Penapisan bakteri penghasil senyawa antimikrob yang berasosiasi dengan spons Haliclona sp. dan deteksi gen penyandi poliketida sintase dan peptida sintase nonribosom
1
PENAPISAN BAKTERI PENGHASIL SENYAWA ANTIMIKROB
YANG BERASOSIASI DENGAN SPONS
sp. DAN
DETEKSI GEN PENYANDI POLIKETIDA SINTASE
DAN PEPTIDA SINTASE NONRIBOSOM
MEGASARI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
2
PENAPISAN BAKTERI PENGHASIL SENYAWA ANTIMIKROB
YANG BERASOSIASI DENGAN SPONS
sp. DAN
DETEKSI GEN PENYANDI POLIKETIDA SINTASE
DAN PEPTIDA SINTASE NONRIBOSOM
MEGASARI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
i
ABSTRAK
MEGASARI. Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa Antimikrob yang Berasosiasi dengan Spons
sp. dan Deteksi Gen Penyandi Poliketida Sintase dan Peptida Sintase Nonribosom.
Dibimbing oleh ARIS TRI WAHYUDI dan NISA RACHMANIA MUBARIK.
Spons tergolong dalam Filum Porifera memiliki kemampuan bersimbiosis dengan
mikroorganisme. Simbiosis tersebut menghasilkan produk alami yang menguntungkan seperti
poliketida dan peptida nonribosom yang memiliki aktivitas antimikrob. Poliketida dan peptida
nonribosom masing-masing dibentuk oleh gen
(PKS) dan
(NRPS). Keduanya merupakan enzim multifungsional yang terlibat dalam
biosintesis senyawa bioaktif yang penting dalam bidang farmasi dan industri. Penelitian ini
bertujuan menapis bakteri asal spons penghasil senyawa antimikrob dan mendeteksi gen yang
berperan dalam biosintesis senyawa bioaktif tersebut. Sebanyak 18 isolat bakteri yang diisolasi
dari spons
sp. dan diuji aktivitas antimikrobnya, didapatkan 12 isolat bakteri yang
menghambat pertumbuhan empat bakteri patogen, yaitu
,
(EPEC),
,
, dua bakteri nonpatogen, yaitu
,
, dan dua cendawan patogen, yaitu
, dan
Deteksi gen penyandi PKS dan NRPS dilakukan dengan teknik
(PCR) menggunakan primer spesifik yang masing-masing menghasilkan amplikon
berukuran 700 pb dan 1000 pb. Satu isolat yang memiliki aktivitas antimikrob terbaik dan
memiliki kedua gen penyandi PKS dan NRPS yaitu Iso 10 dipilih untuk analisis homologinya.
Fragmen DNA dari genom Iso 10 KS (700 pb) yang telah berhasil diklon ke dalam plasmid
pGEMT dan disekuen, menyatakan homologinya dengan domain KS sekitar 49-51%.
Keyword: senyawa bioaktif, antimikrobial, PKS, NRPS, spons
ABSTRACT
MEGASARI. Screening of Bacteria Producing Antimicrobial Compounds which is Associated
with
sp. Sponge and Detection Its Encoding Peptide Synthase and Non-ribosomal
Polyketide Synthase Gene. Supervised by ARIS TRI WAHYUDI and NISA RACHMANIA
MUBARIK.
Sponges are classified in the Porifera phylum have the ability to symbiosis with
microorganisms. The symbiont produced useful natural products such as polyketides and nonribosomal peptides that possessed antimicrobial activities. Each polyketide and non-ribosomal
peptide are synthesized by the
(PKS) dan
(NRPS) gene. Both of them are multifunctional enzymes that involved in the biosynthesis
bioactive compounds that are important in pharmaceutical and other industries.The aims of study
was to screened the bacteria producing antimicrobial compounds which is associated with sponge
and detect the genes that play a role in the biosynthesis of bioactive compounds. A total of 18
isolates bacteria that associated with
sp. was tested their antimicrobial activity and
finally 12 isolates bacteria that inhibited four pathogenic bacteria growth that consist of
,
(EPEC),
,
, and two non-pathogenic bacteria that consist of
,
,
and the two pathogenic fungus
and
. Detection of PKS and
NRPS encoding gene performed by
(PCR) using specific primers,
producing 700 bp and 1000 bp amplicon. One isolate that possessed the best antimicrobial
activities and both of PKS and NRPS gene which is Iso 10 are selected for homology test. DNA
fragment from Iso 10 KS genome (700 bp) that have been successfully cloned into plasmid
pGEMT and sequenced and its homology with other KS domain sequences of about 49-51%.
Keyword: bioactive compounds, antimicrobial, PKS, NRPS, sponge
ii
Judul
Nama
NIM
: Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa Antimikrob yang Berasosiasi dengan
Spons
sp. dan Deteksi Gen Penyandi Poliketida Sintase dan
Peptida Sintase Nonribosom
: Megasari
: G34061194
Disetujui:
Pembimbing I,
Pembimbing II,
(Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si.)
NIP 19630705 199103 1 005
(Dr.Nisa Rachmania Mubarik, M.Si.)
NIP 19671127 199302 2 001
Diketahui:
Ketua Departemen Biologi
Institut Pertanian Bogor
(Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si.)
NIP 19641002 198903 1 002
iii
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yesus Kristus karena dengan berkat, kuasa,
dan roh kudus-Nya penulis dapat menyelesaikan penelitian dan menyusun skripsi ini. Tema
penelitian ini yaitu Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa Antimikrob yang Berasosiasi dengan
Spons
sp. dan Deteksi Gen Penyandi Poliketida Sintase dan Peptida Sintase
Nonribosom. Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Februari sampai Oktober 2010 di
Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi, Institut Pertanian Bogor.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si. dan Ibu Dr.
