Analisis Penanda RAPD (Random Amplifield Polymorphic DNA ) Untuk Analisis Keragaman Genetik Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.) Sumatera Utara
56
Lampiran 1. Gambar Sampel Aksesi Andaliman
Gambar Andaliman Dairi
Gambar Andaliman Karo
57
Gambar Andaliman Simalungun
58
Lampiran 2. Pembuatan Larutan Stok dan Buffer
A. Pembuatan Larutan Stok
•
CTAB 5 % (100 ml): Timbang NaCl sebanyak 2.0 gram dan CTAB sebanyak
5.0 gram. Masukkan bahan kimia ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 100 ml
aquades. Aduk campuran larutan dengan menggunakan stirrer kemudian
diletakkan diatas hote plate.
•
Tris HCl 1 M pH 8.0 (100 ml): Timbang Tris
sebanyak 12.114 gram.
Masukkan Tris ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 80 ml aquades. Aduk
campuran larutan dengan menggunakan stirrer kemudian diletakkan diatas hote
plate. Selanjutnya, ditambahkan 4.2 ml HCl pekat sedikit demi sedikit sampai pH
mencapai 8. Masukkan ke dalam gelas ukur, kemudian volume ditepatkan
dengan aquades hingga volume larutan menjadi 100 ml.
•
Tris HCl 1 M pH 7.4 (50 m): Timbang Tris sebanyak 6.057 gram. Masukkan
Tris ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 30 ml aquades. Aduk campuran
larutan dengan menggunakan stirrer kemudian diletakkan diatas hote plate.
Selanjutnya, ditambahkan NaOH 2.5 M sedikit demi sedikit sampai pH mencapai
7.4. Masukkan ke dalam gelas ukur, kemudian volume ditepatkan dengan
aquades hingga volume larutan menjadi 50 ml.
•
EDTA O.5 M pH 8.0 (100 ml): Timbang EDTA sebanyak 18.612 gram dan
NaOH 2.0 gram. Masukkan bahan kimia ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan
80 ml aquades. Aduk campuran larutan dengan menggunakan stirrer kemudian
diletakkan diatas hote plate. Selanjutnya, ditambahkan HCl pekat sedikit demi
sedikit sampai pH mencapai 8. Masukkan ke dalam gelas ukur, kemudian
volume ditepatkan dengan aquades hingga volume larutan menjadi 100 ml.
59
•
NaCl 5 M (l00 ml): Timbang NaCl sebanyak 29.22 gram. Masukkan ke dalam
erlenmeyer dan ditambahkan 80 ml aquades. Aduk campuran larutan dengan
menggunakan stirrer kemudian diletakkan diatas hote plate. Masukkan ke dalam
gelas ukur, kemudian volume ditepatkan dengan aquades hingga volume larutan
menjadi 100 ml.
**Semua bahan di atas disterilkan dengan menggunakan autoklaf kecuali CTAB 5%.
B. Pembuatan Larutan Buffer
•
Buffer Ekstraksi/CTAB (100 ml): Campurkan 40 ml CTAB 5%, 25.1 ml NaCl
5 M, 4 ml EDTA 0.5 M pH 8.0, 10 ml Tris HCl 1 M pH 8.0 dan 20.8 ml aquades.
•
Buffer TAE 50 X (100 ml): Campurkan 24.2 ml Tris HCl 1 M pH 7.4, 5.7 ml
Asam Asetat Glasial, 10 ml EDTA 0.5 M PH 8.0, dan aquades hingga volume
larutan menjadi 100 ml.
•
Buffer TAE 1X (500 ml): Campurkan 10 ml Buffer TAE 50 X dan 490 ml
aquades.
•
Buffer TE (50 ml): Campurkan 0.5 ml Tris HCl 1 M PH 8.0, 0.1 ml EDTA 0.5
M PH 8.0 dan 49.4 ml aquades.
