kode HAL-13,
HAL-74, dan HAA-01 dari spons Haliclona sp. Isolat tersebut telah dilaporkan
memiliki kemampuan untuk menghambat pertumbuhan bakteri patogen
enteropatogenik Escherichia coli K1-1, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus
aureus, serta khamir Candida albicans dan Candida tropicalis. Isolat bakteri
tersebut kemudian diteliti lebih lanjut oleh Banoet (2011) yang melaporkan bahwa
ekstrak etil asetat yang dihasilkan oleh isolat HAL-13, HAL-74, maupun HAA-01
memiliki aktivitas antimikrob berspektrum luas terhadap bakteri patogen maupun
khamir patogen. Pemurnian senyawa antimikrob dari ekstrak etil asetat yang
dihasilkan oleh salah satu isolat, yaitu HAL-13, menghasilkan tujuh senyawa
bioaktif yang memiliki aktivitas antimikrob terhadap strain uji EPEC K1-1.
Isolat bakteri dengan kode SAB E-31, SAB E-41 dan SAB E-57 telah
berhasil diisolasi oleh Abubakar et al. (2011) dari spons Jaspis sp. Isolat tersebut
telah dilaporkan memiliki kemampuan untuk menghambat pertumbuhan bakteri
patogen S. aureus, E. coli, enteropatogenik E. coli K1-1, P. aeruginosa, C.
albicans dan C. tropicalis. Ketiga isolat tersebut memiliki kluster gen pengkode
kompleks enzim poliketid sintase (PKS) dan non-ribosomal poliketid sintase
(NRPS) yang menyandikan pembentukan senyawa bioaktif Effendi (2011).
Karakteristik morfologi isolat bakteri SAB E-31, SAB E-41, SAB E-57, HAL-13,
HAL 74 dan HAA-01 merupakan gram positif, berbentuk batang, dan membentuk
2
endospora. Isolat tersebut memiliki karakteristik genetik yang berasal dari genus
Bacillus dengan jenis berbeda-beda yaitu SAB E-31 jenis Bacillus pumilus; SAB
E-41 jenis Bacillus amyloliquefaciens; SAB E-57, HAL-13, HAL-74 dan HAA-01
jenis Bacillus subtilis (Tokasaya 2010; Effendi 2012).
Penelitian tentang toksisitas senyawa bioaktif dari isolat bakteri SAB E-31,
SAB E-41, SAB E-57, HAL-13, HAL-74, dan HAA-01 hingga saat ini belum
pernah dilakukan. Salah satu uji toksisitas adalah dengan uji bioaktivitas brine
shrimp lethality test (BSLT) menggunakan larva udang Artemia salina untuk
menentukan nilai kematian 50% atau disebut LC50 sebagai kadar minimum
toksiksitas suatu zat. Ekstrak yang diperoleh difraksionasi menggunakan
kromatografi untuk mendapatkan nilai LC50 yang lebih rendah. Penelitian ini
bertujuan memperoleh ekstrak dan fraksi bioaktif dari bakteri yang berasosiasi
dengan spons.
Perumusan Masalah
Salah satu manfaat penting yang dihasilkan spons yaitu kemampuannya
dalam menghasilkan senyawa metabolit sekunder yang bersifat senyawa bioaktif.
Pemanfaatan spons laut saat ini untuk produk komersial senyawa bioaktif
umumnya dilakukan dengan cara mengambil langsung di alam. Apabila hal
tersebut dilakukan secara berkelanjutan dapat mengakibatkan penurunan populasi
secara signifikan. Oleh karena itu dibutuhkan metode produksi senyawa bioaktif
yang tetap mempertahankan kelestarian sumber daya alam secara
berkesinambungan salah satunya dengan mengekstraksi senyawa bioaktif dari
mikrob yang berasosiasi dengan spons. Analisis suatu senyawa bioaktif baru yang
berpotensi sebagai senyawa sitotoksik terhadap sel hidup ataupun sel kanker dapat
menggunakan metode brine shrimp lethality test (BSLT).
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan menguji toksisitas ekstrak dan fraksi senyawa
bioaktif dari bakteri yang berasosiasi dengan spons terhadap larva udang Artemia
salina.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan mendapatkan ekstrak dan fraksi senyawa bioaktif
yang memiliki nilai toksisitas yang cukup rendah dan berpotensi sebagai senyawa
bioaktif.
