Konstruksi vektor ekspresi gen untuk mengeliminasi gen penyeleksi antibiotik pada tanaman padi (Oryza sativa L.)Transgenik

KONSTRUKSI VEKTOR EKSPRESI GEN UNWK
MENGELIMINASI GEN PENYELEKSI ANTIBIOTIK PADA
TANAMAN PAD1 (Ovza sativa L.) TRANSGENIK

AGUS RACHMAT

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Konstruksi Vektor Ekspresi
Gen untuk Mengeliminasi Gen Penyeleksi Antibiotik pada Tanaman Padi (@a
sativa L.) Transgenik adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk
apapun kepada perguruan tinggi manapun. Surnber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain
telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian
akhir tesis ini.
Bogor, Mei 2006

Agus Rachmat
NIM G351020101

ABSTRAK
AGUS RACHMAT. Konstruksi Vektor
Ekspresi Gen untuk Mengeliminasi
Gen Penyeleksi Antibiotik pada Tanaman Padi (Oryza sativa L.) Transgenik.
Dibimbing oleh SUHARSONO dan INEZ H.S. LOEDIN.
Gen penanda seleksi diperlukan untuk proses seleksi tanaman transgenik,
tetapi tidak diperlukan setelah tanaman transgenik d i i i l k a n . E l i i i gen ini
dapat dilakukan dengan memisahkan gen ini dari gen sasaran pada saat integrasi
ke dalam genom tanaman. Penelitian ini bertujuan untuk mengkonstruksi vektor
ekspresi gen yang dapat mengeliiasi gen penanda seleksi resistensi terhadap
antibiotika pada tanaman padi transgenik. Ada dua pendekatan yang dilakukan
pertama dengan menggunakan double T-DNA dalam satu vektor biner clan kedua
menggunakan dua hang yang membawa gen sasaran dan gen penanda seleksi
secara terpisah. Vektor biner dengan double T-DNA yang masing-masing
mengandung gen cryIAb dan gen hpt (p2TDNAqIAb), dan vektor b i e r yang
mengandung gen penyandi biosintesis asam salisilat (pC12SA) dan vektor biner

lain yang membawa gen hpt (pC1300 hpt intron) telah berhasil dikonstruksi.
Vektor-vektor ini telah digunakan untuk melakukan transformasi genetik kalus
melalui A. tumefaciens. Transformasi genetik kalus menghasilkan 16 tanaman
transgenik yang te&
dari 1 tanaman transgenik yang ditransformasi dengan
p2TDNAcryIAb, 10 tanaman transgenik hasil transformasi dengan pC12SA) dan
pC1300 hpt intron), dan 5 tanaman trausgenik yang ditransformasi dengan
pC1300 hpt intron sebagai kontrol. Hasil analisis tanaman transgenik dengan
PCR menunjukan bahwa kedua T-DNA pada plasmid (p2TDNAcTyIAb) dan
plasmid pC12SA telah terintegrasi ke dalam genom tanaman. Perlu dilakukan
analisis lebih lanjut untuk melihat pola integrasi gen dalam genom tanaman dan
pola segregasi pada keturunan berikutnya .

ABSTRACT
AGUS RACHMAT. Construction of Gene Expression Vector for Selectable
Marker Gene Elimination in Rice (Oryza saliva L.) Transgenic Plant. Under the
direction of SUHARSONO and INEZ H.S. LOEDIN.
Selectable marker genes are widely used for the efficient transformation
of crop plant, but they are not required after transgenic plants were produced.
Transformation technic using double T-DNA has been developed to facilitate the

removal of the marker gene from plant genome after selection. The aim of reseach
was to contruct a gene expression vector for gene elimination of antibiotic
resistance gene in transgenic rice plant. In this system a marker gene and gene of
interest were placed on separate T-DNA molecules. Two approaches were
performed. The first was by the construction of a binary vectors containing two
separate T-DNA's. The vector that carried two separate T-DNAs was
constructed, one T-DNA contained a drug resistance, selection marker gene (hpt)
and the other contained gene of interest cryIAb gene (p2TDNArryIAb). The
second approach was the construction of 2 binary vectors for co-transformation,
one containing the selectable marker hpt gene (pC!300 hpt intron) the other
containing the genes responsible for salycilic acid biosynthesis, pmsB and entC
(pC12SA). These vectors were used to carry out rice genetic transformation by A.
tumefaciens. Transformation with p2TDNAcryIAb resulted in 1 transgenic plant
having the crylAb and hpt selectable marker genes, co-transformation with two
separate binary vectors (pC1300 hpt inhon and pC12SA) resulted in 10 transgenic
plants containing hpt and pmsB genes, and transformation with pC1300 hpt intron
as control resulted in 5 transgenic plants. The results indicated that the two TDNAs in Jectdr p2TDNAcryIAb weik inserted into the rice genbme. Further
experiments need to be perfomed to analyze the integration pattern of the two TDNA's and their segregation in the next generation.

KONSTRUKSI VEKTOR EKSPRESI GEN UNTUK

MENGELIMINASI GEN PENYELEKSI ANTIBIOTIK PADA
TANAMAN PAD1 (Oryza sativa L.) TRANSGENIK

AGUS RACHMAT

Tesis
sebagai salah satui syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Biologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006

Nama
NIM

: Konstruksi Vektor Ekspresi Gen untuk Mengeliminasi
Gen Penyeleksi Antibiotik pada Tanarnan Padi (Oryza

sativa L.) Transgenik
: Agus Rachrnat
: G351020101

Disetujui
Komisi Pembimbing

Dr. 1 d z H. Slamet-Loedin
Anggota

Dr. Suharsono. DEA
Ketua

Diketahui

Ketua Program Studi Biologi

Dr. Dedi Duryadi, DEA

Tanggal Ujian : 2 2 MAR 2006

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT, karena atas berkah
dan izin-Nya penulis mampu menyelesaikan penelitian dan penulisan tesis
Ekspresi Gen untuk Mengeliminasi Gen
dengan judul Konstruksi Vektor
Penyeleksi Antibiotik pada Tanaman Padi (Oryza sativa L.) Transgenik.
Selesainya pendidikan dan penelitian ini tidak luput dari bantuan dan
dukungan berbagai pihak. Oleh karena itu pada kesempatan ini penulis
mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Dr. Suharsono, DEA
clan Dr. Inez H. Slamet-Loedin sebagai pembimbing yang selalu mendorong dan
menuntuk dapat menyelesiakan penelitian ini, Ketua Program Studi
Biologi beserta staf, Direktur Program Pascasarjana IF'B beserta staf yang telah
memberikan pelayanan selama penulis menempuh p e n d i d h , Kepala Puslit
Bioteknologi LIP1 dan staf yang telah memberikan izin belajar dan penggunaan
fasilitas penelitian. Kepada Dr. Inez H. Slamet-bedin dan Sigit Purwantomo
penulis mengucapkan terimakasih atas masukan serta bantuan dana yang sangat
berarti melalui RUT XII. Penulis juga berterimakasih kepada Wulansih Dwi
Astuti, keluarga Sasmita, rekan-rekan mahasiswa Pascasarjana khususnya
Program Strldi Biologi 2002, rekan-rekan di Lab. Biologi Molekuler Tanaman