•
Kloroform Isoamilalkohol 24 : 1 (50 ml): Campurkan 48 ml Kloroform dan 2
ml Isoamilalkohol.
•
Etanol 70 % (100 ml): Campurkan 70 ml Etanol dan 30 ml aquades.
60
Lampiran 3. Alur Penelitian
Sampel DNA Andaliman
Isolasi DNA
Uji Kualitas
Uji Kuantitas
Proses PCR-RAPD
Elektroforesis
Analisis Hasil Amplifikasi PCR-RAPD
61
Lampiran 4. Proses Isolasi DNA
Sampel daun andaliman ditimbang 0.2 gram dan digerus sambil
ditambahkan nitrogen cair dan PVPP
Sampel dimasukkan ke dalam tabung yang bberisi 1 ml buffer
ekstraksi dan 10 µl β-mercaptoetanol
Tabung di vortex dan diinkubasi dalam waterbath selama 30
menit pada suhu 650C
Supernatan ditambahkan 1 ml KIAA (24:1) dan disentrifus
dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit
Supernatan ditambahkan 1 ml KIAA (24:1) dan disentrifus
dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit
Supernatan ditambahkan 1 ml isopropanol dan diinkubasi pada
suhu 40C selama semalama
Tabung disentrifus pada pada kecepatan 13.000 rpm selama 10
menit dan dikeringkan
Pelet dilarutkan dengan buffer TE 100µl
Campuran ditambahkan dengan etanol absolute dingin dan
diinkubasi dalam freezer (-200C) selama 30 menit
Campuran disentrifus dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit
Pelet dicuci dengan etanol 70% dan dikeringkan
Pelet dilarutkan dengan 100 µl buffer TE
Stok DNA disimpan dalam freezer (-200C)
62
Lampiran 4. Proses PCR-RAPD
Komposisi Master Mix volume 25 µl :
Go Taq PCR 12.5 µl
Nuclease free water 9.5 µl
Primer 1 µl
DNA sampel 2 µl
Running PCR sebanyak 45 siklus :
Denaturasi awal 940C 2 menit
Denaturai 940C 1 menit
Annealing 360C 1 menit
Extension 720C 2 menit
Post extension 720C 10 menit
Kondisi akhir PCR 40C tak terbatas
Proses running dimulai selama
kurang lebih 4 jam
63
Lampiran 5. Proses elektroforesis hasil PCR-RAPD
Agar rose 2.6 gram ditambahkan
dengan 130 ml buffer TAE 1 x
Campuran dipanaskan dengan hot
plate
Campuran ditambahkan 1.5 µl EtBr
Larutan gel dituang kedalam cetakan
yang telah dipasang sisir
Gel yang telah mengeras
dipindahkan ke dalam chamber
berisi buffer TAE 1 x
Sampel hasil PCR, marker dan
loading dye dimasukkan ke dalam
sumur gel dengan perbandingan
(8:5:2)
Alat elektroforesis dihubungkan
dengan power supply 80 volt
Proses running dimulai selama 15
menit
64
Lampiran 6. Foto Uji Kuantitas
Gambar 10. Alat spektrofotometer
Gambar 11. Hasil Uji kuantitas
65
Lampiran 7. Hasil Uji Kuantitas Tanaman Andaliman
Kode
Sampel
1
2
3
²
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
Konsentrasi DNA
(ng/µl)
3041
2201
796
1769
2476
97.1
2398
1073
1367
2046
1335
1524
1417
1211
1415
937
1340
823
1551
1801
2100
2204
2337
2951
2612
3760
221
1422
2891
3757
Kemurnian
260/280
2.018
2.078
2.089
2.014
2.016
1.143
1.31
2.075
2.077
2.113
2.052
1.975
2.079
2.079
2.075
1.969
2.044
1.926
2.061
2.073
2.007
2.05
2.019
2.1
2.11
1.625
1.596
1.934
2.127
2.08
66
Lampiran 8. Hasil Fotosintesis
Gambar 12. Hasil elektoroforesis dengan Primer OPD-13
Gambar 13. Hasil elektroforesis dengan Primer OPI-20
Gambar 23. Hasil elekroforesis dengan Primer OPH-09
67
Gambar 14. Hasil elektoforesis dengan Primer OPN-10
Gambar 15. Hasil elektroforesis dengan Primer OPM-01
68
Lampiran 9. Hasil Skoring Pita 30 Individu Pada Kelima Primer
Tabel 5. Hasil scoring pita andaliman pada kelima primer
OPD13
1
2
3
4
1
0
0
1
2
1
1
3
1
4
OPI20