3
METODE
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Desember 2012 – Mei 2013 di
Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi dan Laboratorium Kimia
Organik Departemen Kimia, FMIPA, IPB.
Bahan
Bahan yang digunakan adalah isolat-isolat terbaik bakteri yang berasosiasi
dengan spons yaitu SAB E-31, SAB E-41, SAB E-57 (Abubakar et al. 2011),
HAL-13, HAL-74, dan HAA-01 (Tokasaya 2010), larva Artemia salina (Nauplii),
media sea water complete (SWC) (Lampiran 1), etil asetat, metanol, n-butanol,
tween-80, alkohol 70%, dan silica gel 60F254.
Alat
Alat laboratorium yang digunakan adalah pelat kaca, chamber kaca, pipet
serologis, lampu ultra violet (UV) 254 nm, vorteks, laminar, autoklaf, hot plate,
inkubator bergoyang, rotavapor, botol vial, pipet mikro, dan tabung mikro.
Prosedur
Ekstraksi Senyawa bioaktif
Isolat bakteri asal spons dikulturkan dalam 1 L medium SWC cair. Kultur
diinkubasi pada mesin penggoyang (100 rpm; 30 °C) selama 72 jam (fase
stasioner), kemudian ditambahkan 1 L etil asetat kemudian diaduk selama 12 jam.
Lapisan etil asetat dievaporasi. Ekstrak yang diperoleh disimpan pada suhu 5 °C
(Muller et al. 2004).
Fraksionasi senyawa bioaktif.
Ekstrak etil asetat difraksionasi menggunakan kromatografi lapis tipis
preparaftif (KLTP) dengan eluen terbaik yaitu n-butanol:etil asetat (3:7). Ekstrak
etil asetat senyawa bioaktif diteteskan secukupnya pada lempeng gel silica 60F254.
Lempeng KLTP kemudian diletakkan secara tegak pada chamber kaca berisi
larutan eluen. Setelah eluen bergerak sampai garis batas atas, pelat dikeluarkan
dan dikeringkan. Komponen senyawa organik yang terpisah akan berbentuk fraksi
di sepanjang pelat, kemudian dilihat dan ditandai di bawah sinar UV dengan
4
panjang gelombang 254 nm (Zheng et al. 2005). Fraksi senyawa bioaktif
dilarutkan dalam metanol kemudian dipekatkan menggunakan rotavapor.
Uji toksisitas ekstrak etil asetat dan fraksi menggunakan metode brine
shrimp letality test (BSLT).
Telur A. salina sebanyak 100 mg ditetaskan di dalam gelas piala ukuran 1 L
yang diisi air laut dilengkapi dengan aerator dan lampu penerangan selama 24 jam
telur akan menetas menjadi larva A. salina (Lampiran 2). Sebanyak 20 larva A.
salina ditambahkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi ekstrak etil asetat
atau fraksi dan 3 tetes Tween-80 dengan berbagai konsentrasi dan kontrol, lalu
ditambahkan air laut hingga volume akhir adalah 5 ml. Konsentrasi akhir dalam
tabung setelah penambahan air laut adalah 750 µg mL-1, 500 µg mL-1, 250 µg mL1
, 100 µg mL-1, 10 µg mL-1, dan kontrol. Selanjutnya tabung diinkubasi selama 24
jam. Kematian larva pada setiap konsentrasi dihitung dan dibandingkan dengan
kontrol.
(%) Kematian=
Σ kematian- Σ kematian kontrol
x 100%
Σ larva awal
Nilai kematian organisme 50% (LC50) ditentukan dengan menggunakan
kurva hubungan antara logaritma konsentrasi ekstrak (x) dan nilai probit dari
persentase kematian larva udang (y). Analisis probit yang digunakan berdasarkan
dari metode Finney dan Stevens (1948).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Ekstraksi dan Toksisitas Ekstrak Etil Asetat Senyawa Bioaktif dari Bakteri
yang Berasal dari Spons
Hasil uji toksisitas ekstrak etil asetat senyawa bioaktif yang berasal dari
bakteri yang berasosiasi dengan spons menunjukkan bahwa hampir semua ekstrak
memiliki kemampuan bioaktif kecuali isolat HAL-74. Rendemen ekstrak etil
asetat senyawa bioaktif yang berasal dari bakteri SAB E-31, SAB E-41, SAB E57 menghasilkan jumlah rendemen tertinggi (Tabel 1). Hasil analisis probit
ekstrak etil asetat isolat SAB E-31, SAB-E41, SAB E-57 yang bersifat bioaktif
(Tabel 2).
