Toksisitas Ekstrak Senyawa Bioaktif dari Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons dan Analisis DNA yang Berperan dalam Biosintesisnya

TOKSISITAS EKSTRAK SENYAWA BIOAKTIF DARI
BAKTERI YANG BERASOSIASI DENGAN SPONS
DAN ANALISIS DNA YANG BERPERAN
DALAM BIOSINTESISNYA

MOHAMMAD FADHILLAH

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul “Toksisitas Ekstrak
Senyawa Bioaktif dari Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons dan Analisis DNA
yang Berperan dalam Biosintesisnya” adalah benar karya saya dengan arahan dari
komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan
tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks

dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skipsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Februari 2014

Mohammad Fadhillah
NIM G34090094

ABSTRAK
MOHAMMAD FADHILLAH. Toksisitas Ekstrak Senyawa Bioaktif dari
Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons dan Analisis DNA yang Berperan dalam
Biosintesisnya. Dibimbing oleh ARIS TRI WAHYUDI dan DUDI TOHIR.
Spons merupakan organisme penghasil banyak senyawa bioaktif yang hidup
bersimbiosis dengan banyak mikroorganisme. Mikroorganisme simbion salah
satunya berperan sebagai penghasil senyawa bioaktif untuk pertahanan diri spons
inangnya. Penelitian ini bertujuan menguji toksisitas ekstrak etil asetat bakteri
yang berasosiasi dengan spons terhadap larva Artemia salina serta analisis
keragaman DNA yang berperan dalam sintesis senyawa bioaktif. Uji toksisitas
dilakukan dengan metode BSLT yang menghasilkan nilai LC50 sebesar 117.1
µg/mL sampai 620 µg/mL. Fraksionasi ekstrak etil asetat isolat SAB E-35, SAB

E-38 dan SAB E-40 menggunakan teknik kromatografi lapis tipis preparatif
(KLTP) menghasilkan fraksi dengan nilai LC50 terbaik yaitu 116.7 µg/mL. Fraksi
38-E dari isolat SAB E-38 menunjukkan peningkatan nilai toksisitas dari ekstrak
etil asetatnya, yaitu dari 138.6 µg/mL menjadi 116.7 µg/mL. Isolat SAB E-35,
SAB E-38 dan SAB E-40 memiliki gen penyandi domain KS dari PKS dan
domain A dari NRPS dengan homologi 47% hingga 100%. SAB E-40 memiliki
homologi yang rendah dan diduga berpotensi sebagai penghasil senyawa bioaktif
baru.
Kata kunci: bakteri yang berasosiasi dengan spons, NRPS, PKS, toksisitas

ABSTRACT
MOHAMMAD FADHILLAH. Toxicity of Sponge-Associated Bacteria
Bioactive Compounds Extract and Analysis of DNA that play role in its
Biosynthesis. Supervised by ARIS TRI WAHYUDI and DUDI TOHIR.
Sponges are organisms that produced many bioactive compounds and live
symbiotically with many microorganisms. Symbiont microorganisms act as
producers of bioactive compounds for sponge self-defense. This study aims to test
the toxicity of the ethyl acetate extract sponge-associated bacteria against Artemia
salina larvae and diversity analysis of DNA that play a role in the synthesis of
bioactive compounds. BSLT was used as toxicity assay method and obtained LC50

values ranged from 117.1 µg/mL to 620 µg/mL. Fractionation of the ethyl acetate
extract for isolates SAB E-35, SAB E-38 and SAB E-40 using preparative thin
layer chromatography technique (PTLC) yielded fraction with the best LC50 value
116.7 µg/mL. Fraction 38-E of isolate SAB E-38 showed increase in LC50 value
from its etyl acetat extract 138.6 µg/mL to 116.7 µg/mL. Isolates SAB E-35, SAB
E-38, and SAB E-40 has gene that encoded the KS domain of PKS and A domain
of NRPS with homology percentage from 47% to 100%. SAB E-40 has low
homology and expected as potential producer of new bioactive compounds.
Keywords: NRPS, PKS, sponge-associated bacteria, toxicity

TOKSISITAS EKSTRAK SENYAWA BIOAKTIF DARI
BAKTERI YANG BERASOSIASI DENGAN SPONS
DAN ANALISIS DNA YANG BERPERAN
DALAM BIOSINTESISNYA

MOHAMMAD FADHILLAH

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains

pada
Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

Judul Skripsi : Toksisitas Ekstrak Senyawa Bioaktif dari Bakteri yang Berasosiasi
dengan Spons dan Analisis DNA yang Berperan dalam
Biosintesisnya
Nama
: Mohammad Fadhillah
NIM
: G34090094

Disetujui oleh

Prof Dr Aris Tri Wahyudi, M Si

Pembimbing I

Drs Dudi Tohir, M S
Pembimbing II

Diketahui oleh

Dr Iman Rusmana, M Si
Ketua Departemen

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji dan rasa syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala
karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih
pada penelitian ini adalah Toksisitas Ekstrak Senyawa Bioaktif dari Bakteri yang
Berasosiasi dengan Spons dan Analisis DNA yang Berperan dalam
Biosintesisnya.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Prof Dr Aris Tri Wahyudi, M Si dan
Drs Dudi Tohir, MS selaku dosen pembimbing dan Puji Rianti, M Si selaku dosen

penguji yang telah memberikan arahan dan bimbingannya dalam penyelesaian
karya ilmiah ini. Penulis juga mengucapkan rasa terima kasih kepada Pak Eman,
Pak Sabur, Issanto, S Si, Effendi, M Si, Rahayu Wangsa Putrie, M Si, dan Annisa
Wulan Agus Utami, S Si yang telah banyak membantu dalam pengerjaan dan juga
memberikan saran serta masukan untuk penelitian ini. Ungkapan terima kasih juga
penulis sampaikan kepada Ayah, Ibu, dan seluruh keluarga atas dukungannya baik
secara moril maupun materil selama penyusunan skripsi ini.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Februari 2014

Mohammad Fadhillah

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL

viii

DAFTAR GAMBAR

viii

DAFTAR LAMPIRAN

viii

PENDAHULUAN

1

Latar Belakang

1

Tujuan Penelitian

2

METODE

2

Bahan

2

Alat

2

Prosedur

2

HASIL DAN PEMBAHASAN

4

Ekstraksi Senyawa Bioaktif dan Toksisitasnya

4

Toksisitas Fraksi

6

Amplifikasi Domain KS dan Domain A

7

Analisis Bioinformatika

9

SIMPULAN DAN SARAN

12

Simpulan

12

Saran

12

DAFTAR PUSTAKA

12

LAMPIRAN

17

RIWAYAT HIDUP

21

DAFTAR TABEL

1
2
3
4

Nilai LC50 ekstrak etil asetat bakteri yang berasosiasi dengan spons
Nilai LC50 fraksi ekstrak etil asetat bakteri yang berasosiasi dengan
spons
Persentase homologi sekuen gen penyandi domain A
Persentase homologi sekuen gen penyandi domain KS

4
7
9
9

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4

Fraksionasi ekstrak bakteri SAB E-38 menggunakan kromatografi
lapis tipis preparatif (KLTP)
Elektroforesis gel agarose 1% domain KS dan domain A yang
diamplifikasi dari genom isolat SAB E-35, SAB E-38 dan SAB E-40
Pohon filogenetik berdasarkan sekuen asam amino domain A
(adenilation)
Pohon filogenetik berdasarkan sekuen asam amino domain KS
(ketosintase)

6
8
10
11

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3

Perhitungan LC50 isolat SAB E-40
Komposisi medium sea water complete (SWC) 1000 mL
Sekuen parsial domain KS dan A

