Analisis Penanda RAPD (Random Amplifield Polymorphic DNA ) Untuk Analisis Keragaman Genetik Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.) Sumatera Utara
56
Lampiran 1. Gambar Sampel Aksesi Andaliman
Gambar Andaliman Dairi
Gambar Andaliman Karo
57
Gambar Andaliman Simalungun
58
Lampiran 2. Pembuatan Larutan Stok dan Buffer
A. Pembuatan Larutan Stok
•
CTAB 5 % (100 ml): Timbang NaCl sebanyak 2.0 gram dan CTAB sebanyak
5.0 gram. Masukkan bahan kimia ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 100 ml
aquades. Aduk campuran larutan dengan menggunakan stirrer kemudian
diletakkan diatas hote plate.
•
Tris HCl 1 M pH 8.0 (100 ml): Timbang Tris
sebanyak 12.114 gram.
Masukkan Tris ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 80 ml aquades. Aduk
campuran larutan dengan menggunakan stirrer kemudian diletakkan diatas hote
plate. Selanjutnya, ditambahkan 4.2 ml HCl pekat sedikit demi sedikit sampai pH
mencapai 8. Masukkan ke dalam gelas ukur, kemudian volume ditepatkan
dengan aquades hingga volume larutan menjadi 100 ml.
•
Tris HCl 1 M pH 7.4 (50 m): Timbang Tris sebanyak 6.057 gram. Masukkan
Tris ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 30 ml aquades. Aduk campuran
larutan dengan menggunakan stirrer kemudian diletakkan diatas hote plate.
Selanjutnya, ditambahkan NaOH 2.5 M sedikit demi sedikit sampai pH mencapai
7.4. Masukkan ke dalam gelas ukur, kemudian volume ditepatkan dengan
aquades hingga volume larutan menjadi 50 ml.
•
EDTA O.5 M pH 8.0 (100 ml): Timbang EDTA sebanyak 18.612 gram dan
NaOH 2.0 gram. Masukkan bahan kimia ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan
80 ml aquades. Aduk campuran larutan dengan menggunakan stirrer kemudian
diletakkan diatas hote plate. Selanjutnya, ditambahkan HCl pekat sedikit demi
sedikit sampai pH mencapai 8. Masukkan ke dalam gelas ukur, kemudian
volume ditepatkan dengan aquades hingga volume larutan menjadi 100 ml.
59
•
NaCl 5 M (l00 ml): Timbang NaCl sebanyak 29.22 gram. Masukkan ke dalam
erlenmeyer dan ditambahkan 80 ml aquades. Aduk campuran larutan dengan
menggunakan stirrer kemudian diletakkan diatas hote plate. Masukkan ke dalam
gelas ukur, kemudian volume ditepatkan dengan aquades hingga volume larutan
menjadi 100 ml.
**Semua bahan di atas disterilkan dengan menggunakan autoklaf kecuali CTAB 5%.
B. Pembuatan Larutan Buffer
•
Buffer Ekstraksi/CTAB (100 ml): Campurkan 40 ml CTAB 5%, 25.1 ml NaCl
5 M, 4 ml EDTA 0.5 M pH 8.0, 10 ml Tris HCl 1 M pH 8.0 dan 20.8 ml aquades.
•
Buffer TAE 50 X (100 ml): Campurkan 24.2 ml Tris HCl 1 M pH 7.4, 5.7 ml
Asam Asetat Glasial, 10 ml EDTA 0.5 M PH 8.0, dan aquades hingga volume
larutan menjadi 100 ml.
•
Buffer TAE 1X (500 ml): Campurkan 10 ml Buffer TAE 50 X dan 490 ml
aquades.
•
Buffer TE (50 ml): Campurkan 0.5 ml Tris HCl 1 M PH 8.0, 0.1 ml EDTA 0.5
M PH 8.0 dan 49.4 ml aquades.
•
Kloroform Isoamilalkohol 24 : 1 (50 ml): Campurkan 48 ml Kloroform dan 2
ml Isoamilalkohol.
•
Etanol 70 % (100 ml): Campurkan 70 ml Etanol dan 30 ml aquades.
60
Lampiran 3. Alur Penelitian
Sampel DNA Andaliman
Isolasi DNA
Uji Kualitas
Uji Kuantitas
Proses PCR-RAPD
Elektroforesis
Analisis Hasil Amplifikasi PCR-RAPD
61
Lampiran 4. Proses Isolasi DNA
Sampel daun andaliman ditimbang 0.2 gram dan digerus sambil
ditambahkan nitrogen cair dan PVPP
Sampel dimasukkan ke dalam tabung yang bberisi 1 ml buffer
ekstraksi dan 10 µl β-mercaptoetanol
Tabung di vortex dan diinkubasi dalam waterbath selama 30
menit pada suhu 650C
Supernatan ditambahkan 1 ml KIAA (24:1) dan disentrifus
dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit
Supernatan ditambahkan 1 ml KIAA (24:1) dan disentrifus
dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit
Supernatan ditambahkan 1 ml isopropanol dan diinkubasi pada
suhu 40C selama semalama
Tabung disentrifus pada pada kecepatan 13.000 rpm selama 10
menit dan dikeringkan
Pelet dilarutkan dengan buffer TE 100µl
Campuran ditambahkan dengan etanol absolute dingin dan
diinkubasi dalam freezer (-200C) selama 30 menit
Campuran disentrifus dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit
Pelet dicuci dengan etanol 70% dan dikeringkan
Pelet dilarutkan dengan 100 µl buffer TE
Stok DNA disimpan dalam freezer (-200C)
62
Lampiran 4. Proses PCR-RAPD
Komposisi Master Mix volume 25 µl :
Go Taq PCR 12.5 µl
Nuclease free water 9.5 µl
Primer 1 µl
DNA sampel 2 µl
Running PCR sebanyak 45 siklus :
Denaturasi awal 940C 2 menit
Denaturai 940C 1 menit
Annealing 360C 1 menit
Extension 720C 2 menit
Post extension 720C 10 menit
Kondisi akhir PCR 40C tak terbatas
Proses running dimulai selama
kurang lebih 4 jam
63
Lampiran 5. Proses elektroforesis hasil PCR-RAPD
Agar rose 2.6 gram ditambahkan
dengan 130 ml buffer TAE 1 x
Campuran dipanaskan dengan hot
plate
Campuran ditambahkan 1.5 µl EtBr
Larutan gel dituang kedalam cetakan
yang telah dipasang sisir
Gel yang telah mengeras
dipindahkan ke dalam chamber
berisi buffer TAE 1 x
Sampel hasil PCR, marker dan
loading dye dimasukkan ke dalam
sumur gel dengan perbandingan
(8:5:2)
Alat elektroforesis dihubungkan
dengan power supply 80 volt
Proses running dimulai selama 15
menit
64
Lampiran 6. Foto Uji Kuantitas
Gambar 10. Alat spektrofotometer
Gambar 11. Hasil Uji kuantitas
65
Lampiran 7. Hasil Uji Kuantitas Tanaman Andaliman
Kode
Sampel
1
2
3
²
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
Konsentrasi DNA
(ng/µl)
3041
2201
796
1769
2476
97.1
2398
1073
1367
2046
1335
1524
1417
1211
1415
937
1340
823
1551
1801
2100
2204
2337
2951
2612
3760
221
1422
2891
3757
Kemurnian
260/280
2.018
2.078
2.089
2.014
2.016
1.143
1.31
2.075
2.077
2.113
2.052
1.975
2.079
2.079
2.075
1.969
2.044
1.926
2.061
2.073
2.007
2.05
2.019
2.1
2.11
1.625
1.596
1.934
2.127
2.08
66
Lampiran 8. Hasil Fotosintesis
Gambar 12. Hasil elektoroforesis dengan Primer OPD-13
Gambar 13. Hasil elektroforesis dengan Primer OPI-20
Gambar 23. Hasil elekroforesis dengan Primer OPH-09
67
Gambar 14. Hasil elektoforesis dengan Primer OPN-10
Gambar 15. Hasil elektroforesis dengan Primer OPM-01
68
Lampiran 9. Hasil Skoring Pita 30 Individu Pada Kelima Primer
Tabel 5. Hasil scoring pita andaliman pada kelima primer
OPD13
1
2
3
4
1
0
0
1
2
1
1
3
1
4
OPI20
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
0
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
0
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
2
3
4
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
5
1
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
3
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
4
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
0
1
0
0
0
5
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
0
0
0
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
1
1
2
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
0
0
1
0
0
1
0
1
1
0
1
1
1
1
0
3
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
4
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
OPH09
OPN10
3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
4
1
1
1
1
1
1
1
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
69
5
0
1
0
1
0
1
1
0
1
1
0
1
0
0
1
1
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
6
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
OPM01
1
13
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
3
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
4
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
5
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
6
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
1
0
0
0
0
Ket: “1” = ada
“0” = kosong
70
Lampiran 10. Matriks Jarak Ketidaksamaan Genetik Tanaman Andaliman
Units
1
2
3
4
6
7
8
9
10
11
12
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
2
0.10
3
0.03
0.07
4
0.10
0.00
0.07
6
0.48
0.36
0.46
0.36
7
0.13
0.03
0.10
0.03
0.38
8
0.03
0.07
0.00
0.07
0.46
0.10
9
0.10
0.00
0.07
0.00
0.36
0.03
0.07
10
0.17
0.07
0.14
0.07
0.38
0.10
0.14
0.07
11
0.14
0.17
0.11
0.17
0.36
0.20
0.11
0.17
0.26
12
0.10
0.00
0.07
0.00
0.36
0.03
0.07
0.00
0.07
0.17
14
0.15
0.19
0.12
0.19
0.39
0.21
0.12
0.19
0.28
0.25
0.19
15
0.15
0.19
0.12
0.19
0.39
0.21
0.12
0.19
0.28
0.25
0.19
0.00
16
0.13
0.03
0.10
0.03
0.33
0.06
0.10
0.03
0.10
0.21
0.03
0.15
0.15
17
0.26
0.14
0.23
0.14
0.25
0.17
0.23
0.14
0.15
0.36
0.14
0.13
0.13
0.11
18
0.39
0.42
0.36
0.42
0.50
0.36
0.36
0.42
0.45
0.33
0.42
0.26
0.26
0.39
0.40
19
0.17
0.07
0.14
0.07
0.38
0.10
0.14
0.07
0.14
0.26
0.07
0.20
0.20
0.03
0.15
0.36
20
0.20
0.23
0.17
0.23
0.45
0.26
0.17
0.23
0.33
0.30
0.23
0.05
0.05
0.20
0.18
0.22
0.17
21
0.07
0.10
0.04
0.10
0.52
0.13
0.04
0.10
0.19
0.15
0.10
0.17
0.17
0.14
0.28
0.43
0.19
0.22
22
0.03
0.07
0.00
0.07
0.46
0.10
0.00
0.07
0.14
0.11
0.07
0.12
0.12
0.10
0.23
0.36
0.14
0.17
0.04
23
0.21
0.24
0.19
0.24
0.44
0.27
0.19
0.24
0.26
0.31
0.24
0.17
0.17
0.29
0.20
0.43
0.33
0.22
0.23
0.19
24
0.07
0.16
0.10
0.16
0.48
0.19
0.10
0.16
0.24
0.21
0.16
0.23
0.23
0.20
0.33
0.48
0.24
0.28
0.14
0.10
0.29
25
0.07
0.10
0.03
0.10
0.48
0.13
0.03
0.10
0.17
0.14
0.10
0.15
0.15
0.13
0.26
0.39
0.17
0.20
0.07
0.03
0.21
0.13
26
0.19
0.21
0.15
0.21
0.50
0.24
0.15
0.21
0.23
0.12
0.21
0.30
0.30
0.26
0.42
0.30
0.31
0.36
0.20
0.15
0.36
0.19
0.19
27
0.07
0.17
0.11
0.17
0.44
0.20
0.11
0.17
0.26
0.08
0.17
0.25
0.25
0.21
0.36
0.33
0.26
0.30
0.15
0.11
0.31
0.14
0.14
0.12
30
0.30
0.42
0.36
0.42
0.50
0.44
0.36
0.42
0.45
0.33
0.42
0.26
0.26
0.39
0.40
0.25
0.45
0.33
0.43
0.36
0.43
0.39
0.39
0.30
27
0.24
71
Lampiran 11. Faktorial Koordinat
Tabel 13. Faktorial Analisis (PCoA)
1
2
3
4
6
7
8
9
10
11
12
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
30
Axis
Coord.
0.0041
0.0343
0.0378
0.0343
0.0027
0.0551
0.0739
0.1476
0.0714
0.0277
0.0615
-0.0648
-0.0329
-0.0003
-0.0292
-0.2003
-0.0122
-0.0898
0.0314
0.0096
-0.0054
0.0596
0.0209
-0.0286
-0.0209
-0.1876
Cos²
5
2808
1800
2808
0
452
619
1001
350
77
1714
1033
208
0
64
907
16
604
130
-156
2
114
87
50
61
802
Axis 2
Coord.
-0.0702
-0.0042
-0.0111
-0.0042
0.2270
0.0271
-0.0242
0.0203
0.0508
0.0133
0.0261
0.0112
0.0510
0.0242
0.1005
0.0125
0.0248
0.0088
-0.0676
-0.0427
0.0124
-0.1254
-0.0546
-0.0935
-0.0690
-0.0433
Cos²
1604
43
154
43
873
110
67
19
176
18
308
31
501
300
758
4
65
6
604
-3063
10
506
594
531
661
43
Axis 3
Coord.
-0.0018
0.0147
-0.0122
0.0147
-0.0964
0.0044
0.0038
0.0283
-0.0263
-0.0957
-0.0082
0.0308
0.0060
0.0262
0.0568
0.0199
0.0779
0.0850
0.0397
0.0153
0.0298
-0.0393
0.0261
-0.0678
-0.0575
-0.0741
Cos²
1
515
186
515
158
3
2
37
47
924
30
233
7
350
242
9
640
541
209
-391
57
50
136
279
459
125
Axis 4
Coord.
-0.0285
-0.0041
0.0098
-0.0041
-0.0391
0.0534
0.0257
0.0395
0.0339
0.0421
0.0067
-0.0342
-0.0075
-0.0052
-0.0569
0.0972
0.0323
-0.0123
0.0021
0.0000
-0.0702
-0.0927
0.0005
0.0544
-0.0079
-0.0349
Cos²
265
39
122
39
26
425
75
72
79
179
20
288
11
14
243
214
110
11
1
0
320
277
0
180
9
28
Axis 5
Coord.
0.0046
0.0331
-0.0313
0.0331
-0.0012
0.0094
-0.0586
-0.0087
0.0526
-0.0521
0.0074
-0.0256
-0.0608
0.0382
0.0422
0.0006
0.0457
-0.0368
-0.0183
-0.0066
-0.0370
0.0237
-0.0129
0.0360
0.0052
0.0180
Tabel 14. Nilai Factorial coordinates
Axis
1
2
3
4
5
\
Eigenvalue
0.00537
0.00449
0.00221
0.00167
0.00106
Inertia%
25.52
21.3
10.51
7.93
5.02
Cos²
7
2614
1232
2614
0
13
389
4
189
274
25
161
713
744
134
0
220
101
44
-74
89
18
33
79
4
7
53
DAFTAR PUSTAKA
Azizah, A. 2009. Perbandingan Pola Pita Amplifikasi Dna Daun, Bunga Kelapa
Sawit Normal dan Abnormal. Institut Pertanian Bogor . Bogor
Andayanie, L. 2000. Kajian Daya Insektisida Alami Nabati Kulit Buah Manggis
(Garcinia mangostana L), buah Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium
DC.), getah Gambir (Uncaria gambir Roxb.)dan daun the (Camellia sintetis
L.) terhadap perkembangan hama gudang Sitophilus zeamais Motsch.