Padi dan Rumah Kaca Bioteknologi LIP1 dan semua pihak atas bantuan yang
diberikan &lam pelaksanaan penelitian dan penyusunan tesis. Kepada Ibunda
R. Hj Djulaeha dan keluarga yang telah mendampingi dengan doa, kesabaran dan
ketulusan sampai detik ini penulis mengucapkan terimakasih.
Semoga Allah SWT senantiasa memberikan limpahan taufik dan
hidayah-Nya atas segala kebaikan yang diberikan dan mohon maaf atas segala
kesalahan. Akhir kata semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi dunia ilmu
pengetahuan.
Bogor, Mei 2006

Anus Rachmat

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bogor, Jawa Barat pada tanggal 26 Agustus 1970
merupakan putra ke enam dari delapan bersaudara dari pasangan Bapak
H. E. Padma (alm) dan Ibu R. Hj. Djulaeha.
Penulis menyelesaikan pendidikan formal di SD Negeri 1 Jonggol, S M P
Negeri 1 Jonggol dan SMA Negeri 1 Bekasi. Pada tahun 1995 penulis
memperoleh gelar Sarjana Biologi dari Universitas Andalas Padang. Pada tahun
2002 penulis diterima sebagai mahasiswa pada Program Studi Biologi, Program

Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Sejak tahun 1996 sampai sekarang penulis
bekerja di Pusat Penelitian Bioteknologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia.

DAFTAR IS1
Halaman

...............................................................................................ix
DAFTAR GAMBAR ...........................................................................................x
DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... xi
PENDAHULUAN .............................................................................................
1
Latar Belakang ................................................................................................ 1

DAFTAR TABEL

Tujuan

..............................................................................................................

4

TINJAUAN PUSTAKA .....................................................................................
DNA Vektor (DNA Pembawa) .....................................................................
Konstruksi DNA Rekombiian ......................................................................
Gen Penyandi Higromisin Fosfotransferase ................................................
Strategi Eliminasi Gen Penyeleksi Antibiotik ...............................................
Gen Penyandi Biosintesis Asam Salisilat ....................................................
Gen cry Penyandi 6 Endotoksin .................................................................
Transfomasi Genetik Tanaman Padi melalui Agrobacterium......................
Regenerasi in vitro Tanaman Padi .................................................................
Analisis PCR ..................................................................................................

5
5
6
8
9
11
12
15

19
20

BAHAN DAN METODE .................................................................................
Waktu dan Tempat ........................................................................................
Bahan ...........................................................................................................
Metodologi ...................................................................................................
Konstruksi Vektor yang Mengandung Double T-DNA ................................
Konstruksi Vektor di Dua Inang yang Berbeda ...........................................
KO-kultivasi dan Kultur Tanaman ................................................................
Analisis Tanaman Transgenik .....................................................................

22
22
22
23
25
25
29
31

HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................................
Konstruksi Plasmid DoubleT-DNA ...........................................................
Kontruksi Plasmid Dtla T-DNA Berbeda Inang............................................
Transformasi dan Regenerasi Tanarnan .......................................................
Analisis PCR Tanaman Transgenik ...........................................................

33
33
35

38
40

KESIMF'UCAN DAN SARAN .................................................................... 43
Kesimpulan ..................................................................................................... 43
Saran ...............................................................................:................................. 43
DAFTAR PUSTAKA

........................................................................................ 44

DAFTAR TABEL
Halaman

.......................................

1

Jumlah koloni E. coli hasil transformasi

2

Hasil transformasi tanaman .............................................

..

33
40

DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Proses transfer T-DNA dari Agrobacterium tumefaciens ke dalam
sel tanaman .............................................................................................. 17
2 Plasmid pCAMBIA

..................................................................................

3 Konstruksi vektor ekspresi untuk eliminasi penanda seleksi
dengan double T-DNA ................................................................................

4 Lokasi kaset cryIAb dan hpt intron pa& T-DNA

.......................................

22
24
25

5 Konstruksi vektor ekspresi untuk eliminasi penanda seleksi
melalui dua inang ...................................................................................... 26
6 LokasipmsB dan gen e n s pada T-DNA dari plasmid pC12SA

................ 27

7 Hasil elektroforesis p2TDNA yang dipotong dengan
Ncol dan BglII dan utuh ..............................................................................

33

8 Hasil elektroforesis h g m e n cryIAb dengan
enzim restriksi H i n m ................................................................................. 34
9 Hasil elektroforesis h g m e n cryIAb (lajur 1) pemotongan
p2T-DNA cryIAb dengan enzim restriksi H i d 1 1 ........................................ 34

10 Hasil elektroforesis pSA yang dipotong dengan
enzim restriksi XbaI; XbaI & EcoRI ....................................................... 36
11 Hasil elektroforesis pC12hpt yang mengandung
genpmsB yang dipotong dengan XbaI & EcoRl ....................................... 36
12 Hasil elektroforesis DNA pC12hptSA yang dipotong
dengan enzim XbaI dan EcoRI ...................................................................

37

13 Hasil elektroforesis gen penyandi biosintesis asam
salisilat yang dipotong dengan EcoRl ...................................................... 37
14 Planlet yang ditanam pada media MS yang mengandung higromisin ....... 39

15 Hasil analisis PCR gen hpt

........................................................................

40

...................................................................

41

16 Hasil analisis PCR gen cryIAb
17 Hasil analisis PCR gen pmsB

....................................................................

42

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1. Media untuk ko-kultivasi dan regenerasi ................................................... 49
2. Media untuk pertumbuhan bakteri ............................................................... 50
3.Isolasi DNA dengan metode CTAB ............................................................ 5 1

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Padi merupakan komoditas pertanian yang banyak diusahakan oleh petani
di dunia. Bagi sebagian besar petani, padi mempakan pilihan utama untuk
diusahakan dalam upaya memenuhi kebutuhan pangan. Sejalan dengan makin
bertambahnya jurnlah penduduk, permintaan terhadap beras pun semakin
meningkat. Pada akhir-akhir ini produksi beras nasional mengalami p e n m a n
yang sangat berarti. Pada tahun 2000 produksi beras Indonesia sebesar 32.8 juta
ton sedangkan pada tahm 2001 produksi berm Indonesia sebesar 31.7 juta ton
(BPS & Ditjen BPTP 2002).
Konsep penggunaan Agrobacterium tumefaciem sebagai vektor untuk
merakit tanaman transgenik mempunyai prospek dan harapan. Beberapa tanaman
agronomi dan holtikultura yang memiliki nilai penting secara rutin ditransformasi
menggunakan bakteri hi. Sistem transformasi dengan Agrobacterium secara luas
telah digunakan untuk introduksi gen asing kedalam genom tanaman (Gelvin SB
1998). Introduksi gen asing ke dalam sel tanaman melalui proses transformasi
merupakan ide dari perakitan tanaman transgenik.
Keberadaan gen penyeleksi antibiotik atau resistensi herbisida yang
kondisinya terus menerus diekspresikan telah menimbulkan beberapa masalah
(Granger 2002). Pertama, munculnya kekhawatiran publik tentang terjadinya
resistensi dari organisme penggangu. Hal ini terjadi karena produk yang
diekspresikan terus menerus dapat berfungsi sebagai agen seleksi sehingga dapat
meningkatkan ketahanan bakteri terhadap antibiotik tertentu (dari penggunaan gen
penyeleksi antibiotik) dan gulma terhadap herbisida tertentu (dari penggunaan gen
penyeleksi herbisida). Kedua, ekpresi gen penyeleksi yang terus menerus mungkin
dapat mengganggu produksi karena surnber asam amino dipakai untuk
menghasilkan protein yang disandi oleh gen penyeleksi. Ketiga, keterbatasan agen
seleksi pada sistem seleksi yang efektif menjadi hambatan jika akan dilakukan
penyisipan gen

lain dengan menggunakan gen seleksi sebagai penanda

seleksinya. Adanya sistem seleksi positif, misalnya dengan menggunakan manosa
sebagai agen penyeleksi (Lucca et al. 2001) telah memberikan suatu pilihan
pengalihan penggunaan senyawa antibiotik dalam sistem seleksi.

Gen penyeleksi antibiotik selalu digunakan dalam sistim transformasi,
tetapi gen tersebut biasanya tidak dibutuhkan apabila tanaman transgenik telah
dihasilkan Gen penyeleksi antibiotik pada tanaman transgenik yang telah didapat
bukan hanya tidak dibutuhkan lagi, tetapi juga dapat menimbulkan masalah baru.
Sebagai contoh, gen resistensi antibiotik yang berbeda hams digunakan bila a&
penambahan gen wing ke dalam tanaman transgenik, tetapi sejumlah gen
penyeleksi antibiotik yang ada terbatas. Keamanan dari gen penyeleksi antibiotik
me~pakaIlmasalah dalam pemasaran produk rekayasa genetik.
Keberadaan gen penyeleksi antibiotik pada tanaman transgenik telah
menimbulkan keberatan antara lain berupa kekhawatiran terjadinya transfer gen
tersebut ke milcroorganisme dan kemunglunan terganggunya ekspresi gen yang
memillki peran penting, serta kesulitan untuk mengintroduksi gen lain karena
terbatasnya gen penyeleksi antibiotik yang dapat digunakan. Gen penyeleksi
dapat dieliminasi

dari tanaman transgenik

melalui seleksi pada generasi

berikutnya setelah proses segregasi. Gen penyeleksi &pat berpisah dari gen
sasaran bila kedua gen tersebut terletak pada kromosom yang berbeda atau

keduanya bebas. Terdapat beberapa metode yang dapat mengeliminasi keberadaan
gen penyeleksi antibiotik, antara lain melalui, ko-transfonnasi baik dengan
particle

bombardment

maupun dengan double T-DNA, site-specrfc

recombination (Mom & Hooykaas 1992, Zuo JR

et al. 2001), dan inm-

genomic translocation via transposable elements (Cotsafis et al. 2002). Pada

sistem ketransformasi, gen sasaran dipisahkan dari gen penyeleksi antibiotik.
Teknik ini dapat menjadi suatu teknik generik yang dapat diterapkan untuk semua
sistem transformasi tanaman dalam mengeliminasi gen penyeleksi antibiotik.
Secara alami, beberapa isolat Agrobacterium memiliki lebih dari satu T-DNA,
dan tumor crown gall seringkali disebabkan karena ko-transformasi oleh beberapa
T-DNA (Hooykaas & Schilperoort 1992).
Selain gen sasaran yang diintroduksikan, T-DNA tidak mengintroduksi
DNA lain kecuali right border dan leji border dari Agrobacterium itu sendiri ke

dalam genom. Teknik ini dapat menjadi suatu teknik generik yang &pat
diterapkan untuk semua sistem transformasi tanaman dalam mengeliminasi gen
penyeleksi antibiotik. KO-transformasi menggunakan double T-DNA dilakukan

dengan memisahkan gen sasaran dan gen penyeleksi antibiotik pada T-DNA yang
berbeda. T-DNA adalah daerah DNA yang akan ditransfer dan telah diketahui
dibatasi oleh 25 pasangan basa pada masing-masing ujungnya yang dikenal
sebagai batas kiri (leji border) dan batas kanan (right border) (Hooykaas &
Schilperoort 1992). KO-transformasi dengan menggunakan Agrobacterium
melalui double T-DNA memungkinkan dihasilkannya tanaman transgenik tanpa
gen penyeleksi antibiotik setelah segregasi (Komari et al. 1996; Matthews et al.
2001; Zhou et al. 2003). Kegiatan transformasi gen melalui perantara alami
Agrobacterium tumefaciens telah menjadi kegiatan rutin pada banyak
laboratorium di Indonesia. Akan tetapi tanaman transgenik yang dihasilkan dari
sistem transformasi ini akan selalu mengandung gen penyeleksi antibiotik.
Introduksi gen asing kedalam tanaman tingkat tingg menggunakan teknik
Agrobacterium tumefaciens merupakan teknik yang sering digunakan &lam
biofogi molekuler dan rekayasa genetik tanaman. Walaupun metode ini pada
awalnya digunakan pada

tanaman dikotiledon, tetapi

sekarang telah

dikembangkan pada beberapa tanaman sereal seperti padi, jagung (Hiei et al.
1994). Salah satu keuntungan transfer gen dengan A. tumefaciens adalah efisiensi
transformasi yang tinggi.
Pada penelitian ini strategi yang dilakukan untuk mengintegrasikan gen
penyeleksi yang dapat bersegregasi dengan gen sasaran adalah: 1 ) double
T-DNA yang masing-masing membawa gen penyeleksi dan gen sasaran secara
terpisah, dan gen sasaran yang digunakan adalah gen cryIAb. 2 ) Dua T-DNA
berbeda inang, T-DNA yang satu membawa gen penyeleksi dan T-DNA lainnya
membawa gen sasaran pada masing-masing plasmid Gen sasaran yang digunakan
adalah gen penyandi asam salisilat yang dibawa oleh plasmid pCambia 1200 yang
telah dibuang gen penyeleksinya. Asam salisilat dipilih karena memililu potensi
dapat mempertinggi ketahanan tanaman terhadap stres biotik maupun abiotik.
Asam salisilat secara alami terdapat dalam tanaman dan terlibat dalam
beberapa fungsi fisiologis, seperti pembukaan stomata, induksi pembungaan, dan
memiliki peran penting &lam

mengatasi serangan patogen (Verbeme et al.

2000). Penelitian yang dilakukan Verbeme et al. (2000)pada tanaman tembakau
menunjukan bahwa gen-gen peningkat ekspresi asam salisilat (genpmsB clan gen

enC) yang berhasil disisipkan temyata dapat meningkatkan daya resistensi

tanaman tersebut terhadap patogen, namun tidak mempengamhi fenotip tanaman
tersebut. Kandungan asam salisilat pada tanaman padi berkorelasi positif dengan
tingkat ketahanan padi terhadap Pyricularia grisea (Silverman et al. 1995). Gengen yang bertanggung jawab dalam biosintesis asam salisilat dihasilkan oleh
Pseudomonm fluorescens (gen pmsB) dan Escherichia coli (gen enlC). Gen-gen

tersebut terlibat dalam jalur biosintesis asam salisilat yang dimulai dari
isochorismate sinthase oleh gen entC dan isochorismate pyruvate lyase oleh gen
pmsB untuk meningkatkan resistensi terhadap penyakit yang disebabkan oleh

cendawan (Mercado et al. 1989).
Penggerek batang m e ~ p d c a nsalah satu hama utama tanaman padi yang
kuantitas serangannya semakin meningkat. Penggerek batang me~p&aIIsalah
satu hama utama padi di Asia yang mengakibatkan kehilangan produksi sebesar
5 1 0 % (Pathak & Khan 1994) bahkan sampai 60-95% (Wunn et al. 1996).
Penanganan hama penggerek batang sampai saat ini masih tergantung pada
penggunaan pestisida. Gen cry adalah penyandi protein aktif anti serangga yang
diisolasi dari BaciIlw thuringiemis, yaitu bakteri yang menghasilkan suatu kristal
protein yang bersifat racun jika terhidrolisis dalam jaringan usus serangga
(Dekeyser et al. 1990). Ekspresi gen yang diisolasi dari B. thuringiensis ini pada
kultivar IR58 dan Basmati dapat meningkatkan ketahanan terhadap penggerek
batang kuning dan bergaris (Wunn et d.1996; Nayak et al. 1997). Wunn et al.
(1996) melaporkan tanaman padi yang mengekspresikan gen cyMb dapat
meningkatkan ketahanan terhadap hama penggerek batang sampai 100%.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mengkonsbuksi vektor ekspresi gen yang

dapat mengeliminasi gen penyeleksi antibiotik dengan menggunakan Olyza sativa
sebagai tanaman model.

TINJAUAN PUSTAKA
DNA Vektor (DNA Pembawa)
Vektor DNA adalah molekul DNA yang dipergunakan untuk untuk
membawa dan memperbanyak fragmen DNA yang dibawanya. Vektor hams
mampu mengadakan replikasi dalam sel inang sehingga banyak salinan molekul
DNA yang dihasilkan. Vektor yang sering digunakan adalah plasmid bakteri.
Plasmid adalah bahan genetik ektrakromosom yang diwariskan secara tetap.
Ciri-ciri plasmid antara lain berukuran kecil dan hanya mengandung beberapa
gen, pembawa informasi genetika, terlepas dari DNA kromosom atau kadangkadang &pat terintegrasi dengan DNA kromosom dan dapat diisolasi dengan
mudah dari sel bakteri (Lehninger 1994).

Pada penelitian ini digunakan vektor pCambia 1300 dan pCambia 1200,
yang memiliki beberapa kelebihan seperti memiliki multple cloning site (MCS),
bersifat stabil di Agrobacterium, ukurannya relatif kecil dan jumlah salinannya
tinggi dalam E coli. pCambia memiliki pBR322 origin of replication untuk
replikasi dalam E coli clan Agrobacterium, pBR322 mob site untuk mobilisasi
dari E. coli ke Agrobacterium, membawa gen hpr penyandi ketahnan terhadap
higromisin, gen nptll untuk ketahanan terhadap kanamisin, gen gusA serta &pat
diuji dengan seleksi biru putih karena membawa gen lacZ(Brown 1996).
T-DNA yang ada di dalam vektor pCambia mengandung gen nptZI, gen
hpt dan gen gusA. Gen nprII penyandi enzim neomycin phosphotransfrase yang

digunakan sebagai penyeleksi pada bakteri. Enzim tersebut mendetoksifikasi
senyawa aminoglukosida

melalui fosforilasi. Gen hpt menyandikan enzim

hygromycin phosphotranferase

yang digunakan sebagai penyeleksi untuk

mengetahui terintegrasinya T-DNA Agrobacrer~um ke dalam genom tanaman,
sehingga hanya tanaman transgenik yang dapat hidup di media tumbuh yang
mengandung antibiotik higromisin. Gen hpt umum digunakan untuk transformasi
genetika sel tumbuhan karena antibiotik higromisin pada konsentrasi tertentu
mampu menekan pertumbuhan sel tersbut (Christou et al. 1991).
Beberapa jenis vektor &pat digunakan sebagai vektor rekombinan
diantaranya: 1) Plasmid yaitu molekul DNA yang mampu bereplikasi dalam

sitoplasma bakteri secara bebas. Plasmid juga membawa gen-gen ketahanan
terhadap antibiotik yang berguna sebagai penyeleksi sel-sel bakteri yang
mengandung plasmid rekombinan, 2) Virus atau bacteriofage DNA yang &pat
membawa DNA sisipan sekitar 15 kb, 3) Cosmid yaitu DNA plasmid yang juga
memiliki situs kohesif dari fage. Cosmid memiliki satu atau lebih gen penyeleksi
antibiotik dan membawa sisi cos dari fage A. Cosmid dapat membawa DNA
sisipan relatif besar (40-45 kb), 4) Shuttle vector ialah molekul DNA yang
mampu bereplikasi di dalam dua jensi sel berbeda atau lebih. Beberapa jenis
shuttle vector yang banyak digunakan adalah molekul DNA yang mampu
bereplikasi dalam sitoplasma bakteri atau khamir (Kleinsmith & Kish 1995).
Plasmid dapat diklasifikasikan berdasarkan sifat-sifat utama yang disandi
oleh gen-gen dalam plasmid. Klasifikasi tersebut adalah: 1) plasmid fertilitas
atau plamid F yang hanya membawa gen tra untuk melakukan transfer plasmid
dengan cam konjugasi, 2) plasmid resistensi atau plasmid R, membawa gen yang
menyebabkan resistensi tuan rumah terhadap satu atau lebih gen antibakteri, 3)
plasmid col, mengkode kolisin, protein yang dapat membunuh bakteri lain, 4)
plasmid degadatif memungkinkan bakteri untuk mengadakan metabolisme
molekul yang tidak biasa seperti toluen, dan 5) plasmid virulensi, menyebabkan
patogenitas pada bakteri inang, misalnya plasmid Ti pada Agrobacterium yang
menimbulkan penyakit crown gall pada tanaman dikotil (Brown 1991).
Konstruksi DNA Rekombinan
Teknik DNA rekombinan m e ~ p a k a nteknik pembentukan kombinasi

baru dan DNA dengan cara melakukan penylsipan molekul-molekul DNA yang
dikerjakan di luar sel dalam suatu vektor dan dintroduksikan ke dalam sel inang
sehingga

berkembang biak dalam sel

inang tersebut. Teknologi DNA

rekombinan atau rekayasa genetika pada intinya adalah proses kloning gen
(Davis et a[. 1995; Freifelder 1995). Gen merupakan sekuen nukleotida yang
menyandi RNA yang dibatasi oleh promoter dan terminator. Teknologi DNA
rekombinan memungkinkan sejumlah gen dari sumber berbeda disatukan untuk
membentuk DNA

rekombinan weinsmith & Kish 1995). Tahapan dalam

kloning gen meliputi : penyisipan fragmen DNA yang mengandung gen target ke

dalam molekul DNA vektor, vektor rekombinan dimasukan kedalam sel inang,
vektor dalam sel inang diperbanyak seiring dengan pembelahan sel inang dan
sekaligus memperbanyak gen yang dibawa.
Komponen penting dalam

rekombinasi DNA adalah enzim-enzim

manipulasi DNA serta QNA vektor. Brown (1991) membagi enzim manipulasi
berdasarkan jenis dan reaksi yang dikatalisnya menjadi lima golongan yaitu: a)
nuklease yaitu enzim yang mampu memotong molekul asam nukleat, b) ligase
adalah enzim yang berfhgsi menyatukan molekul asam nukleat, c) polimerase
adalah enzim yang &pat mensintesis DNA, d) enzim modifikasi yang mampu
mengh~langkan atau menambahkan gugus kimia, dan e) topoisomerase adalah
enzim yang mengubah DNA tertutup secara kovalen menjadi DNA supercoil.
Pa& kegiatan pengklonan gen hanya dua jenis enzim yang berperan yaitu enzim
restriksi endonuklease clan enzim ligase. Enzim yang mampu memotong ruas
DNA secara tepat dan konsisten digolongkan kedalam tipe 11 endonuklease
restriksi. Enzim ini mendegradasi DNA dengan memecah ikatan posfodiester
yang menghubungkan satu nukleotida dengan nukleotida lainnya pada untaian
DNA.
Salah satu komponen yang diperlukan dalam teknologi DNA rekombinan
adalah adanya vektor DNA, yaitu molekul

DNA yang

diperlukan untuk

membawa dan memperbanyak fragmen DNA. Vektor yang sering dipergunakan
adalah plasmid bakteri yang merupakan materi genetik ekstra luomosom yang
diwariskan secara tetap. Plasmid yang dipergunakan sebagai vektor sebaiknya
berukuran kecil dan terbesar adalah 15 kb. Ukuran kecil sangat penting agar
dapat memuat fragmen DNA asing yang besar, mudah dikenali dengan peta
restriksi, dan menghasilkan jumlah salinan relatif lebih banyak dibandingkan
dengan yang berukuran besar (Sambrook 1989).
Plasmid yang digunakan untuk rekombinasi DNA

berukuran antara

1.0-250 kb. Plasmid yang berukuran besar biasanya mempunyai jumlah salinan

yang rendah yaitu 1-2 salinan per sel. Sebaliknya plasmid yang berukuran kecil
mempunyai jumlah salinan tinggi, jumlahnya dapat mencapai 100 salinan per sel
(Brown 1991).

Gen Penyandi Higromisin Fosfotransferase

Modifikasi tanaman secara potensid memberikan peningkatan substansid
dalam praktek pertanian, kualitas makanan dan kesehatan manusia Kesuksesan
ha1 ini tergantung pada kemampuan mengintegrasikan gen asing ke tanaman inang

dan efisiensi regenerasi dari sel-sel tertransformasi. Efisiensi transformasi yang
rendah memerlukan gen marker penyeleksi untuk mengidentifikasi tanaman
transgenik (Hare 2002). Penggunaan gen marker dalam proses transformasi

bertujuan memberikan keuntungan selektif untuk sel-sel tertransfonnasi, sehingga
mereka tumbuh lebih cepat dan lebih baik serta membunuh sel-sel non
transforman (Brasileiro & Aragao 2001)
Efektifitas sistem ketahanan terhadap antibiotik tergantung temtama pada
bahan seleksinya (selective agent) yang harus sepenuhnya menghambat
pertumbuhan sel-sel yang tidak tertransformasi. Konsentrasi terendah dari bahan
toksik hams &pat menekan pertumbuhan sel-sel non transforman, akan tetapi
tidak memberikan efek yang merusak pa& sel-sel yang tertransformasi
(Rodriguez & Nottemburg 2002)
Gen-gen ketahanan terhadap antibiotik sebagai marka penyeleksi yang

umum digunakan adalah neomicin fosfotransfm I1 (nptIl) dan higromisin
fosfotransfm (hpt). Higromisin umumnya lebih toksik dibandingkan kanarnisin

dan membunuh sel-sel sensitif lebih cepat (Rodriguez dan Notternburg 2002) dan
me~pakanpenyeleksi yang lebih disukai untuk transformasi pada tanaman
monokotiledon terutama gramineae (Bashir et a[. 2004).Higromisin merupakan
antibiotik aminoglikosida yang diproduksi oleh Streptomyces hygroscopicus dan
mempakan sistem marker penyeleksi yang sesuai untuk sistem tanaman dan
hewan. Antibiotik ini menghambat sintesis protein dengan cara mengganggu
translokasi dan menyebabkan kesalahan translasi pada ribosom 80s (Bashir et al.
2004).
Gen penyandi higromisin fosfotransferase (hpt) juga dikenal sebagai
aminoglykosida 4
atau aphW

- fosfotransferase (APH 4) dan dinotasikan dengan hp!,

hph

(Rodriguez dan Notternburg 2002). Enzim higromisin

fosfotransferase yang dihasilkan gen hpt, &pat mendetoksifikasi antibiotik
higromisin B (Rodriguez & Nottenburg 2002) dan mengkatalisis fosforilasi

kelompok hydroxyl &lam antibiotik higromisin sehingga membuatnya menjadi
tidak aktif (Brasileiro & Aragao 2001).
Strategi Eliminasi Gen Penyeleksi Antibiotik
KO-transformasi dengan double T-DNA
Keberadaan gen penyeleksi antibiotik pada tanaman transgenik telah
menimbulkan keberatan antara lain berupa kekhawatiran tejadinya transfer gen
tersebut ke mikroorganisme dan kemunglunan terganggunya ekspresi gen yang
memiliki peran penting, serta kesulitan untuk mengintroduksi gen lain. Terdapat
beberapa metode yang &pat mengeliminasi keberadaan gen penyeleksi antibiotik,
antara lain melalui, ko-transformasi baik dengan parficle bombardment maupun
dengan double T-DNA, site-specrfic recombination (Mow dan Hooykaas 1992,
Zuo JR et al. 2001), dan intra-genomic translocation via transposable elements
(Cotsafii et al. 2002). Pada sistem ko-transformasi, gen sasaran dipisahkan dari
gen penyeleksi antibiotik. Teknik ini dapat menjadi suatu teknik genenk yang

&pat diterapkan untuk semua sistem transformasi tanaman dalam mengeliminasi
gen penyeleksi antibiotik.
Strategi untuk mendapatkan tanaman transgenik yang hanya mengandung
gen sasaran tetapi tidak mengandung gen penyeleksi antibiotik dapat dilakukan
dengan teknik ko-transformasi. Ko-transformasi &pat diperoleh melalui kokultivasi dengan satu Agrobacterium yang membawa
mengandung

satu plasmid biner

gen penyeleksi dan gen sasaran pada T-DNA yang berbeda.

Depicker et a1 (1985) melakukan kokultivasi pada protoplas tembakau dengan
satu Agrobacterim strain C58 yang mengandung dua T-DNA (T-DNA alami
dan gen npt 11) pada plasmid Ti nopalin. Frekuensi kalus transforman dari basil

seleksi dengan antibiotik kanamisin (Km) adalah 11% dan hormone independent
growth (HN) 8 %. Frekuensi relatif ko-trasnsformasi Km adalah 67% dan HN
73%. Hasil ini mengindikasikan bahwa satu bakteriurn dapat mentrasfer dan
mengintegrasikan dua T-DNA sekaiigus dalam satu tahap infeksi.
Komari

et

a1 (1996) melakukan ko-kultivasi tembakau dan padi dengan

satu Agrobacterium strain LBA 4404 yang mengandung dua T-DNA (satu gen
nptII atau gen hpt sementara yang lain adalah gen p)pada vektor plasmid biner.
Dari hasil penelitian dihasilkan 109 tanaman tembakau dan 549 tanaman pad^

yang hidup pada media seleksi higromisin. Dari masing masing transforman
yang dihasilkan dari tanaman tembakau 54 dan dari tanaman padi 259
memperlihatkan positif p.Efisiensi trasnformasi adalah 50% untuk tanaman
tembakau dan 47 % untuk tanaman padi. Selanjumya dilakukan penyerbukan
sendiri secara acak, dm dari hasil segregasi gen ketahanan higromisin atau
kanarnisisn serta ekspresi p diamati pada k e t m a n berikumya. Anakan yang
hanya mengekpresikan gen p yaitu 56% (519) dari ko-transformasi tanaman
tembakau dan 65% (13120) dari hasil ko-transformasi tanaman padi. Hasil ini
mengindikasikan bahwa satu T-DNA yang hanya mengandung gen gus telah
terintegrasi sekurang-kurangnya kedalam satu lokus yang berbeda.
Ko-transformasi dengan dua Agrobacterium
Ko-tranforrnasi dilakukan

melalui

ko-kultivasi

Agrobacterium yang mengandung gen penyeleksi antibiotik
pada plasmid biner yang berbeda.

men-

dengan dua

dan gen s w a n

Tanaman transforman diseleksi dengan

penyeleksi antibiotik Untuk mendapatkan tanaman transgenik

yang tidak mengandung gen penyeleksi dilakukan segregasi dari ko-trasnsforman
dengan

teknik penyilangan Depicker (1985) melakukan ko-kultivasi pada

protoplas tembakau dengan dua Agrobacteriurn yang berbeda menggunakan
strain C58 yang mengandung nopalin plasmid Ti dengan wild T-DNA dan
plasmid vektor biner

dengan gen n p n . Frekuensi kalus transforman yang

mengandung ketahanan kanamisin adalah 20% dan HN (hormone independent
growth) 21%. Frekuensi relatif ko-transformasi sel-sel transforman Km dan HN
masing-masing adalah 43% dan 42%. Hasil ini menunjukan bahwa masingmasing sel tanaman mempunyai cukup sisi pelekatan untuk beberapa bakteri dan
transformasi satu sel tanaman oleh dua bakteri berbeda mewakili independent
event (kejadian bebas).
Mc Knight et al. (1987) melakukan kokultivasi daun tembakau dengan dua
strain Agrobacterium LBA4404 yang mengandung gen nos (novalin sintase) dan
gen nptII pada plasmid biner. Dari 16 tanaman yang diperoleh dengan
men-

seleksi kanamisin,

tiga mengandung nopaline. Efisiensi

transformasi ko-kultivasi adaiah 19%. Semua tanaman yang didapat dari kotransformasi disilang terhadap tanaman asli bersegregasi untuk kedua gen yang

mengindikasikan bahwa dua T-DNA berbeda terintegrasi ke &lam lokus yang
berbeda.
Daley et al. (1998) melakukan ko-kultivasi rapseed dan tembakau dengan
satu strain Agrobacterium yang mengandung gen nptII dan gen gus. Dari hail
seleksi dengan menggunakan kanamisin diperoleh 34 rapeseed dan 100 tanaman
tembakau yang dpat hidup, 21 dan 52 memperlihatkan aktivitas gus untuk
masing-masing. Frekuensi transfomasi rapeseed adalah 62 % dan tembakau 52
%. Ketunman dari penyerbukan sendiri hanya mengekpresikan satu transgen

yaitu 40% (8120) dari kotrasnsformasi rapeseed dan 58% (24141) untuk tanarnan
tembakau. Segregasi

nptII dan gen gus

setelah penyerbukan sendiri

mengindikasikan bahwa dua T-DNA berbeda terintegrasi kedalam lokus yang
berbeda
Gen Penyandi Biosintesis Asam Salisilat

Asam salisilat yang secara alami terdapat dalam tanaman terlibat dalam
beberapa fungsi fisiologis, seperti pembukaan stomata, induksi pembungaan, dan
memiliki peran penting dalam mengatasi serangan patogen (Verbeme et al.
2000). Penelitian Verbeme et al. (2000) pada tanaman tembakau menunjukkan
bahwa ekspresi gen-gen yang mendukung peningkatan ekspresi asam salisilat
(gen pmsB dan gen enC) dapat meningkatkan daya resistensi tanaman tersebut
terhadap patogen, namun tidak mempengamhi fenotip tanaman tersebut.
Kandungan asam salisilat pada tanaman padi berkorelasi positif dengan tingkat
ketahanan padi terhadap Pyricularia grisea (Silveman et al. 1995).
Jalur biosintesis asam salisilat dimulai dari substrat chorismic acid yang
dikatalis oleh enzirn isochorismate sinthare menjadi isochorismic yang diubah
oleh enzim isochorismatepruvate lyase menjadi asam salisilat. Gen penyandi
enzim isochorismate sinthase telah diisolasi dari Pseudomonas jluorescens dan
disebut dengan genpmsB. Dari Lscherichia coli telah diisolasi gen enC penyandi
enzim isochorismatepymate base (Mercado et al. 1989).
Penyakit blas
Penyakit blas yang disebabkan untuk cendawan P. olyrae merupakan
salah satu penyakit tanaman padi yang sangat merugikan. Cendawan ini

menyerang dan membentuk bercak pada daun, batang, malai, bunga dan biji.
Bercak pada pelepah daun jarang ditemukan. Bentuk khas bercak blas adalah elips
yang kedua ujungnya kurang lebih runcing. Bercak yang telah berkembang pada
bagian tepi bemama coklat dan bagian tengah benvama putih keabuan. Dalam
keadaan lembab bercak akan terus membesar terutama pada varietas peka (Amir
& Karden 1991). Pada varietas padi peka, bercak tersebut dapat meluas dan

bersatu sehingga akhimya helai dam mengering dan mati. Pada padi yang tahan,
gejala serangan hanya berupa bintik kecil b e m a coklat (Ou 1972).
Spora cendawan secara alami menyebar mulai tengah malam karena
adanya embun atau hujan. Penyebaran spora akan bertambah banyak sampai
menjelang pagi hari dan berakhir pada saat terbit matahari. Pelepasan spora di
daemh tropis dapat terjadi pula pada siang hari setelah turun hujan. Embun sangat

berpengaruh terhadap pelepasan spora dan infeksi. Jika periode embun lebih lama,
spora yang dilepaskan lebih banyak sehingga infeksi yang terjadi semakin parah

(IRRI 1975). Penyebaran spora dapat terjadi selain oleh embun atau hujan juga
oleh angin, biji dan jerami sakit. Cendawan P. orjnae dapat bertahan dalam sisa
jerami sakit dan gabah sakit selama lebih dari satu tahun pada suhu kamar.
Sedangkan dalam bentuk miselia mampu bertahan sampai lebih dari tiga tahun
(Amir & Karden 1991).
Gen cry, Penyandi 6 Endotoksin
Bacillus thuringiensis adalah bakteri tanah yang selama proses sporulasi

mampu membentuk laistal protein yang bersifat racun apabila terhidrolisis dalam
usus serangga.

Bakteri ini sudah digunakan lebih dari 50 tahun sebagai

insektisida biologi (Tu et a[. 2000). Tanaman transgenik menjadi tahan hama
karena adanya ekspresi endotoksin yang bersifat seperti insektisida (Insecticidal
CrystaI Protein

=

ICP) dari Bacillus thuringiensis (Bt toxin) dalam jaringan

tanaman (Nayak et al. 1997; Wu et al. 1997). Aktivitas insektisida Bt sangat
spesifik sehingga endotoksin tersebut tidak toksik untuk serangga non target,
burung dan mamalia (Tu et al. 2000).
Gen cry adalah penyandi protein aktif anti serangga

yang diisolasi dari

B. thuringiensis yaitu bakteri yang menghasilkan suatu kristal protein yang

bersifat racun jika terhidrolisis dalam jaringan usus serangga (Dekeyser et a1

1990). Gen cry &pat diklasifikasikan berdasarkan protein yang disandikan dan
spesifitasnya terhadap serangga yaitu bersifat racun cryI, cry11 cryIII cryIV cryV
dan

c f l . Protein yang disandikan oleh gen cry bersifat racun terhadap

serangga ordo Lepidoptera, Diptera dan Coleoptera (Toenniessen 1991) akan
tetapi aktivitas bioinsektisida Bt tidak toksik terhadap ordo homoptera (Rao et al.
1998).
Pada kondisi normal protein ini sulit larut, tetapi akan larut dalam pH
tinggi (diatas 9.5) yaitu kondisi yang biasa ditemukan pada usus tengah larva
lepidoptera. Karena itulah Bt merupakan bahan insektisida yang sangat spesifik.
Saat larut dalam usus serangga, protoksin dipecah oleh protease usus untuk
menghasilkan toksin aktif yang berukuran sekitar 60 kDa Toksin ini diistilahkan
sebagai Gendotoksin. Toksin tersebut berikatan dengan sel-sel epitelium usus,
membuat lubang-lubang (pori) pada sel membran dan menyebabkan
ketidakseimbangan ion. Sebagai akibatnya kerja usus terhenti dengan cepat, selsel epitelium lisis dan isi usus masuk dalam rongga tubuh.

Hal ini akhimya

mengakibatkan keracunan dan matinya larva (Anonim 2000). Penempelan racun

pada usus serangga memerlukan adanya reseptor untuk protein kristal spesifik
sehingga terjadi toksisitas, dan pada satu serangga mungkin saja terdapat reseptor
berbeda untuk protein kristal berbeda .
Kristal protein ini disandikan oleh gen cry. Gen q y yang telah berhasil
diidentifikasi adalah sebanyak lebih dari 140 gen dan telah diklasifikasi ulang
menjadi 24 kelompok utama (Criclanore et al. 1998). Toksin yang berbeda
mempunyai spesifitas yang berbeda untuk serangga yang berbeda. Cry 1 spesifik
untuk hama-hama dari ordo Lepidoptera, Cry 2 untuk Lepidoprera dan Diptera,
Cry 3 untuk Coleoptera dan Cry 4 untuk Diptera (Maqbool er al. 1998).
Beberapa peneliti telah melakukan introduksi gen cry ke dalam tanaman
padi. Gen crylAb dari Bacillus thuringiemis mampu meningkatkan ketahanan
padl kultivar Tarom molaii terhadap penggerek batang padi kuning dan bergaris
(Wu et al. 1997; Ghareyazie et a[. 1997). Nayak et al. (1997) telah mentransfer
gen cryIAc ke padi indica varietas IR64 dan dari hasil insect feeding assoy
menunjukkan bahwa galur transgenik mampu mengekspresikan toksin pa& level
yang mematikan larva penggerek batang padi kuning. Peneliti lain (Tu et al.

2000) menghasilkan galur padi transgenik yang mengandung h i gen crylAc dan
gen crylAb, dan menunjukkan ketahanan terhadap penggulung daun dan
penggerek batang kuning.

Penggerek batang
Penggerek batang merupakan salah satu hama utama tanaman padi yang

kuantitas serangan dari tahun ketahun semakin meningkat. Penggerek batang
merupakan salah satu hama utama padi di Asia yang mengakibatkan kehilangan
produksi sebesar 5-10% (Pathak & Khan 1994), bahkan bisa sampai 60-95%

(Wunn et al. 1996). Terdapat empat spesies penggerek batang padi

yaitu

penggerek batang kuning (Schirphopaga incertulas), penggerek batang putih
(Schirphopaga innotata), penggerek batang bergaris (Chilo supresalis) dan
penggerek batang merah jambu (Sesamia injerens). Tiga jenis pertama tergolong
famili Pyralidae dan yang terakhir

tergolong famili Noctuidae dan semua

termasuk ordo Lepidoptera. Di Indonesia, dari empat spesies yang ada, hanya dua
yang dominan

di daerah

produksi padi yaitu penggerek batang

kuning

(Schirphopaga incertulas), penggerek batang putih (Schirphopaga innotata)
W l i n et al. 1995; Soewito et al. 1995).
Penggerek batang padi menimbulkan gejala kerusakan melalui liang
gerek yang dibuat oleh larva sehingga dapat memutuskan transfort air dan unsur

hara dari akar. Kerusakan yang timbul tergantung pada fase pertumbuhan
tanaman. Jika serangan tejadi pada fase vegetatif maka dam tengah atau pucuk
tanaman mati karena titik tumbuhnya dimakan, gejda ini disebut sundep. jika
seranga tejadi pada fas generatif maka malai akan mati karena pangkalnya
dikerat oleh larva sehingga bulir padi menjadi hampa. Gejala serangan pada tahap
ini disebut beluk (Soewito et al. 1995).
Penanganan penggerek batang sampai saat ini masih tergantung pada
penggunaan pestisida. Teknik penyisipan gen asing untuk tujuan pemberian
ketahanan terhadap hama telah dikembangkan pada beberapa kultivar padi
Indonesia. Salah satu gen ketahanan yang berhasil disisipkan ke kultivar Rojolele
adalah ciyIAb penyandi ketahanan terhadap hama dari golongan Lepidoptera
melalui bombardment (Slamet-Loedin et al. 1998). Ekpresi gen yang diisolasi

dari B. thuringiensis pda kultivar IR58 dan Basmati dapat meningkatkan
ketahanan terhadap penggerek batang kuning dan bergaris (Wunn et al. 1996;
Nayak et al. 1997). Wunn et al. (1996) melaporkan bahwa hasil introduksi gen
cryIAb ke tanaman padi dapat menekan serangan hama penggerek batang

sampai 100%.

Transformasi Genetik Tanaman Padi melalui Agrobacterium
Kemampuan Agrobacterium untuk menjadi mesin genetik alami telah
dimanfaatkan sebagai alat genetik yang sangat penting. Kemampuan untuk
melakukan transformasi sel tanaman tersebut berhubungan dengan adanya
plasmid penginduksi tumor. Istilah tanaman transgenik dalam pengertian luas
dipakai untuk tanaman yang memiliki gen asing yang terintegrasi ke dalam genom
tanaman dan gen tersebut berfungsi (Uchimiya et al. 1989). Berbagai metode saat
ini telah dikembangkan dan digunakan untuk menghasilkan tanaman transgenik
baik melalui transformasi langsung maupun tidak langsung (Herman 1999).
Transformasi secara langsung antara lain dengan elektroporasi, fusi dengan PEG
@oliethylene glycol), mikro injeksi dan penembakan DNA. Transformasi gen
secara tidak langsung ialah melalui vektor A. tumefaciens.
Bakteri A. tumefaciens merupakan patogen tanaman. Secara alami melalui
mekanisme yang komplek, Agrobacterum mampu memindahkan suatu vektor
plasmid yaitu Ti (Tumor inducing) yang terdapat di dalam genom tanaman. Pada
plasrnid Ti terdapat bagian-bagian penting yang terkait dalam mekanisme transfer
gen. Bagian-bagian tersebut ialah daerah T-DNA dan daerah virulence (vir) pada
plasmid Ti. Gen target yang akan diintroduksikan ke dalam T-DNA untuk
selanjutnya dipindahkan ke dalam genom tanaman. Gen vir berperan penting
dalam rnekanisme pemindahan daerah T-DNA ke dalam genom tanaman. Selain
plasmid Ti, ada gen lain yang berperan dalam transfomasi yaitu gen cromosomal
virulence (chv). Gen-gen ini berperan dalam pelekatan bakteri ke dalam sel
tanaman (Sheng & Citovsky 1996). Mekanisme transfer DNA dari plasmid Ti ke

dalam genom tanaman disajikan pada gambar 2 (Gelvin 1993).
Salah satu ha1 penting

dalam keberhasilan

transformasi melalui

Agrobacterium adalah spesifikasi vektor yang dipergunakan. Sistem vektor

ganda (biner) me~pi3kancara yang umum dilakukan. Pada sistim vektor ganda
diperlukan dua plasmid dalam Agrobacterium. Plasmid tersebut adalah plasmid
vektor yang mengandung

fragmen DNA

dan plasmid helper

Ti yang

menyediakan gen vir sebagai fasilitator transfer gen ke dalam sel tanaman
(Slamet-Loedin

1994). Disamping itu efisiensi

Agrobacterium sangat dipengaruhi

dengan jenis
tanaman

transformasi

melalui

kesesuaian antara galur Agrobacteriwn

maupun varietas tanaman yang akan ditransformasi. Varietas

yang berbeda memiliki

respon berbeda

pula terhadap

galur

Agrobacterium yang dipakai &lam proses transformasi genetik.

Keberhasilan Hiei et al. (1994) mentrasnformasi tanaman padi dengan
A. tumefaciens menunjukan

keberhasilan

penerapan sistem

transformasi

A. tumefaciens pada monokotil. Secara alami bakteri patogen tanah ini hanya

menginfeksi tanaman dikotil dengan cara mengintroduksi T-DNA dari plasmid
Ti bakteri ke dalam inti sel tanaman (Smith & Hood 1995). Dong et al. (1996)
menggunakan A. tumefaciens LBA4404 dengan pTok 233 untuk transformasi padi
javanica kultivar Gulhont, tetapi efisiensi transformasinya masih sangat rendah.
Kemudian Rashid et al. (1996) berhasil mentransformasi tanaman padi IndicaIndia kultivar Basmati menggunakan A. tumefaciens EHA 101 dengan PIG 121

Hm. Diantara berbagai jenis tanaman pangan utama, padi m e ~ p a k a nspesies
pertama yang menghasilkan tanaman transgenik fertil. Metode transformasi
genetik pada tanaman padi semakin berkembang termasuk pengetahuan tentang
berbagai promoter (Terada & Shimamoto 1993). Untuk meningkatkan efisiensi
transformasi melalui Agrobacferium pada tanaman monokotil temtama untuk
spesies yang rekalsitran seringkali diperlukan berbagai modifikasi dalam metode
transformasi

melalui Agrobacferium (Smith & Hood 1995). Transformasi

terhadap kecambah kedelai menggunaka Agmbacterium juga telah berhasil
dilakukan oleh Chee et al. (1989).
Menurut Sheng dan Citovky (1996) terdapat tiga komponen dalam

A. tumefaciens yang berperan dalam transfer DNA ke dalam sel tanaman, yaitu:
1. Daerah T-DNA

T-DNA yaitu bagian dari tumor inducing plasmid (Ti) yang dimiliki
A. tumefaciens ditransfer kedalam sel tanaman, atau T-DNA adalah

bagian DNA yang memiliki ciri khusus yang berada pada 200 kb Ti
plasmid Agrobacterium yang diapit oleh sekuen berulang DNA (25)
sebagai batas T-DNA.
2. Daerah virulence (vir)

Gen vir ini mempunyai ukuran 35 kb dan terbagi atas 7 macam, yaitu vir
A, B, C, D, E, F, G, dan vir H. Gen-gen

vir mensistesis protein

virulence. Protein vir ini berperan di dalam menginduksi terjadiiya
trasfer T-DNA dan integrasinya ke tanaman. Ekspresi gen-gen diinduksi
oleh adanya senyawa fenolik seperti asetoseringon, monosakarida
spesifk (glukosa, arabinosa, galaktosa, fruktosa, dan xilosa), dan kondisi
pH juga mempengaruhi

ekspresi

gen vir. Tanaman yang terluka

mengeluarkan cairan dengan keasaman yang khas antara pH 5,O-5,s
(Sheng & Citovsky 1996). Senyawa fenolik dan monosakarida terbentuk
pa& saat tanaman dikotil luka dengan mengeluarkan getah dan proses
ini jarang terjadi pada tanaman monokotil yang perlu penyesuaian
kondisi infeksi. Penyesuaian kondisi dapat berupa penambahan fenolik,
penambahan monosakarida, dan pengurangan pH.

dalam sel tanaman.

3. Gen chromosomal virulence (chv)

Komponen ini terletak pada kromosom Agrobacterium, yang terdiri atas
chv A, chv B, psc A dan art. Gen chv digunakan untuk pelekatan bakteri

ke dalam sel tanaman