17
18
18

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Spons (Filum : Porifera) merupakan organisme penghasil banyak senyawa
bioaktif yang hidupnya bersimbiosis erat dengan banyak mikroorganisme. Wang
(2006) melaporkan bahwa spons merupakan inang bagi banyak mikroorganisme
dari golongan arkaea, bakteri, fungi, aktinomiset, alga hijau biru, dan mikroalga
yang dapat mencapai 40-60% dari biomassa total pada beberapa spons tertentu.
Mikroorganisme yang berasosisasi dengan spons memiliki beberapa peran
meliputi penyedia nutrien tertentu, menstabilkan rangka spons, memproses limbah
metabolisme, dan memproduksi metabolit sekunder (Hentschel et al. 2002).
Beberapa mikoorganisme yang diisolasi dari spons dan hewan laut lain dilaporkan
memproduksi senyawa bioaktif yang sama dengan inangnya. Senyawa bioaktif
yang dihasilkan oleh mikroorganisme simbion sebagai salah satu bentuk
pertahanan bagi hewan invertebrata laut yang tidak memiliki pertahanan secara
fisik (Berdy 2005). Saat ini, kemampuan memproduksi metabolit sekuder yang
bersifat bioaktif dari mikroorganisme yang berasosiasi dengan spons mulai
banyak dipelajari karena berpotensi untuk bidang biomedis dan farmasi sebagai
antiviral, antitumor, antimikrob, dan aktivitas sitotoksik.
Lautan merupakan sumber banyak senyawa-senyawa bioaktif yang
bermanfaat dalam bidang medis dan farmasi. Salah satu senyawa bioaktif yang
berpotensi sebagai antikanker diisolasi dari ekosisitem laut antara lain peptida
pendek linear atau siklik, depsipeptida, poliketida, dan steroid (Simmon et al.
2005). Sebagian besar senyawa tersebut diisolasi dari hewan invertebrata laut
misalnya spons, tunicata, bryozoa, dan moluska. Di samping itu, mikroorganisme
simbion hewan invertebrata laut juga berpotensi sebagai penghasil senyawasenyawa antikanker. Beberapa penelitian yang melaporkan mikroorganisme
simbion memiliki kemampuan sebagai penghasil senyawa antikanker antara lain
bakteri yang berasosiasi dengan spons Thonella swinhoei (Piel et al. 2004) dan
Pseudomonas piscida dari spons Hymeniacidon perleve (Zheng et al. 2006).
Keragaman senyawa bioaktif yang dihasilkan mikroorganisme yang
berasosiasi dengan spons dapat dipelajari salah satunya melalui pendekatan
biologi molekuler (Taylor et al. 2007). Pendekatan biologi molekuler mampu
mengisolasi gen yang menyandikan biosintesis suatu senyawa bioaktif dan
menganalisisnya secara bioinformatik sebagai informasi tambahan dalam
penentuan jenis senyawa bioaktif yang dihasilkan (Zhang et al. 2005). Enzim
peptida sintase nonribosom (NRPS) dan poliketida sintase (PKS) adalah enzim
multidomain yang terlibat dalam biosintesis senyawa bioaktif dari golongan
peptida nonribosom dan poliketida pada banyak bakteri, cendawan, dan tanaman.
Kedua kelompok metabolit sekunder tersebut banyak yang bermanfaat dalam
dunia medis dan farmasi (Cane dan Walsh 1999).
Bakteri yang berasosiasi dengan spons Jaspis sp. dalam penelitian ini
diisolasi oleh Abubakar et al. (2011). Beberapa isolat dilaporkan menunjukkan
aktivitas antimikrob terhadap beberapa strain patogen manusia. Selanjutnya, Putra
(2012) juga menelaah isolat-isolat terbaik tersebut meliputi, konsentrasi hambat
minimum dan aktivitas antimikrob ekstrak etil asetatnya serta bioautografi

2
terhadap beberapa bakteri patogen manusia. Isolat-isolat tersebut diberikan kode
yaitu sponge-associated bacteria (SAB) antara lain, SAB E-8, SAB E-35, SAB E38, SAB E-40, dan SAB S-43.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan menguji toksisitas ekstrak kasar senyawa bioaktif
dan hasil fraksionasi dari bakteri yang berasosiasi dengan spons serta analisis
sekuens DNA yang berperan dalam biosintesis senyawa tersebut.

METODE
Bahan
Bahan yang digunakan adalah isolat-isolat terbaik dari bakteri yang
berasosiasi dengan spons Jaspis sp., yaitu SAB E-8, SAB E-35, SAB E-38, SAB
E-40 dan SAB S-43 (Putra 2012) serta telur Artemia salina. Medium yang
digunakan yaitu sea water complete (SWC) dan air laut (Lampiran 2). Pelarut
yang digunakan untuk ekstraksi adalah etil asetat.
Alat
Alat laboratorium yang digunakan adalah peralatan mikrobiologi pada
umumnya, Silica gel 60 GF254 Merck, peralatan KLT Preparatif, Laminar Air
Flow Cabinet (Jouan, Prancis), autoklaf, hot plate, dan rotary evaporator
Prosedur
Ekstraksi Senyawa Bioaktif
Isolat bakteri yang digunakan dikulturkan dalam media 1000 mL cair
(Lampiran 2). Kultur diinkubasi pada mesin penggoyang (100 rpm, 30 0C) selama
tiga hari, kemudian ditambahkan etil asetat 1000 mL dan diaduk selama 2 jam.
Lapisan etil asetat pada bagian atas kultur dipisahkan dan kemudian dipekatkan
dengan rotary evaporator untuk mendapatkan ekstrak kasar. Ekstrak kasar yang
didapatkan disimpan pada suhu 5 0C hingga digunakan pada penelitian
selanjutnya (Müller et al. 2004).
Uji Toksisitas menggunakan Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)
Uji BSLT dilakukan terhadap larva A.salina. Penetasan A.salina dilakukan
dengan cara memasukkan setengah sendok teh telur ke dalam sistem alat penetas,
aerator dan sumber cahaya. Telur diaerasi dengan kuat selama 24-36 jam
kemudian. Larva yang digunakan untuk uji toksisitas adalah larva aktif yang
berada di daerah yang diberi cahaya. Sebanyak 20 larva dimasukkan dalam tabung
uji dan kemudian ekstrak senyawa bioaktif ditambahkan hingga mencapai
konsentrasi akhir yaitu, 10 µg/mL, 100 µg/mL, 250 µg/mL, 500 µg/mL, 750
µg/mL dan kontrol. Setelah 24 jam jumlah larva yang hidup pada setiap

3
konsentrasi dihitung dan dibandingkan dengan kontrol. Persentase kematian larva
dihitung dengan rumus :
e i
e
i
e i
Nilai kematian organisme uji 50% (LC50) ditentukan dengan menggunakan kurva
hubungan antara logaritma konsentrasi ekstrak (x) dan nilai probit dari persentase
kematian larva udang (y) (Lampiran 1). Analisis probit yang digunakan
berdasarkan dari metode Finney dan Stevens (1948).
Fraksionasi Ekstrak Kasar
Ekstrak kasar yang difraksionasi dipilih berdasarkan nilai LC50 ekstrak
kasar terbaik. Fraksionasi dilakukan dengan kromatografi lapis tipis preparatif
(KLTP). Bubuk silica gel dilarutkan dengan akuades dan dibuat menjadi lapisan
tipis pada pelat kaca berukuran 20×20 cm. Selanjutnya, ekstrak kasar yang sudah
diencerkan dengan etil asetat diteteskan memanjang pada pelat kaca. Kemudian
pelat dimasukkan ke dalam kotak kromatografi yang berisi eluen n-butanol:etil
asetat 3:7 (Putra 2012) yang telah dijenuhkan selama satu jam. Setelah senyawa
bergerak sampai garis batas atas, pelat dikeluarkan dan dikeringkan. Komponenkomponen senyawa yang terpisah menjadi beberapa fraksi yang berbentuk pita di
sepanjang pelat, kemudian dilihat dan ditandai di bawah sinar UV (Zheng et al.
2005). Fraksi-fraksi yang terpisah kemudian diambil dan dikelompokkan. Setelah
itu kumpulan fraksi tersebut dilarutkan dengan metanol. Fraksi yang telah
telarutkan dengan metanol kemudian disaring untuk memisahkan fraksi senyawa
dari silica gel. Fraksi dipekatkan kembali dengan rotary evaporator untuk diuji
kembali toksisitasnya menggunakan larva A.salina menggunakan uji BSLT.
Isolasi DNA Genom
Bakteri dikulturkan pada media SWC selama 24 jam. Sebanyak 1.5 mL
kultur disentrifugasi pada 10.000 rpm selama 10 menit. DNA genom diisolasi
dengan mengikuti metode CTAB (Sambrook dan Russell 2001).
Amplifikasi gen PKS (Domain KS) dan NRPS (Domain A)
Reaksi PCR untuk mengamplifikasi gen penyandi domain KS dari PKS
dan domain A dari NRPS dilakukan dengan metode Schirmer et al. (2005). Reaksi
PCR dilakukan sebanyak 35 siklus dengan masing-masing tahap yaitu
predenaturasi selama 1 menit dan denaturasi selama 5 menit pada suhu 94 ºC,
annealing pada 50 ºC selama 1 menit, polimerisasi pada 72 ºC selama 1 menit,
dan postPCR dilakukan pada suhu 72 ºC selama 10 menit. Visualisasi amplikon
dilakukan dengan elektroforesis pada agarose 1% (b/v). Isolat yang mempunyai
gen penyandi domain ketosintase (KS) menunjukkan terbentuknya pita pada
ukuran di sekitar 700 pb, sedangkan domain adenilation (A) berukuran 1000 pb.
Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi domain KS adalah forward: 5’CSATGGAYCCSCARCARCGSVT-3’ reverse : 5’-GTSCCSGTSCCRTGSSCYTCSAC-3’ d se ue p i e spesifi u u d
i A y i u forward : 5’AARDSIGGIGSIGSITAYBICC-3’reverse : 5’-CKRWAICCICKIAIYTTIA-