5
Tabel 1 Rendemen dan toksisitas (LC50) ekstrak etil asetat dari isolat bakteri yang
berasosiasi dengan spons
Kode Isolat
Rendemen (% b/v)
Nilai LC50 (µg mL-1)
SAB E-31
0.02
328.04
SAB E-41
0.02
251.40
SAB E-57
0.02
390.50
HAL-13
0.01
369.00
HAL-74
0.01
2144.07
HAA-01
0.01
954.99
*Nilai LC50 adalah hasil rata-rata 3 kali ulangan menggunakan larva A. Salina (nauplii).
Tabel 2 Nilai Probit ekstrak etil asetat dari isolat bakteri yang berasosiasi dengan
spons
Kode Konsentrasi
Ulangan
Isolat (µg mL-1)
0
10
100
SAB
E-31
250
500
750
0
10
SAB
E-41
100
250
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
Σ Larva
A. salina
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
Σ Larva
%
Mortalitas
mati
Mortalitas
Probit
0
0
0
2
2
3
5
6
6
8
8
9
10
11
11
14
14
14
0
0
0
2
3
3
5
5
6
8
8
10
0
0
0
10
10
15
25
30
30
40
40
45
50
55
55
70
70
70
0
0
0
10
15
15
25
25
30
40
40
50
3.72
3.72
3.96
4.33
4.48
4.48
4.75
4.75
4.87
5.00
5.13
5.13
5.52
5.52
5.52
3.72
3.96
3.96
4.33
4.33
4.48
4.75
4.75
5.00
Rerata
Probit
-
3.80
4.43
4.79
5.09
5.52
-
3.88
4.38
4.83
6
Tabel 2 Nilai Probit ekstrak etil asetat dari isolat bakteri yang berasosiasi dengan spons
(lanjutan)
500
750
0
10
100
SAB
E-57
250
500
750
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
12
12
13
15
15
15
0
0
0
1
1
2
4
4
4
5
6
6
11
11
11
15
15
15
60
65
65
75
75
75
0
0
0
5
5
10
20
20
20
40
40
50
55
55
55
75
75
75
5.25
5.25
5.39
5.67
5.67
5.67
3.36
3.36
3.72
4.16
4.16
4.16
4.33
4.48
4.48
5.13
5.13
5.13
5.67
5.67
5.67
5.29
5.67
-
3.48
4.16
4.43
5.13
5.67
Mortalitas probit
Nilai kematian organisme 50% (LC50) ditentukan dengan menggunakan
kurva hubungan antara logaritma konsentrasi ekstrak (x) dan nilai probit dari
persentase kematian larva udang (y). Hubungan konsentrasi berbanding lurus
dengan mortalitas probit (Gambar 1.1-1.3).
6
5
4
3
2
1
0
y = 0.854x + 2.851
R² = 0.948
0
1
2
3
4
Log Konsentrasi
Gambar 1.1 Hubungan mortalitas probit dengan log konsentrasi ekstrak etil asetat
SAB E-31
Mortalitas probit
7
6
5
4
3
2
1
0
y = 0.912x + 2.808
R² = 0.914
0
1
2
3
4
Log konsentrasi
Mortalitas probit
Gambar 1.2 Hubungan mortalitas probit dengan log konsentrasi ekstrak etil asetat
SAB E-41
6
5
4
3
2
1
0
y = 1.029x + 2.271
R² = 0.857
0
1
2
3
4
Log konsentrasi
Gambar 1.3 Hubungan mortalitas probit dengan log konsentrasi ekstrak etil asetat
SAB E-57
Fraksionasi dan Toksisitas Senyawa Bioaktif dari Bakteri yang Berasal dari
Spons
Jumlah fraksi hasil kromatografi lapis tipis analitik ekstrak etil asetat isolat
SAB E-31, SAB E-41, dan SAB E-57 dipisahkan berdasarkan nilai Rf
(Retardaction factor). Fraksionasi ekstrak etil asetat SAB E-31 menghasilkan 6
fraksi dengan nilai Rf yaitu 0.17, 0.42, 0.51, 0.65, 0.75, dan 0.86. Ekstrak etil
asetat SAB E-41 menghasilkan 6 fraksi dengan nilai Rf yaitu 0.17, 0.44, 0.52,
0.62, 0.74, dan 0.87. Ekstrak etil asetat SAB E-57 menghasilkan 6 fraksi dengan
nilai Rf yaitu 0.14, 0.24, 0.50, 0.61, 0.73, dan 0.87 (Gambar 2).