Nisa Rachmania Mubarik, M.Si. selaku pembimbing atas saran dan bimbingannya dalam
pelaksanaan penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Terima kasih disampaikan kepada Ibu Dr.
Ir. Raden Roro Dyah Perwitasari, M.Sc. sebagai wakil komisi pendidikan atas saran dan diskusi
yang diberikan. Terima kasih juga kepada Bang Yonathan Banoet, Mbak Rika Astuti, Mbak Ari
untuk saran dan bantuannya selama penelitian di laboratorium. Selain itu, ucapan terima kasih
penulis sampaikan kepada teman-teman terdekat, keluarga besar laboratorium mikrobiologi
FMIPA IPB, keluarga perwira 52, Komisi Literatur PMK IPB, serta teman-teman seperjuangan di
Biologi 43 yang tidak dapat disebutkan satu per satu, atas segala bantuan dan semangat yang telah
diberikan. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Mama, Papa, Robby Sutady,
Angela Meliana, atas do`a, dukungan, semangat, dan segala cinta yang diberikan.
Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.
Bogor, November 2010
!
iv
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 4 Mei 1988 dari Bapak Wijaya Sutady dan Ibu
Lenny. Penulis merupakan anak ketiga dari tiga bersaudara. Tahun 2006 penulis lulus dari SMU
TARAKANITA 1 JAKARTA dan lolos seleksi masuk IPB melalui jalur Seleksi Penerimaan
Mahasiswa Baru (SPMB) pada Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam, Institut Pertanian Bogor.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif sebagai anggota Unit Kegiatan Mahasiswa
Persekutuan Mahasiswa Kristen Institut Pertanian Bogor (UKM PMK IPB) dan aktif sebagai
anggota Komisi Literatur pada tahun 2006-2010 serta pernah menjabat sebagai Sekretaris Komisi
Literatur PMK IPB pada tahun 2008-2009. Penulis menjadi asisten praktikum mata kuliah Botani
Umum pada tahun 2010. Penulis melakukan Praktik Kerja Lapang di Laboratorium Iradiasi
Pangan, Pusat Aplikasi Teknologi Isotop dan Radiasi Badan Tenaga Nuklir Nasional (PATIRBATAN) dari bulan Juli sampai Agustus 2009 dengan judul Pengaruh Iradiasi pada Kandungan
Gizi Nasi.
v
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ……………………………………………………………………………
vii
DAFTAR GAMBAR……...……………………………………………………………….…
vii
DAFTAR LAMPIRAN…..………………………………………………………………..…
vii
PENDAHULUAN
Latar Belakang……………………………………………………………………………….
1
Tujuan…..................................................................................................................................
1
Waktu dan Tempat Penelitian………………………………………………………………..
2
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat………………………………………………………………………...……
2
Metode……………………………………………………………………………………….
2
Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa Antibakteri……………………………...………..
2
Pengujian Bakteri Penghasil Senyawa Antifungi……………………………...………….
2
Isolasi DNA Genom………………………………………………………………………
2
Amplifikasi Domain KS dan Domain A………………………………………………….
2
Kloning Domain KS dan Domain A ke dalam Sel
DH5α...……………………..
3
Analisis Bioinformatika………………………………………...…………………...……
3
HASIL
Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa Antibakteri…...…………………………………
3
Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa Antifungi………...…………………………….
4
Amplifikasi Domain KS dan Domain A………………………………………………....
5
Kloning Domain KS dan Domain A dalam Sel
6
DH5α…………………………..
Verifikasi Hasil Kloning Domain KS dan Domain A……………………………………
6
Analisis Bioinformatika………………………………………………………………….
6
PEMBAHASAN………………………………………………………………………………
7
SIMPULAN……………………………………………………………………………………
8
DAFTAR PUSTAKA…………………………………………………………………………
8
LAMPIRAN……………………………………………………………………………………
9
vi
DAFTAR TABEL
1
2
Halaman
Hasil penapisan bakteri yang berasosiasi dengan spons yang memiliki aktivitas antibakteri
dan antifungi………………………….……………………………..………………….….............
5
Analisis homologi sekuen Iso 10 KS terhadap sekuen domain KS asal "
.......................
7
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
Zona bening di sekitar koloni terhadap (a)
2
Zona bening di sekitar koloni terhadap (a)
, (b)
# ( c)
#
(d) EPEC…………………………………………………………………………………………….
(b)
3
4
dan (b)
……………………………………………………………………………..……….
4
Elektroforesis gel agarosa 1% (b/v) hasil amplifikasi domain KS untuk 12 isolat yang berasosiasi
dengan spons
sp. Ket: (L) 1 Kb $
, (1) HAA 02, (2) Iso act 6, (3) Iso 8, (4) Iso act 2,
(5) Iso 95, (6) Iso act 1, (7) Iso 40, (8) HAA 06, (9) HAL 87, (10) Iso 23, (11) Iso 20, (12) Iso 10…. 5
4
Elektroforesis gel agarosa 1% (b/v) hasil amplifikasi domain A untuk 12 isolat yang berasosiasi
dengan spons
sp. Ket: (L) 1 Kb $
, (1) HAA 02, (2) Iso act 6, (3) Iso 8, (4) Iso act 2,
(5) Iso 95, (6) Iso act 1, (7) Iso 40, (8) HAA 06, (9) HAL 87, (10) Iso 23, (11) Iso 20, (12) Iso 10… 5
5
Koloni putih
6
Elektroforesis agarosa 1% dari pGEMT-Easy-10-KS dipotong dengan
DH5α pada isolat Iso 10 yang diduga membawa plasmid rekombinan…………
6
RI……………………… 6
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
Halaman
Komposisi macam-macam media yang digunakan dalam proses penapisan bakteri yang
berasosiasi dengan spons
sp……………………………..………………….…...........