4
YYTG-3’(Schi e et al. 2005). Selanjutnya, hasil amplifikasi disekuen
menggunakan jasa 1st BASE DNA Sequencing Services.
Analisis Bioinformatika
Sekuen DNA yang didapat (Lampiran 3), kemudian disejajarkan dengan
sekuen yang ada di Genbank (NCBI) menggunakan program BlastX sehingga
didapatkan beberapa sekuen lain yang memiliki kemiripan terdekat. Setelah itu,
sekuen DNA diterjemahkan ke dalam runutan protein menggunakan ExPASY
Molecular Biology untuk membuat pohon filogenetik. Pohon filogenetik dibuat
dengan perangkat lunak Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) versi
5.0 (Tamura et al. 2011).

HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstraksi Senyawa Bioaktif dan Toksisitasnya
Uji toksisitas terhadap larva udang merupakan salah satu metode uji
bioaktif pada penelitian senyawa bahan alam. BSLT merupakan uji pendahuluan
dan digunakan untuk penapisan aktivitas antikanker serta sebagai alternatif
metode yang murah untuk uji toksisitas (Hamburger dan Hostettmann 1991).
Hasil uji BSLT untuk ekstrak etil asetat bakteri yang digunakan menunjukkan
hasil yang beragam seperti tersaji pada Tabel 1. Nilai LC50 yang didapatkan
berkisar antara 117.1 µg/mL sampai 620 µg/mL. Menurut Meyer et al. (1982),
suatu ekstrak dianggap sangat toksik bila memiliki nilai LC50 di bawah 30 µg/mL,
dianggap toksik bila memiliki nilai LC50 30–1000 µg/mL dan dianggap tidak
toksik bila nilai LC50 di atas 1000 µg/mL. Semua ekstrak etil asetat dari isolat
bakteri yang digunakan bersifat toksik. Ekstrak etil asetat dengan nilai LC50
terbaik yaitu dari isolat SAB E-35, SAB E-38, dan SAB-E 40 selanjutnya
dilakukan fraksionasi dan uji BSLT lanjutan.
Tabel 1 Nilai LC50 ekstrak etil asetat bakteri yang berasosiasi dengan spons
Kode Isolat
SAB E-8

Rendemen (% b/v)
0.01

LC50 (µg/mL)
620

SAB E-35

0.02

117.1

SAB E-38

0.02

138.6

SAB E-40

0.01

244.4

SAB S-43

0.02

457

Nilai LC50 adalah nilai rata-rata 3 kali ulangan menggunakan larva A. salina (nauplii).

Ekstrak bakteri yang didapatkan disajikan dalam hasil perhitungan
rendemen (% b/v) pada Tabel 1. Data tersebut memperlihatkan jumlah ekstrak
yang didapatkan dari hasil ekstraksi kultur cair bakteri yang berasosiasi dengan

5
spons. Hasil ekstraksi dengan eluen etil asetat 1000 mL dapat menghasilkan 0.10.2 gram. Pada ekstraksi langsung jaringan spons, ekstrak yang diperoleh dapat
mencapai 150 gram dari 2 kg spons Jaspis sp. (Tang et al. 2012), 80 gram dari
500 gram spons Jaspis splendes (Ebada et al. 2009). Spons yang digunakan dalam
penelitian tersebut diisolasi langsung dari laut. Ekstraksi langsung dari spons
memang lebih banyak menghasilkan ekstrak namun sangat membahayakan
kelestarian spons tersebut. Solusi permasalahan tersebut antara lain isolasi
mikroorganisme yang berasosiasi dengan spons dan budi daya spons. Budi daya
spons ternyata memiliki kelemahan yaitu waktu pertumbuhan yang lama untuk
pemanenan ukuran komersial spons yaitu 800 gram selama 2-3 tahun (MacMillan
1999). Oleh karena itu, salah satu cara yang ramah lingkungan adalah dengan
mencari potensi senyawa bioaktif dari bakteri yang berasosiasi dengan spons.
Larva A. salina digunakan sebagai hewan uji karena sifatnya yang peka
terhadap bahan uji, waktu siklus hidup yang cepat, mudah dibiakkan dan harganya
yang murah. Sifat peka A. salina disebabkan oleh keadaan membran kulitnya yang
sangat tipis sehingga memungkinkan terjadinya difusi zat dari lingkungan yang
mempengaruhi metabolisme dalam tubuhnya (Meyer et al.1982). Larva A. salina
yang digunakan sebagai hewan uji BSLT yang berumur 24 jam karena
pembelahan A. salina pada rentang waktu 0-24 jam mengalami pembelahan sel
yang cepat seperti pembelahan sel kanker (Anderson et al. 1991). Beberapa hal
yang menentukan keakuratan nilai toksisitas yang didapatkan antara lain, suhu
inkubasi telur dan suhu air laut, umur larva yang digunakan, dan salinitas air laut
yang digunakan (Sargeloos et al. 1978).
Uji BSLT masih relevan dalam penapisan senyawa yang bersifat sitotoksik
dan dibuktikan berkorelasi positif dengan hasil uji sitotoksik pada sel kanker
(Carballo et al. 2002). Fajarningsih et al. (2006) melaporkan adanya kenaikan
nilai toksisitas ekstrak metanol spons Crella papilata dari 19.99 µg/mL terhadap
A. salina menjadi 7.6 µg/mL terhadap sel kanker HeLa. Peningkatan nilai
toksisitas juga mungkin dapat terjadi untuk ekstrak etil asetat dari bakteri yang
digunakan pada penelitian ini. Nilai toksisitas terbaik yang didapatkan dari SAB
E-35 yaitu sebesar 117.1 µg/mL. Penelitian lain yang menggunakan ekstrak
langsung spons Petrosia sp. dari Bunaken seperti Astuti et al. (2003)
menghasilkan LC50 bervariasi antara 48.15 µg/mL sampai 445.7 µg/mL.
Pengembangan senyawa bioaktif yang berasal dari spons mengalami hambatan
karena memerlukan biomassa spons yang besar untuk mengekstraksi senyawa
bioaktif dalam aplikasinya di bidang medis (Proksch et al. 2002). Bakteri yang
berasosiasi dengan spons yang menghasilkan senyawa bioaktif diharapkan dapat
dijadikan sebagai alternatif untuk permasalahan tersebut.
Spons laut hidup bersimbiosis dengan mikroorganisme seperti golongan
arkaea, bakteri, fungi, aktinomiset, alga hijau biru, dan mikroalga (Zhang et al.
2005) yang dapat mencapai hingga 40-60% biomassa tubuhnya (Wang 2006).
Beberapa penelitian melaporkan keterlibatan mikroorganisme simbion dari
beberapa bahan alam yang awalnya diisolasi dari spons inangnya karena beberapa
mikroorganisme yang diisolasi dari spons menghasilkan senyawa yang sama
dengan hasil isolasi langsung dari spons. Micrococcus sp. memproduksi
diketopiperazines yang awalnya dilaporkan dari spons Tedania ignis. Bakteri
simbion yang lain, Vibrio sp. menghasilkan brominated biphenyl ethers yang
awalnya diisolasi dari spons Dysidea sp. Selain itu, bakteri Vibrio sp. lainnya