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
0
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
0
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
2
3
4
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
5
1
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
3
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
4
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
0
1
0
0
0
5
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
0
0
0
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
1
1
2
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
0
0
1
0
0
1
0
1
1
0
1
1
1
1
0
3
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
4
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
OPH09
OPN10
3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
4
1
1
1
1
1
1
1
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
69
5
0
1
0
1
0
1
1
0
1
1
0
1
0
0
1
1
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
6
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
OPM01
1
13
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
3
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
4
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
5
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
6
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
1
0
0
0
0
Ket: “1” = ada
“0” = kosong
70
Lampiran 10. Matriks Jarak Ketidaksamaan Genetik Tanaman Andaliman
Units
1
2
3
4
6
7
8
9
10
11
12
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
2
0.10
3
0.03
0.07
4
0.10
0.00
0.07
6
0.48
0.36
0.46
0.36
7
0.13
0.03
0.10
0.03
0.38
8
0.03
0.07
0.00
0.07
0.46
0.10
9
0.10
0.00
0.07
0.00
0.36
0.03
0.07
10
0.17
0.07
0.14
0.07
0.38
0.10
0.14
0.07
11
0.14
0.17
0.11
0.17
0.36
0.20
0.11
0.17
0.26
12
0.10
0.00
0.07
0.00
0.36
0.03
0.07
0.00
0.07
0.17
14
0.15
0.19
0.12
0.19
0.39
0.21
0.12
0.19
0.28
0.25
0.19
15
0.15
0.19
0.12
0.19
0.39
0.21
0.12
0.19
0.28
0.25
0.19
0.00
16
0.13
0.03
0.10
0.03
0.33
0.06
0.10
0.03
0.10
0.21
0.03
0.15
0.15
17
0.26
0.14
0.23
0.14
0.25
0.17
0.23
0.14
0.15
0.36
0.14
0.13
0.13
0.11
18
0.39
0.42
0.36
0.42
0.50
0.36
0.36
0.42
0.45
0.33
0.42
0.26
0.26
0.39
0.40
19
0.17
0.07
0.14
0.07
0.38
0.10
0.14
0.07
0.14
0.26
0.07
0.20
0.20
0.03
0.15
0.36
20
0.20
0.23
0.17
0.23
0.45
0.26
0.17
0.23
0.33
0.30
0.23
0.05
0.05
0.20
0.18
0.22
0.17
21
0.07
0.10
0.04
0.10
0.52
0.13
0.04
0.10
0.19
0.15
0.10
0.17
0.17
0.14
0.28
0.43
0.19
0.22
22
0.03
0.07
0.00
0.07
0.46
0.10
0.00
0.07
0.14
0.11
0.07
0.12
0.12
0.10
0.23
0.36
0.14
0.17
0.04
23
0.21
0.24
0.19
0.24
0.44
0.27
0.19
0.24
0.26
0.31
0.24
0.17
0.17
0.29
0.20
0.43
0.33
0.22
0.23
0.19
24
0.07
0.16
0.10
0.16
0.48
0.19
0.10
0.16
0.24
0.21
0.16
0.23
0.23
0.20
0.33
0.48
0.24
0.28
0.14
0.10
0.29
25
0.07
0.10
0.03
0.10
0.48
0.13
0.03
0.10
0.17
0.14
0.10
0.15
0.15
0.13
0.26
0.39
0.17
0.20
0.07
0.03
0.21
0.13
26
0.19
0.21
0.15
0.21
0.50
0.24
0.15
0.21
0.23
0.12
0.21
0.30
0.30
0.26
0.42
0.30
0.31
0.36
0.20
0.15
0.36
0.19
0.19
27
0.07
0.17
0.11
0.17
0.44
0.20
0.11
0.17
0.26
0.08
0.17
0.25
0.25
0.21
0.36
0.33
0.26
0.30
0.15
0.11
0.31
0.14
0.14
0.12
30
0.30
0.42
0.36
0.42
0.50
0.44
0.36
0.42
0.45
0.33
0.42
0.26
0.26
0.39
0.40
0.25
0.45
0.33
0.43
0.36
0.43
0.39
0.39
0.30
27
0.24
71
Lampiran 11. Faktorial Koordinat
Tabel 13. Faktorial Analisis (PCoA)
1
2
3
4
6
7
8
9
10
11
12
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
30
Axis
Coord.
