Analisis Ekspresi Gen Pada Embriogenesis Somatik Di Tanaman Kelapa Sawit.
ANALISIS EKSPRESI GEN PADA EMBRIOGENESIS
SOMATIK DI TANAMAN KELAPA SAWIT
NURYANTI SYARIYANTO
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa Tesis yang berjudul Analisis Ekspresi
Gen pada Embriogenesis Somatik di Tanaman Kelapa Sawit adalah benar karya
saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa
pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip
dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis
ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor dan PT SMART Tbk.
Bogor, Mei 2016
Nuryanti Syariyanto
NIM P051120211
RINGKASAN
NURYANTI SYARIYANTO. Analisis Ekspresi Gen Pada Embriogenesis Somatik di
Tanaman Kelapa Sawit. Dibimbing oleh UTUT WIDYASTUTI dan NURITA
TORUAN-MATHIUS.
Teknik kultur jaringan merupakan salah satu teknik perbanyakan tanaman kelapa
sawit untuk skala produksi (mass production) karena dapat menghasilkan tanaman yang
memiliki sifat yang sama dengan induknya (true to type). Namun, teknik ini masih kurang
efisien karena keberhasilan pembentukan embrio somatik-nya yang masih rendah (3-6%),
oleh karena itu perlu dilakukan identifikasi gen-gen yang terlibat dalam embriogenesis
pada tanaman kelapa sawit.
Pada penelitian sebelumnya dengan teknik microarray, diperoleh beberapa gen
yang potensial dan terlibat dalam pembentukan embrio somatik di tanaman kelapa sawit,
namun ekspresi gen dari kandidat gen-gen tersebut belum divalidasi, oleh karena itu
penelitian ini bertujuan: (1) seleksi gen-gen terkait embriogenesis somatik dari hasil
microarray berdasarkan pendekatan Bioinformatik dan (2) menganalisis ekspresi gengen tersebut menggunakan qPCR. Penelitian ini diharapkan diperoleh kandidat gen-gen
terkait embriogenesis somatik yang dapat digunakan sebagai marka untuk deteksi dini
kalus-kalus yang memiliki kemampuan embriogenik pada tanaman kelapa sawit.
Penelitian secara garis besar dibagi menjadi dua bagian, yaitu: (1) seleksi gen-gen
terkait embriogenesis somatik dan (2) menganalisis ekspresi gen-gen tersebut
menggunakan qPCR. Pada tahap seleksi gen dengan Bioinformatik, gen-gen hasil dari
analisis dengan microarray diseleksi berdasarkan nilai ekspresinya (fold change), fungsi
gen, dan faktor-faktor yang mempengaruhi embriogenesis.
Analisis ekpsresi gen dilakukan dengan menggunakan sampel kalus (nodular
callus) dan embrio somatik (coleoptilar stage) yang merupakan hasil kultur jaringan dari
tiga progeni tanaman kelapa sawit (Tenera). RNA dari dua jenis sampel diekstraksi,
kemudian diubah menjadi cDNA utas tunggal. Selanjutnya dilakukan analisis ekspresi
gen menggunakan teknik qPCR. Ekspresi gen dikuantifikasi dengan metoda Relative
Quantification Standart Curve. Pada analsis tersebut kalus digunakan sebagai kalibrator
sampel (kontrol) dan gen 40S ribosomal protein (40s) digunakan gen pembanding
(reference gene).
Hasil seleksi gen-gen yang terlibat dalam embriogenesis somatik melalui
pendekatan Bioinformatik diperoleh sebanyak sepuluh kandidat gen yang terdiri atas:
tujuh gen yang up-regulated dan tiga gen down-regulated. Kesepuluh gen tersebut
kemudian dilakukan analisis melt curve sehingga diperoleh empat gen yang primernya
terbukti spesifik dan dapat digunakan dalam analisis qPCR, yaitu: IAA-amino acid
hydrolase ILR1-like1 (ilr1), late embryogenesis abundant (lea2), 26S proteasome nonATPase (26sp), dan trehalose phosphate synthase (tps6). Hasil analisis ekspresi gen
dengan menggunakan qPCR menunjukkan bahwa gen ilr1 dan lea2 terekspresi lebih
tinggi pada embrio somatik (coleoptilar stage) dibandingkan dengan sampel kalus
(kontrol). Meskipun tingginya ekspresi kedua gen tersebut berbeda pada setiap progeni.
