Tempat dan Waktu Bahan dan Alat Metode Penelitian

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Tempat dan Waktu

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi, Depertemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB dan rumah kaca Laboratorium Silvikultur, Departemen Silvikultur, Fakultas Kehutanan, IPB pada bulan November 2010 sampai Mei 2011.

3.2. Bahan dan Alat

Bahan –bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu benih Acacia crassicarpa, sampel tanah gambut utuh bekas terbakar dan belum terbakar, pupuk hayati yang terdiri atas isolat bakteri Bradyrhizobium japonicum galur BJ 11 B1, Rhizobium DD1 dari tanah gambut Riau B2 Wiratama 2010, dan isolat bakteri Bradyrhizobium japonicum galur S1 dari sengon B3, pupuk urea 46 dosis 1 gram B4 dan dosis 0,5 gram B5. Bahan untuk isolat bakteri ialah media yeast mannitol agar YMA + merah kongo, dan YMB untuk media produksi. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini terdiri atas erlenmeyer, pipet, tabung reaksi, laminar flow, autoklaf, inkubator, cawan petri, polibag, mistar, spektrofotometer, dan peralatan laboratorium lainnya.

3.3. Metode Penelitian

3.3.1. Penyiapan Benih Akasia Penyiapan benih diawali dengan seleksi secara fisik. Benih yang dipilih adalah benih yang memiliki ciri-ciri fisik yang baik yaitu dari segi ukuran, warna dan berat benih. Tujuan dari seleksi benih ini diharapkan dapat mengurangi pengaruh internal dari benih yang menyebabkan perbedaan pertumbuhan benih. Benih yang telah dipilih dibersihkan dengan menggunakan aquades, alkohol 70, dan H 2 SO 4 5. Tiap benih diberi perlakuan yang sama yaitu direndam dengan air hangat 80°C selama 5 menit, kemudian ujungnya digunting dan direndam dengan air dingin selama 12 jam. Tujuan perlakuan ini untuk mematahkan kondisi dorman dari benih. Benih yang telah diberi perlakuan dikecambahkan pada cawan petri hingga kecambahnya muncul dan ditanam pada media. 3.3.2. Penyiapan Media Tanam Tanah dikelompokkan ke dalam dua bagian utama yaitu tanah gambut bekas terbakar dan tanah gambut tidak terbakar. Tiap tanah ini ada yang disteril dan ada yang tidak. Sterilisasi dilakukan selama 1 jam dengan mengunakan autoklaf. Kemudian setiap jenis tanah ini dimasukkan ke dalam polibag ukuran diameter = 10 cm sebanyak 210 grampolibag. Kegiatan terakhir yang dilakukan adalah analisis kandungan unsur hara masing-masing jenis tanah yaitu N, P, K, KTK, dan pH. Jenis media yang digunakan terbagi dalam 4 kelompok yaitu: 1. Tanah gambut tidak steril dan tidak terbakar 2. Tanah gambut tidak steril dan terbakar 3. Tanah gambut steril dan tidak terbakar 4. Tanah gambut steril dan terbakar Setiap media diberikan perlakuan yang sama, ada sebanyak 6 perlakuan dan masing-masing perlakuan mempunyai 5 ulangan. Perlakuan yang diberikan adalah: 1. diberi bakteri Bradyrhizobium japonicum BJ 11 koleksi IPBCC sebanyak 2 ml pada tiap polibag, 2. diberi bakteri Rhizobium asal tanah gambut Riau kode DD sebanyak 2 ml pada tiap polibag, 3. diberi bakteri Bradyrhizobium dari tanaman sengon kode S1 sebanyak 2 ml pada tiap polibag, 4. diberi pupuk NPK 46 sebanyak 0,5 gram dalam 1 liter air sebanyak 2 ml pada tiap polibag, 5. diberi NPK 46 sebanyak 1 gram dalam 1 liter air sebanyak 2 ml pada tiap polibag, dan 6. kontrol tanpa diberikan perlakuan. 