0.0041
0.0343
0.0378
0.0343
0.0027
0.0551
0.0739
0.1476
0.0714
0.0277
0.0615
-0.0648
-0.0329
-0.0003
-0.0292
-0.2003
-0.0122
-0.0898
0.0314
0.0096
-0.0054
0.0596
0.0209
-0.0286
-0.0209
-0.1876
Cos²
5
2808
1800
2808
0
452
619
1001
350
77
1714
1033
208
0
64
907
16
604
130
-156
2
114
87
50
61
802
Axis 2
Coord.
-0.0702
-0.0042
-0.0111
-0.0042
0.2270
0.0271
-0.0242
0.0203
0.0508
0.0133
0.0261
0.0112
0.0510
0.0242
0.1005
0.0125
0.0248
0.0088
-0.0676
-0.0427
0.0124
-0.1254
-0.0546
-0.0935
-0.0690
-0.0433
Cos²
1604
43
154
43
873
110
67
19
176
18
308
31
501
300
758
4
65
6
604
-3063
10
506
594
531
661
43
Axis 3
Coord.
-0.0018
0.0147
-0.0122
0.0147
-0.0964
0.0044
0.0038
0.0283
-0.0263
-0.0957
-0.0082
0.0308
0.0060
0.0262
0.0568
0.0199
0.0779
0.0850
0.0397
0.0153
0.0298
-0.0393
0.0261
-0.0678
-0.0575
-0.0741
Cos²
1
515
186
515
158
3
2
37
47
924
30
233
7
350
242
9
640
541
209
-391
57
50
136
279
459
125
Axis 4
Coord.
-0.0285
-0.0041
0.0098
-0.0041
-0.0391
0.0534
0.0257
0.0395
0.0339
0.0421
0.0067
-0.0342
-0.0075
-0.0052
-0.0569
0.0972
0.0323
-0.0123
0.0021
0.0000
-0.0702
-0.0927
0.0005
0.0544
-0.0079
-0.0349
Cos²
265
39
122
39
26
425
75
72
79
179
20
288
11
14
243
214
110
11
1
0
320
277
0
180
9
28
Axis 5
Coord.