Kedua gen ini berpotensi digunakan sebagai penanda untuk mendeteksi adanya embrio
somatik (coleoptilar stage).
Kata kunci: Elaeis guineensis Jacq, IAA-amino acid hydrolase (ilr1), Late embryogenesis
abundant (lea), Quantitative real-time PCR (qPCR)
SUMMARY
NURYANTI SYARIYANTO. Gene Expression Analysis of Somatic Embryogenesis in
Oil Palm. Supervised by UTUT WIDYASTUTI and NURITA TORUAN-MATHIUS.
Tissue culture is one of techniques to multiply elite palms for production true to
type generation. However, this technique is still susceptible by low embryogenesis rate
(3-6%). Therefore, identification of genes related to embryogenesis in oil palm is needed
to improve the efficiency in oil palm tissue culture.
Previous research with microarray technique showed some potential candidate
genes related to oil palm somatic embryogenesis, but the expression of those genes has
not yet been validated. Thus, the aim of this study is to: (1) select genes related in somatic
embryogenesis from microarray result based on Bioinformatic and (2) validate the
expression level of those genes using quantitative real-time PCR (qPCR). In the future,
the candidate genes might be used in developing molecular marker for early detection to
differentiate the embryogenic and non-embryogenic cultures.
This research consist of two parts: (1) selection of genes related in somatic
embryogenesis based on Bioinformatic and (2) analysis expression of genes related in
somatic embryogenesis used qPCR. In genes selection, embryogenesis related genes
were choosen based on fold change, function of the genes and factors of embryogenesis.
In gene expression analysis, nodular callus and somatic embryo of E. guineensis
Tenera at coleoptilar stage were collected from three palms for RNA extraction. The first
strand cDNA was synthesized from RNA and used for gene expression analysis. The
expression of embryogenesis-related genes were analyzed using Relative Quantification
Standard Curve method. Callus was used as calibrator sample and 40S ribosomal protein
S27-2 (40s) gene as reference gene.
Ten genes related to embryogenesis were selected based on Bioinformatic, which
consist of seven up-regulated genes and three down-regulated genes. Melt curve analysis
of those ten primer of target genes showed that only four primers was specific and can
be used for qPCR analysis, such as: IAA-amino acid hydrolase ILR1-like1 (ilr1), late
embryogenesis abundant (lea2), 26S proteasome non-ATPase (26sp), and trehalose
phosphate synthase (tps6). qPCR result showed that ilr1 and lea2 genes were highly
expressed on somatic embryo (coleoptilar stage) in compared to callus, but expression of
those genes was different in each progeny. ilr1 and lea2 genes may potentially be
involved in oil palm somatic embryogenesis.
Keywords: Elaeis guineensis Jacq, IAA-amino acid hydrolase (ilr1), Late embryogenesis
abundant (lea), Quantitative real-time PCR (qPCR)
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau
menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian,
penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan
suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB dan
PT SMART Tbk.
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB dan PT SMART Tbk.
ANALISIS EKSPRESI GEN PADA EMBRIOGENESIS
SOMATIK DI TANAMAN KELAPA SAWIT
NURYANTI SYARIYANTO
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Bioteknologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016
ii
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Prof Ir Sudarsono, MSc PhD
iii
Judul Tesis : Analisis Ekspresi Gen Pada Embriogenesis Somatik di Tanaman
Kelapa Sawit
Nama
: Nuryanti Syariyanto
NIM
: P051120211
iv
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala
karunia-Nya sehingga penelitian ini berhasil diselesaikan. Penelitian yang berjudul
Analisis Ekspresi Gen Pada Embriogenesis Somatik di Tanaman Kelapa Sawit, ini
ditujukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada
Program Studi Bioteknologi Sekolah Pascasarjana IPB Bogor.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu
dalam penyusunan penelitian ini baik secara langsung maupun tidak langsung.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Dr Ir Utut Widyastuti, MSi, sebagai
ketua komisi pembimbing dan Dr Nurita Toruan-Mathius, MS, sebagai anggota
komisi pembimbing atas arahan, bimbingan, serta motivasi yang diberikan kepada
penulis dari awal penelitian hingga penyusunan tesis ini. Kepada Prof Ir Sudarsono,
MSc PhD atas saran, masukan serta kesediaannya menjadi penguji luar komisi, dan
kepada Dr. dr Sri Budiarti atas kesediaannya sebagai moderator dalam ujian tesis.