3.3.3. Pembuatan Media YMA dan YMB Media tumbuh bakteri yang digunakan adalah YMA, berikut komposisi media YMA dalam 100 ml aquades: -Agar 2 gram -Manitol 1 gram -K 2 HPO 2 0,05 gram -MgSO 4 .7H 2 0,04 gram -NaCl 0,02 gram -Yeast extract 0,1 gram Semua bahan dimasukkan ke dalam erlenmeyer berisi 100 ml aquades. Proses pembuatan media YMA dilakukan dengan memasak media hingga mendidih. Media yang telah mendidih ini disterilisasi di dalam autoklaf selama kurang lebih 1 jam. Media yang telah steril dicampur dengan merah kongo sebanyak 1 ml untuk 100 ml media, setelah merah kongo tercampur rata, media YMA dituang ke dalam cawan petri steril sebanyak kurang lebih 12 ml. Setelah media mulai membeku, cawan ditutup dengan plastik dan disimpan terbalik. Proses ini dilakukan di dalam laminar flow untuk menjaga kondisi tetap steril. Pembuatan YMB tidak menggunakan agar, sehingga saat semua bahan telah dicampurkan dalam aquades, bahan diaduk di atas pemanas hingga semua terlarut menjadi satu. Setelah semua bahan terlarut sempurna, media YMB dipindahkan ke erlenmeyer sebanyak yang dibutuhkan. Mulut erlenmeyer ditutup dengan kapas dan dilapisi plastik kemudian disterilisasi seperti halnya media YMA. 3.3.4. Peremajaan Isolat Isolat semua bakteri ditumbuhkan pada media Yeast Mannitol Agar YMA. Inkubasi dilakukan selama 7-8 hari. Inokulan dibuat dengan memindahkan isolat hasil peremajaan ke erlenmeyer yang berisi Yeast Mannitol Broth YMB dan diinkubasi selama 5 hari pada inkubator bergoyang dengan kecepatan 125 rpm. Setelah bakteri diremajakan, bakteri dibiakkan pada media YMA selama 5 hari untuk nantinya diproduksi pada media cair. Isolat masing-masing bakteri dimurnikan pada media YMA dengan menggunakan merah kongo congo reddan pengamatan pada mikroskop dengan metode pewarnaan Gram. Bakteri yang telah murni diproduksi pada media cair YMB sebanyak 100 ml hingga mencapai OD optical density 0,8. Untuk mengetahui bakteri telah mencapai OD 0,8 dilakukan dengan cara uji spektrofotometer dengan panjang gelombang 600 nm. 3.3.5. Penanaman Akasia Biji akasia yang telah mendapat perlakuan dikecambahkan pada cawan petri selama 4 hari atau hingga kecambahnya muncul. Benih yang kecambahnya telah muncul ditanam ke polibag berisi tanah gambut. Tiap polibag diisi satu kecambah Acacia crassicarpa. Setelah semua kecambah dipindahkan ke dalam polibag maka tanaman diberikan perlakuan seperti uraian di atas. 3.3.6. Pemeliharaan Kegiatan pemeliharaan yang dilakukan meliputi penyiraman tanaman dengan air setiap pagi dan sore, mencabut gulma dan mencegah terserang hama ulat. Pengendalian hama dan gulma dilakukan secara manual. 3.3.7. Pengamatan Parameter 3.3.7.1.Tinggi Bibit Pengukuran tinggi bibit dilakukan setiap 1 minggu sekali selama 10 minggu dengan menggunakan mistar. Tinggi bibit diukur mulai dari titik bekas kotiledon sampai titik tumbuh tunas yang paling mudatitik tertinggi meristem apikal pada batang. Nilai tersebut dinyatakan dalam satuan sentimeter cm. 3.3.7.2. Jumlah Daun Pengukuran jumlah daun dilakukan setiap 1 minggu sekali dalam 10 minggu. Jumlah daun yang dihitung adalah daun awal yang telah melebar dan daun semu yang telah membesar. Daun semu dihitung diakhir pengamatan yaitu saat umur 10 minggu setelah tanam. 