0.0046
0.0331
-0.0313
0.0331
-0.0012
0.0094
-0.0586
-0.0087
0.0526
-0.0521
0.0074
-0.0256
-0.0608
0.0382
0.0422
0.0006
0.0457
-0.0368
-0.0183
-0.0066
-0.0370
0.0237
-0.0129
0.0360
0.0052
0.0180
Tabel 14. Nilai Factorial coordinates
Axis
1
2
3
4
5
\
Eigenvalue
0.00537
0.00449
0.00221
0.00167
0.00106
Inertia%
25.52
21.3
10.51
7.93
5.02
Cos²
7
2614
1232
2614
0
13
389
4
189
274
25
161
713
744
134
0
220
101
44
-74
89
18
33
79
4
7
Lampiran 1. Gambar Sampel Aksesi Andaliman
Gambar Andaliman Dairi
Gambar Andaliman Karo
57
Gambar Andaliman Simalungun
58
Lampiran 2. Pembuatan Larutan Stok dan Buffer
A. Pembuatan Larutan Stok
•
CTAB 5 % (100 ml): Timbang NaCl sebanyak 2.0 gram dan CTAB sebanyak
5.0 gram. Masukkan bahan kimia ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 100 ml
aquades. Aduk campuran larutan dengan menggunakan stirrer kemudian
diletakkan diatas hote plate.
•
Tris HCl 1 M pH 8.0 (100 ml): Timbang Tris
sebanyak 12.114 gram.
Masukkan Tris ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 80 ml aquades. Aduk
campuran larutan dengan menggunakan stirrer kemudian diletakkan diatas hote
plate. Selanjutnya, ditambahkan 4.2 ml HCl pekat sedikit demi sedikit sampai pH
mencapai 8. Masukkan ke dalam gelas ukur, kemudian volume ditepatkan
dengan aquades hingga volume larutan menjadi 100 ml.
•
Tris HCl 1 M pH 7.4 (50 m): Timbang Tris sebanyak 6.057 gram. Masukkan
Tris ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 30 ml aquades. Aduk campuran
larutan dengan menggunakan stirrer kemudian diletakkan diatas hote plate.
Selanjutnya, ditambahkan NaOH 2.5 M sedikit demi sedikit sampai pH mencapai
7.4. Masukkan ke dalam gelas ukur, kemudian volume ditepatkan dengan
aquades hingga volume larutan menjadi 50 ml.
•
EDTA O.5 M pH 8.0 (100 ml): Timbang EDTA sebanyak 18.612 gram dan
NaOH 2.0 gram. Masukkan bahan kimia ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan
80 ml aquades. Aduk campuran larutan dengan menggunakan stirrer kemudian
diletakkan diatas hote plate. Selanjutnya, ditambahkan HCl pekat sedikit demi
sedikit sampai pH mencapai 8. Masukkan ke dalam gelas ukur, kemudian
volume ditepatkan dengan aquades hingga volume larutan menjadi 100 ml.
59
•
NaCl 5 M (l00 ml): Timbang NaCl sebanyak 29.22 gram. Masukkan ke dalam
erlenmeyer dan ditambahkan 80 ml aquades. Aduk campuran larutan dengan
menggunakan stirrer kemudian diletakkan diatas hote plate. Masukkan ke dalam
gelas ukur, kemudian volume ditepatkan dengan aquades hingga volume larutan
menjadi 100 ml.
**Semua bahan di atas disterilkan dengan menggunakan autoklaf kecuali CTAB 5%.
B. Pembuatan Larutan Buffer
•
Buffer Ekstraksi/CTAB (100 ml): Campurkan 40 ml CTAB 5%, 25.1 ml NaCl
5 M, 4 ml EDTA 0.5 M pH 8.0, 10 ml Tris HCl 1 M pH 8.0 dan 20.8 ml aquades.
•
Buffer TAE 50 X (100 ml): Campurkan 24.2 ml Tris HCl 1 M pH 7.4, 5.7 ml
Asam Asetat Glasial, 10 ml EDTA 0.5 M PH 8.0, dan aquades hingga volume
larutan menjadi 100 ml.
•
Buffer TAE 1X (500 ml): Campurkan 10 ml Buffer TAE 50 X dan 490 ml
aquades.
•
Buffer TE (50 ml): Campurkan 0.5 ml Tris HCl 1 M PH 8.0, 0.1 ml EDTA 0.5
M PH 8.0 dan 49.4 ml aquades.
•
Kloroform Isoamilalkohol 24 : 1 (50 ml): Campurkan 48 ml Kloroform dan 2
ml Isoamilalkohol.