Terima kasih juga penulis sampaikan kepada Prof Dr Ir Suharsono, DEA selaku
Ketua Program Studi Bioteknologi IPB yang telah memberi arahan dan bimbingan
selama penulis menempuh studi S2 Bioteknologi. Kepada Prof Ir Antonius
Suwanto, MSc PhD atas perhatian, motivasi dan izin sit in di mata kuliah Ekspresi
Gen dan Pengendaliannya.
Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada Bapak Jo Daud Dharsono
selaku Head of Upstream PT SMART Tbk yang telah memberi izin dan kesempatan
kepada penulis untuk melanjutkan studi S2, Bapak Dr Tony Liwang selaku Division
Head dan Ibu Lisa Muliani, MSc selaku Dept. Head Tissue Culture yang telah
memberikan kesempatan, motivasi dan dukungan selama studi. Kepada Bapak Dr
Condro Utomo, Dr Roberdi, Reno Tryono, Zulfikar, Hadi, Ibu Angeli
Karmorahardjo, dan Widyah Budinarta yang telah berperan dalam mengkaji serta
memberikan saran dalam rangka penyusunan publikasi. Kepada Maharani
Anischan, Andree, Fajri, Analekta, Wulan A, dan Sigit atas sharing pengetahuan
mengenai qPCR, kepada Chris Darmawan dan Bu Widyartini atas sharing
pengetahuan dalam perancangan primer, kepada Yogo AN dan Dwi Yono atas
pelatihan analisa data statistik, juga kepada Intana dan Lutfi atas pelatihan
pengunaan alat di laboratorium Bioteknologi.
Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada kedua orang tua, Agus
Syariyanto dan Wong Wan Jin, kedua kakak serta adik atas doa dan dukungannya
selama studi. Terima kasih juga kepada Tami, Fitria, Bu Sussi, Pak Hadi, Yeni,
Qurrota A’yun, teman-teman di Sekolah Pascasarjana Bioteknologi angkatan 2012
serta rekan-rekan dari PT SMART Tbk atas dukungan dan bantuannya selama
penelitian studi S2 ini.
Penulis menyadari bahwa penelitian dan penyusunan tesis ini masih jauh dari
sempurna namun semoga hasil penelitian ini dapat bermanfaat.
Bogor, Mei 2016
Nuryanti Syariyanto
v
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vii
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Hipotesis
1
1
2
2
2
2
2 TINJAUAN PUSTAKA
Tanaman Kelapa Sawit
Kultur Jaringan Tanaman
Embriogenesis somatik
Gen-Gen Terkait Embriogenesis
Analisis Hasil Microarray dengan Bioinformatik
Perancangan Primer
Analisis Ekspresi Gen dengan qPCR
3
3
4
5
7
8
10
11
3 METODE
Bahan
Prosedur Kerja
Seleksi Gen menggunakan Pendekatan Bioinformatik
Isolasi RNA dan Sintesis cDNA Sampel
Perancangan, Optimasi, dan Validasi Primer
Pembuatan Standar qPCR
Seleksi Gen Pembanding
Analisis Ekspresi Gen dengan qPCR
14
14
15
15
16
16
17
17
17
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Seleksi Gen Embriogenesis dengan Pendekatan Bioinfromatik
Isolasi RNA dan Sintesis cDNA Sampel
Perancangan, Optimasi, dan Validasi Primer
Seleksi Gen Pembanding
Analisis Ekspresi Gen dengan qPCR
19
19
21
24
29
30
5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
38
38
38
DAFTAR PUSTAKA
39
LAMPIRAN
44
RIWAYAT HIDUP
55
vi
DAFTAR TABEL
1 Gen-gen yang up-regulated di embrio somatik kelapa sawit
(Budinarta et al. 2012)
2 Informasi asal tanaman dari sampel kalus dan embrio somatik
3 Kandidat gen embriogenesis somatik
4 Fungsi dari kandidat gen embriogenesis somatik
5 Konsentrasi, kemurnian, serta nilai intergritas RNA dari sampel
kalus dan embrio somatik pada ketiga tanaman kelapa sawit
6 Sekuen nukleotida dari primer gen pembanding (primer I)
7 Sekuen nukleotida dan hasil optimasi primer gen target (primer I)