11
Bahan-bahan dan media yang digunakan dalam proses transformasi……………......................
11
Sekuen dari Iso 10 KS (dalam bentuk FASTA)………...………………………………………...
11
Homologi antara sekuen-sekuen domain KS dengan Iso 10 KS…………………………...…......
12
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Mikrob dapat berinteraksi dengan
organisme laut, seperti spons, dan
menghasilkan berbagai produk alami.
Produk alami yang berasal dari metabolit
sekunder mikrob berperan penting dalam
penelitian medis dan pengembangan obat.
Produk alami tersebut dapat secara lansung
menjadi obat atau menjadi struktur dasar
sintesis obat kimia baru (Bahkuni
.
2005). Sejak tahun 1981, dilaporkan bahwa
sekitar 40% produk kimia berasal dari
turunan produk alami mikrob (Lanen &
Shen 2006). Keuntungan dari produk alami
sebagai senyawa bioaktif karena dapat
memiliki aktivitas antimikrob, antiviral,
antimalaria, antikanker, antitumor, bahkan
memiliki aktivitas
% .
Spons yang sudah diteliti dan
menghasilkan senyawa bioaktif antara lain
&
sp.,
#
#
'
#
# dan
Kennedy
(2008, 2009) melaporkan, pada
ditemukan sekitar
delapan filum bakteri. Filum yang paling
banyak
ditemukan
ialah
filum
#
#
(
# dan )
. Metabolit
yang diisolasi dari bakteri yang berasosiasi
dengan spons
sp., misalnya:
sterol, steroid, alkaloid, avarol, nukleosida,
peptida, dan poliketida (Blunt
. 2007).
Peptida nonribosom sebagai salah satu
senyawa bioaktif memiliki kemampuan
untuk menjadi antibiotik hingga racun. Oleh
karena itu, investigasi biosintesis peptida
sangat menarik untuk pembentukan obat
baru dalam bidang farmasi modern. Selain
peptida nonribosom, poliketida juga
memiliki peran penting dalam industri
agrokimia, farmasi, dan bioteknologi
(Schwarger
. 2003, Kennedy
2008).
Peptida nonribosom atau poliketida
masing-masing dibentuk oleh enzim besar
yang multifungsional dengan kelompok situs
katalitik yang terkoordinasi, yaitu
(PKS) dan
(NRPS) (Zhao
2007). NRPS
terdiri atas organisasi modular, yaitu
serangkaian situs aktif terkoordinasi yang
dapat dideteksi untuk analisis genetik bakteri
yang berasosiasi dengan spons. Setiap
modul terdiri atas domain minimal dan
domain opsional. Domain minimal adalah
domain dengan jumlah minimum yang
diperlukan untuk seluruh proses sintesis
peptida nonribosomal, terdiri atas domain
(A), domain
(PCP), domain
(C),
dan domain
(TE). Sedangkan
domain opsional terdiri atas domain
*
(Cy), domain
+
(MT), dan domain
*
(Er) (Shen
2004). Seperti halnya NRPS, PKS juga
merupakan
enzim
besar
yang
multifungsional dengan organisasi modular.
Persyaratan minimal yang dibutuhkan oleh
PKS ialah tiga domain, yaitu domain
+
(AT), domain
(KS), dan domain
(ACP)
(Otsuka
2004, Xiao
2006, Zucko
2007).
Domain KS dan domain A masingmasing memiliki peran penting dalam
sintesis
poliketida
dan
peptida
nonribosomal. Domain A berperan dalam
tugas inti yaitu mengaktifkan dan memilih
asam amino yang sama asal dari kelompok
substrat bebas dalam pembentukan nonribosomal peptida (Schwarger
2003,
Shen
2004, Zhao
2007).
Sedangkan Domain KS bertanggung jawab
untuk
kondensasi
unit
luar
yang
ditambahkan pada rantai poliketida selama
biosintesis poliketida (Xiao
2006,
Zucko
2007). Menurut Shen (2004),
modifikasi NRPS dengan pengubahan
substrat pada domain A akan menjadi
rekayasa sintesis peptida baru. Seperti
halnya domain A, keragaman struktur
poliketida
dapat
dilakukan
dengan
pengubahan starter, perluasan unit, dan
jumlah kondensasi pada modifikasi domain
KS (Otsuka
2004). Selain itu,
persamaan domain KS dan domain A yaitu
keduanya lebih sesuai dalam analisis
filogenetik keanekaragaman PKS dan NRPS
(Zhang
2008, 2009). Oleh karena itu,
analisis domain KS dan domain A
memudahkan penelitian untuk mendeteksi
gen yang berperan dalam pembentukan
senyawa bioaktif yang berperan penting
dalam bidang farmasi dan industri.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan menapis
bakteri yang berasosiasi dengan spons
sp. yang menghasilkan senyawa
antimikrob serta mendeteksi gen yang
berperan dalam biosintesis senyawa
antimikrob tersebut.
2
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan dari bulan
Maret hingga Oktober 2010 di Laboratorium
Bagian Mikrobiologi, Departemen Biologi,
FMIPA, IPB.
