Analisis Senyawa Bioaktif Antimikrob Berspektrum Luas dari Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons Haliclona sp.
! "# "
$ "
%"&
"' ! ()* %) %(')+! ,+ $ ) %" ! *, ' & "# %) *
$%"# " *"
$ %( ') ( !%"##+" ( " %, )+' %' , %' ' %%" ! *, ' '%) % +' $ ,
- .
- /.
- 0.
- .
- . $ "
- 1
( ') ( ( ) ('%) '%) % +' (%!+$ "
$ +2 (' 3 ' "& '%) $
% %)
! ()*
'*#%" $ " "*" '*#%"
,"& % # " %( ') (
( ) *, ' ('%) ! ) " '%) % +' !%! , ( (' 3 '
! ' " '%) $
.
4.
.
.
. $ "
*" %"')
! ' " ! " !+! 5 46 $ )
+ %)" ' " ('%) ! ) " '%) % +' %)( ) "' )
.78 "##
8
, ()*! '*#) 9 ,
'
$
" ) : 1;7 "! !%"+"2+(( "
! "#-! "# *, ' ('%) ! ) " !%! , (
9) ( & "# (' 9 !%"# ! '
!%, ,+ +2
* +'*#) 9
+ $ ) %" ! *, '
!%!
#%"
5
6 $ " , ! $ ) %" ! *, ' !%!
#%"
5
6
' (+"< = ('%) & "# %) *
$%"# " *" . %"&
* (' 9. (' 3 '
"' ! ()*
4
44
"$%) $ )% ') >>>>>>>>>>>>>>>>>>
)
7
!
=
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
=
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
'
'
%
%
+
)
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
:(+3; >>>>>>>>>>>>>>>
(
0
>>>>>>>>>>
0
1
! >>>>>>>>>>>>>>>
0
0
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
=
!
<
*
:
;>>>>>
7
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
7
)
1 : 1 ;
)
: / ;
3/ >>
%
%
%
%
%
%
%
?
?
?
)
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
>>>>>>>>>>>>>>>>
1
!>>>>>>>>>>>>>>>>
0
1
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
!
<
*
>>>>>>>>>>>>>>>
)
1 : 1 ;
)
: / ;
3/>>
?
?
?
2
8
9
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
6
"
(
0
*
0
1
=
7
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
6
6
iii
<
'
!
!
%
?
,
=
2
!
!
*
!
,
=
>>>>>>>
8
@
<
'
%
?
=
1
<
!
!
!
=
3/
1
/
8
@
9
iv
Spons merupakan
nenek moyang
metazoa lebih dari 580 juta tahun lalu.
Habitatnya terdapat pada lingkungan tropis
dan subtropis tetapi juga ditemukan pada
tempat yang lebih tinggi dan pada danau air
tawar dan aliran sungai. Sampai saat ini
telah ditemukan 15.000 spesies spons,
namun keragamannya mungkin jauh lebih
besar. Spons sebagai organisme
mampu mengolah ribuan liter air laut per
hari. Pada permukaan tubuhnya terdapat
lubang kecil sebagai tempat masuknya air,
partikel organik dan sirkulasi kanal
tubuhnya. Spons menjadi inang dari
berbagai jenis komunitas mikroba secara
umum yang dapat mencapai 50!60% dari
tubuhnya (Wang 2006). Peran dari mikroba
tersebut bervariasi, mulai dari sumber
makanan hingga melakukan simbiosis
mutualisme dengan spons itu sendiri
(Kennedy
2009). Spons berperan
sebagai substrat bagi mikroba, menyediakan
akses ke matahari bagi mikroba yang
berfotosintesis, dan sebagai pensuplai
nutrisi. Keuntungan bagi spons dari
simbiosis ini antara lain meningkatkan
kepadatan spons, menghancurkan zat yang
tak dapat larut oleh kolagen spons, dan
penggunaan metabolit sekunder yang
dihasilkan oleh mikrob tersebut sebagai
mekanisme pertahanan terhadap kompetitor
dan predator (Taylor
2007).