8 Hasil BLASTN gen target dan pembanding primer I
9 Sekuen nukleotida dan hasil optimasi primer gen target (primer II)
Sekuen nukleotida primer gen pembanding (primer II)
Hasil BLASTN gen target dan pembanding primer set II
Hasil BLASTN dan BLASTX pada primer set II
Persamaan, nilai R2, dan persentase efisiensi dari masing-masing
kurva standar gen target dan gen pembanding
14 Nilai Cq pada LOD dan NTC dari masing-masing gen target dan
gen pembanding
10
11
12
13
9
14
19
19
22
24
24
25
26
27
28
28
31
32
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
Alur proses kultur jaringan tanaman kelapa sawit
Diagram skematik jalur pembentukan embrio somatik
Fase perkembangan embrio somatik dari kultur kelapa sawit
Gen-gen yang terlibat dalam proses embriogenesis somatik
Kurva amplifikasi pada qPCR
Efisiensi Amplifikasi PCR
Sampel kalus dan embrio somatik
Diagram alir kegiatan penelitian
Heat map dari 1.083 gen hasil seleksi microarray
Interaksi antar gen up-regulated dan down-regulated hasil analisis
dengan Cytoscape
RNA hasil isolasi dari kalus (C) dan embrio somatik (E) tanaman
kelapa sawit
Hasil analisis integritas RNA kalus
Hasil analisis integritas RNA embrio somatik
Hasil sintesis cDNA dari sampel kalus dan embrio somatik
Hasil optimasi primer set II yang tidak spesifik (terdapat dimer)
Hasil analisis Melt curve pada gen target dan gen pembanding
Hasil analisis Melt curve pada kelima gen pembanding
5
6
7
8
12
12
14
15
20
21
22
23
23
24
27
28
29
vii
18 Perbandingan nilai Cq dari ketiga gen (act3, 40s, dan sodm)
pembanding pada sampel kalus (Cal) dan embrio somatik (Emb)
19 Kurva standar dari masing-masing gen target
20 Pita hasil amplifikasi qPCR dari keempat gen target (palm 1)
21 Hasil analisis ekspresi gen sampel kalus dan embrio somatik
22 Jalur biosintesis auksin (Tryptophan-independent pathways)
23 Sistem ekspresi gen auksin dan gen 26S Proteasome (SCFTIR1)
24 Transport auksin pada tahap awal pembentukan embrio
Arabidopsis.
25 ABA-mediated abiotic stress response
26 Trehalose pathway in plants
30
31
32
33
34
34
35
36
37
DAFTAR LAMPIRAN
1 Data hasil pensejajaran sekuen cDNA hasil sekuensing dengan sekuen
cDNA masing-masing gen hasil design primer I
2 Data hasil pensejajaran sekuen cDNA hasil sekuensing dengan sekuen
cDNA masing-masing gen hasil design primer II
3 Hasil analsis qPCR dari keempat kandidat gen embriogenesis
4 Hasil analisis Statistik: One-way Anova dan Dunnett t-tests dari gen
E. guineensis IAA-amino acid hydrolase ILR1-like 1 (ilr1)
5 Hasil analisis Statistik: One-way Anova dan Dunnett t-tests dari gen
E. guineensis Late embryogenesis abundant (lea2)
44
50
52
53
54
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kelapa sawit merupakan tanaman yang paling produktif dalam menghasilkan
minyak nabati (±4 ton ha-1 tahun-1) dibandingkan dengan tanaman lainnya seperti
kanola, bunga matahari, dan kedelai (
SOMATIK DI TANAMAN KELAPA SAWIT
NURYANTI SYARIYANTO
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa Tesis yang berjudul Analisis Ekspresi
Gen pada Embriogenesis Somatik di Tanaman Kelapa Sawit adalah benar karya
saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa
pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip
dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis
ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor dan PT SMART Tbk.