6
memproduksi andrimid peptida anti-Bacillus yang awalnya ditemukan dalam
ekstrak spons Hytella sp. (Lee et al. 2001).
Toksisitas Fraksi
Tiga isolat yang memiliki nilai LC50 terendah difraksionasi menggunakan
metode kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP) yaitu, SAB E-35, SAB E-38
dan SAB E-40 (Gambar 1). Ekstrak etil asetat SAB E-35, SAB E-38 dan SAB E40 berturut-turut menghasilkan 5, 5, dan 6 fraksi (Tabel 2). Semua fraksi tersebut
kemudian diuji toksisitas kembali dengan metode BSLT. Fraksi dari SAB E-35
dan SAB E-40 menghasilkan nilai LC50 yang lebih besar dibandingkan nilai LC50
ekstrak etil asetatnya. Nilai LC50 ekstrak etil asetat SAB E-35 adalah 117.15
µg/mL sedangkan nilai LC50 fraksi-fraksinya yaitu, 630 µg/mL, 1148.15 µg/mL
dan 3981.07 µg/mL. Selain itu, nilai LC50 ekstrak etil asetat SAB E-40 adalah
244.4 µg/mL sedangkan nilai LC50 fraksi-fraksinya yaitu, 562 µg/mL, 1047.01
µg/mL dan 1202.3 µg/mL. Setiap isolat memiliki fraksi aktif dengan nilai LC50
yang lebih besar dibandingkan ekstrak etil asetatnya, kecuali fraksi 38-E. Satu
fraksi dari SAB E-38 yang melebihi keaktifan ekstrak etil asetatnya yaitu 38-E
dengan nilai LC50 116.7 µg/mL sedangkan nilai ekstrak etil asetatnya 138.6
µg/mL.
Fraksi 38-E
Fraksi 38-D
Fraksi 38-C

Fraksi 38-B
Fraksi 38-A

(a)

(b)

Penetesan
ekstrak

Gambar 1 Fraksionasi ekstrak bakteri SAB E-38 menggunakan kromatografi lapis
tipis preparatif (KLTP) (a) Hasil fraksionasi di bawah sinar UV λ 254
nm (b) Ilustrasi hasil fraksionasi di bawah sinar UV λ 254 nm
Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu metode pemisahan
sederhana yang berguna untuk memisahkan campuran sehingga diperoleh
senyawa dalam jumlah banyak. Kromatografi preparatif dipakai untuk
memperoleh komponen campuran dalam jumlah yang memadai sehingga
komponen itu dapat dicirikan lebih lengkap atau dipakai pada reaksi berikutnya.
Pemisahan preparatif merupakan hal yang biasa dalam bidang kimia, biologi,
farmasi dan kedokteran (Gritter et al. 1991). Pada penelitian ini, dilakukan teknik
KLTP untuk mendapatkan fraksi dalam jumlah banyak untuk digunakan pada uji

7
selanjutnya. Nilai LC50 fraksi jika dibandingkan dengan ekstrak etil asetatnya
yang menurun seperti pada beberapa fraksi SAB E-35 dan SAB E-40 diduga
karena kemampuan toksisitasnya merupakan gabungan dari fraksi-fraksi yang
terpisah pada saat KLTP. Krisyuninda (2012) juga menemukan fraksi hasil
pemisahan KLTP yang tidak toksik dari ekstrak spons Callyspongia. Sp. Fraksi
yang tidak toksik adalah fraksi alkaloid yang memiliki nilai LC50 2012.5 µg/mL
dan fraksi steroid dengan nilai LC50 1821.05 µg/mL.
Tabel 2 Nilai LC50 Fraksi ekstrak etil asetat bakteri yang berasosiasi dengan spons
Kode Isolat

LC50 (µg/mL)
Ekstrak Etil asetat

SAB E-35

117.1

SAB E-38

138.6

SAB E-40

244.4

Kode Fraksi
35-A
35-B
35-C
35-D
35-E
38-A
38-B
38-C
38-D
38-E
40-A
40-B
40-C
40-D
40-E
40-F

LC50 (µg/mL)
3981.1
1148.2
630
707.9
933.2
116.7
1047.1
1202.3
562

Nilai LC50 adalah nilai rata-rata 3 kali ulangan menggunakan larva A. salina (nauplii)
- : tidak ada larva A. Salina yang mati setelah 24 jam perlakuan

Amplifikasi Domain KS dan Domain A
Karakteristik lain bakteri yang berpotensi penghasil senyawa bioaktif
adalah adanya gen yang menyandikan enzim poliketida sintase (PKS) dan peptida
nonribosom sitetase (NRPS). PKS dan NRPS adalah dua jenis enzim yang terlibat
dalam sintesis bahan alam pada banyak bakteri, cendawan, dan tanaman (Cane et
al. 1998; Moffit dan Neilan 2003). Kedua enzim tersebut berperan dalam sintesis
banyak senyawa bioaktif seperti antibiotik, toksin, siderophore, dan
immunosuppressant. Enzim tersebut memiliki ukuran yang besar sekitar 200
sampai 2000 kDa sebagai enzim mutifungsional yang memiki modul-modul
dalam membuat suatu senyawa. Beberapa produk poliketida dan peptida
nonribosom dalam dunia medis antara lain, antibakteri vancomycin dan
erythromycin, immunosuppressant cyclosporin dan rapamycin, serta antitumor
bleomycin dan epothilone. Penggunaan domain KS dan A dalam studi keragaman
gen PKS dan NRPS disebabkan domain ketosintase (KS) dan domain adenilasi

8
(A) merupakan domain yang ada dalam tiap modul dan memperlihatkan derajat
konservasi yang tinggi di antara domain lainnya (Moffitt dan Neilan 2003).
Hasil amplifikasi gen penyandi domain A dan domain KS pada isolat SAB
E-35, SAB E-38 dan SAB E-40 menunjukkan semua isolat memiliki gen penyandi
kedua domain tersebut (Gambar 2). Keberadaan kedua gen tersebut dalam satu
isolat menimbulkan dugaan bahwa kedua gen tersebut membentuk kompleks
hibrid atau gabungan antara PKS-NRPS dalam memproduksi senyawa bioaktif
seperti yang ditemukan pada biosintesis senyawa antikanker bleomycin pada
Streptomyces (Shen et al. 2001). Zhang et al. (2009) juga menemukan gen PKS
dan NRPS dalam beberapa isolat bakteri yang berasosiasi dengan spons dari laut
Cina Selatan dan menduga adanya kluster gen hibrid NRPS-PKS pada bakteri
tersebut. Selain itu, adanya hibrid NRPS-PKS juga dilaporkan pada
Pseudoalteromonas sp. yang diisolasi dari spons Hymeniciadon perleve (Zhu et
al. 2009). Meskipun kebanyakan bakteri yang berasosiasi dengan spons memiliki
gen penyandi PKS dan NRPS namun pada beberapa kasus ditemukan hanya
memiliki PKS atau NRPS saja atau tidak memiliki keduanya.
.