Para peneliti menemukan bahwa spons
menghasilkan metabolit sekunder sebagai
mekanisme perlindungan diri. Penelitian lain
juga mengungkapkan bahwa metabolit
sekunder ini tidak hanya berperan dalam
metabolisme organisme tersebut tetapi juga
berperan dalam strategi adaptasi organisme
terhadap lingkungannya (Thakur & Müller
2004). Pada species
sp. lebih dari
190 metabolit dengan aktivitas spektrum
luas telah diisolasi (Yu
2006).
Senyawa tersebut diketahui sebagai
, antimikrob, antifungi, antimalaria,
dan sitotoksik (Fiesler
2004). Senyawa
yang diisolasi dari
sp. mencakup
steroid, terpenoid, poliasetilen, alkaloid,
peptida asam lemak tak jenuh, dan
poliketida (Yu
2006). Isolasi dan
identifikasi komponen!komponen senyawa
organik yang berpotensi sebagai senyawa
bioaktif dapat dilakukan dengan beberapa
cara, salah satunya dengan kromatografi
lapis tipis (KLT)
KLT merupakan teknik pemisahan
senyawa berdasarkan distribusi komponen
yang berbeda dari suatu campuran antara
fase gerak dan fase diam (Khopkar 1990).
Hasil pemisahan senyawa tersebut akan
menghasilkan fraksi!fraksi yang terpisah
sepanjang pelat KLT berdasarkan tingkat
kepolarannya. Setiap fraksi menghasilkan
nilai Rf yang merupakan langkah awal untuk
memperkirakan jenis suatu komponen
senyawa organik yang telah terpisah (Smart
2002; Furniss
1984). Untuk melihat
ada tidaknya aktivitas fraksi yang dihasilkan
dari uji KLT maka dilakukan uji lanjut yaitu
uji bioautografi.
Analisis fungsional metagenom telah
menghasilkan banyak senyawa baru
(Gillespie
2002),
baru (PKS) (Courtois
2003; Moffitt
and Neilan 2003), dan fungsi baru seperti
sistem asosiasi membran proteolitik (Beja
2000).
(PKS) dan
non!ribosomal
(NRPS)
merupakan kompleks enzim multifungsional
yang berperan dalam sintesis beragam
struktur senyawa bioaktif secara luas,
kebanyakan merupakan kepentingan medis
(Hutchinson 2003).
Berbagai senyawa antimikrob telah
diisolasi dari bakteri yang berasosiasi
dengan spons. Bakteri yang berasosiasi
dengan spons
sp. dapat
menghasilkan senyawa bioaktif yang
menghambat
non!
patogen,
patogen,
non!patogen, EPEC,
, dan
. Berdasarkan
analisis kekerabatannya keenam isolat yaitu
HAA!02, HAA!07, HAL!08, HAL!20,
HAL!10, HAL!23 menunjukkan homologi
dengan genus
Aktivitas antimikrob
ditunjukkan dengan adanya konsentrasi
hambat minimum (MIC) yaitu konsentrasi
terendah dari senyawa antimikrob yang akan
menghambat pertumbuhan mikroorganismee
setelah diinkubasi selama satu malam
(Andrews 2001). Pada penelitian ini
dilakukan uji MIC, ekstraksi senyawa
antimikrob dengan menggunakan etil asetat,
analisis kandungan dan aktivitas antimikrob
fraksi senyawa ekstrak kasar, serta deteksi
gen penyandi domain KS pada
(PKS) dan domain A pada non!
ribosomal
(NRPS).
1
Penelitian ini bertujuan menganalisis
senyawa bioaktif antimikrob bespektrum
luas dari bakteri yang berasosiasi dengan
spons
sp.
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan
Januari 2011 hingga Juni 2011 di
Laboratorium Mikrobiologi Departemen
Biologi, FMIPA, IPB.
Bahan yang digunakan adalah isolat!
isolat terbaik dari bakteri yang berasosiasi
dengan spons hasil penelitian terdahulu yaitu
HAA!02, HAA!07, HAL!08, HAL!20,
HAL!10, HAL!23 koleksi Pauliasi Tokasaya
(2010).