BAHAN DAN METODE
Bahan
Bahan yang digunakan dalam
penelitian ini ialah 16 bakteri endofit (HAL
87, Iso act 6, Iso 40, Iso 46, Iso 8, Iso 47, Iso
67, Iso 95, Iso act 1, Iso act 16, Iso act 2, Iso
53, Iso 20, Iso 23, Iso 100, dan Iso 10), dan
2 bakteri permukaan (HAA 02, HAA 06)
yang berasosiasi dengan spons
sp.
asal Pulau Wigeo, wilayah Raja Ampat,
Provinsi Papua Barat (Tokasaya 2010), dua
bakteri uji nonpatogen (
,
), empat bakteri uji patogen
(
,
#
,
[EPEC]), dan dua fungi uji
patogen (
,
).
Metode
Penapisan Bakteri Penghasil
Senyawa Antibakteri. Teknik lapis ganda
(
) digunakan dalam pengujian
aktivitas antibakteri. Teknik ini dilakukan
dengan cara mengkulturkan bakteri uji, baik
yang patogen (
,
,
, EPEC) maupun nonpatogen (
dan
) pada media
,
(SWC) cair (Lampiran 1),
kemudian diinkubasi selama 18 jam. Kultur
cair bakteri uji diambil sebanyak 1 ml
kemudian dimasukkan ke dalam 100 ml
media agar-agar SWC steril. Campuran
antara kultur bakteri dan media SWC
dijadikan
sebagai
lapisan
kedua.
Selanjutnya, sebanyak 15 ml campuran
dituangkan ke dalam cawan petri yang telah
berisi dengan media agar-agar SWC yang
telah padat (lapisan pertama). Setelah padat,
18 isolat bakteri asal spons masing-masing
digoreskan pada permukaan media SWC
yang telah mengandung kultur bakteri uji,
kemudian diinkubasi selama 3 hari pada
suhu 37 0C. Senyawa bioaktif antibakteri
diindikasikan dengan terbentuknya zona
jernih di sekitar koloni.
Penapisan Bakteri Penghasil
Senyawa
Antifungi.
Metode
yang
dilakukan
sama
dengan
pengujian
antibakteri yaitu dengan teknik lapis ganda.
Kultur cair
yang telah diinkubasi
selama 24 jam dalam
%
(PDB), diambil sebanyak 1ml kemudian
dimasukkan ke dalam 100 ml media
%
(PDA) steril (Lampiran 1).
Campuran antara kultur fungi dan media
PDA dijadikan sebagai lapisan kedua.
Selanjutnya, sebanyak 15 ml campuran
dituangkan ke dalam cawan petri yang telah
berisi dengan media PDA yang telah padat
(lapisan pertama). Setelah padat, 18 isolat
bakteri
asal
spons
masing-masing
digoreskan pada permukaan media PDA
yang telah mengandung kultur fungi, lalu
diinkubasi selama 3 hari pada suhu 37 0C.
Senyawa bioaktif antifungi diindikasikan
dengan terbentuknya zona jernih di sekitar
koloni.
Isolasi DNA Genom. DNA genom
dari bakteri yang berasosiasi dengan spons
sp. diisolasi dengan menggunakan
metode
(CTAB) yang diacu dari Sambrook dan
Russel (2001).
Amplifikasi Domain KS dan
Domain A. Domain KS (700 pb) dan
domain A (1000 pb) diamplifikasi dengan
PCR. PCR diawali dengan pembuatan
larutan campuran PCR. Larutan campuran
PCR dibuat dengan mencampurkan berturutturut 12,5 µl bufer GC II, 4 µl dNTPs (2,5
mM), 0,25 µl (5 unit/µl) enzim $
- DNA
, 1 µl (50 pmol) primer spesifik
(+ ,
dan
) untuk masing-masing
PKS dan NRPS, 3,25 µl ddH2O, 3 µl sampel
DNA genom. Sekuen primer spesifik untuk
domain
KS
yaitu
+ , :
5’GCSATGGAYCCSCARCARCGSVT-3’ ;
: 5’-GTSCCSG-TSCCRTGS-SCYTCSAC-3’. Sedangkan sekuen primer spesifik
untuk domain A yaitu + ,
: 5’-AARDSIGGIGSIGSITAYBICC-3’ ;
: 5’CKRWAICCICKIAIYTTIAYYTG-3’.
Sekuen primer yang digunakan adalah
primer yang dirancang khusus untuk gen
PKS dan NRPS. Primer tersebut diacu dari
Schirmer
(2005).
Reaksi PCR untuk kedua pasang
primer dilakukan sebanyak 35 siklus, tiap
siklus terdiri atas predenaturasi, denaturasi,
, dan
. Tahap awal dalam
reaksi PCR adalah predenaturasi pada suhu
94 0C selama 5 menit. Selanjutnya
denaturasi kedua dilakukan pada suhu 94 0C
selama 1 menit,
pada suhu 50 0C
3
selama 1 menit, dan
pada suhu 72
C selama 1 menit. Tahap terakhir dilakukan
pada suhu 72 0C selama 10 menit.
Produk PCR dielektroforesis pada gel
agarosa 1 % (b/v) menggunakan tegangan
70 volt selama ±30-40 menit. Proses
selanjutnya ialah purifikasi produk PCR dari
gel menggunakan Gel/PCR DNA )
%
. (Geneaid Biotech. Ltd.,
Taiwan).
0
Kloning Domain KS dan Domain
A ke dalam Sel E. coli DH5α. Amplikon
diligasi ke dalam vektor kloning pGEMTEasy. Ligasi fragmen pengkode DNA
domain KS dan domain A ke plasmid
pGEMT-Easy
dilakukan
dengan
mencampurkan berturut-turut 5 µl 2x
$
++
(Promega), 2 µl (60 ng
domain KS dan 72 ng domain A) DNA
sisipan, 1µl (3 Weiss units/µl) enzim T4
DNA ligase (Promega), 1 µl (50 ng) vektor
kloning pGEMT-Easy. Campuran kemudian
dilarutkan dengan ddH2O hingga volume
reaksi 10 µl dan diinkubasi semalam (±24
jam) dengan suhu 4 OC. Proses transformasi
hasil ligasi dilakukan ke dalam
DH5α, yang terlebih dahulu disiapkan
menjadi sel kompeten.