8
(a)
Gambar 2
(b)
(c)
Fraksionasi menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) analitik (a)
SAB E-31; (b) SAB E-41; (c) SAB E-57
Fraksionasi ekstrak etil asetat SAB E-31 menghasilkan 6 fraksi dengan kode
fraksi A, B, C, D, E, dan F. Ekstrak etil asetat isolat kode SAB E-41
menghasilkan 7 fraksi dengan kode fraksi G, H, I, J, K, L, dan M. Ekstrak etil
asetat SAB E-57 menghasilkan 6 fraksi dengan kode fraksi N, O, P, Q, R dan S
(Gambar 3). Fraksi yang telah diperoleh kemudian diuji toksisitasnya (LC50)
dengan menentukan nilai probit masing-masing fraksi. Fraksi isolat SAB E-31
memiliki nilai LC50 antara 68.20 µg mL-1–1433.00 µg mL-1 dan diperoleh 2 fraksi
yang bersifat bioaktif yaitu fraksi A (131.55 µg mL-1) dan F (68.20 µg mL1).
Fraksi isolat SAB E-41 memiliki nilai LC50 antara 88.29 µg/mL–1305.18 µg/mL
dan diperoleh 3 fraksi yang bersifat bioaktif yaitu fraksi H (88.29 µgmL-1), J
(188.09 µg mL-1), dan M (189.30 µg mL-1). Isolat SAB E-57 menghasilkan 6
fraksi dengan nilai LC50 antara 46.74 µg mL-1 –323.45 µg mL-1 dan diperoleh 4
fraksi yang bersifat bioaktif yaitu fraksi P, Q, R, dan S (Tabel 2). Rendemen
terbanyak diperoleh dari fraksi M ekstrak etil asetat SAB E-41 sebesar 32.62%
(b/b) (Tabel 3).
9
Fraksi A
Fraksi B
Fraksi C
Fraksi D
Fraksi E
1(a)
2(a)
Fraksi F
Penetesan
Ekstrak
Fraksi G
Fraksi H
Fraksi I
Fraksi J
Fraksi K
Fraksi L
Fraksi M
Penetesan
Ekstrak
1(b)
2(b)
Fraksi N
Fraksi O
Fraksi P
Fraksi Q
Fraksi R
Fraksi S
Penetesan
Ekstrak
1(c)
2(c)
Gambar 3 Fraksionaasi menggunakan kromatografi lapis tipis prreparatif (KLTP) 1)
Hasil frakksionasi pada UV 254 nm isolat kode (a) SAB
S
E-31; (b) SAB
E-41; (c) SAB E-57, 2) Ilustrasi hasil fraksionasi pada
p
UV 254 nm
isolat kodde (a) SAB E-31; (b) SAB E-41; (c) SAB E-557
10
Tabel 3 Toksisitas (LC50) fraksi isolat bakteri yang berasosiasi dengan spons
Ekstrak etil asetat
Isolat kode
SAB E-31
Jumlah
fraksi
6
SAB E-41
7
SAB E-57
6
Fraksi
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
L
M
N
O
P
Q
R
S
Rendemen (%
b/b)
16.59
16.80
24.92
7.20
12.29
22.20
5.93
9.86
4.71
5.53
29.17
12.18
32.62
2.94
7.69
6.04
24.49
27.89
30.95
Nilai LC50 (µg
mL-1)
131.55
1433.50
415.95
213.83
340.11
68.20
381.62
88.29
365.65
188.09
254.17
1305.18
189.30
323.45
212.48
46.74
97.55
62.20
174.80
*Nilai LC50 adalah hasil rata-rata 3 kali ulangan menggunakan larva A. Salina (nauplii).
Pembahasan
Senyawa bioaktif dari bakteri yang berasosiasi dengan spons diekstraksi
menggunakan pelarut etil asetat. Etil asetat digunakan karena etil asetat bersifat
tidak larut terhadap air dan memiliki koefisien partisi yang tinggi terhadap
substrat cair sehingga mudah dipisahkan dari kultur cair bakteri (Jeffery et al.