Bogor, Mei 2016
Nuryanti Syariyanto
NIM P051120211
RINGKASAN
NURYANTI SYARIYANTO. Analisis Ekspresi Gen Pada Embriogenesis Somatik di
Tanaman Kelapa Sawit. Dibimbing oleh UTUT WIDYASTUTI dan NURITA
TORUAN-MATHIUS.
Teknik kultur jaringan merupakan salah satu teknik perbanyakan tanaman kelapa
sawit untuk skala produksi (mass production) karena dapat menghasilkan tanaman yang
memiliki sifat yang sama dengan induknya (true to type). Namun, teknik ini masih kurang
efisien karena keberhasilan pembentukan embrio somatik-nya yang masih rendah (3-6%),
oleh karena itu perlu dilakukan identifikasi gen-gen yang terlibat dalam embriogenesis
pada tanaman kelapa sawit.
Pada penelitian sebelumnya dengan teknik microarray, diperoleh beberapa gen
yang potensial dan terlibat dalam pembentukan embrio somatik di tanaman kelapa sawit,
namun ekspresi gen dari kandidat gen-gen tersebut belum divalidasi, oleh karena itu
penelitian ini bertujuan: (1) seleksi gen-gen terkait embriogenesis somatik dari hasil
microarray berdasarkan pendekatan Bioinformatik dan (2) menganalisis ekspresi gengen tersebut menggunakan qPCR. Penelitian ini diharapkan diperoleh kandidat gen-gen
terkait embriogenesis somatik yang dapat digunakan sebagai marka untuk deteksi dini
kalus-kalus yang memiliki kemampuan embriogenik pada tanaman kelapa sawit.
Penelitian secara garis besar dibagi menjadi dua bagian, yaitu: (1) seleksi gen-gen
terkait embriogenesis somatik dan (2) menganalisis ekspresi gen-gen tersebut
menggunakan qPCR. Pada tahap seleksi gen dengan Bioinformatik, gen-gen hasil dari
analisis dengan microarray diseleksi berdasarkan nilai ekspresinya (fold change), fungsi
gen, dan faktor-faktor yang mempengaruhi embriogenesis.
Analisis ekpsresi gen dilakukan dengan menggunakan sampel kalus (nodular
callus) dan embrio somatik (coleoptilar stage) yang merupakan hasil kultur jaringan dari
tiga progeni tanaman kelapa sawit (Tenera). RNA dari dua jenis sampel diekstraksi,
kemudian diubah menjadi cDNA utas tunggal. Selanjutnya dilakukan analisis ekspresi
gen menggunakan teknik qPCR. Ekspresi gen dikuantifikasi dengan metoda Relative
Quantification Standart Curve. Pada analsis tersebut kalus digunakan sebagai kalibrator
sampel (kontrol) dan gen 40S ribosomal protein (40s) digunakan gen pembanding
(reference gene).
Hasil seleksi gen-gen yang terlibat dalam embriogenesis somatik melalui
pendekatan Bioinformatik diperoleh sebanyak sepuluh kandidat gen yang terdiri atas:
tujuh gen yang up-regulated dan tiga gen down-regulated. Kesepuluh gen tersebut
kemudian dilakukan analisis melt curve sehingga diperoleh empat gen yang primernya
terbukti spesifik dan dapat digunakan dalam analisis qPCR, yaitu: IAA-amino acid
hydrolase ILR1-like1 (ilr1), late embryogenesis abundant (lea2), 26S proteasome nonATPase (26sp), dan trehalose phosphate synthase (tps6). Hasil analisis ekspresi gen
dengan menggunakan qPCR menunjukkan bahwa gen ilr1 dan lea2 terekspresi lebih
tinggi pada embrio somatik (coleoptilar stage) dibandingkan dengan sampel kalus
(kontrol). Meskipun tingginya ekspresi kedua gen tersebut berbeda pada setiap progeni.
Kedua gen ini berpotensi digunakan sebagai penanda untuk mendeteksi adanya embrio
somatik (coleoptilar stage).
Kata kunci: Elaeis guineensis Jacq, IAA-amino acid hydrolase (ilr1), Late embryogenesis
abundant (lea), Quantitative real-time PCR (qPCR)
SUMMARY
NURYANTI SYARIYANTO. Gene Expression Analysis of Somatic Embryogenesis in
Oil Palm. Supervised by UTUT WIDYASTUTI and NURITA TORUAN-MATHIUS.
Tissue culture is one of techniques to multiply elite palms for production true to
type generation. However, this technique is still susceptible by low embryogenesis rate
(3-6%). Therefore, identification of genes related to embryogenesis in oil palm is needed
to improve the efficiency in oil palm tissue culture.
Previous research with microarray technique showed some potential candidate
genes related to oil palm somatic embryogenesis, but the expression of those genes has
not yet been validated. Thus, the aim of this study is to: (1) select genes related in somatic
embryogenesis from microarray result based on Bioinformatic and (2) validate the
expression level of those genes using quantitative real-time PCR (qPCR). In the future,
the candidate genes might be used in developing molecular marker for early detection to
differentiate the embryogenic and non-embryogenic cultures.
This research consist of two parts: (1) selection of genes related in somatic
embryogenesis based on Bioinformatic and (2) analysis expression of genes related in
somatic embryogenesis used qPCR. In genes selection, embryogenesis related genes
were choosen based on fold change, function of the genes and factors of embryogenesis.
In gene expression analysis, nodular callus and somatic embryo of E. guineensis
Tenera at coleoptilar stage were collected from three palms for RNA extraction. The first
strand cDNA was synthesized from RNA and used for gene expression analysis. The
expression of embryogenesis-related genes were analyzed using Relative Quantification
Standard Curve method. Callus was used as calibrator sample and 40S ribosomal protein
S27-2 (40s) gene as reference gene.
Ten genes related to embryogenesis were selected based on Bioinformatic, which
consist of seven up-regulated genes and three down-regulated genes. Melt curve analysis
of those ten primer of target genes showed that only four primers was specific and can
be used for qPCR analysis, such as: IAA-amino acid hydrolase ILR1-like1 (ilr1), late
embryogenesis abundant (lea2), 26S proteasome non-ATPase (26sp), and trehalose
phosphate synthase (tps6). qPCR result showed that ilr1 and lea2 genes were highly
expressed on somatic embryo (coleoptilar stage) in compared to callus, but expression of
those genes was different in each progeny. ilr1 and lea2 genes may potentially be
involved in oil palm somatic embryogenesis.
Keywords: Elaeis guineensis Jacq, IAA-amino acid hydrolase (ilr1), Late embryogenesis
abundant (lea), Quantitative real-time PCR (qPCR)
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau
menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian,
penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan
suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB dan
PT SMART Tbk.
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB dan PT SMART Tbk.
ANALISIS EKSPRESI GEN PADA EMBRIOGENESIS
SOMATIK DI TANAMAN KELAPA SAWIT
NURYANTI SYARIYANTO
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Bioteknologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016
ii
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Prof Ir Sudarsono, MSc PhD
iii
Judul Tesis : Analisis Ekspresi Gen Pada Embriogenesis Somatik di Tanaman
Kelapa Sawit
Nama
: Nuryanti Syariyanto
NIM
: P051120211
iv
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala
karunia-Nya sehingga penelitian ini berhasil diselesaikan. Penelitian yang berjudul
Analisis Ekspresi Gen Pada Embriogenesis Somatik di Tanaman Kelapa Sawit, ini
ditujukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada
Program Studi Bioteknologi Sekolah Pascasarjana IPB Bogor.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu
dalam penyusunan penelitian ini baik secara langsung maupun tidak langsung.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Dr Ir Utut Widyastuti, MSi, sebagai
ketua komisi pembimbing dan Dr Nurita Toruan-Mathius, MS, sebagai anggota
komisi pembimbing atas arahan, bimbingan, serta motivasi yang diberikan kepada
penulis dari awal penelitian hingga penyusunan tesis ini. Kepada Prof Ir Sudarsono,
MSc PhD atas saran, masukan serta kesediaannya menjadi penguji luar komisi, dan
kepada Dr. dr Sri Budiarti atas kesediaannya sebagai moderator dalam ujian tesis.
Terima kasih juga penulis sampaikan kepada Prof Dr Ir Suharsono, DEA selaku
Ketua Program Studi Bioteknologi IPB yang telah memberi arahan dan bimbingan
selama penulis menempuh studi S2 Bioteknologi. Kepada Prof Ir Antonius
Suwanto, MSc PhD atas perhatian, motivasi dan izin sit in di mata kuliah Ekspresi
Gen dan Pengendaliannya.
Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada Bapak Jo Daud Dharsono
selaku Head of Upstream PT SMART Tbk yang telah memberi izin dan kesempatan
kepada penulis untuk melanjutkan studi S2, Bapak Dr Tony Liwang selaku Division
Head dan Ibu Lisa Muliani, MSc selaku Dept. Head Tissue Culture yang telah
memberikan kesempatan, motivasi dan dukungan selama studi. Kepada Bapak Dr
Condro Utomo, Dr Roberdi, Reno Tryono, Zulfikar, Hadi, Ibu Angeli
Karmorahardjo, dan Widyah Budinarta yang telah berperan dalam mengkaji serta
memberikan saran dalam rangka penyusunan publikasi. Kepada Maharani
Anischan, Andree, Fajri, Analekta, Wulan A, dan Sigit atas sharing pengetahuan
mengenai qPCR, kepada Chris Darmawan dan Bu Widyartini atas sharing
pengetahuan dalam perancangan primer, kepada Yogo AN dan Dwi Yono atas
pelatihan analisa data statistik, juga kepada Intana dan Lutfi atas pelatihan
pengunaan alat di laboratorium Bioteknologi.
Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada kedua orang tua, Agus
Syariyanto dan Wong Wan Jin, kedua kakak serta adik atas doa dan dukungannya
selama studi. Terima kasih juga kepada Tami, Fitria, Bu Sussi, Pak Hadi, Yeni,
Qurrota A’yun, teman-teman di Sekolah Pascasarjana Bioteknologi angkatan 2012
serta rekan-rekan dari PT SMART Tbk atas dukungan dan bantuannya selama
penelitian studi S2 ini.
Penulis menyadari bahwa penelitian dan penyusunan tesis ini masih jauh dari
sempurna namun semoga hasil penelitian ini dapat bermanfaat.
Bogor, Mei 2016
Nuryanti Syariyanto
v
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vii
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Hipotesis
1
1
2
2
2
2
2 TINJAUAN PUSTAKA
Tanaman Kelapa Sawit
Kultur Jaringan Tanaman
Embriogenesis somatik
Gen-Gen Terkait Embriogenesis
Analisis Hasil Microarray dengan Bioinformatik
Perancangan Primer
Analisis Ekspresi Gen dengan qPCR
3
3
4
5
7
8
10
11
3 METODE
Bahan
Prosedur Kerja
Seleksi Gen menggunakan Pendekatan Bioinformatik
Isolasi RNA dan Sintesis cDNA Sampel
Perancangan, Optimasi, dan Validasi Primer
Pembuatan Standar qPCR
Seleksi Gen Pembanding
Analisis Ekspresi Gen dengan qPCR
14
14
15
15
16
16
17
17
17
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Seleksi Gen Embriogenesis dengan Pendekatan Bioinfromatik
Isolasi RNA dan Sintesis cDNA Sampel
Perancangan, Optimasi, dan Validasi Primer
Seleksi Gen Pembanding
Analisis Ekspresi Gen dengan qPCR
19
19
21
24
29
30
5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
38
38
38
DAFTAR PUSTAKA
39
LAMPIRAN
44
RIWAYAT HIDUP
55
vi
DAFTAR TABEL
1 Gen-gen yang up-regulated di embrio somatik kelapa sawit
(Budinarta et al. 2012)
2 Informasi asal tanaman dari sampel kalus dan embrio somatik
3 Kandidat gen embriogenesis somatik
4 Fungsi dari kandidat gen embriogenesis somatik