Skripsi. Bogor: Fakultas Teknologi pertanian IPB. Hal. 36.
Bahagiawati. 2011. Peran Markah Molekuler Dalam Pemuliaan Tanaman. Badan
Litbang Pertanian. Edisi 16-22 Maret 2011 No.3397 Tahun XLI.
Bardakci,F. 2001. Random Ampilfied Polymorphic DNA (RAPD) markers. Turk.J.
Biol. 25: 185-37.
Elfrod, S. dan Stansfield, W. 2007. Genetika. Edisi Keempat. Penerjemah
:Damaring, T. W. Penerbit Erlangga. Jakarta.
Ferreira, M.E dan D. Gratapaglia.1998. Introducao ao uso de marcadores em
analise genetic. Embrapa-Cenargen.Brasilia.
Hasairin, A. 1994. Etnobotani Tanaman Rempah dalam Makanan Adat
Masyarakat Batak Angkola Dan Mandailing. Thesis. Bogor: Program
Pascasarjana IPB
Hsuang, Keng, 1978. Orders and Families of Malayan Seed Plants. Dalam Wijaya
, C.H. 1999. Andaliman, Rempah tradisional Sumatera Utara dengan
aktivitas antioksidan dan antimikroba. Bul.Teknol. dan Industri Pangan.
10(2): 58-65.
Hutami,S., I.Mariska, dan Y.Supriati. 2005 . Peningkatan Keragaman Genetik
Tanaman melalui Keragaman Somaklonal. J. Agro. Biogen.2(2):81-88.
Jones, C.J., K.J. Edwards, S. Castagiole, M.O.Winfield, F. Sala, C. van del Wiel,
G. Bredemeijer, B. Vosman, M. Matthes, A. Dally, R. Brettsshneider, P.
Bettini, M, Buiatti, E. Maestri, A. Malcevschi, N.Marmiroli,R. Aert, G.
Volkaert, J. Rueda, R. Linacero, A. Vasques and A. Karp. 1997. A
Reproducibility testing of RAPD, AFLP and SSR markers in plants by a
network of European laboratories. Molecular Breeding 3 (5): 382-390
Lim, L.S, R. Wickneswari, S. L. Lee and A. Latif. 2002. Genetic variation of
Dryobalanops aromatica Gaertn. F. (Dipterocapaceae) in Peninsular
Malaysia using microsatellite DNA markers. Forest Genetics 9 (2) : 125136.
54
Karsinah, Sudarsono, Setyobudi, L., dan Aswidionnoor, H., 2002.
Keanekaragaman
Genetik
Plasma
Nutfah
jeruk
berdasarkan
AnalisisPenanda RAPD. Jurnal Bioteknologi Pertanian 7 (1) : 8-16
Maftuchah dan A. Zainuddin. 2013. Studi Pendahuluan variasi genetik jarak pagar
(Jatrpha curcas L.) lokal berdasarkan Random Amplified Polymorphic DNA
. Pusat pengembangan Bioteknologi universitas Muhammadiyah Malang
(123-131).
Mahardika, I.G.N.K. 2003. Polymerase Chain Reaction. Laboratorium Virologi.
Fakultas Kedokteran Hewan.Universitas Udayana. Denpasar.
Mangoendidjojo, W., 2003. Polymerase Chain Reaction. Laboratorium Virologi.
Fakultas Kedokteran Hewan. Universitas Udayana. Denpasar.
Mulia,L.2000. Kajian Aktivitas Antimikroba Andaliman (Zanthoxylum
acanthopodium ) dan Antarasa (Litsea cubeba). Skkripsi . Institut Pertanian
Bogor .Bogor, hlm 7-21.
Murray, RK, Graner DK, Mayes PA Rodwell VW. 2000. Biokimia Harper.
Andry H, penerjemah; Anna PB, Tiara MN, editor. Jakarta: Penerbit Buku
Kedokteran EGC. Terjemahan dari: Harper’s Biochemistry.
Napitupulu,B., Sorth,S., dan Mery, S., 2004. Potensi andaliman sebagai Food
Additive tradisional etnis batak Sumatera Utara. BPTP Sumatera Utara.
Medan, Hlm. 53-56
Pandin , D.S., 2010. Penanda DNA untuk Pemuliaan Tanaman kelapa (Cocos
nucifera L.) Perspektif 9 (1) ;21-35.
Parhusip, A.J., Posman S., Adelina T. 1999. Studi Tentang Aktifitas Antimikroba
Alami pada Andaliman. Seminar Nasional Teknologi Pangan.
Prana,T.K dan S.N Hartati. 2003. Identifikasi sidik jari DNA Talas (Colocasia
esculenta L.Schott) Indonesia dengan teknik RAPD. Jurnal Natur Indonesia
5(2): 107-112.
Rahayu, E.S., dan S., Handayani, 2010. Keragaman genetik pandan asal Jawa
Barat berdasarkan penanda inter simple sequence repeat. Marka Sains 14 ;
158-162.
Rholf, F. J. 2000.NT SYS-pc: Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis
System Version 2.1 User Guide. Department of Ecology and Evolution
State University of New York.
Sabri,dkk. 2008. Peningkatan dan Pemanfaatan dan Kualitas Tanaman Andaliman
(Zantholium acanthopodium DC) di Sumatera Utara. Laporan Penelitian
hibah Bersaing. FMIPA Universitas Sumatera Utara, Medan.
55
Setiyo, I.E., 2001. Pemetaan dan Keragaman Genetik RAPD pada Kelepa Sawit
sungai pancur (RISPA). Tesis. Program Pascasarjana IPB. Bogor.
Simajuntak, SP. 2006. Perkecambahan Biji Andaliman (Zanthoxylum
acanthopodium DC) Deskripsi dan Perkecambahan. Hayati Vol.10 No.1
Siregar, B.L., 2003. Andaliman (Zanthoxylum Acanthapodium DC.) di Sumatera
Utara; Deskripsi dan Perkecambahan. J. Hayati hlm. 38-40.
Suryanto D. 2003. Melihat Keanekaragaman organisme melalui beberapa teknik
genetika molekuler . USU Digital Library
[terhubung berkala].
http://www.library.usu.ac.id/modules.php [07 Maret 2015.
Wijaya, C. H. 1999. Andaliman, Rempah Tradisional Sumatera Utara Dengan
Aktivitas Antioksidan dan Antimikroba. Bul. Teknol. Dan Industri Pangan.
10(2).
Wijaya, C.H. 2000. Isolasi dan Identifikasi senyawa trigeminal aktif buah
andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC). Hayati 7:9-95.
Yuwono, T., 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Penerbit Andi.
Yogyakarta
26
METODE PENELITIAN
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran
Universitas sumatera Utara, Medan yang akan dimulai pada bulan April 2015
sampai dengan bulan September 2015.
Bahan dan Alat
Bahan tanaman digunakan dalam penelitian ini adalah materi genetik
DNA Andaliman yang sudah di isolasi peneliti yang sebelumnya Sinaga (2014)
pada tiga populasi alami tanaman aren hasil koleksi dari berbagai lokasi di
Sumatera Utara
Bahan kimia digunakan adalah adalah cetyl trimethylammonium bromide
(CTAB) 5%, NaCl, Tris, HCl, NaOH, isopropanol, ethylenediamine tetraacetic
(EDTA), Asam Asetat Glasial, agarose, Ethidium Bromide (EtBr), kloroform,
isoamilalkohol, β-Mercaptoethanol, polyvinilpyrolidone (PVPP), etanol 70%,
etanol absolut, DNA Marker I00 bp Ladder, Go Taq ® Green Master Mix,
nitrogen cair, loading dye, aquades, aquabidestila dan Primer OPD-13, OPI-20,
OPH-09. OPM-01 dan OPN-10.
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah gunting, timbangan
digital, hotplate, mortar, centrifuge, freezer, vortex, freezer, tabung eppendorf 2
ml dan 1,5 ml, mikropippete 1-50 µl, 100-500 µl dan 200-1000 µl, sarung tangan
karet, tip pipet kristal, kamera,oven, pH meter, pengaduk magnetik, alat-alat gelas
(beaker gelas, erlenmeyer, dll), UV Transluminator (UV Tec Cambridge 20 UV),
elektroforesis (Power PAC 3000, Biorad), PCR (Therma Cycler), Gel-Doc (UV
Cambridge), power supply, alat tulis.
27
Metode Penelitian
Metode penelitian yang digunakan adalah Metode RAPD (Random
Amplified Polymorphic DNA) berdasarkan PCR (Polymerase Chain Reaction)
yang mengamplifikasi sekuen DNA secara acak.
28
Pelaksanaan Penelitian
Pengambilan Sampel Daun
Daun andaliman yang digunakan adalah daun dari populasi alam di daerah
kabuupaten dairi dan sekitarnya. Daun dipilih yang masih muda/lembut berwana
hijau kemerahan, kemudian dicuci bersih , dilap pakai tisu dan kemudian dibawa
ke Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran.
Isolasi DNA
Tahapan isolasi yang dilakukan adalah daun andaliman dibuang tulang
daunnya lalu dicuci dan dikeringkan dengan tisu dan ditimbang masing-masing
0,1-0,3 gram. Daun dipotong halus dengan gunting secara melintang. Daun
andaliman digerus menggunakan mortar sambil ditambahkan nitrogen cair dan
PVPP. Setelah halus, sampel dimasukkan ke dalam tabung sentrifus yang berisi 1
ml buffer ekstraksi dan β-mercaptoetanol 10 µl kemudian tabung dikocok
menggunakan vortex lalu tabung diinkubasi dalam waterbath selama 30 menit
pada suhu 650C. Setiap 10 menit sekali tabung dibolak balik dengan perlahanlahan. Setelah itu, tabung diinkubasi pada suhu ruang selama 4-5 menit lalu 1 ml
kloroform:isoamilalkohol (24:1) ditambahkan ke dalam tabung.
Tabung disentrifus dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu ruang selama
10 menit. Supernatan yang diperoleh dipindahkan pada tabung sentrifus lain, lalu
1 ml kloroform:isoamilalkohol (24:1) ditambahkan ke dalam tabung lalu tabung
dikocok menggunakan vortex dan tabung disentrifus lagi dengan kecepatan
13.000 pada suhu ruang rpm selama 15 menit. Supernatan yang diperolah
dipindahkan lalu 1 ml isopropanol dingin ditambahkan ke dalam tabung.
Supernatan dihomogenkan dengan membolak-balik tabung lalu tabung disimpan
29
dalam lemari es (40C) selama satu malam kemudian tabung disentrifus kembali
dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit. Supernatan yang
diperoleh dibuang kemudian pelet dikeringanginkan. Pelet yang sudah kering
dilarutkan dengan buffer TE sebanyak 100 µl kemudian tabung dispin manual
hingga homogen.
Kemudian etanol absolut dingin ditambahkan lalu dibolak-balik hingga
homogen. Setelah itu, supernatan diinkubasi dalam freezer (-200C) selama 2 jam
kemudian supernatant disentrifus lagi dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu
40C selama 10 menit. Supernatan dibuang sedangkan pelet dicuci menggunakan
etanol 70% dan pellet dikeringanginkan. Pelet DNA yang sudah kering dilarutkan
dengan 100 µl buffer TE. Simpan DNA dalam freezer (-200C).
Uji Kuantitas DNA
Pengujian dilakukan dengan menggunakan alat spektrofotometri. Larutan
stok DNA diambil sebanyak 2 µl, kemudian alat dijalankan. Absorbansi (A)
diukur pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Tingkat kemurnian DNA
ditentukan dengan nilai perbandingn A260/A280. Menurut Wilson dan Walker
(2010), sampel DNA murni akan menghasilkan rasio A260/A280 berkisar 1.8-2.0.
Nilai kemurnian yang lebih dari 2.0 menunjukkan bahwa sampel mengandung
kontaminan RNA, sedangkan nilai kemurnian yang kurang dari 18 menunjukkan
bahwa sampel mengandung kontaminan protein (Yuwono, 2006).
Amflifikasi dan Genotyping
Amflifikasi
mengikuti prosedur baku analisis RAPD, sesuai prosedur
Wiliiam et al., (1990). Amflifikasi dilakukan dengan menggunakan 5 primer
polimefrik,yaitu OPD-13, OPI-20, OPH-09, OPM-01, OPN-10.
30
Sebelum running PCR dilakukan pengenceran DNA dengan mengambil 5
ɰl stok DNA dan ditambahkan 45 µ ml ddH2O sehinnga diperoleh 50 µl aliquot
DNA . kemudian dilakukan pengenceran primer yaitu tube primer disentrifius 5
menit setelah itu ditambahkan dd H2O sesuai ukuran molar. Dibuat aliquot primer
yaitu dengan mengambil 10-15 ɰl stok primer.
Persiapan awal PCR adalah mencairkan komponen untuk running PCR yaitu
paket PCR produksi Promega dalam kotak berisi pecahan es. Untuk
mempermudah pembuatan larutan master dimisalkan 5 sampel yang akan
digunakan maka larutan master terdiri atas :dd H²O 9.5 ɰ x 5= 47.5 ɰl, Go tag
12,5 x 5 = 62,5 ɰl, aliquot primer 1 ɰ x 5 = 5 ɰl. Dari tube diambil 23 ɰl ke
tube yang lain sehingga diperoleh 20 tube untuk PCR dan ditambahkan masingmasing DNA sebanyak 2 ɰl. Kemudian tabung dispin manual. Tabung berisi stok
DNA
dan campuran master dimasukkan dalam block sampel dimesin PCR
dengan suhu annealing 36ºC. Reaksi amplifikasi Gene Amp PCR Applied
Biosystem di desain waktu,suhu dan jumlah siklus termal 45 kali (3 jam 51 menit)
berdasarkan yang digunakan peneliti Setiyo (2001).
Proses amplifikasi PCR
dapat dilihat pada tabel 1.
Tabel 1. Siklus, proses, suhu dan waktu dalam amplifikasi DNA 30 aksesi
andaliman
Tahapan
Proses
Suhu ºC
Waktu
I ( 1 siklus )
Pre Denaturasi
94
2 menit
II ( 45 siklus )
Denaturasi
94
1 menit
Penempelan
36
1 menit
Elongasi
72
1 menit
Post Elongasi
72
10 menit
III ( 1 siklus )
31
Setelah reaksi PCR selesai DNA hasil amplifikasi disimpan dalam suhu
±20º C bila sedang tidak digunakan.
Elektroforesis
Sebelum dilakukan elektroforesis disiapkan gel agarose konsentrasi 2 %
(b/v). Agarose ditimbang 2,6 g kemudian dilarutkan dengan menambahkan 130
ml buffer TAE 1x. Larutan tersebut dimasukan ke dalam elenmeyer, kemudian
dipanaskan dan diaduk dengan pengaduk magnetik hingga larutan menjadi
bening. Setelah larutan dipanaskan kemudian didingikan ditambah larutan etidium
bromide 1 µl kemudian dipanaskan kembali lalu didinginkan dengan cara yang
sama. Setelah larutan agak dingin ( suhu ± 60º C) larutan dimasukkan dalam
cetakan agar yang telah dipasang sisir pembuat lubang ( well-forming combs) dan
dibiarkan memadat selama ± 45 menit atau sampai gel mengeras. Well-forming
combs dilepas secara perlahan dan gel agarose siap digunakan untuk
elektroforesis.
Untuk elektroforesis tray yang berisi gel agarose diletakkan dalam tank
elektroforesis dan larutan buffer TAE 1x dituang ke dalam tank tersebut ± 500 ml
(hingga terendam) hingga 1 mm diatas permukaan gel atau sampai batas yang
telah ditemukan. Contoh DNA yang telah disiapkan dimasukkan ke dalam sumur
pada gel.
Setelah semua sampel dimasukkan ke dalam sumur (well), tank
elektroforesis ditutup dan dihubungkan dengan arus listrik. Kemudian proses
elektroforesis siap dijalankan. Running elektroforesis dilakukan pada kondisi 80
volt selama 65 menit. Setelah running elektroforesi selesai, arus listrik dimatikan
dan tray diambil dengan menggunakan sarung tangan. Visualisasi DNA yang
32
telah dielektroforesis dilakukaan dengan UV transluminator dan jika pita/band
molekul DNA kelihatan terang maka didokumentasikan.
Analisis Data
Penentuan Skoring Marka RAPD
Untuk menentukan keragaman genetik, produk PCR – RAPD diskoring
berdasarkan muncul tidaknya pita DNA. Pita yang muncul pada gel diasumsikan
sebagai alel RAPD. Keragaman alel RAPD ditentukan dari perbedaan migrasi alel
pada gel masing-masing individu sampel. Berdasarkan ada atau tidaknya pita,
profil pita diterjemahkan ke dalam data biner. Pita yang muncul diberi kode 1(ada) dan -0 (tidak ada) ( Ferreira dan Grattapaglia, 1994).
Penentuan Ukuran Pasangan Basa
Ukuran fragmen basa (pasangan basa = bp) produk PCR ditentukan
dengan menggunakan software UVITEC Cambridge FireReader. Fragmen DNA
yang digunakan yaitu 100 bp DNA ladder . Dengan menggunakan software
UVITEC Cambridge FireReader maka ukuran pita DNA hasil amplifikasi dapat
terukur seperti pada gambar. Ukuran pita DNA (base pairs) ini akan berpacuan
dari ladder yang kita gunakan. Program ini akan mengukur pita yang muncul
berdasarkan ukuran ladder yang digunakan. Pengukuran pola pita yang terbentuk
ini dengan pendar cahaya DNA yang terbentuk saat proses elektroforesis dengan
sinar UV.
Matriks jarak atau ketidaksamaan genetik untuk semua kombinasi pasangan
individu dapat dilakukan dengan dua tipe analisis deskriptif dari keragaman : (1)
Principal Coordinates Analysis (PCoA), suatu jenis analisis faktorial pada tabel
ketidaksamaan untuk mendapatkan group origin utama dan (ii) Neighbour-Joining
33
Tree (NJtree) berdasarkan Saitou dan Nei (1978) untuk memperoleh gambaran
dari kekerabatan diantara individu-individu. Perhitungan dan analisis deskriptif ini
menggunakan software DARwin 5.05 (Perrier dan Jacquemoud-Collet, 2009).
34
HASIL DAN PEMBAHASAN
Data Geografis dan Morfologis 30 Aksesi Andaliman
Tiga puluh sampel aksesi andaliman yang diambil dari 3 kabupaten
(Dairi, Tanah Karo, dan Simalungun) menunjukkan adanya perbedaan warna
daun bagian bawah. Setiap sampel menunjukkan tingkat kemerahan setiap daun
berbeda, sehingga dikelompokkam pada 3 tingkat warna, yaitu berwarna hijau,
hijau kemerahan dan merah. Data dapat dilihat pada tabel 2.
Tabel 2. Data geografis dan morfologis 30 aksesi andaliman dari 3 kabupaten Sumatera Utara
No.
Kabupaten/Kecamatan/Kota Titik koordinat
Ketinggian Tinggi
lilit
Warna Umur
Aksesi
Tempat Tanaman Batang Daun Tanaman
(mdpl.)
(cm)
(cm)
(cm)
D1 Dairi/Sidikalang/Hutarakyat
N: 02°45’14.6” 1001
330
13
Hijau
2
E : 98°17’46.9”
D2
Dairi/Sidikalang/Hutarakyat
N: 02°45’17,5”
E: 98°16’50”
978
80
3
Merah
0,5
D3
Dairi/Sumbul/Parbuahan
N: 02°46’45,6”
E: 98°24’52,2”
1254
308
21
Hijau
2,5
D4
Dairi/Sumbul/Parbuahan
N: 02°47’02,1”
E: 98°25’09”
1253
294
17
Hijau
2
D5
Dairi/Sumbul/Lae Tangiang
N:02°47’16,6”
E: 98°25’58,1”
1357
170,1
12,6
Hijau
Kemerahan
D6
Dairi/Parbuluan/Sigalingging
N:02°36’07,9”
E:98°30’21,8”
1518
265
28
Hijau
1,5
Kemerahan
D7
Dairi/Parbuluan/Sigalingging
N:02°36’07,9”
E:98°30’21,4”
1518
156
10
Merah
1
D8
Dairi/Parbuluan/Sihotang
N:02°39,13,7”
E:98°27’02,9”
1317
430
28
Hijau
Kemerahan
3
D9
Dairi/Parbuluan/Sihotang
N:02°39’13,8”
E: 98°27’02,5”
1317
320
15
Hijau
1,5
D10
Dairi/Parbuluan/Sihotang
N:02°39’13,8”
E:98°27’2,5”
1317
128
7
Hijau
1,5
D11
Dairi/Parbuluan/Siarung-arung N:02°39’57,5”
E: 98°25’06,5”
1290
190
20
Merah
3
1
35
No.
Kabupaten/Kecamatan/Desa
Aksesi
Titik koordinat
Ketinggian Tinggi
Lilit
Tempat
Tanaman Batang
(mdpl.)
(cm)
(cm)
1292
200
25
Warna
Umur
Daun Tanaman
(cm)
Merah
2,5
D12
Dairi/Parbuluan/Siarung-arung N:02°39’55”
E:98°25’5,1”
D13
Dairi/Sumbul/Pegagan Julu7
N:02°45’14,6”
E: 98°17’46,9
1109
300
15
Hijau
1,5
D14
Dairi/Sumbul/Pegagan Julu7
N:02°47’9,2”
E:98°23’22,7”
1109
310
18
Hijau
2
D15
Dairi/Pegagan Hilir/Tiga Baru N:02°48’47,6”
E: 98°23’38,9”
1202
294
20
Hijau
2
D16
Dairi/Pegagan Hilir/Tiga Baru N: 02°48’43,9”
1206
192
9
Hijau
1
E: 98°23’43,8”
Kemerahan
D17
Dairi/Pegagan Hilir/Tiga Baru N: 02°48’39,2”
E: 98°23’48,5
1217
177
7
Merah
1
D18
Dairi/Pegagan Hilir/Tiga Baru N: 02°48’38,8”
E: 98°24’29,4”
1276
203
14
Hijau
1
K1
Tanah Karo/Merek/Garingging N: 02°58’13,8”
E : 98°32’11”
1483
333
20
Merah
4
K2
Tanah Karo/Merek/Garingging N: 02°58’15,7”
E : 98°32’09,8”
1483
400
22
Hijau
4,5
K3
Tanah Karo/Merek/Garingging N: 02°58’33,5”
E : 98°31’27,6”
1495
248
10
Hijau
1,5
S1
Simalungun/Purba/Purba
Hinalang
N : 02°55’13,3”
E : 98°38’18,8”
1423
240
15
Hijau
kemerahan
S2
Simalungun/Purba/Purba
Hinalang
N : 02°55’13,5”
E : 98°38’18,8”
1423
238
14
Hijau
S3
Simalungun/Purba/Purba
Hinalang
N : 02°55’13,7”
E : 98°38’18,6”
1423
144
9
Hijau
Kemerahan
1
S4
Simalungun/Purba/Purba
Hinalang
N : 02°54’56,6”
E : 98°38’30,9”
1408
370
18
Merah
1
S5
Simalungun/Purba/Kampung N : 02°53’19,5”
Baru
E : 98°43’39,9”
1211
290
22
Hijau
1,5
S6
Simalungun/Purba/Kampung N : 02°53’19,6”
Baru
E : 98°43’39,8”
1211
198
21
Hijau
Kemerahan
2
S7
Simalungun/Purba/Kampung N : 02°53’19,8”
Baru
E : 98°43’40,1”
1211
155
10
Hijau
1
S8
Simalungun/Purba/Kampung N : 02°53’20,3”
Baru
E : 98°43’43,4”
1213
290
23
Merah
2
S9
Simalungun/Purba/Kampung N : 02°53’20,7”
1214
310
24,8
Hijau
1,5
1
1
36
Baru
E : 98°43’44”
Umur aksesi andaliman yang digunakan sebagai sampel umumnya
tanaman yang berumur 1- 4 tahun. Gambar 14,15,16 dan 17 (Lampiran 2),
menunjukkan perbedaan tinggi dan kanopi tanaman andaliman yang digunakan
sebagai sampel, namun tidak dibahas dalam penelitian ini.
Uji Kuantitas DNA
Uji kuantitatif DNA dilakukan secara spektrofotometri pada panjang
gelombang 260 nm dan 280 nm sehingga diperoleh nilai kemurnian dan
konsentrasi DNA hasil isolasi. Panjang gelombang 260 nm merupakan serapan
maksimum untuk asam nukleat, sedangkan panjang gelombang 280 nm
merupakan serapan maksimum untuk protein. Hasil pengukuran dapat dilihat pada
Tabel 3.
Tabel 3.Hasil uji kuantitatif 30 aksesi DNA tanaman andaliman
Kode
Sampel
1
2
3
²
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
Konsentrasi DNA
(ng/µl)
3041
2201
796
1769
2476
97.1
2398
1073
1367
2046
1335
1524
1417
1211
1415
937
1340
823
1551
Kemurnian
260/280
2.018
2.078
2.089
2.014
2.016
1.143
1.31
2.075
2.077
2.113
2.052
1.975
2.079
2.079
2.075
1.969
2.044
1.926
2.061
37
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
1801
2100
2204
2337
2951
2612
3760
221
1422
2891
3757
2.073
2.007
2.05
2.019
2.1
2.11
1.625
1.596
1.934
2.127
2.08
Kemurnian DNA yang diperoleh pada penelitian ini berkisar 1.143 –
2.113. Dari 30 sampel DNA yang diisolasi hanya 4 sampel yang nilai kemurnian
nya berkisar 1.8 – 2.0. Yaitu aksesi nomor 12, 16, 18, dan 28. Menunjukkan
bahwa sampel DNA telah murni.
Sampel dengan nilai kemurnian dibawah 1.8 sebanyak 4 sampel. Yaitu
aksesi nomor 6, 7, 26 dan 27. Hal ini menunjukkan bahwa stok DNA masih
banyak mengandung polysakarida. Sedangkan sampel dengan kemurnian diatas
2.0 sebanyak 22 sampel. Yaitu aksesi nomor 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 15,
17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 29 dan 30. Hal ini menunjukkan bahwa sampel
masih belum murni dan mengandung banyak protein.
Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sampel harus jernih dan larut
sempurna. Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi. DNA yang mengandung
basa-basa purin dan pirimidin dapat menyerap cahaya UV. Pita ganda DNA dapat
menyerap cahaya UV pada 260 nm, sedang kontaminan protein atau phenol dapat
menyerap cahaya pada 280 nm. Dengan adanya perbedaan penyerapan cahaya
UV ini, sehingga kemurnian DNA dapat diukur dengan menghitung nilai
absorbansi 260 nm dibagi dengan nilai absorbansi 280 (Å260/Å280)
(Fatchiyah, 2011).
38
Menurut Haris et al. (2003), konsentrasi DNA akan berdampak pada
kualitas fragmen hasil amplifikasi. Konsentrasi DNA yang terlalu rendah akan
menghasilkan fragmen yang sangat tipis pada gel atau bahkan tidak terlihat secara
visual, sebaliknya konsentrasi DNA yang terlalu tinggi akan menyebabkan
fragmen terlihat tebal sehingga sulit dibedakan antara satu fragmen dengan
fragmen lainnya.
Salah satu keuntungan pemakaian analisis keragaman genetik tanaman
dengan menggunakan teknik molekuler yang memanfaatkan teknologi amplifikasi
PCR adalah kuantitas DNA yang diperlukan hanya sedikit. Di samping itu, dalam
pelaksanaan teknik RAPD tingkat kemurnian DNA yang dibutuhkan tidak perlu
terlalu tinggi, atau dengan kata lain teknik amplifikasi PCR relatif toleran
terhadap tingkat kemurnian DNA. Meskipun demikian, dalam suatu teknik isolasi
DNA masih diperlukan suatu tahapan untuk meminimalkan senyawa-senyawa
kontaminan yang dapat mengganggu reaksi PCR seperti polisakarida dan
metabolit sekunder. Hal ini disebabkan keberadaan polisakarida dan metabolit
sekunder dalam sel tanaman sering menyulitkan dalam isolasi asam nukleat
(Maftuchah dan Zainuddin, 2013).
Hasil PCR dengan marka RAPD
Hasil amplifikasi menggunakan 5 primer yang digunakan yaitu OPD-13,
OPI-20, OPH-09, OPM-01, OPN-10 pada 30 aksesi tanaman andaliman yang
menghasilkan produk PCR yang dapat dibaca dan diskoring, sehingga hasilnya
dapat di analisis. Namun tidak semua primer mengamplifikasi DNA pada 30
aksesi andaliman . Hasil PCR dapat dilihat pada gambar
39
Satu dari lima primer yang digunakan mengamplifikasi DNA pada 30
Aksesi andaliman yaitu Primer OPI-20 Sedangkan 4 Primer lagi yaitu : OPD-13,
OPH-09, OPM-01, OPN-10 tidak mengamplifikasi DNA pada 30 aksesi. Jumlah
DNA yang paling banyak teramplifikasi terdapat pada OPH-09 yaitu aksesi nomor
28,29, dan 30 . Sedangkan yang paling sedikit terdapat pada Primer OPD-13,
OPM-01, OPN-10 yaitu 1 pada aksesi no 13. Sementara OPH-09 tidak
mengamplifikasi DNA 2 aksesi pada aksesi nomor 28, dan 29.
Tabel 4. Hasil Amplifikasi Lima Primer yang Digunakan
No
Nama Primer
Urutan Basa (5'3')
Jumlah Aksesi yang
Tidak Teramplifikasi
No. Aksesi
1
2
3
4
5
OPD-13
OPI-20
OPH-09
OPM-01
OPN-10
ACGCGCATGT
AAAGTGCGGG
GACGCCACAC
ACAACTGGGG
GTTGGTGGCT
1
2
1
1
5
28,29
13
13
Pita yang muncul memiliki ukuran basa dan intensitas pita yang bervariasi.
Perbedaan intensitas pita DNA dipengaruhi oleh sebaran situs penempelan primer
pada genom, kemurnian dan konsentrasi genom dalam reaksi. Banyaknya pita
yang dihasilkan oleh setiap primer tergantung pada sebaran situs yang homolog
pada genom (Williams dkk, 1990). Fragmen yang tidak muncul disebabkan tidak
terjadinya amplifikasi, terjadi karena munkin primer yang digunakan tidak sesuai
dengan DNA cetakan. Beberapa bukti percobaan menunjukkan bahwa perbedaan
satu pasang basa saja sudah cukup menyebabkan ketidaksesuaian cetakan primer
yang kemudian mencegah amplifikasi (William dkk., 1990).
Konsentrasi primer berpengaruh terhadap intensitas produk PCR-RAPD.
Menurut Padmalatha dan Prasad (2006) konsentrasi primer yang terlalu rendah
40
atau yang terlalu tinggi menyebabkan tidak terjadinya amplifikasi. Rasio yang
rendah antara primer dan DNA cetakan dapat menyebabkan produk RAPD yang
dihasilkan tidak konsisten. Magnesium merupakan komponen yang penting dalam
reaksi PCR dan mempengaruhi kualitas profil RAPD yang dihasilkan
(Pharmawati, 2009). Magnesium mempengaruhi penempelan primer serta aktifitas
enzim (Padmalatha dan Prasad, 2006). Konsentrasi MgCl2 yang tinggi juga
mempengaruhi jumlah band yang dihasilkan dan mengakibatkan penurunan
intensitas band tertentu.
Secara umum, hasil penelitian ini menunjukkan bahwa pola pita yang
dihasilkan oleh lima primer yang digunakan memperlihatkan pola pita yang
berbeda. Ukuran pita-pita yang dihasilkan bervariasi antara 320 bp – 2.540 bp.
Total pola pita dari kelima primer yang tampak sebanyak 25 dengan rata-rata 5
pita per primer dengan dengan pita polimorfik sebanyak 21 pita dan pita yang
monomorfik sebanyak 4 pita. Persentase pita yang polimorfik bervariasi sebesar
75% sampai 100% dengan rata-rata 84.20% untuk seluruh primer.
No
Nama
Primer
1
OPD-13
2
OPI-20
3
OPH-09
4
OPM-01
5
OPN-10
TOTAL
Rata-rata
Ukuran
Pita
(bp)
4682462
3201717
5002540
4401791
3861297
Total
Pola
Pita
Persenta
Jumlah Pita
Jumlah
se Pita
Polimorfik Monomorfik Polimor
fik (%)
4
3
1
75%
5
4
1
80%
4
4
0
100%
6
5
1
83%
6
5
1
83%
25
5
21
4.2
4
0.8
421%
84.20%
41
Jumlah pola pita tertinggi terdapat pada primer OPM 01 dan OPN 10 yang
berjumlah 6 pola pita sedangkan jumlah pola pita terendah terdapat pada primer
OPD 13 dan OPH 09 yang berjumlah 4 pola pita. Ukuran pita tertinggi terdapat
pada primer OPH 09 sebesar 2540 bp sedangkan ukuran pita terendah terdapat
pada primer OPI 20 sebesar 320 bp.
Primer OPD-13 menunjukkan pola pita yang berjumlah 4 pita dengan
ukuran pita berkisar 468.238 – 2462.792 bp. Persentase pita polimorfik sebesar
75% dan persentase monomorfis sebesar 25 %.
250 bp
3000 bp
2500 bp
1
2
3
4
5
6
7
9
8
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24 25
26
27
28
29
30
1
2000 bp
1500 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
Gambar 2.Elektroforegram amplifikasi 30 DNA Andaliman dengan primer OPD13, ket ; M = marker ladder 100 bp , Kab Dairi : (1-18), Kab Karo :
(19-21), Dan Kab Simalungun (22-30)
Primer OPI-20 menunjukkan pola pita yang berjumlah 5 pita dengan
ukuran pita berkisar 320.415 – 1717.12 bp . Persentase pita polimorfis sebesar
80% . Dan persentase monomorfis sebesar 20%.
2500 bp
1
2
3
1
3000 bp
2500 bp
2000 bp
1500 bp
1000 bp
750 bp
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
15
1
15
500 bp
250 bp
Gambar 2.Elektroforegram amplifikasi 30 DNA Andaliman dengan primer OPI20, ket ; M = marker ladder 100 bp , Kab Dairi : (1-18), Kab Karo :
(19-21), Dan Kab Simalungun (22-30)
29
30
42
Primer OPH-09 menunjukkan pola pita yang berjumlah 4 pita dengan
ukuran pita berkisar 500 bp – 2540.66 bp. Persentase pita polimorfis sebesar 100
%. Dan persentasse monomorfis sebesar 0 %.
1
2
3
4
5
6
7
9
8
10
11 12
13 14
15
16
17
18
19 20
21
22 23
24
25 26
27
28
29
30
3000 bp
2500 bp
2000 bp
1500 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
Gambar 4.Elektroforegram amplifikasi 30 DNA Andaliman dengan primer OPH09, ket ; M = marker ladder 100 bp , Kab Dairi : (1-18), Kab Karo :
(19-21), Dan Kab Simalungun (22-30)
Primer OPN-10 menunjukkan pola pita yang berjumlah 6 pita dengan
ukuran pita berkisar 386.465 bp – 1297.55 bp. Persentase pita polimorfis sebesar
83 %. Dan persentase monomorfis sebesar 17%.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16 17
18 19
20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
3000 bp
2500 bp
2000 bp
1500 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
Gambar 5. Elektroforegram amplifikasi 30 DNA Andaliman dengan primer OPN10, ket ; M = marker ladder 100 bp , Kab Dairi : (1-18), Kab Karo :
(19-21), Dan Kab Simalungun (22-30)
Primer OPM-01 menunjukkan pola pita yang berjumlah 6 pita dengan
ukuran pita berkisar 440.58 – 1791.54 bp. Persentase pita polimorfis sebesar
83 %. Dan persentase monomorfis sebesar 17 %.
43
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10
11 12
13 14
15
16
17
18
19 20
21
22
23
24 25
26
27 28
3000 bp
2500 bp
2000 bp
1500 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
Gambar 6. Elektroforegram amplifikasi 30 DNA Andaliman dengan primer OPM01, ket ; M = marker ladder 100 bp , Kab Dairi : (1-18), Kab Karo :
(19-21), Dan Kab Simalungun (22-30)
Keberhasilan suatu primer dalam mengamplifikasi DNA cetakan
ditentukan oleh ada tidaknya homologi sekuen nukleotida primer dengan sekuen
nukleotida DNA cetakan. Selain itu juga dipengaruhi oleh kualitas dan kuantitas
DNA, konsentrasi MgCl2, enzim Taq DNA polimerase, dan suhu pelekatan
primer (Wibowo, 2010).
Menurut Yuwono (2006) primer yang tidak spesifik dapat menyebabkan
teramplifikasinya daerah lain dalam genom yang tidak dijadikan sasaran atau
sebaliknya tidak ada daerah genom yang teramplifikasi. Keberhasilan teknik ini
ditentukan oleh ada tidaknya situs penempelan primer, kemurnian DNA dan
keutuhan DNA cetakan (Bardakci, 2001). Konsentrasi DNA genom merupakan
faktor terpenting dalam reaksi amplifikasi. Konsentrasi DNA yang terlalu tinggi
dapat meningkatkan kontaminan yang menggangu reaksi amplifikasi
(Chen, 2000).
Keberhasilan teknik ini lebih didasarkan kepada kesesuaian primer dan
efisiensi dan optimasi proses PCR. Primer yang tidak spesifik dapat menyebabkan
teramplifikasinya daerah lain dalam genom yang tidak dijadikan sasaran atau
sebaliknya tidak ada daerah genom yang teramplifikasi. Optimasi PCR juga
diperlukan untuk menghasilkan karakter yang diinginkan. Optimasi ini
29
30
44
menyangkut suhu denaturasi dan annealing DNA dalam mesin PCR. Suhu
denaturasi yang rendah dapat menyebabkan belum terbukanya DNA utas ganda
sehingga tidak dimungkinkan terjadinya polimerisasi DNA baru. Proses
penempelan primer pada utas DNA yang sudah terbuka memerlukan suhu
optimum, sebab suhu yang terlalu tinggi dapat menyebabkan amplifikasi tidak
terjadi atau sebaliknya suhu yang terlalu rendah menyebabkan primer menempel
pada sisi lain genom yang bukan sisi homolognya; akibatnya dapat teramplifikasi
banyak daerah tidak spesifik dalam genom tersebut. Suhu penempelan (annealing)
ini ditentukan berdasarkan primer yang digunakan yang dipengaruhi oleh panjang
dan komposisi primer (Suryanto, 2003).
Konsentrasi primer berpengaruh terhadap intensitas produk PCR-RAPD.
Menurut Padmalatha dan Prasad (2006) konsentrasi primer yang terlalu rendah
atau yang terlalu tinggi menyebabkan tidak terjadinya amplifikasi. Rasio yang
rendah antara primer dan DNA cetakan dapat menyebabkan produk RAPD yang
dihasilkan tidak konsisten. Magnesium merupakan komponen yang penting dalam
reaksi PCR dan mempengaruhi kualitas profil RAPD yang dihasilkan
(Pharmawati, 2009). Magnesium mempengaruhi penempelan primer serta aktifitas
enzim (Padmalatha dan Prasad, 2006). Konsentrasi MgCl2 yang tinggi juga
mempengaruhi jumlah band yang dihasilkan dan mengakibatkan penurunan
intensitas band tertentu.
Tiap primer menghasilkan jumlah pita DNA yang berbeda. Pita yang
muncul memiliki ukuran basa dan intensitas pita yang bervariasi. Perbedaan
intensitas pita DNA dipengaruhi oleh sebaran situs penempelan primer pada
genom, kemurnian dan konsentrasi genom dalam reaksi. Banyaknya pita yang
45
dihasilkan oleh setiap primer tergantung pada sebaran situs yang homolog pada
genom (Williams et al., 1990). Adanya perbedaan pola pita yaitu berdasarkan
jumlah dan ukuran pita menggambarkan adanya genom tanaman yang sangat
kompleks (Grattapaglia et al., 1992).
Menurut Demeke dan Adams (1994), amplifikasi DNA dengan primer
acak pada analisis RAPD biasanya menghasilkan 5-20 fragmen untuk setiap
primer. Jumlah fragmen hasil amplifikasi dengan RAPD memang lebih rendah
dibandingkan dengan hasil amplifikasi menggunakan AFLP (Haris et al., 2003).
Kelemahan RAPD adalah pemunculan pita DNA kadang–kadang tidak
konsisten. Hal ini lebih sering terjadi jika suhu annealing yang digunakan terlalu
tinggi. Dalam analisis kekerabatan, hal ini dapat diatasi dengan menggunakan
primer yang lebih banyak. Ruas DNA yang berulang sering berlipat ganda,
homologi urutan nukleotida pada pita-pita DNA dengan mobilitas yang sama pada
gel tidak diketahui, penanda RAPD bersifat dominan dan tingkat keberulangannya
(reproducibility) rendah (Demeke dan Adams, 1994)
46
Analisis Hubungan Genetik Andaliman
Berdasarkan elektroforesis hasil amplifikasi dengan menggunakan
program software Darwin 5.05 (Perrier dan Jacquemoud-Collet, 2009) dari 30
aksesi yang dianalisis hanya 26 aksesi yang diproses oleh software, karena ada
beberapa aksesi yang tidak memenuhi persentasi yang distandarkan.
Gambar 7. Pohon filogenik 30 aksesi andaliman dari 3 kabupaten (Dairi,Tanah
Karo dan Simalungun) yang dianalisis berdasarkan Matrix
Dissimilarity Simple Matching).
47
Data biner hasil skoring amplifikasi 5 primer yang diolah dengan software
DARwin dihasilkan radial filogenetik yang menunjukkan kekerabatan aksesi
andaliman dimana 26 aksesi andaliman yang dikelompokkan menjadi 3
klustering. Kluster I terbagi lagi menjadi 2 subkluster yaitu : subkluster IA dan
subkluster IB. Subkluster IA terdiri dari aksesi yang berasal dari Dairi (D18),
Karo (K2 dan K3) , dan Simalungun (S2, S3, S5 dan S8) yang mengelompok
secara acak (D, K dan S). Subkluter IB terdiri dari aksesi yang berasal dari
Simalungun (S1 dan S4).
Kluster II terbagi lagi menjadi 2 subkluster yaitu subkluster IIA dan IIB.
Subkluster IIA terdiri atas aksesi yang berasal dari Dairi (D3, D7, D8, D9, D10,
D11, dan D12), dan subkluster IIB terdiri dari aksesi yang berasal dari Dairi (D2
dan D4) .
Kluster III terbagi lagi menjadi 3 subkluster yaitu subkluster IIIA dan IIIB.
Subkluster IIIA terdiri atas aksesi yang berasal dari Dairi (D1, D14 dan D15),
Simalungun (S9). Dan subkluster IIIB terdiri dari aksesi yang berasal dari Dairi
(D13) dan Simalungun (S6 dan S7). Hasil clustering menunjukkan bahwa
keragaman genetik dari andaliman pada 3 kabupaten tersebut adalah tinggi.
Hasil klustering 3 aksesi andaliman, dapat dilihat bahwa pada kelompok
kedua, yang terdiri dari subkluster IIA dan IIB merupakan aksesi yang berasal
dari 1 kabupaten yaitu kabupaten Dairi . Pada kelompok kedua ini tidak terdapat
aksesi yang berasal dari kabupaten lain , meskipun aksesi dari kabupaten dairi
lainnya menyebar pada kelompok yang lainnya.
Pengelompokkan tersebut menunjukkan bahwa penggelompokkan tidak
berdasarkan warna daun andaliman yang beberapa berwarna hijau, hijau
48
kemerahan dan merah. Setiap jenis andaliman yang berbeda berwarna daun sama
menyebar pada ketiga kelompok tersebut. Hal ini menunjukkan bahwa perbedaan
secara morfologi tidak menentukan bahwa perbedaan tersebut dipengaruhi oleh
faktor genetik.
Menurut Sitanggang dan Habeahan (1999) ada tiga jenis andaliman yang
terdapat di kawasan Danau Toba yaitu : Sihorbo (buah besar, kurang aromatis dan
produksi rendah ), Simanuk ( buah kecil, aroma dan rasa lebih tajam dari Sihorbu)
dan jenis Sitanga (aroma sangat tajam sehingga lebih mirip bau kepinding,
produksi tinggi namun kurang disenangi masyarakat). Ketiga jenis andaliman ini
merupakan pengelompokkan masyarakat secara morfologi dan pengamatan visual
yang tidak terukur. Dari hasil filogenetik andaliman dengan marka RAPD ini juga
dapat dilihat bahwa andaliman dapat dikelompokkan menjadi 3 kelompok besar ,
namun tidak dapat dihubungkan dengan pengelompokkan secara morfologi secara
spesifik untuk setiap sampel aksesi andaliman tersebut.
Menurut Zulhalmi (2013) informasi keragaman genetik tanaman pada
tingkat individu , spesies maupun populasi perlu diketahui sebagai dasar
pertimbangan dalam menyusun strategi konservasi, pemuliaan , pengelolaan, dan
pemanfaatan sumber daya genetik tanaman secara berkelanjutan. Dari filogenetik
dari 25 aksesi andaliman dapat dilihat bahwa andaliman memiliki tingkat
keanekaragaman yang tinggi , dimana menurut Hutami (2006) Keragaman genetik
ini dapat dimanfaatkan untuk merakit varietas unggul.
49
II
IIA
IIB
IB
IIIB
I
III
IIIA
IA
Gambar 8. Profil radial neighbor-joining 25 aksesi andaliman dari 3 kabupaten
(Dairi, Tanah karo, dan Simalungun) yang dianalisis berdasarkan
Matrix Dissimilarity Simple Matching.
50
Hasil skoring pada setiap fragmen pita DNA yang terbentuk setelah
amplifikasi dapat diketahui kekerabatan setiap aksesi andaliman dari 3 kabupaten
tersebut. Nilai bootstrap pada 1000 mereplikasi untuk mengetahui tingkat
kekerabatan pengelompokkan ditunjukkan pada (Gambar 9).
Factorial analysis: (Axes 1 / 2)
.25
D6
.2
.15
S2
.1
K3
D10
.05
D7D12
S4 S1
S3
-.25
-.2
S5
-.15
-.1
D9
D11
S8
K2
-.05
D4.05
D2
D3
.1
.15
D8
D18
-.05
S7
D13
D15
D14
D1
S6
-.1
S9
-.15
Gambar 9. Faktorial analisis (Principal Coordinate Analysis )
Lampiran 1. Gambar Sampel Aksesi Andaliman
Gambar Andaliman Dairi
Gambar Andaliman Karo
57
Gambar Andaliman Simalungun
58
Lampiran 2. Pembuatan Larutan Stok dan Buffer
A. Pembuatan Larutan Stok
•
CTAB 5 % (100 ml): Timbang NaCl sebanyak 2.0 gram dan CTAB sebanyak
5.0 gram. Masukkan bahan kimia ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 100 ml
aquades. Aduk campuran larutan dengan menggunakan stirrer kemudian
diletakkan diatas hote plate.
•
Tris HCl 1 M pH 8.0 (100 ml): Timbang Tris
sebanyak 12.114 gram.
Masukkan Tris ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 80 ml aquades. Aduk
campuran larutan dengan menggunakan stirrer kemudian diletakkan diatas hote
plate. Selanjutnya, ditambahkan 4.2 ml HCl pekat sedikit demi sedikit sampai pH
mencapai 8. Masukkan ke dalam gelas ukur, kemudian volume ditepatkan
dengan aquades hingga volume larutan menjadi 100 ml.
•
Tris HCl 1 M pH 7.4 (50 m): Timbang Tris sebanyak 6.057 gram. Masukkan
Tris ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 30 ml aquades. Aduk campuran
larutan dengan menggunakan stirrer kemudian diletakkan diatas hote plate.
Selanjutnya, ditambahkan NaOH 2.5 M sedikit demi sedikit sampai pH mencapai
7.4. Masukkan ke dalam gelas ukur, kemudian volume ditepatkan dengan
aquades hingga volume larutan menjadi 50 ml.
•
EDTA O.5 M pH 8.0 (100 ml): Timbang EDTA sebanyak 18.612 gram dan
NaOH 2.0 gram. Masukkan bahan kimia ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan
80 ml aquades. Aduk campuran larutan dengan menggunakan stirrer kemudian
diletakkan diatas hote plate. Selanjutnya, ditambahkan HCl pekat sedikit demi
sedikit sampai pH mencapai 8. Masukkan ke dalam gelas ukur, kemudian
volume ditepatkan dengan aquades hingga volume larutan menjadi 100 ml.
59
•
NaCl 5 M (l00 ml): Timbang NaCl sebanyak 29.22 gram. Masukkan ke dalam
erlenmeyer dan ditambahkan 80 ml aquades. Aduk campuran larutan dengan
menggunakan stirrer kemudian diletakkan diatas hote plate. Masukkan ke dalam
gelas ukur, kemudian volume ditepatkan dengan aquades hingga volume larutan
menjadi 100 ml.
**Semua bahan di atas disterilkan dengan menggunakan autoklaf kecuali CTAB 5%.
B. Pembuatan Larutan Buffer
•
Buffer Ekstraksi/CTAB (100 ml): Campurkan 40 ml CTAB 5%, 25.1 ml NaCl
5 M, 4 ml EDTA 0.5 M pH 8.0, 10 ml Tris HCl 1 M pH 8.0 dan 20.8 ml aquades.
•
Buffer TAE 50 X (100 ml): Campurkan 24.2 ml Tris HCl 1 M pH 7.4, 5.7 ml
Asam Asetat Glasial, 10 ml EDTA 0.5 M PH 8.0, dan aquades hingga volume
larutan menjadi 100 ml.
•
Buffer TAE 1X (500 ml): Campurkan 10 ml Buffer TAE 50 X dan 490 ml
aquades.
•
Buffer TE (50 ml): Campurkan 0.5 ml Tris HCl 1 M PH 8.0, 0.1 ml EDTA 0.5
M PH 8.0 dan 49.4 ml aquades.
•
Kloroform Isoamilalkohol 24 : 1 (50 ml): Campurkan 48 ml Kloroform dan 2
ml Isoamilalkohol.
•
Etanol 70 % (100 ml): Campurkan 70 ml Etanol dan 30 ml aquades.
60
Lampiran 3. Alur Penelitian
Sampel DNA Andaliman
Isolasi DNA
Uji Kualitas
Uji Kuantitas
Proses PCR-RAPD
Elektroforesis
Analisis Hasil Amplifikasi PCR-RAPD
61
Lampiran 4. Proses Isolasi DNA
Sampel daun andaliman ditimbang 0.2 gram dan digerus sambil
ditambahkan nitrogen cair dan PVPP
Sampel dimasukkan ke dalam tabung yang bberisi 1 ml buffer
ekstraksi dan 10 µl β-mercaptoetanol
Tabung di vortex dan diinkubasi dalam waterbath selama 30
menit pada suhu 650C
Supernatan ditambahkan 1 ml KIAA (24:1) dan disentrifus
dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit
Supernatan ditambahkan 1 ml KIAA (24:1) dan disentrifus
dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit
Supernatan ditambahkan 1 ml isopropanol dan diinkubasi pada
suhu 40C selama semalama
Tabung disentrifus pada pada kecepatan 13.000 rpm selama 10
menit dan dikeringkan
Pelet dilarutkan dengan buffer TE 100µl
Campuran ditambahkan dengan etanol absolute dingin dan
diinkubasi dalam freezer (-200C) selama 30 menit
Campuran disentrifus dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit
Pelet dicuci dengan etanol 70% dan dikeringkan
Pelet dilarutkan dengan 100 µl buffer TE
Stok DNA disimpan dalam freezer (-200C)
62
Lampiran 4. Proses PCR-RAPD
Komposisi Master Mix volume 25 µl :
Go Taq PCR 12.5 µl
Nuclease free water 9.5 µl
Primer 1 µl
DNA sampel 2 µl
Running PCR sebanyak 45 siklus :
Denaturasi awal 940C 2 menit
Denaturai 940C 1 menit
Annealing 360C 1 menit
Extension 720C 2 menit
Post extension 720C 10 menit
Kondisi akhir PCR 40C tak terbatas
Proses running dimulai selama
kurang lebih 4 jam
63
Lampiran 5. Proses elektroforesis hasil PCR-RAPD
Agar rose 2.6 gram ditambahkan
dengan 130 ml buffer TAE 1 x
Campuran dipanaskan dengan hot
plate
Campuran ditambahkan 1.5 µl EtBr
Larutan gel dituang kedalam cetakan
yang telah dipasang sisir
Gel yang telah mengeras
dipindahkan ke dalam chamber
berisi buffer TAE 1 x
Sampel hasil PCR, marker dan
loading dye dimasukkan ke dalam
sumur gel dengan perbandingan
(8:5:2)
Alat elektroforesis dihubungkan
dengan power supply 80 volt
Proses running dimulai selama 15
menit
64
Lampiran 6. Foto Uji Kuantitas
Gambar 10. Alat spektrofotometer
Gambar 11. Hasil Uji kuantitas
65
Lampiran 7. Hasil Uji Kuantitas Tanaman Andaliman
Kode
Sampel
1
2
3
²
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
Konsentrasi DNA
(ng/µl)
3041
2201
796
1769
2476
97.1
2398
1073
1367
2046
1335
1524
1417
1211
1415
937
1340
823
1551
1801
2100
2204
2337
2951
2612
3760
221
1422
2891
3757
Kemurnian
260/280
2.018
2.078
2.089
2.014
2.016
1.143
1.31
2.075
2.077
2.113
2.052
1.975
2.079
2.079
2.075
1.969
2.044
1.926
2.061
2.073
2.007
2.05
2.019
2.1
2.11
1.625
1.596
1.934
2.127
2.08
66
Lampiran 8. Hasil Fotosintesis
Gambar 12. Hasil elektoroforesis dengan Primer OPD-13
Gambar 13. Hasil elektroforesis dengan Primer OPI-20
Gambar 23. Hasil elekroforesis dengan Primer OPH-09
67
Gambar 14. Hasil elektoforesis dengan Primer OPN-10
Gambar 15. Hasil elektroforesis dengan Primer OPM-01
68
Lampiran 9. Hasil Skoring Pita 30 Individu Pada Kelima Primer
Tabel 5. Hasil scoring pita andaliman pada kelima primer
OPD13
1
2
3
4
1
0
0
1
2
1
1
3
1
4
OPI20
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
0
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
0
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
2
3
4
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
5
1
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
3
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
4
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
0
1
0
0
0
5
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
0
0
0
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
1
1
2
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
0
0
1
0
0
1
0
1
1
0
1
1
1
1
0
3
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
4
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
OPH09
OPN10
3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
4
1
1
1
1
1
1
1
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
69
5
0
1
0
1
0
1
1
0
1
1
0
1
0
0
1
1
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
6
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
OPM01
1
13
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
3
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
4
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
5
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
6
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
1
0
0
0
0
Ket: “1” = ada
“0” = kosong
70
Lampiran 10. Matriks Jarak Ketidaksamaan Genetik Tanaman Andaliman
Units
1
2
3
4
6
7
8
9
10
11
12
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
2
0.10
3
0.03
0.07
4
0.10
0.00
0.07
6
0.48
0.36
0.46
0.36
7
0.13
0.03
0.10
0.03
0.38
8
0.03
0.07
0.00
0.07
0.46
0.10
9
0.10
0.00
0.07
0.00
0.36
0.03
0.07
10
0.17
0.07
0.14
0.07
0.38
0.10
0.14
0.07
11
0.14
0.17
0.11
0.17
0.36
0.20
0.11
0.17
0.26
12
0.10
0.00
0.07
0.00
0.36
0.03
0.07
0.00
0.07
0.17
14
0.15
0.19
0.12
0.19
0.39
0.21
0.12
0.19
0.28
0.25
0.19
15
0.15
0.19
0.12
0.19
0.39
0.21
0.12
0.19
0.28
0.25
0.19
0.00
16
0.13
0.03
0.10
0.03
0.33
0.06
0.10
0.03
0.10
0.21
0.03
0.15
0.15
17
0.26
0.14
0.23
0.14
0.25
0.17
0.23
0.14
0.15
0.36
0.14
0.13
0.13
0.11
18
0.39
0.42
0.36
0.42
0.50
0.36
0.36
0.42
0.45
0.33
0.42
0.26
0.26
0.39
0.40
19
0.17
0.07
0.14
0.07
0.38
0.10
0.14
0.07
0.14
0.26
0.07
0.20
0.20
0.03
0.15
0.36
20
0.20
0.23
0.17
0.23
0.45
0.26
0.17
0.23
0.33
0.30
0.23
0.05
0.05
0.20
0.18
0.22
0.17
21
0.07
0.10
0.04
0.10
0.52
0.13
0.04
0.10
0.19
0.15
0.10
0.17
0.17
0.14
0.28
0.43
0.19
0.22
22
0.03
0.07
0.00
0.07
0.46
0.10
0.00
0.07
0.14
0.11
0.07
0.12
0.12
0.10
0.23
0.36
0.14
0.17
0.04
23
0.21
0.24
0.19
0.24
0.44
0.27
0.19
0.24
0.26
0.31
0.24
0.17
0.17
0.29
0.20
0.43
0.33
0.22
0.23
0.19
24
0.07
0.16
0.10
0.16
0.48
0.19
0.10
0.16
0.24
0.21
0.16
0.23
0.23
0.20
0.33
0.48
0.24
0.28
0.14
0.10
0.29
25
0.07
0.10
0.03
0.10
0.48
0.13
0.03
0.10
0.17
0.14
0.10
0.15
0.15
0.13
0.26
0.39
0.17
0.20
0.07
0.03
0.21
0.13
26
0.19
0.21
0.15
0.21
0.50
0.24
0.15
0.21
0.23
0.12
0.21
0.30
0.30
0.26
0.42
0.30
0.31
0.36
0.20
0.15
0.36
0.19
0.19
27
0.07
0.17
0.11
0.17
0.44
0.20
0.11
0.17
0.26
0.08
0.17
0.25
0.25
0.21
0.36
0.33
0.26
0.30
0.15
0.11
0.31
0.14
0.14
0.12
30
0.30
0.42
0.36
0.42
0.50
0.44
0.36
0.42
0.45
0.33
0.42
0.26
0.26
0.39
0.40
0.25
0.45
0.33
0.43
0.36
0.43
0.39
0.39
0.30
27
0.24
71
Lampiran 11. Faktorial Koordinat
Tabel 13. Faktorial Analisis (PCoA)
1
2
3
4
6
7
8
9
10
11
12
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
30
Axis
Coord.
0.0041
0.0343
0.0378
0.0343
0.0027
0.0551
0.0739
0.1476
0.0714
0.0277
0.0615
-0.0648
-0.0329
-0.0003
-0.0292
-0.2003
-0.0122
-0.0898
0.0314
0.0096
-0.0054
0.0596
0.0209
-0.0286
-0.0209
-0.1876
Cos²
5
2808
1800
2808
0
452
619
1001
350
77
1714
1033
208
0
64
907
16
604
130
-156
2
114
87
50
61
802
Axis 2
Coord.
-0.0702
-0.0042
-0.0111
-0.0042
0.2270
0.0271
-0.0242
0.0203
0.0508
0.0133
0.0261
0.0112
0.0510
0.0242
0.1005
0.0125
0.0248
0.0088
-0.0676
-0.0427
0.0124
-0.1254
-0.0546
-0.0935
-0.0690
-0.0433
Cos²
1604
43
154
43
873
110
67
19
176
18
308
31
501
300
758
4
65
6
604
-3063
10
506
594
531
661
43
Axis 3
Coord.
-0.0018
0.0147
-0.0122
0.0147
-0.0964
0.0044
0.0038
0.0283
-0.0263
-0.0957
-0.0082
0.0308
0.0060
0.0262
0.0568
0.0199
0.0779
0.0850
0.0397
0.0153
0.0298
-0.0393
0.0261
-0.0678
-0.0575
-0.0741
Cos²
1
515
186
515
158
3
2
37
47
924
30
233
7
350
242
9
640
541
209
-391
57
50
136
279
459
125
Axis 4
Coord.
-0.0285
-0.0041
0.0098
-0.0041
-0.0391
0.0534
0.0257
0.0395
0.0339
0.0421
0.0067
-0.0342
-0.0075
-0.0052
-0.0569
0.0972
0.0323
-0.0123
0.0021
0.0000
-0.0702
-0.0927
0.0005
0.0544
-0.0079
-0.0349
Cos²
265
39
122
39
26
425
75
72
79
179
20
288
11
14
243
214
110
11
1
0
320
277
0
180
9
28
Axis 5
Coord.
0.0046
0.0331
-0.0313
0.0331
-0.0012
0.0094
-0.0586
-0.0087
0.0526
-0.0521
0.0074
-0.0256
-0.0608
0.0382
0.0422
0.0006
0.0457
-0.0368
-0.0183
-0.0066
-0.0370
0.0237
-0.0129
0.0360
0.0052
0.0180
Tabel 14. Nilai Factorial coordinates
Axis
1
2
3
4
5
\
Eigenvalue
0.00537
0.00449
0.00221
0.00167
0.00106
Inertia%
25.52
21.3
10.51
7.93
5.02
Cos²
7
2614
1232
2614
0
13
389
4
189
274
25
161
713
744
134
0
220
101
44
-74
89
18
33
79
4
7
53
DAFTAR PUSTAKA
Azizah, A. 2009. Perbandingan Pola Pita Amplifikasi Dna Daun, Bunga Kelapa
Sawit Normal dan Abnormal. Institut Pertanian Bogor . Bogor
Andayanie, L. 2000. Kajian Daya Insektisida Alami Nabati Kulit Buah Manggis
(Garcinia mangostana L), buah Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium
DC.), getah Gambir (Uncaria gambir Roxb.)dan daun the (Camellia sintetis
L.) terhadap perkembangan hama gudang Sitophilus zeamais Motsch.