Mikrob indikator yang digunakan untuk
uji antagonis adalah
(EPEC)
K.1.1,
,
dan
. Media yang digunakan
yaitu SWC (
), NB
(!
), NA (!
" ), PDB
(
#
) dan PDA (
#
" ). Pelarut yang digunakan
untuk ekstraksi adalah etil asetat. Alat!alat
laboratorium yang digunakan adalah pelat
KLT ($% "
60F254 produksi Merck) vorteks, laminar
(Jouan, Perancis), autoklaf,
, mesin
PCR, pipet mikro, cawan, tabung, serta
peralatan umum yang digunakan di
laboratorium.
!"
Isolat bakteri marin dikulturkan dalam
medium SWC lalu diinkubasi selama tiga
hari di suhu ruang. Mikrob target
diremajakan kembali dalam media NB untuk
EPEC,
dan
atau dalam media PDB untuk
dan
Mikrob target
tersebut diinkubasi selama 24 jam pada suhu
ruang kemudian diinkubasi kemudian
disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm
selama 30 menit. Filtrat dari hasil
sentrifugasi dimasukkan ke dalam 5 tabung
reaksi dengan konsentrasi yang berbeda!
beda masing!masing 6.25%, 12.5%, 25%,
50%, dan 100%. Selain kelima konsentrasi
tersebut, dibuat juga kontrol yang tidak
diberi filtrat bakteri. Setelah itu, masing!
masing tabung diisi dengan 1 ml bakteri
target. Biakan uji MIC tersebut lalu
diinkubasi selama 24 jam. Kemudian
diamati kekeruhan masing!masing biakan di
dalam tabung reaksi. MIC ditentukan
berdasarkan kekeruhan biakan dibandingkan
dengan kontrol.
#
#
$
% &
'
#
Isolat bakteri marin dikulturkan ke
dalam 500 ml media SWC cair. Kultur
diinkubasi pada mesin penggoyang (100
rpm, 30 ºC) selama tiga hari. Kemudian ke
dalam kultur ditambahkan 500 ml etil asetat,
diaduk selama 3 jam, dan dievaporasi.
Ekstrak yang dihasilkan disimpan pada suhu
5 ºC untuk pemakaian selanjutnya (Muller
2004).
#
( #
$ % &
)
Mikrob indikator dikultur selama 24
jam. Sebanyak 1% kultur mikrob indikator
dicampurkan ke media NA dan PDA semi
padat lalu dituangkan di cawan. Ekstrak
kasar senyawa antimikrob yang telah
dilarutkan dengan metanol (100 mg/ml)
diteteskan ke kertas cakram masing!masing
sebanyak 100 Dl kemudian diletakkan di
permukaan media agar semipadat tersebut.
Cawan uji diinkubasi selama 24 jam. Hasil
uji positif ditunjukkan dengan terbentuknya
zona bening.
*
# #
#
#
Isolasi dan identifikasi senyawa bioaktif
sampel dilakukan dengan KLT terhadap
senyawa organik dari ekstrak kasar.
Fraksinasi dilakukan pada pelat 25 $%
"
60F254.
Sebanyak 30 Dl ekstrak senyawa antimikrob
diteteskan dengan pipa kapiler pada pelat
yang telah diberi tanda sebagai titik awal.
Kemudian pelat dimasukkan ke dalam kotak
kromatografi yang berisi eluen n!butanol:
etil asetat: akuades (2:3:1) dan n!butanol:
etil asetat (3:7) dan telah dijenuhkan selama
satu jam. Setelah senyawa bergerak sampai
garis batas atas, pelat dikeluarkan dan
dikeringkan. Komponen senyawa organik
yang terpisah akan berbentuk noda!noda di
sepanjang pelat, kemudian dilihat dan
ditandai di bawah sinar UV dengan panjang
gelombang 254 dan 365 nm (Zheng
2005).
Masing!masing
komponen
2
antimikrob kemudian diuji aktivitasnya
(bioautografi) untuk mengetahui komponen
antimikrob yang dapat menghambat bakteri.