M

Domain KS
~ 700 pb

35

38

40

35

38

40

Domain A
~1000 pb

Gambar 2 Elektroforesis gel agarose 1% domain KS dan domain A yang
diamplifikasi dari genom isolat SAB E-35, SAB E-38 dan SAB E40
Enzim PKS dan NRPS disusun oleh tiga domain utama yaitu dua domain
berfungsi sebagai katalitik dan satu domain sebagai pembawa (carrier). Domain
utama pada PKS antara lain, ketosintase (KS), acyl tranferase (AT), dan acyl
carrier protein (ACP) sedangkan pada NRPS kondensasi (C), adenilasi (A), dan
peptidyl carrier protein (PCP) (Cane dan Walsh 1999). Hibrid antara PKS dan
NRPS terjadi apabila ditemukan domain PKS atau NRPS dalam satu jalur
biosintesis yang sama dalam memproduksi senyawa bahan alam yang sama baik
poliketida maupun peptida nonribosom. Produk sistem hibrid PKS-NRPS antara
lain, pada sintesis antibiotik rapamicin (12 PKS modul dan 1 NRPS modul)
(Aparicio et al. 1996) dan sintesis yersiniabactin (3 NRPS modul dan 1 PKS
modul) (Gehring et al. 1998). Adanya hibrid PKS-NRPS ini sangat menarik
karena akan menambah variasi kombinasi modul biosintesis dalam menghasilkan

9
berbagai senyawa bioaktif karena jumlah dan jenis modul pada PKS maupun
NRPS menentukan variasi struktur peptida dan poliketida yang dihasilkannya.
Analisis Bioinformatika
Analisis BLAST terhadap sekuen parsial gen penyandi domain KS dan
domain A memiliki persentase homologi yang berbeda seperti ditunjukkan pada
Tabel 3 dan Tabel 4. Beberapa sekuen memiliki tingkat homologi yang tinggi
dengan sekuen referensi di basis data NCBI seperti kemiripan sekuens domain KS
isolat SAB E-38 dan SAB E-35 berturut-turut 100% dan 97% pada sekuen yang
sama dengan enzim peptida sintetase Bacillus subtilis. Tingkat homologi pada
sekuen domain A SAB E-35 juga memiliki kemiripan yang tinggi dengan sekuen
hibrid NRPS/PKS dari Bacillus subtilis subsp.subtilis str BSP1 sebesar 99%
sedangkan kemiripan sekuen SAB E-38 sebesar 84% dengan enzim beta-keto asil
sintase dari Paenibacillus mucilaginosus. Sekuen gen penyandi domain A dan KS
dari isolat SAB E-40 memiliki kemiripan yang rendah yaitu berturut-turut 54%
dan 47%. Tingkat kemiripan yang rendah tersebut menunjukkan kemungkinan
besar senyawa bioaktif yang diproduksi adalah baru.
Tabel 3 Persentase homologi sekuen gen penyandi domain A
Isolat
Bakteri
SAB E-35
SAB E-38

SAB E-40
a

Kemiripan
Peptide synthetase
[Bacillus subtilis]
Peptide synthetase
[Bacillus subtilis]
Nonribosomal
peptide synthetase
adenilation domain
[Nostoc punctiforme
PCC 73102]

Id/Sima (%)

E-value

Score

No. Akses

97/97

6e-170

456

WP017696132.1

100/100

0.0

649

WP017696132.1

58/77

1e-116

352

AAW55330.1

Id : Identity; Sim : Similarity

Tabel 4 Persentase homologi sekuen gen penyandi domain KS
Isolat
Bakteri
SAB E-35

SAB E-38

SAB E-40
a

Kemiripan
Hybrid NRPS/PKS
[Bacillus subtilis
subsp.subtilis str
BSP1]
Beta-ketoacyl
synthase
[Paenibacillus
mucilaginosus]
Polyketida synthase
[Bacillus
amyloliquefaciens]

Id : Identity; Sim : Similarity

Id/Sima (%)

E-value

Score

No. Akses

99/98

2e-146

457

YP007209580.1

84/92

1e-118

380

YP004643575.1

47/54

5e-24

76.6

WP003154089.1

10
Genus Bacillus banyak merupakan penghasil senyawa metabolit
antimikrob dan sitotoksik. Awalnya genus ini sering ditemukan di darat namun
juga dilaporkan diisolasi dari bentos laut dan karang lunak (Kapley et al. 2007)
dan spons laut (Hentschel et al. 2001). Paenibacillus adalah genus yang
dipisahkan dari Bacillus sejak tahun 1997 yang juga banyak mendiami relung
ekologi (Saha et al. 2005), menghasilkan antibiotik (Li et al. 2007), hampir
setengah genus ini mempunyai kemampuan antibakteri dan antifungi yang
berspektrum luas (Lorentz et al. 2006). Antibiotik yang dihasilkan oleh genus
Paenibacillus disusun oleh peptida pendek serta ditemukan gen penyandi PKS
dan NRPS (Wu et al. 2011). Beberapa genus sianobakteri atau alga hijau biru juga
dilaporkan penghasil senyawa bioaktif antara lain Microcystis, Anabaena, Nostoc,
dan Oscillatoria (Namikoshi dan Rinehart 1996). Salah satu senyawa bioaktif asal
alga hijau biru yang telah banyak dipelajari adalah hepatotoksin seperti,
mikrosistin. Mikrosistin merupakan toksin yang disusun heptapeptida siklik yang
tidak disintesis di ribosom melainkan oleh enzim peptida sintetase tersendiri atau
NRPS (Neilan et al. 1999).
Bacillus subtilis BSn5
65 Bacillus subtilis
37

Bacillus subtilis str. 168
Bacillus subtilis QB928

54

Bacillus sp. EGD-AK10
17
61
55
100

SAB E 35
SAB E 38
Bacillus subtilis1
Bacillus vallismortis
Bacillus subtilis str.W23
Streptomyces sp. ATCC 700974
SAB E 40
Cyanothece sp. PCC 7424

100

Nostoc punctiforme PCC 73102

82
90

Anabaena variabilis ATCC 29413

0.1

Gambar 3 Pohon filogenetik berdasarkan sekuen asam amino domain A (adenilation)
yang dikonstruksi dengan metode Neighbor-Joining. (Keterangan: Angka
0,1 pada bagian atas pohon menunjukkan skala jarak kekerabatan (distance
scale) antar profil isolat bakteri. Angka pada nodus adalah nilai bootstrap
dengan 1000 ulangan).

Hasil konstruksi pohon filogenetik domain KS dan A dapat menunjukkan
kekerabatan antar isolat SAB E-35, SAB E-38 dan SAB E-40 dengan beberapa
sekuen referensi terdekat hasil analisis BLAST (Gambar 3). Sekuen domain A
SAB E-35 dan SAB E-38 berkerabat dekat sekuen domain A dan KS dari Bacillus
subtilis dan terdapat dalam satu clade yang sama. Sementara itu, SAB E-40

11
berada di clade yang lain dengan kelompok alga hijau biru. Pada pohon
filogenetik domain KS, SAB E-38 berkerabat dengan Paenibacillus mucilagenous
dan bakteri laut yang tidak dapat dikulturkan. Sekuens domain KS SAB E-35
berkerabat dengan beberapa sekuen Bacillus subtilis sedangkan domain KS SAB40 terpisah (Gambar 4).
Sekuen domain A dari NRPS SAB E-35 dan SAB E-38 memiliki
homologi yang tinggi dengan sekuen peptida sintetase dan juga surfaktin sintetase
dari Bacillus subtilis. Peptida sintetase (peptide synthetase) merupakan protein
multifungsional nonribosom yang mensintesis peptida dengan berat molekul yang
kecil dan berasal dari mikroba. Antibiotik dari genus Bacillus banyak terdiri atas
polipeptida yang disintesis oleh enzim peptida sintetase nonribosom atau NRPS
salah satunya surfaktin (Edward dan Arnold 1977 ; Nakano et al. 1988). Surfaktin
merupakan antibiotik lipopeptida yang dihasilkan oleh Bacillus subtilis. Surfaktin
juga merupakan biosurfaktan yang dapat menurunkan tegangan permukaan air
dari 72 ke 27 mN/m dan berpotensi untuk diaplikasikan dalam industri seperti
industri makanan, farmasi, kosmetik dan bioremediasi limbah oli (Desai dan
Banat 1997).
Bacillus subtilis subsp. subtilis 6051-HGW
62 polyk etide synthase L Bacillus subtilis
62

Bacillus subtilis PY79
Bacillus subtilis

100

SAB E 35
Bacillus subtilis subsp. subtilis str. BSP1

81

Bacillus amyloliquefaciens IT-45
46 Bacillus amyloliquefaciens
87

Bacillus amyloliquefaciens CAU B946

50 Bacillus amyloliquefaciens Y2
65 Bacillus amyloliquefaciens YAU B9601-Y2

SAB E 40
Streptomyces maritimus
96
69

SAB E 38
Paenibacillus mucilaginosusK02
uncultured marine cyanobacterium

100
85

Leptolyngbya mycoidea LEGE 06118
100 Oscillatoria sp. CCAP 1459/26

0.2

Gambar 4 Pohon filogenetik berdasarkan sekuen asam amino domain KS (ketosintase)
yang dikonstruksi dengan metode Neighbor-Joining. (Keterangan: Angka
0,2 pada bagian atas pohon menunjukkan skala jarak kekerabatan (distance
scale) antar profil isolat bakteri Angka pada nodus adalah nilai bootstrap
dengan 1000 ulangan).