Pembuatan sel kompeten dilakukan
dengan mengkulturkan satu koloni
ke
media LB selama 16 jam. Kemudian kultur
diambil 500 µl dan dikulturkan kembali ke
dalam media LB baru selama 2 jam. Hasil
kultur
diambil sebanyak 1,5 ml dan
diinkubasi di dalam es selama 10 menit.
Setelah itu disentrifugasi dengan kecepatan
3000 rpm (372,29 g) selama 10 menit,
kemudian pelet sel
diresuspensi
dengan /
+
++
(TFB)
sebanyak 250 µl (Lampiran 2). Hasil
resuspensi diinkubasi ke dalam es selama 20
menit. Proses resuspensi dengan TFB
diulang kembali dan diinkubasi kembali ke
dalam es selama 10 menit.
Plasmid
DNA
rekombinan
sebanyak 10 µl dicampur dengan
dan
diinkubasi kembali ke dalam es selama 45
menit. Campuran diberi perlakuan renjatan
panas (
0. Proses renjatan panas
dilakukan dengan memasukan campuran ke
dalam penangas air yang bersuhu 42 0C
selama 45 detik dan segera dimasukkan ke
dalam es selama 5 menit. Kemudian
campuran ditambahkan TFB sebanyak 100
µl dan diinkubasi dalam penangas air
dengan suhu 37 0C selama 45-60 menit.
Setelah itu campuran disebar dalam media
(LA) yang di dalamnya
terkandung ampisilin, X-gal, dan IPTG
kemudian diinkubasi dengan suhu 37 OC
selama 16 jam (Lampiran 2). Koloni putih
yang tumbuh dikulturkan dalam media LA
yang mengandung ampisilin sebagai
simpanan dan dikulturkan juga ke media LB.
Kultur dalam media
(LB)
diisolasi plasmid rekombinannya.
Plasmid rekombinan (pGEMT-EasyKS dan pGEMT-Easy-A) yang telah
diisolasi selanjutnya dipotong dengan
menggunakan enzim restriksi
RI.
Visualisasi hasil restriksi dilakukan dengan
elektroforesis menggunakan gel agarosa 1 %
(b/v). Plasmid rekombinan selanjutnya
disekuen
dan
dilakukan
analisis
bioinformatika.
Analisis Bioinformatika. Sekuen
dari domain KS dan domain A pada plasmid
rekombinan dianalisis dengan menggunakan
program
dan BLAST dari
+
1 +
(NCBI). Sekuen dicari homologinya dengan
sekuen domain KS yang sudah dipublikasi
dengan menggunakan CLUSTAL W
(ncbi.nlm.nih.gov).
HASIL
Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa
Antibakteri
Sebanyak 18 isolat bakteri yang
Iso act 6spons diuji aktivitas
berasosiasi dengan
antibakterinya terhadap bakteri uji, baik
yang patogen (
,
#
, dan EPEC K-11) maupun nonpatogen (
dan
). Hasil dari
penapisan bakteri didapatkan beberapa isolat
bakteri
yang
dapat
menghambat
pertumbuhan bakteri uji. Hal ini ditandai
dengan zona bening di sekitar goresan
bakteri pada permukaan media yang
mengandung bakteri uji (Tabel 1). Bakteri
endofit dapat menghambat sekitar 2-4
bakteri uji. Bakteri uji yang dapat dihambat
bakteri endofit ialah
,
#
, dan
. Bakteri
permukaan dapat menghambat sekitar 2-5
bakteri uji. Bakteri uji yang dapat dihambat
bakteri permukaan ialah
,
#
,
, dan
.
EPEC merupakan bakteri uji yang tidak
dapat dihambat pertumbuhannya, sedangkan
bakteri uji
hanya dapat dihambat
oleh satu bakteri permukaan.
4
40, Iso 46, Iso 8, Iso 47, Iso 67, Iso 95,Iso
act 1, Iso act 16, Iso act 2, Iso 53, Iso 20, Iso
23, Iso 100, dan Iso 10). Demikian pula
bakteri permukaan HAA 02 dan HAA 06
hanya dapat menghambat pertumbuhan
. Baik bakteri endofit ataupun
bakteri permukaan tidak ada yang dapat
menghambat pertumbuhan
(Gambar 2, Tabel 1).
Iso 95
Iso 8
(a)
(b)
Iso 8
Iso 10
Iso 23
HAA 06
c)
(d)
Gambar 1 Zona hambatan di sekitar koloni
bakteri pada pengujian dengan
(a)
# (b)
# (c)
# dan (d) EPEC.
Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa
Antifungi
Hasil penapisan bakteri yang dapat
menghambat pertumbuhan
yaitu bakteri endofit (HAL 87, Iso act 6, Iso
Iso 10
(a)
(b)
Gambar 2 Zona hambatan di sekitar koloni
bakteri pada pengujian dengan
(a)
# dan (b)
Berdasarkan
uji
aktivitas
antimikrob didapatkan 12 isolat bakteri yang
mampu menghambat pertumbuhan bakteri
Tabel 1 Hasil penapisan bakteri yang berasosiasi dengan spons yang memiliki aktivitas antibakteri dan antifungi
Bakteri Uji
Isolat
Fungi Uji
EPEC
HAA 02
+++
+++
-
++++
+++
-
+++
-
Iso act 6
+++
-
-
+++
+++
-
+++
-
Iso 40
+++
-
-
-
-
-
-
-
Iso 46
-
-
-
-
-
-
-
-
Iso 8
-
+++
-
+++
+++
-
+++
-
Iso 47
-
-
-
-
-
-
-
-
Iso 67
-
-
-
-
-
-
-
-
Iso 95
+++
+++
-
-
-
++
-
-
-
-
-
+++
+++
-
-
-
iso act 1
Iso act 16
-
-
-
-
-
-
-
-
Iso act 2
-
+++
-
+++
+++
-
+++
-
Iso 53
-
-
-
-
-
-
-
-
HAA 06
-
-
-
+++
+++
-
+ +++
-
Iso 20
-
-
-
+++
+++
-
+++
-
HAL 87
-
+++
-
-
-
-
-
-
Iso 23
-
+ ++
-
+++
+++
-
++++
-
Iso 100
-
-
-
-
-
-
-
-
Iso 10
+++
+++
+++
++++
Keterangan ukuran zona bening = (+): 1-5 mm, (++): 5-10 mm, (+++): 10-15 mm, (++++): 15-20
mm; (-): tidak menunjukkan adanya aktivitas
HAA
: Isolat yang diisolasi dari permukaan
Iso, HAL : Isolat yang diisolasi dari endofit
5
uji dan fungi uji yang lebih baik. Isolatisolat bakteri tersebut ialah HAA 02, Iso act
6, Iso 8, Iso act 2, Iso 95, Iso act 1, Iso 40,
HAA 06, HAL 87, Iso 23, Iso 20, dan Iso
10.
Amplifikasi Domain KS dan Domain A
DNA genom dari 12 isolat bakteri
diamplifikasi dengan proses
(PCR). Hasil amplifikasi
domain KS dan domain A pada gel agarosa
L 1 2
1% (b/v) menunjukkan pita berukuran
sekitar 700 pb untuk domain KS (Gambar 3)
dan sekitar 1000 pb untuk domain A
(Gambar 4). Hasil amplifikasi domain KS
dan domain A dari 12 isolat bakteri yang
berasosiasi
dengan
spons
tersebut
menunjukkan bahwa ke-12 isolat tersebut
memiliki domain KS dan domain A.
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
3000 pb
1000 pb
domain KS
(700 pb)
750 pb
Gambar 3 Elektroforesis gel agarosa 1% (b/v) hasil amplifikasi domain KS untuk 12 isolat yang
berasosiasi dengan spons
sp. Ket: (L) 1 Kb $
, (1) HAA 02, (2) Iso act
6, (3) Iso 8, (4) Iso act 2, (5) Iso 95, (6) Iso act 1, (7) Iso 40, (8) HAA 06, (9) HAL 87,
(10) Iso 23, (11) Iso 20, (12) Iso 10.
L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
3000 pb
1000 pb
domain A
(1000 pb)
Gambar 4 Elektroforesis gel agarosa 1% (b/v) hasil amplifikasi domain A untuk 12 isolat yang
berasosiasi dengan spons
sp. Ket: (L) 1 Kb $
, (1) HAA 02, (2) Iso act
6, (3) Iso 8, (4) Iso act 2, (5) Iso 95, (6) Iso act 1, (7) Iso 40, (8) HAA 06, (9) HAL 87,
(10) Iso 23, (11) Iso 20, (12) Iso 10.
6
Kloning Domain KS dan Domain A
Dalam Sel
DH5α
Dua isolat dipilih untuk proses
pengklonan domain KS dan domain A ke
dalam sel
DH5α, yaitu isolat Iso 10
dan HAA 02. Iso 10 menjadi contoh dari
bakteri endofit dan HAA 02 menjadi contoh
dari bakteri permukaan. Keduanya memiliki
aktivitas antimikrob. Selain itu Iso 10 dan
HAA 02 juga memiliki domain KS dan
domain A berdasarkan hasil verifikasi
dengan elektroforesis. Hasil klon domain KS
dari Iso 10 menunjukkan adanya koloni
putih dan koloni biru (Gambar 5), sedangkan
hasil klon dari domain A dari isolat Iso 10
tidak terdapat koloni putih dan biru. Hasil
klon domain KS dan domain A dari isolat
HAA 02 tidak menunjukkan adanya koloni
putih. Hal ini menandakan proses
pengklonan domain KS dan domain A dari
isolat HAA 02 tidak berhasil.
Koloni
putih
3000 pb
pGEMT-Easy
750 pb
domain KS
(700 pb)
Gambar 6 Elektroforesis gel agarosa 1% dari
pGEMT-Easy-10-KS
yang
dipotong dengan
RI.
Analisis Bioinformatika
Palsmid rekombinan dari isolat Iso
10 yang diduga membawa domain KS
selanjutnya dilakukan sekuensi (Lampiran
3). Hasil analisis didapatkan sekuen Iso 10
KS tidak sesuai dengan domain KS.
Berdasarkan hasil dari amplifikasi PCR dan
verifikasi hasil restriksi Iso 10 sesuai dengan
domain KS, sehingga sekuen Iso KS
Koloni
dihomologikan
dengan
sekuen
dari
biru
yang
telah
dipublikasikan dan dinyatakan telah
memiliki domain KS (Lampiran 4).
Gambar 5 Koloni putih
DH5α pada
(
dari sekuen-sekuen
isolat Iso 10 yang diduga
tersebut,
yaitu
membawa plasmid rekombinan.
AAW84215, AAW84218, AAW84193, dan
AAW84190. Proses ini digunakan untuk
Verifikasi Hasil Kloning Domain KS dan
mendapatkan homologi antara sekuen Iso
Domain A
KS dengan sekuen domain KS lainnya. Hasil
Koloni putih dari Iso 10 untuk
analisis didapatkan bahwa 49-51% dengan
domain KS dipilih untuk proses isolasi
sekuen-sekuen domain KS lainnya (Tabel
plasmid. Plasmid rekombinan hasil isolasi
2).
plasmid dari beberapa koloni putih
DH5α diduga ialah pGEMT-Easy-10-KS.
Plasmid yang diduga rekombinan dipotong
dengan enzim
RI dan menghasilkan dua
pita dengan ukuran yang berbeda. Pita
pertama berukuran 3000 pb yang
menunjukkan
ukuran
pGEMT-Easy,
sedangkan pita kedua berukuran 700 pb
yang sesuai dengan ukuran domain KS
berdasarkan Schirmer
(2005) (Gambar
6). Hal ini menunjukkan bahwa pengklonan
domain KS Iso 10 berhasil disisipkan pada
DH5α. Selain itu, plasmid
rekombinan yang membawa domain KS
tersebut telah terpotong oleh enzim
RI.
7
Tabel 2 Analisis homologi sekuen Iso 10 KS terhadap sekuen domain KS asal "
(
Organisme
Homologi (%)
AAW84215
2
51 %
AAW84218
2
50 %
AAW84193
2
49 %
AAW84190
2
49 %
PEMBAHASAN
Proses penapisan bakteri yang
berasosiasi dengan
sp. dilakukan
dengan menguji adanya aktivitas antibakteri
dan antifungi. Penapisan dilakukan terhadap
bakteri yang terdapat pada bagian endofit
dan permukaan dari spons
sp.
yang berasal dari Pulau Waigeo, wilayah
Raja Ampat, Provinsi Papua Barat
(Tokasaya 2010). Sebanyak dua isolat
bakteri permukaan dan 16 isolat bakteri
endofit yang digunakan dalam proses
penapisan bakteri. Isolat bakteri endofit
adalah bakteri yang berasal dari bagian
, yaitu lapisan yang luas dari
jaringan ikat spons bagian dalam. Umumnya
bakteri yang berasal dari
terdapat
dalam jumlah yang berlimpah. Hal ini
karena aliran air yang mengandung partikel
makanan dialirkan ke dalam
oleh
sel
yang
berflagella
(
).
Berlimpahnya nutrisi menjadikan
sebagai tempat tinggal komunitas bakteri
yang padat (Taylor
2007).
Isolat bakteri endofit berbeda
dengan bakteri yang terdapat pada bagian
permukaan spons. Bakteri permukaan
terdapat dalam jumlah yang lebih sedikit
dibandingkan bakteri
Ketersediaan
nutrisi yang lebih sedikit pada bagian
permukaan dibandingkan dengan bagian
dapat menjadi penyebabnya (Taylor
2007).
Bakteri uji yang digunakan dalam
penelitian ini, yaitu
adalah
bakteri aerob, berbentuk batang, dan
termasuk bakteri Gram negatif. Isolat ini
termasuk
dalam
bakteri
patogen
oportunistik, yaitu bakteri yang dapat
mengeksploitasi inang saat pertahanan
inangnya melemah. Bakteri patogen yang
lain yaitu
, adalah bakteri Gram
positif yang sering ditemukan dalam bagian
pernapasan manusia. Hal ini menjadikan
sebagai penyebab beberapa infeksi
serius pada manusia seperti, pneumonia dan
meningitis. Bakteri
merupakan
bakteri patogen terhadap udang dan ikan,
sedangkan EPEC merupakan bakteri yang
patogen terhadap manusia. EPEC dapat
menyebabkan diare dan banyak ditemukan
pada negara berkembang (Madigan
2006).
Fungi uji yang digunakan ialah
dan
, keduanya
merupakan khamir patogen pada manusia.
menyerang bagian mulut, organ
pencernaan, dan organ kelamin, sedangkan
menyerang kulit, bagian
pencernaan, organ kelamin wanita, dan
kerongkongan (Calderone & Fonzi 2001).
Hasil uji aktivitas antibakteri,
menunjukkan isolat-isolat bakteri dapat
menghambat pertumbuhan bakteri uji
bakteri patogen (P.
,
,
dan
) dan nonpatogen (
dan
). Zona bening di sekitar koloni
yang merupakan zona hambatan berukuran
rata-rata 10-15 mm (Gambar 1). Bakteri uji
yang dapat dihambat bakteri endofit ialah
,
#
,
, dan
. Bakteri uji yang dapat dihambat
bakteri permukaan ialah
,
#
, dan
. Bakteri uji
yang tidak dapat dihambat pertumbuhannya
ialah EPEC, sedangkan bakteri uji
hanya dapat dihambat oleh satu
bakteri permukaan. Zona bening yang
terdapat pada
berukuran rata-rata
5-10 mm (Gambar 2). Seperti dilaporkan
pada penelitian Abubakar (2009), isolat
bakteri endofit yang berasosiasi dengan
&
sp. dapat menghambat pertumbuhan
bakteri uji lebih baik dibanding isolat bakteri
permukaan.