##
+ #
) $ % &
# * # #
'"
Bahan yang digunakan adalah pelat
KLT yang mengandung senyawa yang sudah
difraksinasi. Pelat tersebut disterilisasi
menggunakan sinar UV selama 30 menit,
lalu diletakkan di atas agar nutrien pada
cawan petri. Kemudian lapisan tersebut
dilapisi oleh media agar cair yang
mengandung bakteri uji
dengan metode agar tuang, kemudian
diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 24 jam.
Setelah masa inkubasi, zona bening yang
terbentuk diamati, untuk melihat komponen
senyawa organik yang dapat menghambat
pertumbuhan bakteri (Zheng
2005).
#
# ,
Isolat bakteri dikulturkan dalam media
kaldu SWC selama 24 jam. Sebanyak 1.5 ml
kultur disentrifugasi 10000 rpm selama 10
menit. DNA genom bakteri diekstrak dengan
mengikuti metode CTAB (Sambrook &
Russell 2001).
#
($
,
($
,
- $
!Reaksi PCR untuk mengamplifikasi
domain KS dari gen penyandi PKS dan
domain A dari gen penyandi NRPS
dilakukan dengan mengikuti metode
Schirmer
(2005). Reaksi PCR
dilakukan sebanyak 30 siklus dengan
masing!masing tahap yaitu predenaturasi
selama 1 menit dan denaturasi selama 30
detik pada suhu 94 ºC,
50 ºC
selama 30 detik, polimerisasi 75 ºC selama 1
menit 10 detik, dan post PCR dilakukan
pada suhu 72 ºC selama 5 menit. Visualisasi
amplikon PKS dan NRPS dilakukan melalui
elektroforesis. Isolat yang mempunyai gen
penyandi domain keto!sintase (KS) dari PKS
menunjukkan terbentuknya pita pada ukuran
di sekitar 700 pasang basa (
),
sedangkan pada deteksi gen penyandi
domain adenilasi (A) dari NRPS ditunjukkan
dengan munculnya pita pada ukuran sekitar
1000 bp.
$
$
Uji
MIC
menghasilkan
kisaran
hambatan yang berbeda, yaitu antara 12,5%
sampai 100% Isolat HAL!08 memiliki nilai
MIC sebesar 12,5% terhadap
(Tabel 1). Hal ini merupakan indikasi yang
bagus terhadap efek senyawa antimikrob
yang dihasilkan oleh isolat tersebut. HAL!
10 menghambat paling kuat terhadap
. HAL!20 menghambat paling
kuat terhadap
. HAL!23 memiliki
nilai MIC yang tinggi yaitu 12,5% terhadap
. Selain itu isolat ini juga memiliki
aktivitas hambat yang tinggi terhadap
dan
. Isolat HAA!02
memiliki aktivitas hambat terhadap
dan EPEC dengan konsentrasi
sebesar
50%.
Sedangkan
HAA!07
menghambat EPEC dengan konsentrasi
25%. Berdasarkan uji MIC, semua isolat
hanya menghambat pertumbuhan bakteri
atau bakteriostatik.
Semua supernatan dari bakteri marin
tidak memiliki aktivitas terhadap
dan
. Hal ini karena kedua
cendawan tersebut merupakan cendawan
patogen yang memiliki dinding sel yang
tebal sehingga sulit untuk didegradasi.
Selain itu terdapat mekanisme pertahanan
dari sel cendawan patogen tersebut yang
dapat menghambat atau menghilangkan efek
senyawa bioaktif dari supernatan bakteri
marin, seperti produksi enzim, perubahan
permeabilitas dinding sel, dan jalur
metabolik yang menjadi target dari senyawa
bioaktif tersebut (Lay 1994). Uji MIC
bersifat tidak stabil tergantung dari mikrob
uji, ukuran inokulum, komposisi kultur
media, waktu inkubasi, dan kondisi inkubasi
seperti temperatur, pH, dan aerasi (Tokasaya
2010).
