Ekstraksi kasar Pemurnian Katepsin

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Pemurnian Katepsin

Pemurnian katepsin dilakukan dengan ektraksi secara kasar melalui sentrifugasi diferensiasi, presipitasi dengan garam ammonium sulfat, serta dialisis dengan menggunakan kantong dialisis berukuran 12 MWCO.

4.1.1 Ekstraksi kasar

Pemurnian katepsin diawali dengan ektraksi kasar dari daging ikan bandeng yang sudah memasuki tahap post-rigor. Pemilihan fase ini mengacu pada penelitian terdahulu yang dilakukan Fentiana 2009 yang menyatakan bahwa pada tahap post- rigor , aktivitas katepsin berada pada aktivitas tertinggi dibandingkan pada fase-fase sebelumnya sehingga akan meningkatkan rendemen katepsin yang dihasilkan. Pada tahap ekstraksi, pemilihan buffer Tris-HCl pH 7,4 dinilai sudah sesuai. Hal ini sesuai dengan pendapat dari Whitaker 1994 yang menyatakan bahwa ekstraksi enzim sebaiknya menggunakan buffer untuk mengontrol pH dekat dengan 7,5 dan kekuatan ion 0,1-0,5. Buffer diperlukan untuk melindungi enzim dari sejumlah besar asam yang dilepaskan dari vakuola pada saat pecahnya sel. Ekstrak kasar yang dihasilkan memiliki aktivitas spesifik sebesar 0,8598 Umg dengan kadar protein sebesar 0,1163 mgmL. Sentrifugasi yang dilakukan pada tahap ekstraksi kasar ialah sentrifugasi metode diferensiasi. Penelitian Toyohara et al. 1981 menyebutkan bahwa ekstrak kasar katepsin A yang berasal dari carp muscle memiliki aktivitas spesifik sebesar 0,279 Umg. Sentrifugasi metode diferensiasi diawali dengan sentrifugasi tingkat pertama, dimana hasil pada tingkat pertama ini pelet yang dihasilkan dibuang, kemudian pada sentrifugasi tingkat kedua supernatan kembali disentrifugasi pada kecepatan yang tinggi untuk memisahkan partikel yang berukuran sedang. Pemisahan dapat dicapai melalui sentrifugasi metode diferensiasi dapat ditingkatkan dengan mengulang resuspensi dua atau tiga kali pada sentrifugasi tahap ketiga, pelet yang didapatkan dihomogenisasi dengan media yang sesuai dan disentrifugasi kembali. Selanjutnya akan didapatkan supernatan dengan partikel yang kecil Rana 2006. Penelitian yang dilakukan Dinu et al. 2002 menyebutkan bahwa pada sentrifugasi tingkat pertama dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 600xg selama 10 menit. Sentrifugasi tingkat kedua dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 10000xg selama 10 menit. Sentrifugasi tahap ketiga dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 4000xg selama 10 menit. Prinsip dari sentrifugasi itu sendiri ialah berdasarkan fenomena bahwa partikel yang tersuspensi di dalam suatu wadah akan mengendap ke dasar wadah karena pengaruh gravitasi. Laju pengendapan tersebut dapat ditingkatkan dengan cara meningkatkan pengaruh gravitasional terhadap partikel. Hal ini dapat dilakukan dengan menempatkan tabung berisi suspensi partikel ke dalam rotor suatu mesin sentrifugasi kemudian diputar dengan kecepatan tinggi Yuwono 2008.

4.1.2 Presipitasi