12
Sekuen domain A SAB E-40 dan sekuen domain KS SAB E-38 berada
dalam satu clade dengan sekuen dari sioanobakteri. Sianobakteri juga merupakan
kelompok yang banyak diteliti sebagai penghasil senyawa bioaktif seperti
antikanker, antibakteri, antifungi serta inhibitor protease (Moore 1996). Banyak
senyawa bioaktif yang dihasilkan termasuk ke dalam golongan peptida atau
makrolid dan alkaloid dan sintesis oleh PKS dan atau NRPS (Kehr et al. 2011).
Penelitian keragaman gen penghasil senyawa bioaktif terutama PKS dan NRPS
juga telah banyak dilakukan. Banyak ditemukan kasus hibrid PKS-NRPS dalam
sintesis senyawa bioaktif seperti, Nostopicin dari genus Nostoc dan barbamide
dari genus Lyngbya (Fewer et al. 2011; Chang et al. 2002).

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Ekstrak etil asetat isolat SAB E-8, SAB E-35, SAB E-38, SAB E-40, dan
SAB S-43 bersifat toksik berdasarkan nilai LC50 yang berkisar antara 117.1
µg/mL sampai 620 µg/mL. Fraksi 38-E dari isolat SAB E-38 menunjukkan
peningkatan nilai toksisitas dari ekstrak etil asetatnya yaitu dari 138.6 µg/mL
menjadi 116.7 µg/mL. Isolat-isolat SAB E-35, SAB E-38, dan SAB E-40
diketahui memiliki gen penyandi domain A untuk enzim NRPS dan gen penyandi
domain KS untuk enzim PKS. Berdasarkan analisis bioinformatika untuk gen
penyandi domain A dan KS, SAB E-35 dan SAB E-38 memiliki homologi yang
cukup tinggi dengan sekuen referensi yaitu antara 84% sampai 100% sementara
SAB E 40 memiliki homologi yang rendah yaitu 54% dan 47% dan sberpotensi
sebagai penghasil senyawa bioaktif baru.
Saran
Nilai LC50 pada uji BSLT dipengaruhi oleh ketepatan pembuatan
konsentrasi larutan uji dan umur larva A.salina yang digunakan. Oleh karena itu,
perlu dilakukan pembuatan larutan uji yang tepat dan digunakan larva A.salina
yang berumur 36-48 jam.

DAFTAR PUSTAKA
Abubakar H, Wahyudi AT, Yuhana M. 2011. Skrining bakteri yang berasosiasi
dengan spons Jaspis sp. sebagai penghasil senyawa antimikroba. Ilmu
kelautan. 16:35-40.
Anderson JE, Goetz CM, McLaughlin JL, Suffness M. 1991. A blind comparison
of simple bench-top bioassay and human tumour cell cytotoxicities as
antitumor prescreens. Phytochem Anal. 2:107-111.
Aparicio JF, Molnár I, Schwecke T, König A, Haydock SF, Khaw LE, Staunton
J, Leadlay PF. 1996. Organization of the biosynthetic gene cluster for

13
rapamycin in Streptomyces hygroscopicus: analysis of the enzymatic
domains in the modular polyketide synthase. Gene. 169:9-16.
Astuti P, Alam G, Wahyuono S. 2003. Bioactivity screening of sponges collected
from Bunaken, Manado by brine shrimp lethality test agains Artemia
salina Leach. Majalah Farmasi Indonesia. 14:238-243.
Berdy J. 2005. Bioactive microbial metabolites. J Antibiot. 58:1-26.
Cane DE, Walsh CT, Khosla C. 1998. Harnessing the biosynthetic code:
combinations, permutations, and mutations. Science. 282:63-68.
Cane DE, Walsh CT. 1999. This parallel and convergent universes of poliketide
synthetase and nonribosomal peptide synthetase. Chem Biol. 6:319-325.
Carballo JL, Hernandez-Inda ZL, Perez P, Gravalos MD. 2002. A comparison
between two brine shrimp assay to detect in vitro cytotoxicity in marine
natural product (methodology article). BMC Biotechnol. 2:1-5.
Chang Z, Flatt P, Gerwick WH, Nguyen VA, Willis CL, Sherman DH. 2002. The
barbamide biosynthetic gene cluster : a novel marine cyanobacterial
system of mixed polyketide synthase (PKS)-nonribosomal peptide
synthetase (NRPS) origin involving an unusual trichloroleucyl strater
unit. Gene. 296:235-247.
Desai JD, Banat IM. 1997. Microbial production of surfactants and their
commercial potential. Microbiol Mol Biol. 61:47-64.
Ebada SS, Wray V, Voogd NJ, Deng Z, Lin W, Proksch P. 2009. Two new
jaspamide derivatives from the marine sponge Jaspis splendes. Mar
Drugs.7:435-444.
Edward K, Arnold LD. 1977. The peptide antibiotics of Bacillus : chemistry,
biogenesis and possible functions. Bacteriol Rev. 41(2):449-474.
Fajarningsih ND, Januar HI, Nursid M, Wikanta T. 2006. Potensi antitumor
ekstrak spons Crella papilata asal taman nasional laut Kepulauan
Seribu. J Pascapanen dan Bioteknologi Kelaiutan dan Perikanan. 1(1):
35-42.
Fewer DP, Osterholm J, Rouhiainen L, Jokela J, Wahlsten M, Sivonen K. 2011.
Nostophycin biosynthesis is directed by a hybrid PKS-NRPS in the
toxic cuanobacterium Nostoc sp. 152. J Appl Environ Microbiol.
77(22):8034-8040.
Finney DJ, Stevens WL. 1948. A table for the calculation of working probits and
weights in probit analysis. Biometrika. 35:191-201.
Gehring AM, Mori I, Perry RD, Walsh CT. 1998. The nonribosomal peptide
synthetase HMWP2 forms a thiazoline ring during biogenesis of
yersiniabactin, an iron-chelating virulence factor of Yersinia pestis.
Biochemistry. 37:11637-11650.
Gritter RJ, Bobbit JM, Schwarting AE. 1991. Pengantar Kromatografi.
Padmawinata K, penerjemah. Bandung (ID): Penerbit ITB.
Hamburger M, Hostettmann. 1991. Bioactivity in plant: the link between
phytochemistry and medicine. Phytochemistry. 12:3864-3874.
Hentschel U, Schimid M, Wagner M, Fieseler L, Gernert C, Hacker J. 2001.
Marine sponges as microbial fermenters. FEMS Microbiol Ecol.
55:167–177.

14
Hentschel U, Hopke J, Horn M, Friedrich AB, Wagner M, Hacker J, Moore BS.
2002. Molecular evidence for a uniform microbial community in
sponges from different oceans. Appl Environ Microbiol. 68:4431-4440.
Kapley A, Siddiqui S, Misra K, Ahmad SM, Purohitp HJ. 2007. Preliminary
analysis of bacterial diversity associated with the porites coral from the
Arabian sea. World J Microbiol Biotechnol. 23:923-930.
Kehr JC, Picchi DG, Dittmann E. 2011. Natural product biosynthesis in
cyanobacteria : a treasure trove of unique enzymes. Beilstein J Org
Chem. 7:1622-1635.
Krisyunda MP. 2012. Uji toksisitas fraksi spons Callyspongia sp. dengan metode
brine shrimp test (BST) dari Pasir Putih Situbondo [skripsi]. Surabaya
(ID): Institut Teknologi Sepuluh Nopember.
Lee YK, Lee J, Lee HK. 2001. Microbial symbiosis in marine sponges. J
Microbiol. 39:254-264.
Li J, Beatty PK, Shah S, Jensen SE. 2007. Use of PCR-targeted metagenesis to
distrupt production of fusaricidin-type antifungal antibiotics in
Paenibacillus polymyxa. App Environ Microbiol. 73: 3480-3489.
Lorentz RH, Artico S, Silveira AB, Einsfeld A, Carcao G. 2006. Evaluation of
antimicrobial activity in Paenibacillus spp. starins isolated from natural
environmental. Lett Appl Microbiol. 43:541-547.
MacMillan SM. 1999. Starting A Succesful Commercial Sponge Aquaculture
Farm. Hawaii (US): CTSA Publication.
Meyer N, Ferrigni NR, Putnam JE. 1982. Brine shrimp: a convenient general
bioassay for active plant constituents. Planta Med. 45:31-32.
Moffitt MC, Neilan BA. 2003. Evolutionary affiliations within the superfamily of
ketosynthases reflect complex pathway associations. J. Mol.
Evol. 56:446-457.
Moore RE. 1996. Cyclic peptides and depsipeptides from cyanobateria : a review.
J Ind Microbiol. 16:782-792.
Müller WEG, Grebenjuk VA, Thakur NL, Thakur AN, Batel R. 2004. Oxygencontrolled bacterial growth in the sponge Suberites domuncula: toward
a molecular understanding of the symbiotic relationships between
sponge and bacteria. Appl Environ Microbiol. 70:2332-2341.
Nakano MM, Marahiel MA, Zuber P. 1988. Identification of genetic locus
required for biosynthesis of the lipopeptide antibiotic surfactin in
Bacillus subtilis. J Bacteriol. 170(12):56-62.
Namikoshi M, Rinehart KL. 1996. Bioactive compound produced by
cyanobacteria. J Industrial Microbiol. 17:373-384.
Neilan BA, Dittmann E, Rouhiainen L, Bass RA, Schaub V, Sivonen K, Borner T.
1999. Nonribosomal peptide synthesis and toxigenicity of
cyanobacteria. J Bacteriol. 181(13):4089.
Piel J, Hui D, Wen G, Butzke D, Platzer M, Fusetani N, Matsunaga S. 2004.
Antitumor polyketide biosynthesis by uncultivated bacterial simbiont of
the marine sponge Thonella swinhoei. Proc Natl Acad Sci. 101:1622216227.
Proksch P, Edrada RA, Ebel R. 2002. Drugs from the sea : current status and
microbial implications. Appl Microbiol Biotechnol. 59:125-134.

15
Putra I. 2012. Ekstraksi dan bioaktivitas senyawa antimikrob dari bakteri yang
berasosiasi dengan spons Jaspis sp. [skripsi]. Bogor (ID): Institut
Pertanian Bogor.
Saha P, Modal AK, Mayilraj S. Krishnamurthi S, Bhattacharya A, Chakrabarti T.
2005. Paenibacillus assamensis sp. nov. A novel bacterium isolated
from a warm spring in Assam India. Int J Syst Evol Microbiol. 55:25772581.
Sambrook W, Russel DW. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Ed
ke-3. New York (US): Gold Spring Harbor Laboratory.
Sargeloos P, Van Der Wielen CR, Persoone G. 1978. The use Artemia nauplii for
toxicity test - a critical analysis. Ecotoxicol and Environ Safety. 2:249255.
Schirmer A, Gadkari R, Reeves CD, Ibrahim F, DeLong EF, Hutchinson CR.
2005. Metagenomic analysis reveals diverse polyketide synthase gene
cluster in microorganisme associated with the marine sponge
Discodermia dissoluta. Appl Environ Microbiol. 71:4840-4849.
Shen B, L. Du, C. Sanchez, D.J. Edwards, M. Chen, and J.M. Murrell. 2001. The
biosynthetic gene cluster for the anticancer drug bleomycin from
Streptomyces verticillus ATCC15003 as a model for hybrid peptide–
polyketide natural product biosynthesis. J Industrial Microbiology and
Biotechnology. 27:378-385.
Simmons TL, Andrianasolo E, McPhail K. 2005. Marine natural products as
anticancer drugs. Mol Cancer Ther. 4:333-342.
Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S. 2011. MEGA5 :
Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood,
Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Mol Biol
and Evol. 28:2731-2739.
Tang S, Xu R, Lin W, Duan H. 2012. Jaspiferin A and B: two new secondary
metabolites from the south China sea sponge Jaspis stellifera. Rec Nat
Prod. 6:398-401.
Taylor MW, Radax R, Steger D, Wagner M. 2007. Sponge-associated
microorganisms: evolution, ecology. Microbiol Mol Biol Rev. 71:295347.
Wang G. 2006. Diversity and biotechnological potential of the spons-associated
microbial consortia. J Ind Microbiol Biotechnol. 33:545-551.
Wu X, Qian C, Fang H, Wen Y, Zhou J, Zhan Z, Ding R, Li O, Gao H. 2011.
Paenimacrolidin, a novel macrolide antiviotic from Paenibacillus sp.
F6-B70 active against methicillin-resistant Staphyloccus aureus. J
Microbial Biotechnol. 4(4):491-502.
Zhang L, An R, Wang J, Sun N, Zhang S, Hu J, Kuai J. 2005. Exploring novel
bioactive compounds from marine microbes. Current Opinion in
Microbiol. 8:276-281.
Zhang W, Li Z, Miao X, Zhang F. 2009. The screening of antimicrobial bacteria
with diverse novel nonribosomal peptide synthetase (NRPS) genes from
South China Sea sponges. J Mar Biotechnol. 11:346-355.
Zheng L, H Chen, X Han, X Yan. 2005. Antimicrobial screening and
activecompound isolation from marine bacterium NJ6-3-1 associated

16
with the sponge Hymeniacidon perleve. World J Microbiol Biotechnol.
21:201-206.
Zheng L, Yan X, Han X, Chen H, Lin W, Lee FS, Wang X. 2006. Identification of
norharman as the cytotoxic compound produced by the sponge
(Hymeniacidon perleve)-associated marine bacterium Pseudomonas
piscida and its apoptotic effect on cancer cells. Biotechnol Appl
Biochem. 44:135-142.
Zhu, Peng, Zheng Y, You Y, Yan X, Shao J. 2009. Molecular phylogeny and
modular structure of hybrid NRPS/PKS gene fragment of
Pseudoalteromonas sp. NJ6-3-2 isolated from marine sponge
Hymeniciadon perleve. J Microbiol Biotechnol. 19(3):229-237.

17
Lampiran 1 Perhitungan LC50 isolat SAB E-40

Konsentrasi
(µg/mL)

Log
Ulangan
Konsentrasi

Larva
A.salina

1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3

20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20

0

-

10

1

100

2

250

2.39

500

2.69

750

2.87

Larva
mati

%
Mortalitas

0
0
0
0
0
0
8
7
5
15
18
10
18
13
15
18
16
15

0
0
0
0
0
0
40
35
30
80
90
50
90
65
75
90
80
75

Probit

Ratarata
Probit

0

0

35

4.61

73.3

5.61

76.7

5.71

81.67

5.88

7

Mortalitas Probit

6
5
y = 3.2203x - 2,6905
R² = 0.9231

4
3
2
1
0
0

0,5

Perhitungan LC50 :
y = 3.2203x-2,6905
5= 3.2203x-2,6905
x = 2.3881  10x = 244,4
LC50 = 244.4 µg/mL

1

1,5
2
Log 10 Konsentrasi

2,5

3

3,5

18
Lampiran 2 Komposisi medium sea water complete (SWC) 1000 mL
Pepton
Yeast Extract
Gliserol
Bacto Agar
Air laut
Aquades

5 gram
1 gram
3 mL
15 gram (untuk media padat)
750 mL
250 mL

Lampiran 3 Sekuen parsial domain KS dan A
>SAB_35_PKS
ACCCGGCCCAACACCACTCGCGGTGCTGCTGGACGATTGAGGATGCGG
GCTATACGCCAAAGACGTTGGCGAAGCCTAAAGGACGAAATAAAAGG
CAGCATGTAGGAGTTTTTGCCGGTGTCATGCACAAGGATTATACATTA
GTCGGAGCTGAAGAAGCATCAGCAGAAAACGTGTTTCCTCTCTCGCTC
AACTATGCGCAAATCGCCAACCGTGTTTCTTACTTTTGTAATTTCCACG
GTCCGAGTATGGCTGTCGATACGGTATGTTCATCCTCTTTGACCGCAGT
GCACTTGGCGTTGGAAAGCATACGTCACGGTGAGTGCGATGTTGCGTT
AGCAGGCGGAGTGAACCTGTCTTTGCACCCGAATAAATATATGACATA
CGGGGTCTGGGATATGTTTTCCACTGACGGGCACTGCCGTACGTTTGG
AAAGGATGGGGACGGTTATGTGCCTGCCGAGGGTATAGGCGCGGTTTT
ATTAAAGCCTTTGCGCCAGGCGGAGAAAGACGGAGATCGCATTTATGC
AGTTATTAAAGGAAGTGCTGTGAATCATGTGGGCACTGTAAGCGGCAT
TTCAGTGCCGAGCCCTGTTTCTCAAGCTGATCTGATTGAGACATGCTTG
GAGAAAACGGGAATCGACCCGCGGACGAACAGTTATGTCGAAGCCCA
CGGCACAGGCACAGAAA
>SAB_35_NRPS
ACCCTCCCAATTTCGATTGTTCATCTGGAGCCAGCGCGCCACGTCCCCG
GTCCGGTACATGCGATCGCCCGGCACGAATGGATCTTGTAAAAACTTC
TCTTCCGTTAATTCAGGCAAATGCAAATAGCCTCGGGCCACACCGTCT
CCCGCGATATAAAGCTCACCCGCCACGCCTTCAGGCTGCAGCCGGCCT
TTTTGATCCAAAATATATAAGCGGTTATTCCCCAGCGCTTTCCCGATCG
GCACATACGCGTGATTGAACTGCATTCTCAGGGATAACCGGATGAACA
GACGCGTCAACGCACGTTTCAGTCGGCCCGTACACATTAGTCAAACGC
GGCGCTGTGCCGGCTTCTTTAAACAGCTTCAGCAGCTTGTCCGCAACA
ACAGATGACAGGCCTTCTCCTCCGATCAGCATGTGCTTCAGTTTTAGGC
CTTCAAAATCGCCCGCTGCTGCCAGCATTTGCAAATGAGCCGGTGTTC
CATCCGTCGCCTCAATGCTGTTTCTCCGATAATATGTAGCAAGGGCGG
TCCCGTTCGTCACTGTTTTCTTCGGTACGATATAAAGGGTTTGTCCCAA
AAGAAGCGACGCGAAGATCTGCTTCACTGACGCATCAAAGTGGAACG

19
GCGCAAGCAATGCCATCCGCAGGGTTTGGCTGCCGCTTTGGTAAATCG
TCTGCTGCAGAGATTCAACCAAATGATGAACCTGGCGATGCTCGATCA
TAACGCCTTTCGGACGTCCGGTTGTTCCCGATGTGTAAATAATGTAGG
CAAGATTCCGCGCGTTTACATCAGCCTCCGTCATATCGTCTGCACCTTC
CGCAATTGCCTGATCTAAGTCAATCAGCTCAGCATCGGCTTCAGGCGC
TGCAACCTTCGATTCAGTCAGGATGAAGTCCGCCCCGCAGTCCTCCAA
AATATATTGAATCCGCTCTGCAGGAAAAACCCGGATCAATCGGGACGT
AAGCCCCCGCCGCCAAA
>SAB_38_PKS
TGGGAAGTGTTAGAGACTGCTGGGTATGATCCAGAAAAATATCTTGGG
CGTATCGGTGTATACGCTGGTGTATTTTCTAGTACGTATCTGTTTAATT
TATACAGCAATCCAAGTCTTTATCATTCAGTAGGAGAACTAAATATTC
GCCATGGGAATGAAAAGGATTATTTGGCTACTCGGGTATCATATAAAT
TAAATCTTAAAGGACCAAGCGTGAGTGTACAGACTTCTTGCTCTACGT
CTCTTGTTGCTGTTCACTTTGCAGTCCAGAACTTATTAAGTGGTGAATG
TGACATGGCAATCGCTGGTGGGGTGTCAATTATCACACCTCAAAAGAC
GGGATACATGTATCAAGAAGGTGGCGTTCTATCACCAGATGGACATTG
TCGTCCTTTCGATGCGAAAGCAAAGGGTACAATTTTTGGTAACGGAGT
AGGGGCTGTTGTACTTAAGCGACTAGAAGATGCTCGCAAAGATGGTGA
CACTATCTTTGCTGTTATTAAAGGAAGCGCAGTTAATAACGATGGTGC
AGACAAAGTTGGATTCACTGCACCGAGTGTCAATGGTCAAGCTGAAGT
AATCGCTGATGCGATGGCTATGGCGGAAGTCGATCCATTCACGGTAG
>SAB_38_NRPS
CTGGGATCGCCTCCGTTATTCGATTGTTCATCTGGAGCCAGCGCACCAC
GTCTCCGGTCCGGTACATGCGATCGCCCGGCACGAATGGATCTTGTAA
AAACTTCTCTTCCGTTAATTCAGGCAAATGTAAATAGCCTCGGCCCAC
ACCGTCTCCCGCGATATAAAGCTCGCCCGCCACGCCTTCAGGCTGCAG
CCGGCCTTTTTGATCCAAAATATATAAGCGGTTATTCCCCAGCGCTTTC
CCGATCGGCACATACGCTGATTGAACTGCATTCTCAGGGATAACCGGA
TGAACAGACGCGTCAACGCATGTTTCAGTCGGCCCGTACACATTGGTC
AACCGCGGCGCTGTGCCGGCTTCTTTAAACAGCTTGAGCAGCTTGTCC
GCAACAACAGATGACAGGCCTTCTCCTCCGATCAGCATGTGCTTCAGT
TTTAGGCCTTCAAAATCGCCCGCTGCTACCAGCATTTGCAAATGAGCC
GGTGTTCCATCCGTCGCCTCAATGCTGTTTCTCCGATAATATGCAGCAA
GGGCGGCCCCGTTCGTCACAGTTTTCTTCGGTACGATATAAAGGGTTT
GTCCCAAAAGAAGCGACGCGAAGATCTGCTTCACTGACGCATCGAAGT
GGAACGGCGCAAGCAATGCCATCCGCAGGGTTTGGCTGCCGCTTTGAT
AAATCGTCTGCTGCAGAGATTCAACCAAATGATGAACCTGGCGATGCT
CGATCATAACTCCTTTCGGGCGTCCGGTTGTTCCCGATGTATAAATAAT

20
GTAGGCAAGGTTCCGTGCGTTCACATCTGCATTCAGGCTTTCTTCTGCA
CCTTCTGCAATTGCCTGATCTAAGTCAATCAGCTCAGCATCGGCTTCAG
GTGCCGCAACCTTCGATTCAGTCAGGATGAAGTCCGCCCCGCAGTCCT
CCAAAATATATTGAATGCGCTCAGCAGGAAAACCCGGATCAATCGGG
ACATACGCCCCCACCCGCAAAA
>SAB_40_PKS
CAATTNNGNCTTCGGAATAAGCCTGAGTATCTAGACTGCCTTATGACT
TCTGCTTGTGCAGCGGATTCGGGAGGTAATTCCGCTGCTTTCCCGACGT
GATCATGCGCTTCCTTTATGACGGCGTAAATGCGGCTCCGTCTTGACG
GCGTCTCTCAGACGTTTGACCCCGACGGCCCGACCACTTTCCCCGGAA
ACAAACCGTCCCCCGTTTGATCCAACTGAGGGGATCCGGCGGTCGGTG
ACATGCTTTCCTACTTTTCTGACGATGGAAAAAAATCCGGGGTGGATT
GACTGATTCCCCCCTCCGGCAAGGGCATTTTCAATTTCTTCGTCCCGAA
TGCCTTAAATGGCCAAAGAATGGGTGGCAAAGGACTGGAAACTGCTG
GTATCAACCGGAATGCTCGGCCCTTGAAATTCACAATAATAGGGACAC
TCTGTTGGGAATGAGCGAATAATTATTGCCCACCGCAAATGGACCTGC
TTTCTGTTGTTGTTCAATGGCCTGTAAAGAATCGTCGTTATACATGACA
CCTGCGCATAAGTCGATGGGATGTAGTTACTCTCCTTTATATCCCGCAT
CTTCAAGCGCTTTCCATGATTCTTCCATCAACACCCAGTGTGGCTCATT
CCATCACACGCCTGCTAAGATTCCATCGCA
>SAB_40_NRPS
ATGTCATGTATACGTCAGGCTCAACGGGACTGCCTAAAGGAGTAAGTA
TTGTTAACCGCGGTGTGATTCGGCTGGTGAAGGAGACTGATTATGCGG
TATTTGATGAGAATCAAACGTTTCTGCAATTAGCTTCTGCCGCTTTTGA
CGCTTCTACCTTCGAGATCTGG