#
( #
$ % &
)
Bagian selanjutnya dari penelitian ini
yaitu ekstraksi senyawa bioaktif dari bakteri
dengan menggunakan etil asetat. Proses
ekstraksi menghasi
$ "
%"&
"' ! ()* %) %(')+! ,+ $ ) %" ! *, ' & "# %) *
$%"# " *"
$ %( ') ( !%"##+" ( " %, )+' %' , %' ' %%" ! *, ' '%) % +' $ ,
- .
- /.
- 0.
- .
- . $ "
- 1
( ') ( ( ) ('%) '%) % +' (%!+$ "
$ +2 (' 3 ' "& '%) $
% %)
! ()*
'*#%" $ " "*" '*#%"
,"& % # " %( ') (
( ) *, ' ('%) ! ) " '%) % +' !%! , ( (' 3 '
! ' " '%) $
.
4.
.
.
. $ "
*" %"')
! ' " ! " !+! 5 46 $ )
+ %)" ' " ('%) ! ) " '%) % +' %)( ) "' )
.78 "##
8
, ()*! '*#) 9 ,
'
$
" ) : 1;7 "! !%"+"2+(( "
! "#-! "# *, ' ('%) ! ) " !%! , (
9) ( & "# (' 9 !%"# ! '
!%, ,+ +2
* +'*#) 9
+ $ ) %" ! *, '
!%!
#%"
5
6 $ " , ! $ ) %" ! *, ' !%!
#%"
5
6
' (+"< = ('%) & "# %) *
$%"# " *" . %"&
* (' 9. (' 3 '
"' ! ()*
4
44
"$%) $ )% ') >>>>>>>>>>>>>>>>>>
)
7
!
=
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
=
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
'
'
%
%
+
)
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
:(+3; >>>>>>>>>>>>>>>
(
0
>>>>>>>>>>
0
1
! >>>>>>>>>>>>>>>
0
0
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
=
!
<
*
:
;>>>>>
7
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
7
)
1 : 1 ;
)
: / ;
3/ >>
%
%
%
%
%
%
%
?
?
?
)
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
>>>>>>>>>>>>>>>>
1
!>>>>>>>>>>>>>>>>
0
1
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
!
<
*
>>>>>>>>>>>>>>>
)
1 : 1 ;
)
: / ;
3/>>
?
?
?
2
8
9
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
6
"
(
0
*
0
1
=
7
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
6
6
iii
<
'
!
!
%
?
,
=
2
!
!
*
!
,
=
>>>>>>>
8
@
<
'
%
?
=
1
<
!
!
!
=
3/
1
/
8
@
9
iv
Spons merupakan
nenek moyang
metazoa lebih dari 580 juta tahun lalu.
Habitatnya terdapat pada lingkungan tropis
dan subtropis tetapi juga ditemukan pada
tempat yang lebih tinggi dan pada danau air
tawar dan aliran sungai. Sampai saat ini
telah ditemukan 15.000 spesies spons,
namun keragamannya mungkin jauh lebih
besar. Spons sebagai organisme
mampu mengolah ribuan liter air laut per
hari. Pada permukaan tubuhnya terdapat
lubang kecil sebagai tempat masuknya air,
partikel organik dan sirkulasi kanal
tubuhnya. Spons menjadi inang dari
berbagai jenis komunitas mikroba secara
umum yang dapat mencapai 50!60% dari
tubuhnya (Wang 2006). Peran dari mikroba
tersebut bervariasi, mulai dari sumber
makanan hingga melakukan simbiosis
mutualisme dengan spons itu sendiri
(Kennedy
2009). Spons berperan
sebagai substrat bagi mikroba, menyediakan
akses ke matahari bagi mikroba yang
berfotosintesis, dan sebagai pensuplai
nutrisi. Keuntungan bagi spons dari
simbiosis ini antara lain meningkatkan
kepadatan spons, menghancurkan zat yang
tak dapat larut oleh kolagen spons, dan
penggunaan metabolit sekunder yang
dihasilkan oleh mikrob tersebut sebagai
mekanisme pertahanan terhadap kompetitor
dan predator (Taylor
2007).