•
Etanol 70 % (100 ml): Campurkan 70 ml Etanol dan 30 ml aquades.
60
Lampiran 3. Alur Penelitian
Sampel DNA Andaliman
Isolasi DNA
Uji Kualitas
Uji Kuantitas
Proses PCR-RAPD
Elektroforesis
Analisis Hasil Amplifikasi PCR-RAPD
61
Lampiran 4. Proses Isolasi DNA
Sampel daun andaliman ditimbang 0.2 gram dan digerus sambil
ditambahkan nitrogen cair dan PVPP
Sampel dimasukkan ke dalam tabung yang bberisi 1 ml buffer
ekstraksi dan 10 µl β-mercaptoetanol
Tabung di vortex dan diinkubasi dalam waterbath selama 30
menit pada suhu 650C
Supernatan ditambahkan 1 ml KIAA (24:1) dan disentrifus
dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit
Supernatan ditambahkan 1 ml KIAA (24:1) dan disentrifus
dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit
Supernatan ditambahkan 1 ml isopropanol dan diinkubasi pada
suhu 40C selama semalama
Tabung disentrifus pada pada kecepatan 13.000 rpm selama 10
menit dan dikeringkan
Pelet dilarutkan dengan buffer TE 100µl
Campuran ditambahkan dengan etanol absolute dingin dan
diinkubasi dalam freezer (-200C) selama 30 menit
Campuran disentrifus dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit
Pelet dicuci dengan etanol 70% dan dikeringkan
Pelet dilarutkan dengan 100 µl buffer TE
Stok DNA disimpan dalam freezer (-200C)
62
Lampiran 4. Proses PCR-RAPD
Komposisi Master Mix volume 25 µl :
Go Taq PCR 12.5 µl
Nuclease free water 9.5 µl
Primer 1 µl
DNA sampel 2 µl
Running PCR sebanyak 45 siklus :
Denaturasi awal 940C 2 menit
Denaturai 940C 1 menit
Annealing 360C 1 menit
Extension 720C 2 menit
Post extension 720C 10 menit
Kondisi akhir PCR 40C tak terbatas
Proses running dimulai selama
kurang lebih 4 jam
63
Lampiran 5. Proses elektroforesis hasil PCR-RAPD
Agar rose 2.6 gram ditambahkan
dengan 130 ml buffer TAE 1 x
Campuran dipanaskan dengan hot
plate
Campuran ditambahkan 1.5 µl EtBr
Larutan gel dituang kedalam cetakan
yang telah dipasang sisir
Gel yang telah mengeras
dipindahkan ke dalam chamber
berisi buffer TAE 1 x
Sampel hasil PCR, marker dan
loading dye dimasukkan ke dalam
sumur gel dengan perbandingan
(8:5:2)
Alat elektroforesis dihubungkan
dengan power supply 80 volt
Proses running dimulai selama 15
menit
64
Lampiran 6. Foto Uji Kuantitas
Gambar 10. Alat spektrofotometer
Gambar 11. Hasil Uji kuantitas
65
Lampiran 7. Hasil Uji Kuantitas Tanaman Andaliman
Kode
Sampel
1
2
3
²
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
Konsentrasi DNA
(ng/µl)
3041
2201
796
1769
2476
97.1
2398
1073
1367
2046
1335
1524
1417
1211
1415
937
1340
823
1551
1801
2100
2204
2337
2951
2612
3760
221
1422
2891
3757
Kemurnian
260/280
2.018
2.078
2.089
2.014
2.016
1.143
1.31
2.075
2.077
2.113
2.052
1.975
2.079
2.079
2.075
1.969
2.044
1.926
2.061
2.073
2.007
2.05
2.019
2.1
2.11
1.625
1.596
1.934
2.127
2.08
66
Lampiran 8. Hasil Fotosintesis
Gambar 12. Hasil elektoroforesis dengan Primer OPD-13
Gambar 13. Hasil elektroforesis dengan Primer OPI-20
Gambar 23. Hasil elekroforesis dengan Primer OPH-09
67
Gambar 14. Hasil elektoforesis dengan Primer OPN-10
Gambar 15. Hasil elektroforesis dengan Primer OPM-01
68
Lampiran 9. Hasil Skoring Pita 30 Individu Pada Kelima Primer
Tabel 5. Hasil scoring pita andaliman pada kelima primer
OPD13
1
2
3
4
1
0
0
1
2
1
1
3
1
4
OPI20
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
0