1989). Uji aktivitas sitotoksik menggunakan metode brine shrimp lethality test
(BSLT) dengan hewan uji larva Artemia salina. BSLT digunakan sebagai
penapisan awal dalam upaya pencarian senyawa yang berpotensi sebagai
antikanker, antioksidan dan pengobatan lainnya. BSLT merupakan uji toksisitas
yang umum digunakan sebagai tahapan awal (prescreening) dalam penapisan
senyawa bioaktif. Keuntungan menggunakan metode BSLT yaitu prosedurnya
sederhana, cepat, tidak memerlukan biaya yang besar dan hasilnya akurat
(Sorgeloos et al. 1978).
Larva Artemia salina digunakan sebagai hewan uji karena sifatnya yang
peka terhadap bahan uji, waktu siklus hidup yang cepat, mudah dibiakkan dan
harganya yang murah. Sifat peka A. salina disebabkan oleh keadaan membran
kulitnya yang sangat tipis sehingga memungkinkan terjadinya difusi zat dari
lingkungan yang mempengaruhi metabolisme dalam tubuhnya (Meyer et al.
1982). Penambahan ekstrak yang diduga mengandung senyawa bioaktif
berpotensi sebagai obat diharapkan mampu mengganggu metabolisme dan
menyebabkan kematian larva udang. Respon hewan uji terhadap toksik selalu
11
binomial (mati/tidak mati). Hubungan antara respon dan konsentrasi toksik selalu
berbentuk sigmoid (Gambar 1.1-1.3). Analisis probit digunakan untuk mengubah
bentuk kurva yang sigmoid ke bentuk linear sehingga mudah untuk dianalisis
(Finney & Stevens 1948).
National Cancer Institute (NCI) di Amerika Serikat melaporkan bahwa
terdapat hubungan yang signifikan antara uji toksisitas yang menggunakan larva
A. salina dengan penghambatan pertumbuhan beberapa jenis sel tumor secara in
vitro. Larva A. salina yang digunakan sebagai hewan uji BSLT yang berumur 24
jam karena pembelahan A. salina pada rentang waktu 0-24 jam mengalami
pembelahan sel yang cepat seperti pembelahan sel kanker (Anderson et al. 1991).
A. salina yang telah berumur 48 jam akan membentuk membran sel yang
kompleks sehingga ekstrak yang diberikan tidak dapat masuk ke dalam sel larva
A. salina. Selain itu jika umur A. salina yang digunakan lebih dari 48 jam,
dikhawatirkan kematian A. salina bukan disebabkan toksisitas ekstrak melainkan
oleh terbatasnya persediaan makanan (Sorgeloos et al. 1978).
Ekstrak yang bersifat toksik berpotensi sebagai senyawa bioaktif yang dapat
mematikan minimal 50% organisme uji dengan konsentrasi ≤ 1000 g mL-1
(Meyer et al. 1982). Suatu ekstrak atau senyawa yang bersifat toksik memiliki
kemampuan bioaktif yang berpotensi sebagai obat-obatan. Nilai LC50 ekstrak etil
asetat SAB E-31, SAB E-41, SAB E-57, HAL-13, dan HAA-01 memiliki nilai
LC50 dibawah 1000 g mL-1 yang berarti ekstrak etil asetat tersebut bersifat
bioaktif. Hasil dari nilai LC50 terbaik diperoleh dari isolat kode SAB E-41 sebesar
251.40 g mL-1. Penelitian tentang uji toksisitas ekstrak dan fraksi dari bakteri
belum banyak dilakukan. Issanto (2012) melaporkan bahwa toksisitas ekstrak dari
bakteri yang berasosiasi dengan spons Jaspis sp. dengan kode SAB E-8, SAB-35,
SAB E-38, SAB E-40, SAB E-43 bersifat bioaktif dengan nilai LC50 terendah
81.00 g mL-1.
Persentase mortalitas pada kontrol (0 µg mL-1) sebesar 0% yang
menunjukkan bahwa kondisi lingkungan tempat hidup A. salina dinilai cukup baik
dan tidak menyebabkan kematian sehingga dapat disimpulkan larva A. salina yang
mati disebabkan oleh bioaktivitas senyawa toksik pada ekstrak (Tabel 2). Ekstrak
yang bersifat bioaktif dihasilkan oleh bakteri dalam bentuk metabolit sekunder
ekstraseluler yang dihasilkan pada saat fase stasioner. Senyawa bioaktif umumnya
yang dihasilkan oleh bakteri merupakan turunan dari asam amino dan nukleosida,
flavonoid, alkaloid, terpenoid, makrolid, porfirin, peroksida alifatik, dan sterol
(Thomas et al. 2010).
Ekstrak etil asetat isolat SAB E-31, SAB-E41, HAL-13, SAB E-57
merupakan isolat yang paling aktif tetapi karena rendemen ekstrak etil asetat isolat
HAL-13 sangat sedikit maka dipilih 3 fraksi yang memiliki nilai rendemen cukup
banyak dan memiliki nilai LC50 yang rendah (Tabel 1). Rendemen ekstrak dapat
digunakan sebagai parameter standar mutu ekstrak pada produksi maupun
efisiensi ekstraksi. Senyawa bioaktif isolat terpilih SAB E-31, SAB E-41, dan
SAB E-57 difraksionasi menggunakan metode kromatografi lapis tipis preparatif
(KLTP) untuk memisahkan campuran senyawa dari sampel berdasarkan fraksinya
yang selanjutnya fraksi-fraksi tersebut dikumpulkan dan digunakan untuk analisa
berikutnya. Fraksi dilarutkan menggunakan pelarut organik metanol karena
pelarut ini dapat melarutkan hampir semua senyawa dan mudah menguap. Fraksi-
12
fraksi hasil fraksionasi kemudian diuji toksisitasnya dengan metode BSLT
menggunakan larva A. salina.
Ekstrak etil asetat hasil fraksionasi diperoleh nilai LC50 yang lebih aktif
dibandingkan LC50 ekstrak etil asetatnya. Hal ini disebabkan karena fraksi lebih
murni daripada ekstrak yang merupakan gabungan dari beberapa fraksi. Menurut
Meyer (1982) Suatu senyawa hasil fraksionasi bersifat bioaktif jika nilai LC50 ≤
200 µg mL-1. Sebanyak 9 fraksi dinyatakan bersifat bioaktif diantaranya yaitu
fraksi dengan kode A, F, H, J, M, P, Q, R, dan S dengan nilai LC50 terendah yaitu
46.74 µg mL-1. Suatu ekstrak tersusun atas beberapa fraksi yang memiliki
bioaktivitas berbeda-beda. Fraksi-fraksi tersebut ada yang memiliki nilai LC50
yang lebih rendah dan lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak. Ekstrak etil
asetat SAB E-31 memiliki 2 fraksi (fraksi A dan F) bersifat toksik dan 4 fraksi
(fraksi B, C, D, E) bersifat tidak toksik. Ekstrak etil asetat SAB E-41 memiliki 3
fraksi (fraksi H, I, M) bersifat toksik dan 4 fraksi (fraksi G, J, K, L) bersifat tidak
toksik. Ekstrak etil asetat SAB E-57 memiliki 4 fraksi (fraksi P, Q, R, S) bersifat
toksik dan 2 fraksi (fraksi N, O) bersifat tidak toksik. Hal ini diduga ada sifat
sinergis-antagonis antar fraksi-fraksi senyawa kimia dalam suatu ekstrak yang
menyebabkan peningkatan atau penurunan bioativitasnya. Pemberian nama fraksi
berdasarkan alfabet agar memudahkan dalam pengelompokan fraksi dari SAB E31, SAB E-41, dan SAB E-57 (Tabel 3).
Nilai keaktifan fraksi P SAB E-57 dengan nilai LC50 46.74 µg mL-1dapat
digolongkan aktif karena mendekati nilai standar keaktifan dari National Cancer
Institute (NCI) Amerika yang menyatakan standar efektifitas komponen bioaktif
untuk melawan sel kanker adalah ≤ 30 g/mL (Albuntana et al. 2011). Fraksi P
SAB E-57 diduga memiliki potensi sebagai antikanker dan antioksidan. Menurut
Setiani (2009) fraksi dari ekstrak etil asetat biji Mahoni dengan nilai LC50 74.30
µg mL-1yang kemudian diuji penghambatannya terhadap sel kanker T47D
menghasilkan nilai hambat 50% (IC50) sebesar 49.12 µg mL-1yang berpontensi
sebagai antikanker karena memiliki nilai IC50 kurang dari 50 µg mL-1 (Mans et al.
2000). Mahardika (2013) dalam penelitiannya melaporkan bahwa kulit petai
memiliki bahan bioaktif dengan nilai LC50 49.50 µg mL-1memiliki nilai IC50 2 µg
mL-1yang berpotensi sebagai antioksidan. Suatu senyawa dikatakan memiliki
aktivitas antioksidan yang tinggi bila nilai IC50-nya kurang dari 200 mg L-1 (Hanani et
al. 2005).