Para peneliti menemukan bahwa spons
menghasilkan metabolit sekunder sebagai
mekanisme perlindungan diri. Penelitian lain
juga mengungkapkan bahwa metabolit
sekunder ini tidak hanya berperan dalam
metabolisme organisme tersebut tetapi juga
berperan dalam strategi adaptasi organisme
terhadap lingkungannya (Thakur & Müller
2004). Pada species
sp. lebih dari
190 metabolit dengan aktivitas spektrum
luas telah diisolasi (Yu
2006).
Senyawa tersebut diketahui sebagai
, antimikrob, antifungi, antimalaria,
dan sitotoksik (Fiesler
2004). Senyawa
yang diisolasi dari
sp. mencakup
steroid, terpenoid, poliasetilen, alkaloid,
peptida asam lemak tak jenuh, dan
poliketida (Yu
2006). Isolasi dan
identifikasi komponen!komponen senyawa
organik yang berpotensi sebagai senyawa
bioaktif dapat dilakukan dengan beberapa
cara, salah satunya dengan kromatografi
lapis tipis (KLT)
KLT merupakan teknik pemisahan
senyawa berdasarkan distribusi komponen
yang berbeda dari suatu campuran antara
fase gerak dan fase diam (Khopkar 1990).
Hasil pemisahan senyawa tersebut akan
menghasilkan fraksi!fraksi yang terpisah
sepanjang pelat KLT berdasarkan tingkat
kepolarannya. Setiap fraksi menghasilkan
nilai Rf yang merupakan langkah awal untuk
memperkirakan jenis suatu komponen
senyawa organik yang telah terpisah (Smart
2002; Furniss
1984). Untuk melihat
ada tidaknya aktivitas fraksi yang dihasilkan
dari uji KLT maka dilakukan uji lanjut yaitu
uji bioautografi.
Analisis fungsional metagenom telah
menghasilkan banyak senyawa baru
(Gillespie
2002),
baru (PKS) (Courtois
2003; Moffitt
and Neilan 2003), dan fungsi baru seperti
sistem asosiasi membran proteolitik (Beja
2000).
(PKS) dan
non!ribosomal
(NRPS)
merupakan kompleks enzim multifungsional
yang berperan dalam sintesis beragam
struktur senyawa bioaktif secara luas,
kebanyakan merupakan kepentingan medis
(Hutchinson 2003).
Berbagai senyawa antimikrob telah
diisolasi dari bakteri yang berasosiasi
dengan spons. Bakteri yang berasosiasi
dengan spons
sp. dapat
menghasilkan senyawa bioaktif yang
menghambat
non!
patogen,
patogen,
non!patogen, EPEC,
, dan
. Berdasarkan
analisis kekerabatannya keenam isolat yaitu
HAA!02, HAA!07, HAL!08, HAL!20,
HAL!10, HAL!23 menunjukkan homologi
dengan genus
Aktivitas antimikrob
ditunjukkan dengan adanya konsentrasi
hambat minimum (MIC) yaitu konsentrasi
terendah dari senyawa antimikrob yang akan
menghambat pertumbuhan mikroorganismee
setelah diinkubasi selama satu malam
(Andrews 2001). Pada penelitian ini
dilakukan uji MIC, ekstraksi senyawa
antimikrob dengan menggunakan etil asetat,
analisis kandungan dan aktivitas antimikrob
fraksi senyawa ekstrak kasar, serta deteksi
gen penyandi domain KS pada
(PKS) dan domain A pada non!
ribosomal
(NRPS).
1
Penelitian ini bertujuan menganalisis
senyawa bioaktif antimikrob bespektrum
luas dari bakteri yang berasosiasi dengan
spons
sp.
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan
Januari 2011 hingga Juni 2011 di
Laboratorium Mikrobiologi Departemen
Biologi, FMIPA, IPB.
Bahan yang digunakan adalah isolat!
isolat terbaik dari bakteri yang berasosiasi
dengan spons hasil penelitian terdahulu yaitu
HAA!02, HAA!07, HAL!08, HAL!20,
HAL!10, HAL!23 koleksi Pauliasi Tokasaya
(2010).