3.3.7.3. Jumlah Bintil Pengukuran jumlah bintil dilakukan diakhir pengamatan yaitu setelah tanaman berurumur 10 minggu. Pengukuran dilakukan dengan menjumlahkan seluruh bintil yang ditemukan dalam setiap ulangan untuk setiap jenis perlakuan. Bintil yang telah dipanen dibelah dan diamati warnanya. Apabila berwarna merah artinya bintil efektif dan apabila warnanya semakin pucat artinya bintil semakin tidak efektif. 3.3.7.4. Warna Daun Pengamatan warna daun dilakukan setiap hari selama 10 minggu dengan cara mendokumentasikan setiap perubahan warna yang terjadi dan membandingkan dengan literarur tanda-tanda kekurangan unsur hara pada tanaman. 3.3.7.5.Biomassa Tanaman Pengukuran biomassa tanaman dilakukan saat pemanenan yaitu dengan mengukur berat kering akar dan pucuk. Pengukuran berat kering dilakukan dengan memisahkan bagian antara akar dan pucuknya daun dan batang kemudian dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 80°C dalam waktu 48 jam. Setelah di oven maka berat kering akar dan pucuk ditimbang. Nilai tersebut dinyatakan dalam satuan gram. Rasio pucuk akar didapatkan dengan perbandingan antara berat kering bagian pucuk dengan bagian akar tanaman. 3.3.8. Rancangan Percobaan Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap Faktorial 3 Faktor dengan 24 perlakuan masing-masing perlakuan diulang sebanyak 5 kali dengan demikian jumlah total polibag pengamatan berjumlah 120 polibag. Adapun faktor-faktor yang digunakan ialah pertama media gambut yang terdiri dari 2 taraf yaitu: Faktor G = Tanah Gambut G0 = Tanah gambut tidak terbakar G1 = Tanah gambut terbakar Faktor kedua sterilisasi tanah yang terdiri dari 2 taraf yaitu: Faktor S = Sterilisasi tanah S0 = Tidak steril S1 = Steril Faktor ketiga pemberian bakteri atau urea 46 B yang terdiri dari 6 taraf yaitu: Faktor B = Bakteri dan Urea 46 B0 = Kontrol B1 = Bakteri Bradyrhizobium asal Malang B2 = Bakteri Rhizobium asal Riau B3 = Bakteri Bradyrhizobium dari tanaman sengon B4 = Pupuk NPK 46 sebanyak 0,5 gram B5 = Pupuk NPK 46 sebanyak 1 gram Kombinasi perlakuan yang diujicobakan dapat dilihat pada lampiran 1. Model rancangan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: Yijkl = µ + Ai + Bj + Ck + ABij + ACik + BCjk + ABCijk + eijkl Keterangan : Yijkl = Nilai dari pengamatan yang memperoleh i faktor gambut terbakar, j faktor sterilisasi gambut, taraf k faktor pemberian bakteri atau urea pada ulangan ke-l μ = Nilai rata-rata umum A i = Nilai pengaruh taraf ke-i faktor gambut B j = Nilai pengaruh taraf ke-j faktor sterilisasi C k = Nilai pengaruh taraf ke-k faktor pemberian bakteri atau urea AB ij = Nilai interaksi gambut ke-i dan sterilisasi ke-j AC ik = Nilai interaksi gambut ke-i dan pemberian bakteri atau urea ke-k BC jk = Nilai interaksi sterilisasi ke-i dan pemberian bakteri atau urea ke-k ABCijk = Nilai interaksi gambut ke-i, sterilisasi ke-j dan pemberian bakteri atau urea ke-k eijkl = Nilai alat dari unit percobaan yang diberikan taraf i faktor tanah gambut, taraf j faktor sterilisasi gambut dan taraf k faktor pemberian bakteri atau urea pada ulangan ke-l. Untuk mengetahui pengaruh perlakuan yang diberikan terhadap peubah yang diamati, dilakukan analisis keragaman yang diperoleh dari pengolahan data dengan menggunakan program SAS. Kemudian bila pengaruh yang diberikan menunjukan perbedaan yang nyata maka dilakukan uji lanjut Duncan.

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN