III. METODOLOGI 3.1
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan April sampai Juli 2010 di Laboratorium Bioteknologi Hasil Perairan, Laboratorium Biokimia Hasil Perairan,
Laboratorium Mikrobiologi Hasil Perairan, Laboratorium Bahan Baku Hasil Perairan Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan.
Laboratorium Bioteknologi Hewan, Laboratorium Kimia dan Biokimia, Ruang Pendingin, Pusat Antar Universitas. Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran
Hewan, Institut Pertanian Bogor.
3.2 Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari bahan utama yakni ikan bandeng dalam keadaan post-rigor, bahan-bahan untuk ektraksi kasar buffer
Tris HCl 0,1 M pH 7,4, akuades, presipitasi ammonium sulfat teknis, dialisis Kantong dialisis, buffer Tris HCl pH 7,4, uji aktivitas katepsin [hemoglobin
Sigma, buffer tris 0,1 pH 7,4, tirosin Applichem, akuades, TCA 5, folin Merck, HCl 1 N], uji kadar protein [pereaksi Bradford, bovine serum albumin
Applichem]. Alat yang digunakan pada penelitian ini antara lain inkubator Thermoline,
sentrifuse suhu dingin Himac, spektrofotometer Yamato, pH meter, tabung dialisis, kertas saring Whatman no.1 dan erlenmeyer.
3.3 Metode Penelitian
Penelitian ini dilakukan melalui beberapa tahap, yaitu preparasi sampel berupa ikan bandeng pada tahap post-rigor yang diambil bagian dagingnya. Tahap
selanjutnya yakni pemurnian enzim katepsin semi murni yang meliputi ektraksi kasar, presipitasi, dan dialisis. Tahapan metode penelitian ini dapat dilihat pada Gambar 7.
Gambar 7. Diagram alir kerja penelitian pembuatan katepsin semi murni Ikan bandeng dalam
keadaan post-rigor
Preparasi
Daging
Ekstraksi kasar
Enzim katepsin kasar Pengukuran aktivitas
enzim dan kadar protein Presipitasi
30, 40, 50, 60, 70, 80 bv
Katepsin semi murni 1 Pengukuran aktivitas
enzim dan kadar protein
Dialisis 2 jam, 4 jam 6 jam, 8 jam
Katepsin semi murni 2 Pengukuran aktivitas
enzim dan kadar protein SDS-PAGE dan Zimogram
3.3.1 Ekstraksi katepsin kasar Dinu et al. 2002 Ekstraksi dilakukan dengan preparasi sampel untuk memperoleh ektrak kasar
katepsin dengan cara ikan dimatikan, kemudian daging ikan dibedah dengan cepat dan dicuci untuk menghilangkan darah. Daging ikan diambil dan disuspensikan
dalam akuades dengan perbandingam daging ikan dan akuades sebesar 1:1, lalu dihomogenisasi pada suhu 0 °C.
Ektrak daging hasil homogenisasi disentrifugasi pada 600xg selama 10 menit dan supernatan yang diperoleh kemudian disentrifugasi lagi pada 10000xg selama 10
menit. Pelet yang dihasilkan dari hasil sentrifugasi kemudian dilarutkan dalam buffer Tri-HCl 0,1 M pH 7,4 dengan jumlah yang sama seperti jumlah akuades tadi dan
disentrifugasi pada 4000xg selama 10 menit. Supernatan ekstrak kasar katepsin yang diperoleh merupakan protein utama dari mitokondria dan lisosom yang siap
untuk diteliti aktivitasnya lebih lanjut. 3.3.2 Presipitasi dan dialisis
Katepsin semi murni diperoleh dengan mengendapkan ektrak kasar katepsin menggunakan ammonium sulfat dengan tingkat kejenuhan 30, 40, 50, 60,
70 dan 80 bv. Pengendapan dilakukan dengan menambahkan garam ammonium sulfat ke dalam supernatan sedikit demi sedikit dan disentrifugasi pada
12000xg selama 30 menit. Pelet dilarutkan dalam buffer Tris HCl 0,1 M pH 7,4. Langkah selanjutnya
yakni dialisis. Dialisis dilakukan dalam buffer Tris HCl pH 7,4 menggunakan kantong selofan berukuran 12 kDa, dengan waktu dialisis 2, 4, 6, dan 8 jam. Tahap
presipitasi dan dialisis ini dilakukan pada suhu ≤ 4 °C.
3.3.3 Karakterisasi katepsin Karakterisasi dilakukan terhadap hasil dialisis dengan aktivitas spesifik yang
tertinggi. Karakterisasi meliputi penentuan suhu optimum, pH optimum, pengaruh ion logam dan penentuan konsentrasi substrat optimum.
