3. CAAT atau AGGA box, letaknya kira-kira 75 bp di atas transcription site. Bagian ini berfungsi mengatur jumlah transkrip yang akan dibuat oleh
suatu gen.
5. Peranan dari distal regulatory element
Elemen pengatur ini diketahui mengatur ekpresi gen yang dipengaruhi oleh berbagai faktor lingkungan dan ada yang dipengaruhi oleh perkembangan tanaman.
Ada beberapa cara untuk menentukan letak dan mendeteksi elemen ini. Jika suatu gen telah berhasil diisolasi melalui proses kloning, regulatory element dapat
ditentukan dengan membandingkan sekuensinya dengan sekuensi gen yang aktif terekspresi dalam kondisi yang sama, sehingga didapat suatu concencus sequences
tertentu. Akan tetapi, hasil yang didapat dari cara di atas harus diuji kembali dengan analisis fungsi dari elemen yang didapat untuk menghindari kesalahan yang
mungkin terjadi. Penggunaan tanaman transgenim dapat membantu analisis fungsi dari suatu elemen terhadap ekspresi gen. Prosedur eksperimen yang baku adalah
membuat konstruksi dengan berbagai delesi di bagian 5’ dari gennya. Delesi dapat dilakukan dengan menggunakan situs enzim restriksi yang ada Gambar 2 atau
menggunakan enzim nuklease Bal31. Masing-masing kontruksi gen yang didapat selanjutnya diintroduksikan ke tanaman model biasanya tembakau dan ekspresi
dari masing-masing gennya dianalisis.
Aktivitas ekspresi dari berbagai konstruksi gen tersebut dapat diamati dengan dua cara, yaitu 1 dengan mengamati akumulasi mRNA-nya dengan teknik Northern
bloting, atau 2 dengan mengamati protein yang disandikan oleh masing-masing kontruksi gen dengan menggunakan antibodi tertentu. Pada Gambar 3 dapat dilihat
hasil dari penggunaan teknik yang kedua untuk mengidentifikasi regulatory element dari gen legA legumin tanaman kacang kapri Pisum sativum. Tiga konstruksi
dengan berbagai delesi pada bagian regulatory element dan satu kontruksi dengan gen utuh diintroduksikan ke tanaman tembakau sehingga terbentuk satu seri
tembakau transgenik yang masing-masing membawa salah satu dari keempat konstruksi gen yang dibuat. Protein legumin yang dihasilkan diisolasi dari masing-
masing individu tanaman transgenik tembakau dan dideteksi dengan teknik ELISA. Hasil yang didapat menunjukkan konstruksi dengan delesi yang berakhir sampai
dengan –97bp di atas transcription start kontruksi –97 menghilangkan aktivitas dari gen protein legumin tidak diproduksi dari kontruksi gen ini. Sintesis legumin
pertama kali dapat dideteksi dalam tanaman yang membawa konstruksi –549. Hal ini berarti bahwa sekuensi upstream dari –97 diperlukan untuk mengaktifkan gen
legA. Biji dari tanaman transgenik yang membawa kontruksi –833 dan konstruksi – 1203 yang tidak mengalami delesi menunjukkan ekspresi legumin yang tinggi,
pada beberapa tanaman dapat mencapai 0.5 dari total protein sel. Hasil yang sama dengan data ELISA juga diperoleh ketika jumlah transkrip mRNA yang
terbentuk dari masing-masing konstruksi gen ditentukan dengan menggunakan teknik Northern blotting.
Contoh analisis in vivo menggunakan tanaman transgenik seperti ini dapat memberikan gambaran tentang dua hal penting yang berkaitan dengan regulatory
element pada tanaman, yaitu : 1 sekuensi DNA yang diperlukan untuk ekspresi dalam jumlah rendah dan yang bersifat spesifik jaringan biasanya berada di sekitar
500 bp upstream dari transcriptional start, dan 2 elemen yang berada lebih jauh lagi dapat meningkatkan ekspresi gen tanpa berpengaruh terhadap eks[resi gen
yang bersifat spesifik jaringa. Beberapa dari elemen tipe ini tidak akan berfungsi jika dipisahkan dari gen-nya semula, sedangkan beberapa yang lain dapat berfungsi
sebagai enhancer ketika digabungkan dengan gen lain. Dengan demikian, kesimpulan dari percobaan menggunakan gen legA menunjukkan sekuensi DNA
2002 digitized by USU digital library
3
sampai dengan –549 bp berperanan dalam mengatur ekspresi yang bersifat spesifik jaringan, sedangkan sekuensi antara –549 dengan –1203 bp dapat meningkatkan
ekspresi gen. 6. Enhancer
Enhancer adalah sekuensi DNA regulator yang posisinya relatif jauh dari transcription start, dapat berfungsi tanpa tergantung pada posisi atau orientasinya,
dan dapat mendorong proses transkripsi berbagai gen yang ada di dekatnya. Sekuensi enhancer ditemukan pada gen conglycinin seed storage protein yang
berasal dari kedelai. Letak dari enhancer ini ada diantara nukleotida –159 sampai – 257 upstream dari transcription start. Diantara nukleotida tersebut terdapat
beberapa kopi DNA repeat yang masing-masing berukuran 6 bp dengan urutan sebagai berikut :
A AGCCCA
A Dalam suatu percobaan, DNA repeat tersebut disisipkan dalam berbagai posisi
dan orientasi yang berbeda, upstream dari suatu gen reporter. Sistem gen reporter yang dibuat terdiri dari : distal element dari gen conglycinin, cauliflower mosaic virus
CaMV promoter, dan sekuensi pengkode enzim chloramphenicol acetyl transferase CAT. Konstruksi gen ini telah diintroduksikan ke dalam tanaman model sehingga
terbentuk populasi tanaman transgenik yang masing-masing membawa gen reporter tertentu. Tanaman transgenik yang membawa gen reporter dengan DNA elemen
yang ada diantara –257 dan –159 mampu mengekspresi enzim CAT dalam biji sebanyak 25 kali lipat lebih tinggi dibanding tanaman kontrol. Hal ini memberikan
indikasi bahwa pada sekuensi DNA diantara –257 dan –159 tersebut terdapat elemen yang berlaku sebagai enhancer.
7. Fusi Promotor dan gen reporter