Faktor-faktor yang dapat mempengaruhi keberhasilan pengujian toksisitas
menggunakan BSLT, yaitu konsentrasi ekstrak dan air laut yang digunakan dalam
setiap pengujian harus konstan dan tepat, penambahan zat yang membantu
melarutkan ekstrak dalam air laut seperti Tween-80, ketepatan dan ketelitian
peneliti untuk menghitung jumlah larva awal dan yang mati serta pengulangan
minimal 2 kali pengulangan untuk dapat memberikan nilai ketepatan uji yang
tinggi (Septina 2005).
13
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Ekstrak etil asetat yang berasal dari bakteri yang berasosiasi dengan spons
menunjukkan bahwa hampir semuanya memiliki kemampuan bioaktif kecuali
isolat HAL-74. Hasil fraksionasi diperoleh jumlah fraksi pada masing-masing
isolat yaitu SAB E-31 (6 Fraksi), SAB E-41(7 fraksi), dan SAB E-57 (6 fraksi).
Ekstrak etil asetat isolat setelah difraksionasi diperoleh LC50 yang lebih aktif
dibandingkan LC50 ekstrak etil asetatnya. Sebanyak 9 fraksi dinyatakan bersifat
bioaktif diantaranya yaitu fraksi dengan kode A, F, H, J, M, P, Q, R, dan S dengan
nilai LC50 terendah yaitu 46.74 µg mL-1.
Saran
Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan analisis fitokimia untuk mengetahui
kandungan senyawa metabolit sekunder pada ekstrak dan fraksi aktif serta
pengujian antioksidan, antikanker, dan anti-inflamasi untuk aplikasi dalam bidang
medis sebagai obat-obatan.
DAFTAR PUSTAKA
Abubakar H, Wahyudi AT, Yuhana M. 2011. Skrining bakteri yang berasosiasi
dengan spons Jaspis sp. sebagai penghasil senyawa antimikroba. Ilmu
Kelautan. 16:35-40.
Albuntana A, Yasman, Wardhana W. 2011. Uji toksisitas ekstrak empat jenis
teripang suku Holothuriidae dari Kepulauan Penjaliran Timur, Kepulauan
Seribu, Jakarta menggunakan brine shrimp lethality test (BSLT). J Iltek
Keltrop. 3:65-72.
Anderson JE, Goetz CM, McLaughlin JL, Suffness M. 1991. A blind comparison
of simple bench-top bioassay and human tumour cell cytotoxicities as
antitumor prescreens. Phytochem Anal. 2:107-111.
Banoet Y. 2011. Aktivitas senyawa bioaktif antimikrob dari bakteri yang
berasosiasi dengan spons Haliclona sp. dan telaah genetiknya [tesis]. Bogor
(ID): Institut Pertanian Bogor.
Effendi. 2012. Antimicrobial activity of bioactive compounds isolated from
marine bacteria associated with sponge Jaspis sp. and their genetic analysis.
[tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
14
Finney DJ, Stevens WL. 1948. A table for the calculation of working probits and
weights in probit analysis. Biometrika 35: 191-201.
Hanani E, Abdul M, Ryany S. 2005. Identifikasi senyawa antioksidan dalam
Callyspongia sp dari Kepulauan Seribu. Maj Ilmu Kefarmasian. 2:127-133.
Issanto P. 2012. Ekstraksi dan bioaktivitas senyawa antimikrob dari bakteri yang
berasosiasi dengan spons Jaspis sp [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian
Bogor.
Jeffery GH, Bassett J, Mendham J, Denney RC. 1989. Textbook of Quantitative
Chemical Analysis. Fifth Edition. New York: John Wiley & Sons, Inc.
Mahardhika C. 2013. Fraksionasi ekstrak kulit petai berpotensi antioksidan.
[skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Mans DRA, Adriana Bd’R, Schwartsmann G. 2000. Anticancer drugs discovery
and development in Brazil: tergeted plants collection as a rational s trategy
to acquire candidate anticancer compound. Oncologys. 5:185-198.
Meyer BN, Ferigni NR, Putnam JE, Jacobsen RE, Nicholas, McLaughin JL. 1982.