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
0
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
2
3
4
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
5
1
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
3
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
4
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
0
1
0
0
0
5
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
0
0
0
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
1
1
2
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
0
0
1
0
0
1
0
1
1
0
1
1
1
1
0
3
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
4
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
OPH09
OPN10
3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
4
1
1
1
1
1
1
1
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
69
5
0
1
0
1
0
1
1
0
1
1
0
1
0
0
1
1
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
6
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
OPM01
1
13
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
3
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
4
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
5
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
6
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
1
0
0
0
0
Ket: “1” = ada
“0” = kosong
70
Lampiran 10. Matriks Jarak Ketidaksamaan Genetik Tanaman Andaliman
Units
1
2
3
4
6
7
8
9
10
11
12
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
2
0.10
3
0.03
0.07
4
0.10
0.00
0.07
6
0.48
0.36
0.46
0.36
7
0.13
0.03
0.10
0.03
0.38
8
0.03
0.07
0.00
0.07
0.46
0.10
9
0.10
0.00
0.07
0.00
0.36
0.03
0.07
10
0.17
0.07
0.14
0.07
0.38
0.10
0.14
0.07
11
0.14
0.17
0.11
0.17
0.36
0.20
0.11
0.17
0.26
12
0.10
0.00
0.07
0.00
0.36
0.03
0.07
0.00
0.07
0.17
14
0.15
0.19
0.12
0.19
0.39
0.21
0.12
0.19
0.28
0.25
0.19
15
0.15
0.19
0.12
0.19
0.39
0.21
0.12
0.19
0.28
0.25
0.19
0.00
16
0.13
0.03
0.10
0.03
0.33
0.06
0.10
0.03
0.10
0.21
0.03
0.15
0.15
17
0.26
0.14
0.23
0.14
0.25
0.17
0.23
0.14
0.15
0.36
0.14
0.13
0.13
0.11
18
0.39
0.42
0.36
0.42
0.50
0.36
0.36
0.42
0.45
0.33
0.42
0.26
0.26
0.39
0.40
19
0.17
0.07
0.14
0.07
0.38
0.10
0.14
0.07
0.14
0.26
0.07
0.20
0.20
0.03
0.15
0.36
20
0.20
0.23
0.17
0.23
0.45
0.26
0.17
0.23
0.33
0.30
0.23
0.05
0.05
0.20
0.18
0.22
0.17
21
0.07
0.10
0.04
0.10
0.52
0.13
0.04
0.10
0.19
0.15
0.10
0.17
0.17
0.14
0.28
0.43
0.19
0.22
22
0.03
0.07
0.00
0.07
0.46
0.10
0.00
0.07
0.14
0.11
0.07
0.12
0.12
0.10
0.23
0.36
0.14
0.17
0.04
23
0.21
0.24
0.19
0.24
0.44
0.27
0.19
0.24
0.26
0.31
0.24
0.17
0.17
0.29
0.20
0.43
0.33
0.22
0.23
0.19
24
0.07
0.16
0.10
0.16
0.48
0.19
0.10
0.16
0.24
0.21
0.16
0.23
0.23
0.20
0.33
0.48
0.24
0.28
0.14
0.10
0.29
25
0.07
0.10
0.03
0.10
0.48
0.13
0.03
0.10
0.17
0.14
0.10
0.15
0.15
0.13
0.26
0.39
0.17
0.20
0.07
0.03
0.21
0.13
26
0.19
0.21
0.15
0.21
0.50
0.24
0.15
0.21
0.23
0.12
0.21
0.30
0.30
0.26
0.42
0.30
0.31
0.36
0.20
0.15
0.36
0.19
0.19
27
0.07
0.17
0.11
0.17
0.44
0.20
0.11
0.17
0.26
0.08
0.17
0.25
0.25
0.21
0.36
0.33
0.26
0.30
0.15
0.11
0.31
0.14
0.14
0.12
30
0.30
0.42
0.36
0.42
0.50
0.44
0.36
0.42
0.45
0.33
0.42
0.26
0.26
0.39
0.40
0.25
0.45
0.33
0.43
0.36
0.43
0.39
0.39
0.30
27
0.24
71
Lampiran 11. Faktorial Koordinat
Tabel 13. Faktorial Analisis (PCoA)
1
2
3
4
6
7
8
9
10
11
12
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
30
Axis
Coord.