Mikrob indikator yang digunakan untuk
uji antagonis adalah
(EPEC)
K.1.1,
,
dan
. Media yang digunakan
yaitu SWC (
), NB
(!
), NA (!
" ), PDB
(
#
) dan PDA (
#
" ). Pelarut yang digunakan
untuk ekstraksi adalah etil asetat. Alat!alat
laboratorium yang digunakan adalah pelat
KLT ($% "
60F254 produksi Merck) vorteks, laminar
(Jouan, Perancis), autoklaf,
, mesin
PCR, pipet mikro, cawan, tabung, serta
peralatan umum yang digunakan di
laboratorium.
!"
Isolat bakteri marin dikulturkan dalam
medium SWC lalu diinkubasi selama tiga
hari di suhu ruang. Mikrob target
diremajakan kembali dalam media NB untuk
EPEC,
dan
atau dalam media PDB untuk
dan
Mikrob target
tersebut diinkubasi selama 24 jam pada suhu
ruang kemudian diinkubasi kemudian
disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm
selama 30 menit. Filtrat dari hasil
sentrifugasi dimasukkan ke dalam 5 tabung
reaksi dengan konsentrasi yang berbeda!
beda masing!masing 6.25%, 12.5%, 25%,
50%, dan 100%. Selain kelima konsentrasi
tersebut, dibuat juga kontrol yang tidak
diberi filtrat bakteri. Setelah itu, masing!
masing tabung diisi dengan 1 ml bakteri
target. Biakan uji MIC tersebut lalu
diinkubasi selama 24 jam. Kemudian
diamati kekeruhan masing!masing biakan di
dalam tabung reaksi. MIC ditentukan
berdasarkan kekeruhan biakan dibandingkan
dengan kontrol.
#
#
$
% &
'
#
Isolat bakteri marin dikulturkan ke
dalam 500 ml media SWC cair. Kultur
diinkubasi pada mesin penggoyang (100
rpm, 30 ºC) selama tiga hari. Kemudian ke
dalam kultur ditambahkan 500 ml etil asetat,
diaduk selama 3 jam, dan dievaporasi.
Ekstrak yang dihasilkan disimpan pada suhu
5 ºC untuk pemakaian selanjutnya (Muller
2004).
#
( #
$ % &
)
Mikrob indikator dikultur selama 24
jam. Sebanyak 1% kultur mikrob indikator
dicampurkan ke media NA dan PDA semi
padat lalu dituangkan di cawan. Ekstrak
kasar senyawa antimikrob yang telah
dilarutkan dengan metanol (100 mg/ml)
diteteskan ke kertas cakram masing!masing
sebanyak 100 Dl kemudian diletakkan di
permukaan media agar semipadat tersebut.
Cawan uji diinkubasi selama 24 jam. Hasil
uji positif ditunjukkan dengan terbentuknya
zona bening.
*
# #
#
#
Isolasi dan identifikasi senyawa bioaktif
sampel dilakukan dengan KLT terhadap
senyawa organik dari ekstrak kasar.
Fraksinasi dilakukan pada pelat 25 $%
"
60F254.
Sebanyak 30 Dl ekstrak senyawa antimikrob
diteteskan dengan pipa kapiler pada pelat
yang telah diberi tanda sebagai titik awal.
Kemudian pelat dimasukkan ke dalam kotak
kromatografi yang berisi eluen n!butanol:
etil asetat: akuades (2:3:1) dan n!butanol:
etil asetat (3:7) dan telah dijenuhkan selama
satu jam. Setelah senyawa bergerak sampai
garis batas atas, pelat dikeluarkan dan
dikeringkan. Komponen senyawa organik
yang terpisah akan berbentuk noda!noda di
sepanjang pelat, kemudian dilihat dan
ditandai di bawah sinar UV dengan panjang
gelombang 254 dan 365 nm (Zheng
2005).
Masing!masing
komponen
2
antimikrob kemudian diuji aktivitasnya
(bioautografi) untuk mengetahui komponen
antimikrob yang dapat menghambat bakteri.
##
+ #
) $ % &
# * # #
'"
Bahan yang digunakan adalah pelat
KLT yang mengandung senyawa yang sudah
difraksinasi. Pelat tersebut disterilisasi
menggunakan sinar UV selama 30 menit,
lalu diletakkan di atas agar nutrien pada
cawan petri. Kemudian lapisan tersebut
dilapisi oleh media agar cair yang
mengandung bakteri uji
dengan metode agar tuang, kemudian
diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 24 jam.
Setelah masa inkubasi, zona bening yang
terbentuk diamati, untuk melihat komponen
senyawa organik yang dapat menghambat
pertumbuhan bakteri (Zheng
2005).
#
# ,
Isolat bakteri dikulturkan dalam media
kaldu SWC selama 24 jam. Sebanyak 1.5 ml
kultur disentrifugasi 10000 rpm selama 10
menit. DNA genom bakteri diekstrak dengan
mengikuti metode CTAB (Sambrook &
Russell 2001).
#
($
,
($
,
- $
!Reaksi PCR untuk mengamplifikasi
domain KS dari gen penyandi PKS dan
domain A dari gen penyandi NRPS
dilakukan dengan mengikuti metode
Schirmer
(2005). Reaksi PCR
dilakukan sebanyak 30 siklus dengan
masing!masing tahap yaitu predenaturasi
selama 1 menit dan denaturasi selama 30
detik pada suhu 94 ºC,
50 ºC
selama 30 detik, polimerisasi 75 ºC selama 1
menit 10 detik, dan post PCR dilakukan
pada suhu 72 ºC selama 5 menit. Visualisasi
amplikon PKS dan NRPS dilakukan melalui
elektroforesis. Isolat yang mempunyai gen
penyandi domain keto!sintase (KS) dari PKS
menunjukkan terbentuknya pita pada ukuran
di sekitar 700 pasang basa (
),
sedangkan pada deteksi gen penyandi
domain adenilasi (A) dari NRPS ditunjukkan
dengan munculnya pita pada ukuran sekitar
1000 bp.
$
$
Uji
MIC
menghasilkan
kisaran
hambatan yang berbeda, yaitu antara 12,5%
sampai 100% Isolat HAL!08 memiliki nilai
MIC sebesar 12,5% terhadap
(Tabel 1). Hal ini merupakan indikasi yang
bagus terhadap efek senyawa antimikrob
yang dihasilkan oleh isolat tersebut. HAL!
10 menghambat paling kuat terhadap
. HAL!20 menghambat paling
kuat terhadap
. HAL!23 memiliki
nilai MIC yang tinggi yaitu 12,5% terhadap
. Selain itu isolat ini juga memiliki
aktivitas hambat yang tinggi terhadap
dan
. Isolat HAA!02
memiliki aktivitas hambat terhadap
dan EPEC dengan konsentrasi
sebesar
50%.
Sedangkan
HAA!07
menghambat EPEC dengan konsentrasi
25%. Berdasarkan uji MIC, semua isolat
hanya menghambat pertumbuhan bakteri
atau bakteriostatik.
Semua supernatan dari bakteri marin
tidak memiliki aktivitas terhadap
dan
. Hal ini karena kedua
cendawan tersebut merupakan cendawan
patogen yang memiliki dinding sel yang
tebal sehingga sulit untuk didegradasi.
Selain itu terdapat mekanisme pertahanan
dari sel cendawan patogen tersebut yang
dapat menghambat atau menghilangkan efek
senyawa bioaktif dari supernatan bakteri
marin, seperti produksi enzim, perubahan
permeabilitas dinding sel, dan jalur
metabolik yang menjadi target dari senyawa
bioaktif tersebut (Lay 1994). Uji MIC
bersifat tidak stabil tergantung dari mikrob
uji, ukuran inokulum, komposisi kultur
media, waktu inkubasi, dan kondisi inkubasi
seperti temperatur, pH, dan aerasi (Tokasaya
2010).
#
( #
$ % &
)
Bagian selanjutnya dari penelitian ini
yaitu ekstraksi senyawa bioaktif dari bakteri
dengan menggunakan etil asetat. Proses
ekstraksi menghasi