3.3.3.1 Karakterisasi suhu Karakterisasi suhu dilakukan dengan melakukan variasi suhu inkubasi pada
saat pegujian aktivitas katepsin dengan suhu20, 30, 40, 50, 60, dan 70 °C. Pada
waktu pengujian, hemoglobin sebagai substratnya dibuat dengan konsentrasi 2 pH 2. Sebanyak 0,5 mL dari larutan substrat, 0,1 mL larutan buffer Tris pH 7,4
diinkubasi dengan 0,1 mL larutan enzim pada variasi suhu 20, 30, 40, 50, 60, 70 °C
selama 10 menit. Reaksi dihentikan dengan penambahan 2 mL TCA 5 wv. Campuran disaring dan 1 mL filtrat hasil hasil penyaringan ditambah dengan 1 mL
pereaksi folin. Selanjutnya diinkubasi kembali pada suhu 37 °C selama 20 menit.
Campuran kemudian diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 750 nm. Selain itu, dilakukan pula pengukuran untuk larutan blanko dan larutan
standar dengan prosedur yang sama seperti larutan sampel hanya untuk larutan blanko dan larutan standar enzimnya digantikan dengan akuades dan tirosin.
3.3.3.2 Karakterisasi pH Karakterisasi pH dilakukan dengan melakukan variasi pH buffer dan pH
substrat yakni pH hemoglobin 2 dengan variasi pH yakni 2, 3, 4, 5, 6, dan 7. Pada waktu pengujian, hemoglobin sebagai substratnya dibuat dengan konsentrasi 2 dan
variasi pH 2, 3, 4, 5, 6, dan 7. Sebanyak 0,5 mL dari larutan substrat, 0,1 mL larutan buffer dengan variasi pH 2, 3, 4, 5, 6, dan 7 diinkubasi dengan 0,1 mL larutan
enzim pada 37 °C selama 10 menit. Reaksi dihentikan dengan penambahan 2 mL TCA 5 wv. Campuran disaring dan 1 mL filtrat hasil hasil penyaringan
ditambah dengan 1 mL pereaksi folin. Selanjutnya diinkubasi kembali pada suhu 37
°C selama 20 menit. Campuran kemudian diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 750 nm. Selain itu, dilakukan pula pengukuran untuk larutan
blanko dan larutan standar dengan prosedur yang sama seperti larutan sampel hanya untuk larutan blanko dan larutan standar enzimnya digantikan dengan akuades dan
tirosin.
3.3.3.3 Karakterisasi konsentrasi substrat Karakterisasi konsentrasi subtrat dilakukan dengan mengubah konsentrasi
substrat hemoglobin dengan variasi konsentrasi ½, 1, 1 ½, 2, 2 ½, 3, 3 ½, 4, dan 4 ½ bv. Pada waktu pengujian, hemoglobin sebagai substratnya
dibuat dengan konsentrasi ½, 1, 1 ½, 2, 2 ½, 3, 3 ½, 4, dan 4 ½ bv pH 2. Sebanyak 0,5 mL dari larutan substrat, 0,1 mL larutan buffer Tris pH 7,4
diinkubasi dengan 0,1 mL larutan enzim pada variasi suhu 20, 30, 40, 50, 60, 70 °C
selama 10 menit. Reaksi dihentikan dengan penambahan 2 mL TCA 5 wv. Campuran disaring dan 1 mL filtrat hasil hasil penyaringan ditambah dengan 1 mL
pereaksi folin. Selanjutnya diinkubasi kembali pada suhu 37 °C selama 20 menit.
Campuran kemudian diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 750 nm. Selain itu, dilakukan pula pengukuran untuk larutan blanko dan larutan
standar dengan prosedur yang sama seperti larutan sampel hanya untuk larutan blanko dan larutan standar enzimnya digantikan dengan akuades dan tirosin.
3.3.3.4 Karakterisasi pengaruh ion logam Karakterisasi pengaruh ion logam dilakukan dengan menambahkan ion logam
monovalen NaCl, bivalen BaCl
2
dan CaCl
2
, serta trivalen AlCl
3
dan FeCl
3
. Pada waktu pengujian, hemoglobin sebagai substratnya dibuat dengan konsentrasi 2
pH 2. Sebanyak 0,5 mL dari larutan substrat, 0,1 mL larutan buffer Tris pH 7,4 dan 0,1 mL larutan logamNaCl, BaCl
2
, CaCl
2,
AlCl
3
dan FeCl
3
diinkubasi dengan 0,1 mL larutan enzim pada 37 °C selama 10 menit. Reaksi dihentikan dengan
penambahan 2 mL TCA 5 wv. Campuran disaring dan 1 mL filtrat hasil hasil penyaringan ditambah dengan 1 mL pereaksi folin. Selanjutnya diinkubasi kembali
pada suhu 37 °C selama 20 menit. Campuran kemudian diukur dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang 750 nm. Selain itu, dilakukan pula pengukuran untuk larutan blanko dan larutan standar dengan prosedur yang sama
seperti larutan sampel hanya untuk larutan blanko dan larutan standar enzimnya digantikan dengan akuades dan tirosin.
3.4 Analisis
Kategori