Skripsi. Bogor: Fakultas Teknologi pertanian IPB. Hal. 36.
Bahagiawati. 2011. Peran Markah Molekuler Dalam Pemuliaan Tanaman. Badan
Litbang Pertanian. Edisi 16-22 Maret 2011 No.3397 Tahun XLI.
Bardakci,F. 2001. Random Ampilfied Polymorphic DNA (RAPD) markers. Turk.J.
Biol. 25: 185-37.
Elfrod, S. dan Stansfield, W. 2007. Genetika. Edisi Keempat. Penerjemah
:Damaring, T. W. Penerbit Erlangga. Jakarta.
Ferreira, M.E dan D. Gratapaglia.1998. Introducao ao uso de marcadores em
analise genetic. Embrapa-Cenargen.Brasilia.
Hasairin, A. 1994. Etnobotani Tanaman Rempah dalam Makanan Adat
Masyarakat Batak Angkola Dan Mandailing. Thesis. Bogor: Program
Pascasarjana IPB
Hsuang, Keng, 1978. Orders and Families of Malayan Seed Plants. Dalam Wijaya
, C.H. 1999. Andaliman, Rempah tradisional Sumatera Utara dengan
aktivitas antioksidan dan antimikroba. Bul.Teknol. dan Industri Pangan.
10(2): 58-65.
Hutami,S., I.Mariska, dan Y.Supriati. 2005 . Peningkatan Keragaman Genetik
Tanaman melalui Keragaman Somaklonal. J. Agro. Biogen.2(2):81-88.
Jones, C.J., K.J. Edwards, S. Castagiole, M.O.Winfield, F. Sala, C. van del Wiel,
G. Bredemeijer, B. Vosman, M. Matthes, A. Dally, R. Brettsshneider, P.
Bettini, M, Buiatti, E. Maestri, A. Malcevschi, N.Marmiroli,R. Aert, G.
Volkaert, J. Rueda, R. Linacero, A. Vasques and A. Karp. 1997. A
Reproducibility testing of RAPD, AFLP and SSR markers in plants by a
network of European laboratories. Molecular Breeding 3 (5): 382-390
Lim, L.S, R. Wickneswari, S. L. Lee and A. Latif. 2002. Genetic variation of
Dryobalanops aromatica Gaertn. F. (Dipterocapaceae) in Peninsular
Malaysia using microsatellite DNA markers. Forest Genetics 9 (2) : 125136.
54
Karsinah, Sudarsono, Setyobudi, L., dan Aswidionnoor, H., 2002.
Keanekaragaman
Genetik
Plasma
Nutfah
jeruk
berdasarkan
AnalisisPenanda RAPD. Jurnal Bioteknologi Pertanian 7 (1) : 8-16
Maftuchah dan A. Zainuddin. 2013. Studi Pendahuluan variasi genetik jarak pagar
(Jatrpha curcas L.) lokal berdasarkan Random Amplified Polymorphic DNA
. Pusat pengembangan Bioteknologi universitas Muhammadiyah Malang
(123-131).
Mahardika, I.G.N.K. 2003. Polymerase Chain Reaction. Laboratorium Virologi.
Fakultas Kedokteran Hewan.Universitas Udayana. Denpasar.
Mangoendidjojo, W., 2003. Polymerase Chain Reaction. Laboratorium Virologi.
Fakultas Kedokteran Hewan. Universitas Udayana. Denpasar.
Mulia,L.2000. Kajian Aktivitas Antimikroba Andaliman (Zanthoxylum
acanthopodium ) dan Antarasa (Litsea cubeba). Skkripsi . Institut Pertanian
Bogor .Bogor, hlm 7-21.
Murray, RK, Graner DK, Mayes PA Rodwell VW. 2000. Biokimia Harper.
Andry H, penerjemah; Anna PB, Tiara MN, editor. Jakarta: Penerbit Buku
Kedokteran EGC. Terjemahan dari: Harper’s Biochemistry.
Napitupulu,B., Sorth,S., dan Mery, S., 2004. Potensi andaliman sebagai Food
Additive tradisional etnis batak Sumatera Utara. BPTP Sumatera Utara.
Medan, Hlm. 53-56
Pandin , D.S., 2010. Penanda DNA untuk Pemuliaan Tanaman kelapa (Cocos
nucifera L.) Perspektif 9 (1) ;21-35.
Parhusip, A.J., Posman S., Adelina T. 1999. Studi Tentang Aktifitas Antimikroba
Alami pada Andaliman. Seminar Nasional Teknologi Pangan.
Prana,T.K dan S.N Hartati. 2003. Identifikasi sidik jari DNA Talas (Colocasia
esculenta L.Schott) Indonesia dengan teknik RAPD. Jurnal Natur Indonesia
5(2): 107-112.
Rahayu, E.S., dan S., Handayani, 2010. Keragaman genetik pandan asal Jawa
Barat berdasarkan penanda inter simple sequence repeat. Marka Sains 14 ;
158-162.
Rholf, F. J. 2000.NT SYS-pc: Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis
System Version 2.1 User Guide. Department of Ecology and Evolution
State University of New York.
Sabri,dkk. 2008. Peningkatan dan Pemanfaatan dan Kualitas Tanaman Andaliman
(Zantholium acanthopodium DC) di Sumatera Utara. Laporan Penelitian
hibah Bersaing. FMIPA Universitas Sumatera Utara, Medan.
55
Setiyo, I.E., 2001. Pemetaan dan Keragaman Genetik RAPD pada Kelepa Sawit
sungai pancur (RISPA). Tesis. Program Pascasarjana IPB. Bogor.
Simajuntak, SP. 2006. Perkecambahan Biji Andaliman (Zanthoxylum
acanthopodium DC) Deskripsi dan Perkecambahan. Hayati Vol.10 No.1
Siregar, B.L., 2003. Andaliman (Zanthoxylum Acanthapodium DC.) di Sumatera
Utara; Deskripsi dan Perkecambahan. J. Hayati hlm. 38-40.
Suryanto D. 2003. Melihat Keanekaragaman organisme melalui beberapa teknik
genetika molekuler . USU Digital Library
[terhubung berkala].
http://www.library.usu.ac.id/modules.php [07 Maret 2015.
Wijaya, C. H. 1999. Andaliman, Rempah Tradisional Sumatera Utara Dengan
Aktivitas Antioksidan dan Antimikroba. Bul. Teknol. Dan Industri Pangan.
10(2).
Wijaya, C.H. 2000. Isolasi dan Identifikasi senyawa trigeminal aktif buah
andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC). Hayati 7:9-95.
Yuwono, T., 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Penerbit Andi.
Yogyakarta
26
METODE PENELITIAN
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran
Universitas sumatera Utara, Medan yang akan dimulai pada bulan April 2015
sampai dengan bulan September 2015.
Bahan dan Alat
Bahan tanaman digunakan dalam penelitian ini adalah materi genetik
DNA Andaliman yang sudah di isolasi peneliti yang sebelumnya Sinaga (2014)
pada tiga populasi alami tanaman aren hasil koleksi dari berbagai lokasi di
Sumatera Utara
Bahan kimia digunakan adalah adalah cetyl trimethylammonium bromide
(CTAB) 5%, NaCl, Tris, HCl, NaOH, isopropanol, ethylenediamine tetraacetic
(EDTA), Asam Asetat Glasial, agarose, Ethidium Bromide (EtBr), kloroform,
isoamilalkohol, β-Mercaptoethanol, polyvinilpyrolidone (PVPP), etanol 70%,
etanol absolut, DNA Marker I00 bp Ladder, Go Taq ® Green Master Mix,
nitrogen cair, loading dye, aquades, aquabidestila dan Primer OPD-13, OPI-20,
OPH-09. OPM-01 dan OPN-10.
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah gunting, timbangan
digital, hotplate, mortar, centrifuge, freezer, vortex, freezer, tabung eppendorf 2
ml dan 1,5 ml, mikropippete 1-50 µl, 100-500 µl dan 200-1000 µl, sarung tangan
karet, tip pipet kristal, kamera,oven, pH meter, pengaduk magnetik, alat-alat gelas
(beaker gelas, erlenmeyer, dll), UV Transluminator (UV Tec Cambridge 20 UV),
elektroforesis (Power PAC 3000, Biorad), PCR (Therma Cycler), Gel-Doc (UV
Cambridge), power supply, alat tulis.
27
Metode Penelitian
Metode penelitian yang digunakan adalah Metode RAPD (Random
Amplified Polymorphic DNA) berdasarkan PCR (Polymerase Chain Reaction)
yang mengamplifikasi sekuen DNA secara acak.
28
Pelaksanaan Penelitian
Pengambilan Sampel Daun
Daun andaliman yang digunakan adalah daun dari populasi alam di daerah
kabuupaten dairi dan sekitarnya. Daun dipilih yang masih muda/lembut berwana
hijau kemerahan, kemudian dicuci bersih , dilap pakai tisu dan kemudian dibawa
ke Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran.
Isolasi DNA
Tahapan isolasi yang dilakukan adalah daun andaliman dibuang tulang
daunnya lalu dicuci dan dikeringkan dengan tisu dan ditimbang masing-masing
0,1-0,3 gram. Daun dipotong halus dengan gunting secara melintang. Daun
andaliman digerus menggunakan mortar sambil ditambahkan nitrogen cair dan
PVPP. Setelah halus, sampel dimasukkan ke dalam tabung sentrifus yang berisi 1
ml buffer ekstraksi dan β-mercaptoetanol 10 µl kemudian tabung dikocok
menggunakan vortex lalu tabung diinkubasi dalam waterbath selama 30 menit
pada suhu 650C. Setiap 10 menit sekali tabung dibolak balik dengan perlahanlahan. Setelah itu, tabung diinkubasi pada suhu ruang selama 4-5 menit lalu 1 ml
kloroform:isoamilalkohol (24:1) ditambahkan ke dalam tabung.
Tabung disentrifus dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu ruang selama
10 menit. Supernatan yang diperoleh dipindahkan pada tabung sentrifus lain, lalu
1 ml kloroform:isoamilalkohol (24:1) ditambahkan ke dalam tabung lalu tabung
dikocok menggunakan vortex dan tabung disentrifus lagi dengan kecepatan
13.000 pada suhu ruang rpm selama 15 menit. Supernatan yang diperolah
dipindahkan lalu 1 ml isopropanol dingin ditambahkan ke dalam tabung.
Supernatan dihomogenkan dengan membolak-balik tabung lalu tabung disimpan
29
dalam lemari es (40C) selama satu malam kemudian tabung disentrifus kembali
dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit. Supernatan yang
diperoleh dibuang kemudian pelet dikeringanginkan. Pelet yang sudah kering
dilarutkan dengan buffer TE sebanyak 100 µl kemudian tabung dispin manual
hingga homogen.
Kemudian etanol absolut dingin ditambahkan lalu dibolak-balik hingga
homogen. Setelah itu, supernatan diinkubasi dalam freezer (-200C) selama 2 jam
kemudian supernatant disentrifus lagi dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu
40C selama 10 menit. Supernatan dibuang sedangkan pelet dicuci menggunakan
etanol 70% dan pellet dikeringanginkan. Pelet DNA yang sudah kering dilarutkan
dengan 100 µl buffer TE. Simpan DNA dalam freezer (-200C).
Uji Kuantitas DNA
Pengujian dilakukan dengan menggunakan alat spektrofotometri. Larutan
stok DNA diambil sebanyak 2 µl, kemudian alat dijalankan. Absorbansi (A)
diukur pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Tingkat kemurnian DNA
ditentukan dengan nilai perbandingn A260/A280. Menurut Wilson dan Walker
(2010), sampel DNA murni akan menghasilkan rasio A260/A280 berkisar 1.8-2.0.
Nilai kemurnian yang lebih dari 2.0 menunjukkan bahwa sampel mengandung
kontaminan RNA, sedangkan nilai kemurnian yang kurang dari 18 menunjukkan
bahwa sampel mengandung kontaminan protein (Yuwono, 2006).
Amflifikasi dan Genotyping
Amflifikasi
mengikuti prosedur baku analisis RAPD, sesuai prosedur
Wiliiam et al., (1990). Amflifikasi dilakukan dengan menggunakan 5 primer
polimefrik,yaitu OPD-13, OPI-20, OPH-09, OPM-01, OPN-10.
30
Sebelum running PCR dilakukan pengenceran DNA dengan mengambil 5
ɰl stok DNA dan ditambahkan 45 µ ml ddH2O sehinnga diperoleh 50 µl aliquot
DNA . kemudian dilakukan pengenceran primer yaitu tube primer disentrifius 5
menit setelah itu ditambahkan dd H2O sesuai ukuran molar. Dibuat aliquot primer
yaitu dengan mengambil 10-15 ɰl stok primer.
Persiapan awal PCR adalah mencairkan komponen untuk running PCR yaitu
paket PCR produksi Promega dalam kotak berisi pecahan es. Untuk
mempermudah pembuatan larutan master dimisalkan 5 sampel yang akan
digunakan maka larutan master terdiri atas :dd H²O 9.5 ɰ x 5= 47.5 ɰl, Go tag
12,5 x 5 = 62,5 ɰl, aliquot primer 1 ɰ x 5 = 5 ɰl. Dari tube diambil 23 ɰl ke
tube yang lain sehingga diperoleh 20 tube untuk PCR dan ditambahkan masingmasing DNA sebanyak 2 ɰl. Kemudian tabung dispin manual. Tabung berisi stok
DNA
dan campuran master dimasukkan dalam block sampel dimesin PCR
dengan suhu annealing 36ºC. Reaksi amplifikasi Gene Amp PCR Applied
Biosystem di desain waktu,suhu dan jumlah siklus termal 45 kali (3 jam 51 menit)
berdasarkan yang digunakan peneliti Setiyo (2001).
Proses amplifikasi PCR
dapat dilihat pada tabel 1.
Tabel 1. Siklus, proses, suhu dan waktu dalam amplifikasi DNA 30 aksesi
andaliman
Tahapan
Proses
Suhu ºC
Waktu
I ( 1 siklus )
Pre Denaturasi
94
2 menit
II ( 45 siklus )
Denaturasi
94
1 menit
Penempelan
36
1 menit
Elongasi
72
1 menit
Post Elongasi
72
10 menit
III ( 1 siklus )
31
Setelah reaksi PCR selesai DNA hasil amplifikasi disimpan dalam suhu
±20º C bila sedang tidak digunakan.
Elektroforesis
Sebelum dilakukan elektroforesis disiapkan gel agarose konsentrasi 2 %
(b/v). Agarose ditimbang 2,6 g kemudian dilarutkan dengan menambahkan 130
ml buffer TAE 1x. Larutan tersebut dimasukan ke dalam elenmeyer, kemudian
dipanaskan dan diaduk dengan pengaduk magnetik hingga larutan menjadi
bening. Setelah larutan dipanaskan kemudian didingikan ditambah larutan etidium
bromide 1 µl kemudian dipanaskan kembali lalu didinginkan dengan cara yang
sama. Setelah larutan agak dingin ( suhu ± 60º C) larutan dimasukkan dalam
cetakan agar yang telah dipasang sisir pembuat lubang ( well-forming combs) dan
dibiarkan memadat selama ± 45 menit atau sampai gel mengeras. Well-forming
combs dilepas secara perlahan dan gel agarose siap digunakan untuk
elektroforesis.
Untuk elektroforesis tray yang berisi gel agarose diletakkan dalam tank
elektroforesis dan larutan buffer TAE 1x dituang ke dalam tank tersebut ± 500 ml
(hingga terendam) hingga 1 mm diatas permukaan gel atau sampai batas yang
telah ditemukan. Contoh DNA yang telah disiapkan dimasukkan ke dalam sumur
pada gel.
Setelah semua sampel dimasukkan ke dalam sumur (well), tank
elektroforesis ditutup dan dihubungkan dengan arus listrik. Kemudian proses
elektroforesis siap dijalankan. Running elektroforesis dilakukan pada kondisi 80
volt selama 65 menit. Setelah running elektroforesi selesai, arus listrik dimatikan
dan tray diambil dengan menggunakan sarung tangan. Visualisasi DNA yang
32
telah dielektroforesis dilakukaan dengan UV transluminator dan jika pita/band
molekul DNA kelihatan terang maka didokumentasikan.
Analisis Data
Penentuan Skoring Marka RAPD
Untuk menentukan keragaman genetik, produk PCR – RAPD diskoring
berdasarkan muncul tidaknya pita DNA. Pita yang muncul pada gel diasumsikan
sebagai alel RAPD. Keragaman alel RAPD ditentukan dari perbedaan migrasi alel
pada gel masing-masing individu sampel. Berdasarkan ada atau tidaknya pita,
profil pita diterjemahkan ke dalam data biner. Pita yang muncul diberi kode 1(ada) dan -0 (tidak ada) ( Ferreira dan Grattapaglia, 1994).
Penentuan Ukuran Pasangan Basa
Ukuran fragmen basa (pasangan basa = bp) produk PCR ditentukan
dengan menggunakan software UVITEC Cambridge FireReader. Fragmen DNA
yang digunakan yaitu 100 bp DNA ladder . Dengan menggunakan software
UVITEC Cambridge FireReader maka ukuran pita DNA hasil amplifikasi dapat
terukur seperti pada gambar. Ukuran pita DNA (base pairs) ini akan berpacuan
dari ladder yang kita gunakan. Program ini akan mengukur pita yang muncul
berdasarkan ukuran ladder yang digunakan. Pengukuran pola pita yang terbentuk
ini dengan pendar cahaya DNA yang terbentuk saat proses elektroforesis dengan
sinar UV.
Matriks jarak atau ketidaksamaan genetik untuk semua kombinasi pasangan
individu dapat dilakukan dengan dua tipe analisis deskriptif dari keragaman : (1)
Principal Coordinates Analysis (PCoA), suatu jenis analisis faktorial pada tabel
ketidaksamaan untuk mendapatkan group origin utama dan (ii) Neighbour-Joining
33
Tree (NJtree) berdasarkan Saitou dan Nei (1978) untuk memperoleh gambaran
dari kekerabatan diantara individu-individu. Perhitungan dan analisis deskriptif ini
menggunakan software DARwin 5.05 (Perrier dan Jacquemoud-Collet, 2009).
34
HASIL DAN PEMBAHASAN
Data Geografis dan Morfologis 30 Aksesi Andaliman
Tiga puluh sampel aksesi andaliman yang diambil dari 3 kabupaten
(Dairi, Tanah Karo, dan Simalungun) menunjukkan adanya perbedaan warna
daun bagian bawah. Setiap sampel menunjukkan tingkat kemerahan setiap daun
berbeda, sehingga dikelompokkam pada 3 tingkat warna, yaitu berwarna hijau,
hijau kemerahan dan merah. Data dapat dilihat pada tabel 2.
Tabel 2. Data geografis dan morfologis 30 aksesi andaliman dari 3 kabupaten Sumatera Utara
No.
Kabupaten/Kecamatan/Kota Titik koordinat
Ketinggian Tinggi
lilit
Warna Umur
Aksesi
Tempat Tanaman Batang Daun Tanaman
(mdpl.)
(cm)
(cm)
(cm)
D1 Dairi/Sidikalang/Hutarakyat
N: 02°45’14.6” 1001
330
13
Hijau
2
E : 98°17’46.9”
D2
Dairi/Sidikalang/Hutarakyat
N: 02°45’17,5”
E: 98°16’50”
978
80
3
Merah
0,5
D3
Dairi/Sumbul/Parbuahan
N: 02°46’45,6”
E: 98°24’52,2”
1254
308
21
Hijau
2,5
D4
Dairi/Sumbul/Parbuahan
N: 02°47’02,1”
E: 98°25’09”
1253
294
17
Hijau
2
D5
Dairi/Sumbul/Lae Tangiang
N:02°47’16,6”
E: 98°25’58,1”
1357
170,1
12,6
Hijau
Kemerahan
D6
Dairi/Parbuluan/Sigalingging
N:02°36’07,9”
E:98°30’21,8”
1518
265
28
Hijau
1,5
Kemerahan
D7
Dairi/Parbuluan/Sigalingging
N:02°36’07,9”
E:98°30’21,4”
1518
156
10
Merah
1
D8
Dairi/Parbuluan/Sihotang
N:02°39,13,7”
E:98°27’02,9”
1317
430
28
Hijau
Kemerahan
3
D9
Dairi/Parbuluan/Sihotang
N:02°39’13,8”
E: 98°27’02,5”
1317
320
15
Hijau
1,5
D10
Dairi/Parbuluan/Sihotang
N:02°39’13,8”
E:98°27’2,5”
1317
128
7
Hijau
1,5
D11
Dairi/Parbuluan/Siarung-arung N:02°39’57,5”
E: 98°25’06,5”
1290
190
20
Merah
3
1
35
No.
Kabupaten/Kecamatan/Desa
Aksesi
Titik koordinat
Ketinggian Tinggi
Lilit
Tempat
Tanaman Batang
(mdpl.)
(cm)
(cm)
1292
200
25
Warna
Umur
Daun Tanaman
(cm)
Merah
2,5
D12
Dairi/Parbuluan/Siarung-arung N:02°39’55”
E:98°25’5,1”
D13
Dairi/Sumbul/Pegagan Julu7
N:02°45’14,6”
E: 98°17’46,9
1109
300
15
Hijau
1,5
D14
Dairi/Sumbul/Pegagan Julu7
N:02°47’9,2”
E:98°23’22,7”
1109
310
18
Hijau
2
D15
Dairi/Pegagan Hilir/Tiga Baru N:02°48’47,6”
E: 98°23’38,9”
1202
294
20
Hijau
2
D16
Dairi/Pegagan Hilir/Tiga Baru N: 02°48’43,9”
1206
192
9
Hijau
1
E: 98°23’43,8”
Kemerahan
D17
Dairi/Pegagan Hilir/Tiga Baru N: 02°48’39,2”
E: 98°23’48,5
1217
177
7
Merah
1
D18
Dairi/Pegagan Hilir/Tiga Baru N: 02°48’38,8”
E: 98°24’29,4”
1276
203
14
Hijau
1
K1
Tanah Karo/Merek/Garingging N: 02°58’13,8”
E : 98°32’11”
1483
333
20
Merah
4
K2
Tanah Karo/Merek/Garingging N: 02°58’15,7”
E : 98°32’09,8”
1483
400
22
Hijau
4,5
K3
Tanah Karo/Merek/Garingging N: 02°58’33,5”
E : 98°31’27,6”
1495
248
10
Hijau
1,5
S1
Simalungun/Purba/Purba
Hinalang
N : 02°55’13,3”
E : 98°38’18,8”
1423
240
15
Hijau
kemerahan
S2
Simalungun/Purba/Purba
Hinalang
N : 02°55’13,5”
E : 98°38’18,8”
1423
238
14
Hijau
S3
Simalungun/Purba/Purba
Hinalang
N : 02°55’13,7”
E : 98°38’18,6”
1423
144
9
Hijau
Kemerahan
1
S4
Simalungun/Purba/Purba
Hinalang
N : 02°54’56,6”
E : 98°38’30,9”
1408
370
18
Merah
1
S5
Simalungun/Purba/Kampung N : 02°53’19,5”
Baru
E : 98°43’39,9”
1211
290
22
Hijau
1,5
S6
Simalungun/Purba/Kampung N : 02°53’19,6”
Baru
E : 98°43’39,8”
1211
198
21
Hijau
Kemerahan
2
S7
Simalungun/Purba/Kampung N : 02°53’19,8”
Baru
E : 98°43’40,1”
1211
155
10
Hijau
1
S8
Simalungun/Purba/Kampung N : 02°53’20,3”
Baru
E : 98°43’43,4”
1213
290
23
Merah
2
S9
Simalungun/Purba/Kampung N : 02°53’20,7”
1214
310
24,8
Hijau
1,5
1
1
36
Baru
E : 98°43’44”
Umur aksesi andaliman yang digunakan sebagai sampel umumnya
tanaman yang berumur 1- 4 tahun. Gambar 14,15,16 dan 17 (Lampiran 2),
menunjukkan perbedaan tinggi dan kanopi tanaman andaliman yang digunakan
sebagai sampel, namun tidak dibahas dalam penelitian ini.
Uji Kuantitas DNA
Uji kuantitatif DNA dilakukan secara spektrofotometri pada panjang
gelombang 260 nm dan 280 nm sehingga diperoleh nilai kemurnian dan
konsentrasi DNA hasil isolasi. Panjang gelombang 260 nm merupakan serapan
maksimum untuk asam nukleat, sedangkan panjang gelombang 280 nm
merupakan serapan maksimum untuk protein. Hasil pengukuran dapat dilihat pada
Tabel 3.
Tabel 3.Hasil uji kuantitatif 30 aksesi DNA tanaman andaliman
Kode
Sampel
1
2
3
²
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
Konsentrasi DNA
(ng/µl)
3041
2201
796
1769
2476
97.1
2398
1073
1367
2046
1335
1524
1417
1211
1415
937
1340
823
1551
Kemurnian
260/280
2.018
2.078
2.089
2.014
2.016
1.143
1.31
2.075
2.077
2.113
2.052
1.975
2.079
2.079
2.075
1.969
2.044
1.926
2.061
37
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
1801
2100
2204
2337
2951
2612
3760
221
1422
2891
3757
2.073
2.007
2.05
2.019
2.1
2.11
1.625
1.596
1.934
2.127
2.08
Kemurnian DNA yang diperoleh pada penelitian ini berkisar 1.143 –
2.113. Dari 30 sampel DNA yang diisolasi hanya 4 sampel yang nilai kemurnian
nya berkisar 1.8 – 2.0. Yaitu aksesi nomor 12, 16, 18, dan 28. Menunjukkan
bahwa sampel DNA telah murni.
Sampel dengan nilai kemurnian dibawah 1.8 sebanyak 4 sampel. Yaitu
aksesi nomor 6, 7, 26 dan 27. Hal ini menunjukkan bahwa stok DNA masih
banyak mengandung polysakarida. Sedangkan sampel dengan kemurnian diatas
2.0 sebanyak 22 sampel. Yaitu aksesi nomor 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 15,
17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 29 dan 30. Hal ini menunjukkan bahwa sampel
masih belum murni dan mengandung banyak protein.
Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sampel harus jernih dan larut
sempurna. Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi. DNA yang mengandung
basa-basa purin dan pirimidin dapat menyerap cahaya UV. Pita ganda DNA dapat
menyerap cahaya UV pada 260 nm, sedang kontaminan protein atau phenol dapat
menyerap cahaya pada 280 nm. Dengan adanya perbedaan penyerapan cahaya
UV ini, sehingga kemurnian DNA dapat diukur dengan menghitung nilai
absorbansi 260 nm dibagi dengan nilai absorbansi 280 (Å260/Å280)
(Fatchiyah, 2011).
38
Menurut Haris et al. (2003), konsentrasi DNA akan berdampak pada
kualitas fragmen hasil amplifikasi. Konsentrasi DNA yang terlalu rendah akan
menghasilkan fragmen yang sangat tipis pada gel atau bahkan tidak terlihat secara
visual, sebaliknya konsentrasi DNA yang terlalu tinggi akan menyebabkan
fragmen terlihat tebal sehingga sulit dibedakan antara satu fragmen dengan
fragmen lainnya.
Salah satu keuntungan pemakaian analisis keragaman genetik tanaman
dengan menggunakan teknik molekuler yang memanfaatkan teknologi amplifikasi
PCR adalah kuantitas DNA yang diperlukan hanya sedikit. Di samping itu, dalam
pelaksanaan teknik RAPD tingkat kemurnian DNA yang dibutuhkan tidak perlu
terlalu tinggi, atau dengan kata lain teknik amplifikasi PCR relatif toleran
terhadap tingkat kemurnian DNA. Meskipun demikian, dalam suatu teknik isolasi
DNA masih diperlukan suatu tahapan untuk meminimalkan senyawa-senyawa
kontaminan yang dapat mengganggu reaksi PCR seperti polisakarida dan
metabolit sekunder. Hal ini disebabkan keberadaan polisakarida dan metabolit
sekunder dalam sel tanaman sering menyulitkan dalam isolasi asam nukleat
(Maftuchah dan Zainuddin, 2013).
Hasil PCR dengan marka RAPD
Hasil amplifikasi menggunakan 5 primer yang digunakan yaitu OPD-13,
OPI-20, OPH-09, OPM-01, OPN-10 pada 30 aksesi tanaman andaliman yang
menghasilkan produk PCR yang dapat dibaca dan diskoring, sehingga hasilnya
dapat di analisis. Namun tidak semua primer mengamplifikasi DNA pada 30
aksesi andaliman . Hasil PCR dapat dilihat pada gambar
39
Satu dari lima primer yang digunakan mengamplifikasi DNA pada 30
Aksesi andaliman yaitu Primer OPI-20 Sedangkan 4 Primer lagi yaitu : OPD-13,
OPH-09, OPM-01, OPN-10 tidak mengamplifikasi DNA pada 30 aksesi. Jumlah
DNA yang paling banyak teramplifikasi terdapat pada OPH-09 yaitu aksesi nomor
28,29, dan 30 . Sedangkan yang paling sedikit terdapat pada Primer OPD-13,
OPM-01, OPN-10 yaitu 1 pada aksesi no 13. Sementara OPH-09 tidak
mengamplifikasi DNA 2 aksesi pada aksesi nomor 28, dan 29.
Tabel 4. Hasil Amplifikasi Lima Primer yang Digunakan
No
Nama Primer
Urutan Basa (5'3')
Jumlah Aksesi yang
Tidak Teramplifikasi
No. Aksesi
1
2
3
4
5
OPD-13
OPI-20
OPH-09
OPM-01
OPN-10
ACGCGCATGT
AAAGTGCGGG
GACGCCACAC
ACAACTGGGG
GTTGGTGGCT
1
2
1
1
5
28,29
13
13
Pita yang muncul memiliki ukuran basa dan intensitas pita yang bervariasi.
Perbedaan intensitas pita DNA dipengaruhi oleh sebaran situs penempelan primer
pada genom, kemurnian dan konsentrasi genom dalam reaksi. Banyaknya pita
yang dihasilkan oleh setiap primer tergantung pada sebaran situs yang homolog
pada genom (Williams dkk, 1990). Fragmen yang tidak muncul disebabkan tidak
terjadinya amplifikasi, terjadi karena munkin primer yang digunakan tidak sesuai
dengan DNA cetakan. Beberapa bukti percobaan menunjukkan bahwa perbedaan
satu pasang basa saja sudah cukup menyebabkan ketidaksesuaian cetakan primer
yang kemudian mencegah amplifikasi (William dkk., 1990).
Konsentrasi primer berpengaruh terhadap intensitas produk PCR-RAPD.
Menurut Padmalatha dan Prasad (2006) konsentrasi primer yang terlalu rendah
40
atau yang terlalu tinggi menyebabkan tidak terjadinya amplifikasi. Rasio yang
rendah antara primer dan DNA cetakan dapat menyebabkan produk RAPD yang
dihasilkan tidak konsisten. Magnesium merupakan komponen yang penting dalam
reaksi PCR dan mempengaruhi kualitas profil RAPD yang dihasilkan
(Pharmawati, 2009). Magnesium mempengaruhi penempelan primer serta aktifitas
enzim (Padmalatha dan Prasad, 2006). Konsentrasi MgCl2 yang tinggi juga
mempengaruhi jumlah band yang dihasilkan dan mengakibatkan penurunan
intensitas band tertentu.
Secara umum, hasil penelitian ini menunjukkan bahwa pola pita yang
dihasilkan oleh lima primer yang digunakan memperlihatkan pola pita yang
berbeda. Ukuran pita-pita yang dihasilkan bervariasi antara 320 bp – 2.540 bp.
Total pola pita dari kelima primer yang tampak sebanyak 25 dengan rata-rata 5
pita per primer dengan dengan pita polimorfik sebanyak 21 pita dan pita yang
monomorfik sebanyak 4 pita. Persentase pita yang polimorfik bervariasi sebesar
75% sampai 100% dengan rata-rata 84.20% untuk seluruh primer.
No
Nama
Primer
1
OPD-13
2
OPI-20
3
OPH-09
4
OPM-01
5
OPN-10
TOTAL
Rata-rata
Ukuran
Pita
(bp)
4682462
3201717
5002540
4401791
3861297
Total
Pola
Pita
Persenta
Jumlah Pita
Jumlah
se Pita
Polimorfik Monomorfik Polimor
fik (%)
4
3
1
75%
5
4
1
80%
4
4
0
100%
6
5
1
83%
6
5
1
83%
25
5
21
4.2
4
0.8
421%
84.20%
41
Jumlah pola pita tertinggi terdapat pada primer OPM 01 dan OPN 10 yang
berjumlah 6 pola pita sedangkan jumlah pola pita terendah terdapat pada primer
OPD 13 dan OPH 09 yang berjumlah 4 pola pita. Ukuran pita tertinggi terdapat
pada primer OPH 09 sebesar 2540 bp sedangkan ukuran pita terendah terdapat
pada primer OPI 20 sebesar 320 bp.
Primer OPD-13 menunjukkan pola pita yang berjumlah 4 pita dengan
ukuran pita berkisar 468.238 – 2462.792 bp. Persentase pita polimorfik sebesar
75% dan persentase monomorfis sebesar 25 %.
250 bp
3000 bp
2500 bp
1
2
3
4
5
6
7
9
8
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24 25
26
27
28
29
30
1
2000 bp
1500 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
Gambar 2.Elektroforegram amplifikasi 30 DNA Andaliman dengan primer OPD13, ket ; M = marker ladder 100 bp , Kab Dairi : (1-18), Kab Karo :
(19-21), Dan Kab Simalungun (22-30)
Primer OPI-20 menunjukkan pola pita yang berjumlah 5 pita dengan
ukuran pita berkisar 320.415 – 1717.12 bp . Persentase pita polimorfis sebesar
80% . Dan persentase monomorfis sebesar 20%.
2500 bp
1
2
3
1
3000 bp
2500 bp
2000 bp
1500 bp
1000 bp
750 bp
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
15
1
15
500 bp
250 bp
Gambar 2.Elektroforegram amplifikasi 30 DNA Andaliman dengan primer OPI20, ket ; M = marker ladder 100 bp , Kab Dairi : (1-18), Kab Karo :
(19-21), Dan Kab Simalungun (22-30)
29
30
42
Primer OPH-09 menunjukkan pola pita yang berjumlah 4 pita dengan
ukuran pita berkisar 500 bp – 2540.66 bp. Persentase pita polimorfis sebesar 100
%. Dan persentasse monomorfis sebesar 0 %.
1
2
3
4
5
6
7
9
8
10
11 12
13 14
15
16
17
18
19 20
21
22 23
24
25 26
27
28
29
30
3000 bp
2500 bp
2000 bp
1500 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
Gambar 4.Elektroforegram amplifikasi 30 DNA Andaliman dengan primer OPH09, ket ; M = marker ladder 100 bp , Kab Dairi : (1-18), Kab Karo :
(19-21), Dan Kab Simalungun (22-30)
Primer OPN-10 menunjukkan pola pita yang berjumlah 6 pita dengan
ukuran pita berkisar 386.465 bp – 1297.55 bp. Persentase pita polimorfis sebesar
83 %. Dan persentase monomorfis sebesar 17%.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16 17
18 19
20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
3000 bp
2500 bp
2000 bp
1500 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
Gambar 5. Elektroforegram amplifikasi 30 DNA Andaliman dengan primer OPN10, ket ; M = marker ladder 100 bp , Kab Dairi : (1-18), Kab Karo :
(19-21), Dan Kab Simalungun (22-30)
Primer OPM-01 menunjukkan pola pita yang berjumlah 6 pita dengan
ukuran pita berkisar 440.58 – 1791.54 bp. Persentase pita polimorfis sebesar
83 %. Dan persentase monomorfis sebesar 17 %.
43
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10
11 12
13 14
15
16
17
18
19 20
21
22
23
24 25
26
27 28
3000 bp
2500 bp
2000 bp
1500 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
Gambar 6. Elektroforegram amplifikasi 30 DNA Andaliman dengan primer OPM01, ket ; M = marker ladder 100 bp , Kab Dairi : (1-18), Kab Karo :
(19-21), Dan Kab Simalungun (22-30)
Keberhasilan suatu primer dalam mengamplifikasi DNA cetakan
ditentukan oleh ada tidaknya homologi sekuen nukleotida primer dengan sekuen
nukleotida DNA cetakan. Selain itu juga dipengaruhi oleh kualitas dan kuantitas
DNA, konsentrasi MgCl2, enzim Taq DNA polimerase, dan suhu pelekatan
primer (Wibowo, 2010).
Menurut Yuwono (2006) primer yang tidak spesifik dapat menyebabkan
teramplifikasinya daerah lain dalam genom yang tidak dijadikan sasaran atau
sebaliknya tidak ada daerah genom yang teramplifikasi. Keberhasilan teknik ini
ditentukan oleh ada tidaknya situs penempelan primer, kemurnian DNA dan
keutuhan DNA cetakan (Bardakci, 2001). Konsentrasi DNA genom merupakan
faktor terpenting dalam reaksi amplifikasi. Konsentrasi DNA yang terlalu tinggi
dapat meningkatkan kontaminan yang menggangu reaksi amplifikasi
(Chen, 2000).
Keberhasilan teknik ini lebih didasarkan kepada kesesuaian primer dan
efisiensi dan optimasi proses PCR. Primer yang tidak spesifik dapat menyebabkan
teramplifikasinya daerah lain dalam genom yang tidak dijadikan sasaran atau
sebaliknya tidak ada daerah genom yang teramplifikasi. Optimasi PCR juga
diperlukan untuk menghasilkan karakter yang diinginkan. Optimasi ini
29
30
44
menyangkut suhu denaturasi dan annealing DNA dalam mesin PCR. Suhu
denaturasi yang rendah dapat menyebabkan belum terbukanya DNA utas ganda
sehingga tidak dimungkinkan terjadinya polimerisasi DNA baru. Proses
penempelan primer pada utas DNA yang sudah terbuka memerlukan suhu
optimum, sebab suhu yang terlalu tinggi dapat menyebabkan amplifikasi tidak
terjadi atau sebaliknya suhu yang terlalu rendah menyebabkan primer menempel
pada sisi lain genom yang bukan sisi homolognya; akibatnya dapat teramplifikasi
banyak daerah tidak spesifik dalam genom tersebut. Suhu penempelan (annealing)
ini ditentukan berdasarkan primer yang digunakan yang dipengaruhi oleh panjang
dan komposisi primer (Suryanto, 2003).
Konsentrasi primer berpengaruh terhadap intensitas produk PCR-RAPD.
Menurut Padmalatha dan Prasad (2006) konsentrasi primer yang terlalu rendah
atau yang terlalu tinggi menyebabkan tidak terjadinya amplifikasi. Rasio yang
rendah antara primer dan DNA cetakan dapat menyebabkan produk RAPD yang
dihasilkan tidak konsisten. Magnesium merupakan komponen yang penting dalam
reaksi PCR dan mempengaruhi kualitas profil RAPD yang dihasilkan
(Pharmawati, 2009). Magnesium mempengaruhi penempelan primer serta aktifitas
enzim (Padmalatha dan Prasad, 2006). Konsentrasi MgCl2 yang tinggi juga
mempengaruhi jumlah band yang dihasilkan dan mengakibatkan penurunan
intensitas band tertentu.
Tiap primer menghasilkan jumlah pita DNA yang berbeda. Pita yang
muncul memiliki ukuran basa dan intensitas pita yang bervariasi. Perbedaan
intensitas pita DNA dipengaruhi oleh sebaran situs penempelan primer pada
genom, kemurnian dan konsentrasi genom dalam reaksi. Banyaknya pita yang
45
dihasilkan oleh setiap primer tergantung pada sebaran situs yang homolog pada
genom (Williams et al., 1990). Adanya perbedaan pola pita yaitu berdasarkan
jumlah dan ukuran pita menggambarkan adanya genom tanaman yang sangat
kompleks (Grattapaglia et al., 1992).
Menurut Demeke dan Adams (1994), amplifikasi DNA dengan primer
acak pada analisis RAPD biasanya menghasilkan 5-20 fragmen untuk setiap
primer. Jumlah fragmen hasil amplifikasi dengan RAPD memang lebih rendah
dibandingkan dengan hasil amplifikasi menggunakan AFLP (Haris et al., 2003).
Kelemahan RAPD adalah pemunculan pita DNA kadang–kadang tidak
konsisten. Hal ini lebih sering terjadi jika suhu annealing yang digunakan terlalu
tinggi. Dalam analisis kekerabatan, hal ini dapat diatasi dengan menggunakan
primer yang lebih banyak. Ruas DNA yang berulang sering berlipat ganda,
homologi urutan nukleotida pada pita-pita DNA dengan mobilitas yang sama pada
gel tidak diketahui, penanda RAPD bersifat dominan dan tingkat keberulangannya
(reproducibility) rendah (Demeke dan Adams, 1994)
46
Analisis Hubungan Genetik Andaliman
Berdasarkan elektroforesis hasil amplifikasi dengan menggunakan
program software Darwin 5.05 (Perrier dan Jacquemoud-Collet, 2009) dari 30
aksesi yang dianalisis hanya 26 aksesi yang diproses oleh software, karena ada
beberapa aksesi yang tidak memenuhi persentasi yang distandarkan.
Gambar 7. Pohon filogenik 30 aksesi andaliman dari 3 kabupaten (Dairi,Tanah
Karo dan Simalungun) yang dianalisis berdasarkan Matrix
Dissimilarity Simple Matching).
47
Data biner hasil skoring amplifikasi 5 primer yang diolah dengan software
DARwin dihasilkan radial filogenetik yang menunjukkan kekerabatan aksesi
andaliman dimana 26 aksesi andaliman yang dikelompokkan menjadi 3
klustering. Kluster I terbagi lagi menjadi 2 subkluster yaitu : subkluster IA dan
subkluster IB. Subkluster IA terdiri dari aksesi yang berasal dari Dairi (D18),
Karo (K2 dan K3) , dan Simalungun (S2, S3, S5 dan S8) yang mengelompok
secara acak (D, K dan S). Subkluter IB terdiri dari aksesi yang berasal dari
Simalungun (S1 dan S4).
Kluster II terbagi lagi menjadi 2 subkluster yaitu subkluster IIA dan IIB.
Subkluster IIA terdiri atas aksesi yang berasal dari Dairi (D3, D7, D8, D9, D10,
D11, dan D12), dan subkluster IIB terdiri dari aksesi yang berasal dari Dairi (D2
dan D4) .
Kluster III terbagi lagi menjadi 3 subkluster yaitu subkluster IIIA dan IIIB.
Subkluster IIIA terdiri atas aksesi yang berasal dari Dairi (D1, D14 dan D15),
Simalungun (S9). Dan subkluster IIIB terdiri dari aksesi yang berasal dari Dairi
(D13) dan Simalungun (S6 dan S7). Hasil clustering menunjukkan bahwa
keragaman genetik dari andaliman pada 3 kabupaten tersebut adalah tinggi.
Hasil klustering 3 aksesi andaliman, dapat dilihat bahwa pada kelompok
kedua, yang terdiri dari subkluster IIA dan IIB merupakan aksesi yang berasal
dari 1 kabupaten yaitu kabupaten Dairi . Pada kelompok kedua ini tidak terdapat
aksesi yang berasal dari kabupaten lain , meskipun aksesi dari kabupaten dairi
lainnya menyebar pada kelompok yang lainnya.
Pengelompokkan tersebut menunjukkan bahwa penggelompokkan tidak
berdasarkan warna daun andaliman yang beberapa berwarna hijau, hijau
48
kemerahan dan merah. Setiap jenis andaliman yang berbeda berwarna daun sama
menyebar pada ketiga kelompok tersebut. Hal ini menunjukkan bahwa perbedaan
secara morfologi tidak menentukan bahwa perbedaan tersebut dipengaruhi oleh
faktor genetik.
Menurut Sitanggang dan Habeahan (1999) ada tiga jenis andaliman yang
terdapat di kawasan Danau Toba yaitu : Sihorbo (buah besar, kurang aromatis dan
produksi rendah ), Simanuk ( buah kecil, aroma dan rasa lebih tajam dari Sihorbu)
dan jenis Sitanga (aroma sangat tajam sehingga lebih mirip bau kepinding,
produksi tinggi namun kurang disenangi masyarakat). Ketiga jenis andaliman ini
merupakan pengelompokkan masyarakat secara morfologi dan pengamatan visual
yang tidak terukur. Dari hasil filogenetik andaliman dengan marka RAPD ini juga
dapat dilihat bahwa andaliman dapat dikelompokkan menjadi 3 kelompok besar ,
namun tidak dapat dihubungkan dengan pengelompokkan secara morfologi secara
spesifik untuk setiap sampel aksesi andaliman tersebut.
Menurut Zulhalmi (2013) informasi keragaman genetik tanaman pada
tingkat individu , spesies maupun populasi perlu diketahui sebagai dasar
pertimbangan dalam menyusun strategi konservasi, pemuliaan , pengelolaan, dan
pemanfaatan sumber daya genetik tanaman secara berkelanjutan. Dari filogenetik
dari 25 aksesi andaliman dapat dilihat bahwa andaliman memiliki tingkat
keanekaragaman yang tinggi , dimana menurut Hutami (2006) Keragaman genetik
ini dapat dimanfaatkan untuk merakit varietas unggul.
49
II
IIA
IIB
IB
IIIB
I
III
IIIA
IA
Gambar 8. Profil radial neighbor-joining 25 aksesi andaliman dari 3 kabupaten
(Dairi, Tanah karo, dan Simalungun) yang dianalisis berdasarkan
Matrix Dissimilarity Simple Matching.
50
Hasil skoring pada setiap fragmen pita DNA yang terbentuk setelah
amplifikasi dapat diketahui kekerabatan setiap aksesi andaliman dari 3 kabupaten
tersebut. Nilai bootstrap pada 1000 mereplikasi untuk mengetahui tingkat
kekerabatan pengelompokkan ditunjukkan pada (Gambar 9).
Factorial analysis: (Axes 1 / 2)
.25
D6
.2
.15
S2
.1
K3
D10
.05
D7D12
S4 S1
S3
-.25
-.2
S5
-.15
-.1
D9
D11
S8
K2
-.05
D4.05
D2
D3
.1
.15
D8
D18
-.05
S7
D13
D15
D14
D1
S6
-.1
S9
-.15
Gambar 9. Faktorial analisis (Principal Coordinate Analysis )