5 Konsentrasi, kemurnian, serta nilai intergritas RNA dari sampel
kalus dan embrio somatik pada ketiga tanaman kelapa sawit
6 Sekuen nukleotida dari primer gen pembanding (primer I)
7 Sekuen nukleotida dan hasil optimasi primer gen target (primer I)
8 Hasil BLASTN gen target dan pembanding primer I
9 Sekuen nukleotida dan hasil optimasi primer gen target (primer II)
Sekuen nukleotida primer gen pembanding (primer II)
Hasil BLASTN gen target dan pembanding primer set II
Hasil BLASTN dan BLASTX pada primer set II
Persamaan, nilai R2, dan persentase efisiensi dari masing-masing
kurva standar gen target dan gen pembanding
14 Nilai Cq pada LOD dan NTC dari masing-masing gen target dan
gen pembanding
10
11
12
13
9
14
19
19
22
24
24
25
26
27
28
28
31
32
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
Alur proses kultur jaringan tanaman kelapa sawit
Diagram skematik jalur pembentukan embrio somatik
Fase perkembangan embrio somatik dari kultur kelapa sawit
Gen-gen yang terlibat dalam proses embriogenesis somatik
Kurva amplifikasi pada qPCR
Efisiensi Amplifikasi PCR
Sampel kalus dan embrio somatik
Diagram alir kegiatan penelitian
Heat map dari 1.083 gen hasil seleksi microarray
Interaksi antar gen up-regulated dan down-regulated hasil analisis
dengan Cytoscape
RNA hasil isolasi dari kalus (C) dan embrio somatik (E) tanaman
kelapa sawit
Hasil analisis integritas RNA kalus
Hasil analisis integritas RNA embrio somatik
Hasil sintesis cDNA dari sampel kalus dan embrio somatik
Hasil optimasi primer set II yang tidak spesifik (terdapat dimer)
Hasil analisis Melt curve pada gen target dan gen pembanding
Hasil analisis Melt curve pada kelima gen pembanding
5
6
7
8
12
12
14
15
20
21
22
23
23
24
27
28
29
vii
18 Perbandingan nilai Cq dari ketiga gen (act3, 40s, dan sodm)
pembanding pada sampel kalus (Cal) dan embrio somatik (Emb)
19 Kurva standar dari masing-masing gen target
20 Pita hasil amplifikasi qPCR dari keempat gen target (palm 1)
21 Hasil analisis ekspresi gen sampel kalus dan embrio somatik
22 Jalur biosintesis auksin (Tryptophan-independent pathways)
23 Sistem ekspresi gen auksin dan gen 26S Proteasome (SCFTIR1)
24 Transport auksin pada tahap awal pembentukan embrio
Arabidopsis.
25 ABA-mediated abiotic stress response
26 Trehalose pathway in plants
30
31
32
33
34
34
35
36
37
DAFTAR LAMPIRAN
1 Data hasil pensejajaran sekuen cDNA hasil sekuensing dengan sekuen
cDNA masing-masing gen hasil design primer I
2 Data hasil pensejajaran sekuen cDNA hasil sekuensing dengan sekuen
cDNA masing-masing gen hasil design primer II
3 Hasil analsis qPCR dari keempat kandidat gen embriogenesis
4 Hasil analisis Statistik: One-way Anova dan Dunnett t-tests dari gen
E. guineensis IAA-amino acid hydrolase ILR1-like 1 (ilr1)
5 Hasil analisis Statistik: One-way Anova dan Dunnett t-tests dari gen
E. guineensis Late embryogenesis abundant (lea2)
44
50
52
53
54
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kelapa sawit merupakan tanaman yang paling produktif dalam menghasilkan
minyak nabati (±4 ton ha-1 tahun-1) dibandingkan dengan tanaman lainnya seperti
kanola, bunga matahari, dan kedelai (