0.0041
0.0343
0.0378
0.0343
0.0027
0.0551
0.0739
0.1476
0.0714
0.0277
0.0615
-0.0648
-0.0329
-0.0003
-0.0292
-0.2003
-0.0122
-0.0898
0.0314
0.0096
-0.0054
0.0596
0.0209
-0.0286
-0.0209
-0.1876
Cos²
5
2808
1800
2808
0
452
619
1001
350
77
1714
1033
208
0
64
907
16
604
130
-156
2
114
87
50
61
802
Axis 2
Coord.
-0.0702
-0.0042
-0.0111
-0.0042
0.2270
0.0271
-0.0242
0.0203
0.0508
0.0133
0.0261
0.0112
0.0510
0.0242
0.1005
0.0125
0.0248
0.0088
-0.0676
-0.0427
0.0124
-0.1254
-0.0546
-0.0935
-0.0690
-0.0433
Cos²
1604
43
154
43
873
110
67
19
176
18
308
31
501
300
758
4
65
6
604
-3063
10
506
594
531
661
43
Axis 3
Coord.
-0.0018
0.0147
-0.0122
0.0147
-0.0964
0.0044
0.0038
0.0283
-0.0263
-0.0957
-0.0082
0.0308
0.0060
0.0262
0.0568
0.0199
0.0779
0.0850
0.0397
0.0153
0.0298
-0.0393
0.0261
-0.0678
-0.0575
-0.0741
Cos²
1
515
186
515
158
3
2
37
47
924
30
233
7
350
242
9
640
541
209
-391
57
50
136
279
459
125
Axis 4
Coord.
-0.0285
-0.0041
0.0098
-0.0041
-0.0391
0.0534
0.0257
0.0395
0.0339
0.0421
0.0067
-0.0342
-0.0075
-0.0052
-0.0569
0.0972
0.0323
-0.0123
0.0021
0.0000
-0.0702
-0.0927
0.0005
0.0544
-0.0079
-0.0349
Cos²
265
39
122
39
26
425
75
72
79
179
20
288
11
14
243
214
110
11
1
0
320
277
0
180
9
28
Axis 5
Coord.
0.0046
0.0331
-0.0313
0.0331
-0.0012
0.0094
-0.0586
-0.0087
0.0526
-0.0521
0.0074
-0.0256
-0.0608
0.0382
0.0422
0.0006
0.0457
-0.0368
-0.0183
-0.0066
-0.0370
0.0237
-0.0129
0.0360
0.0052
0.0180
Tabel 14. Nilai Factorial coordinates
Axis
1
2
3
4
5
\
Eigenvalue
0.00537
0.00449
0.00221
0.00167
0.00106
Inertia%
25.52
21.3
10.51
7.93
5.02
Cos²
7
2614
1232
2614
0
13
389
4
189
274
25
161
713
744
134
0
220
101
44
-74
89
18
33
79
4
7