Brine Shrimp : A Convenient Bioassay for Active Plant Constituent. Planta
Med. 45:31-34.
Muller WEG, Grebenjuk VA, Thakur NL, Thakur AN, Batel R. 2004. Oxygencontrolled bacterial growth in the sponge Suberites domuncula: toward a
molecular understanding of the symbiotic relation-ships between sponge
and bacteria. Appl Environ Microbiol. 70:2332-2341.
Proksch P, Edrada RA, Ebel R. 2002. Drugs from the seas-current status and
microbial implications. Appl Microbiol Biotechnol. 59:125-134.
Sargeloos P, Van Der Wielen CR, Persoone G. 1978. The use Artemia nauplii for
toxicity test- a critical analysis. Ecotoxicol and Environ Safety. 2:249-255.
Septina YA. 2005. Identifikasi dan uji toksisitas asam tanat dalam ekstrak daun
ketapang (Terminalia catappa) [skripsi]. Semarang (ID): Universitas
Diponegoro.
Setiani RFC. 2009. Sitoksisitas fraksi aktif biji Mahoni (Swietenia mahagoni)
pada sel kanker payudara T47D. [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian
Bogor.
Taylor MW, Radax R, Steger D, Wagner M. 2007. Sponge-associated
microorganisms: evolution, ecology, and biotechnological potential.
Microbiol Mol Biol Rev. 71:295-347.
Thakur NL, Muller WEG. 2004. Bio-technological potential of marine sponges.
Curr Sci. 11:86.
Thakur AN, Thakur NL, Indap MM, Pandit RA, Datar VV, Műller WEG. 2005.
Antiangiogenik, antimicrobial, and citotoxic potential of sponges-associated
bacteria. Mar Biotechnol. 7:245-252.
Thomas TRA, Kavlekar DP, Lokabharathi PA. 2010. Marine drug from spongemicrobe association. Mar Drugs 8: 1417-1468.
Tokasaya P. 2010. Sponge-Associated Bacteria Producing Antimicrobial
Compounds and Their Genetic Diversity Analysis [tesis]. Bogor (ID):
Institut Pertanian Bogor.
Wang G. 2006. Diversity and biotechnological potential of the sponges-associated
microbial consortia. J Ind Microbiol Biotechnol. 33:545- 551.
15
Zheng L, H Chen, X Han, X Yan. 2005. Antimicrobial screening and active
compound isolation from marine bacterium NJ6-3-1 associated with the
sponge Hymeniacidon perleve. World J Microbiol Biotechnol. 21:201-206.
16
Lampiran 1 Komposisi meedium sea water complete (SWC)
Komposisi untuk 1000 mL
Pepton
Yeast Extract
Glicerol
Bacto Agar
Air laut steril
Aquades
5 graam
1 graam
3 mL
L
15 grram
750 mL
m
250 mL
m
Lampiran 2 Larva Artemia salina umur 24 jam
17
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 1 Agustus 1991 dari ayah Heru
Agus Sulistiawan dan ibu Eni Kurniasari Penulis adalah putri pertama dari empat
bersaudara. Tahun 2009 penulis lulus dari SMA Negeri 1 Jasinga. Selama di SMA
penulis memperoleh peringkat 1 Olimpiade Biologi tingkat SMA di Kabupaten
Bogor pada tahun 2008. Penulis lulus seleksi masuk Institut Pertania Bogor (IPB)
melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB dan diterima di Departemen Biologi,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Saat ini penulis sedang
mengikuti program FASTRACK sinergi S1 Biologi- S2 Mikrobiologi.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif sebagai staf Departemen
Advokasi dan Kesejahteraan Mahasiswa BEM FMIPA IPB 2011. Tahun 2011
Penulis melakukan penelitian Studi Lapangan dengan judul Inventarisasi Meniran
di Hutan Pendidikan Gunung Walat. Tahun 2012 penulis melaksanakan Praktik
Lapangan di Pusat Studi Biofarmaka IPB dengan judul Pemeriksaan Kualitas
Simplisia Kulit Kayu Manis Cina (Cinnamomum casia) dan Kayu Manis Padang
(Cinnamomum burmanii).
Penulis juga mendapatkan prestasi dalam Program Kreativitas Mahasiswa
(PKM) di bidang artikel ilmiah dengan judul “Keanekaragaman Meniran di Hutan
Pendidikan Gunung Walat” dari Dinas Pendidikan Tinggi (DIKTI) pada tahun
2012.