Hasil uji aktivitas antifungi
menunjukkan, bakteri endofit hanya dapat
menghambat pertumbuhan
. Baik
bakteri endofit ataupun bakteri permukaan
tidak ada yang dapat menghambat
pertumbuhan
(Gambar 2)
Seperti yang dilaporkan Tokasaya (2010),
dalam penelitiannya menguji aktivitas
antifungi, sebanyak 6 isolat dari 31 isolat
bakteri endofit yang mampu menghambat
pertumbuhan
. Selain itu, hanya
5 isolat dari 8 isolat bakteri permukaan yang
mampu menghambat pertumbuhan
. HAL 87 merupakan isolat bakteri
8
endofit yang sama digunakan dalam
penelitian ini dan dalam penelitian Tokasaya
(2010). Hasilnya didapatkan bahwa HAL 87
memang
tidak
dapat
menghambat
pertumbuhan
. Selain itu, isolat
bakteri permukaan yang digunakan dalam
penelitian ini sama dengan penelitian
Tokasaya (2010) ialah HAA 02 dan HAA
06. Namun hasil penelitian Tokasaya HAA
02 dan HAA 06 dapat menghambat
pertumbuhan
, sedangkan dalam
penelitian ini tidak. Diduga bahwa khamir
yang digunakan berasal dari
galur yang berbeda.
Hasil penapisan 18 isolat bakteri
didapatkan 12 isolat (66,67%) yang
memiliki potensi sebagai penghasil senyawa
antimikrob (Tabel 1). Isolat-isolat bakteri
tersebut memiliki aktivitas antibakteri dan
antifungi dengan spektrum luas. Salah satu
contoh isolat bakteri yang memiliki aktivitas
antimikrob dengan spektrum luas ialah HAA
02.
HAA
02
dapat
menghambat
pertumbuhan tiga bakteri uji dan satu fungi
uji. Selain HAA 02, terdapat lima isolat
bakteri lain yang dapat menghambat
pertumbuhan tiga bakteri uji dan satu fungi
uji. Isolat-isolat bakteri tersebut ialah Iso act
6, Iso 8, Iso act 2, Iso 23, dan Iso 10. Isolat
bakteri lainnya hanya dapat menghambat
pertumbuhan sekitar dua sampai tiga bakteri
uji. Radjasa (2007) menyatakan bahwa,
bakteri yang berasosiasi dengan
sp. memiliki spektrum aktivitas antimikrob
yang luas. Sehingga bakteri asosiasi dengan
sp. dapat dimungkinkan sebagai
sumber
senyawa
antimikrob
untuk
mengendalikan bakteri patogen.
Senyawa bioaktif dari bakteri yang
berasosiasi dengan spons laut mungkin
memiliki gen biosintesis metabolit sekunder
yaitu PKS dan NRPS. Proses PCR dapat
dilakukan untuk melihat ada atau tidaknya
gen PKS dan NRPS pada suatu bakteri.
Metode PCR dapat menjadi suatu cara untuk
memperkirakan
kekayaan
produsen
metabolit sekunder hasil asosiasi dengan
spons
sp. dan mempelajari
keragaman gen bakteri pada spons lain
(Radjasa
2007).
Sebanyak 12 genom dari isolat
bakteri diuji dengan PCR. Primer PCR
dirancang secara khusus untuk domain KS
dan domain A. Primer degeneratif tersebut
diacu berdasarkan Schirmer (2005). Hasil
amplifikasi domain KS dan domain A pada
gel agarosa 1% (b/v) menunjukkan pita
berukuran sekitar 700 pb untuk domain KS
(Gambar 3) dan sekitar 1000 pb untuk
domain A (Gambar 4). Hal ini menunjukkan
bahwa 12 isolat tersebut memiliki domain
KS dan domain A. Hal ini memungkinkan
12 isolat memiliki gen hibrid PKS-NRPS
(Gambar 3 & 4). Hibrid PKS-NRPS dapat
terjadi dengan kombinasi domain pada
modul NRPS dengan domain pada modul
PKS dalam satu
+
. Gen
hibrid PKS-NRPS dapat menghasilkan
senyawa bioaktif dengan struktur hibrid
(Ansari
2004, Zhu
2009)
Sebanyak dua isolat dipilih dari 12
isolat untuk pengklonan domain KS dan
domain A ke dalam sel
DH5α yaitu
HAA 02 dan Iso 10. Isolat Iso 10 untuk
domain KS menghasilkan koloni putih dan
biru (Gambar 5). Isolat Iso 10 memiliki
domain KS. Hal tersebut didukung dengan
verifikasi hasil isolasi plasmid dan proses
pemotongan plasmid (restriksi) dengan
RI. Hasil verifikasi mendapatkan dua
pita dengan ukuran yang berbeda berukuran
3000 pb dan 700 pb (Gambar 6).
Pengklonan domain A untuk Isolat Iso 10
dan HAA 02 tidak menghasilkan koloni
putih dan biru. Hal ini diduga proses
pengklonan domain A pada Iso 10 dan HAA
02 tidak berhasil.
Hasil analisis dengan BLAST
diidentifikasikan Iso 10 tidak memiliki
domain KS. Iso 10 memiliki
%
sebesar 92% sebagai
(
). Berdasarkan
hasil amplifikasi PCR dan verifikasi hasil
pemotongan plasmid (restriksi) didapatkan
ukuran pita dari plasmid Iso 10 sesuai
dengan domain KS. Hasil analisis
didapatkan bahwa Iso 10 memiliki
kemiripan sekitar 49-51% dengan sekuensekuen domain KS. Sekuen domain KS yang
mirip merupakan organisme
yang
telah
dipublikasikan
(Lampiran 4). Seperti dilaporkan dalam
penelitian Schirmer (2005), sebanyak 256
sekuen dari isolat bakteri yang berasosiasi
dengan spons memiliki tingkat homologi
yang cukup rendah. Tingkat kehomologian
untuk sekuen KS berdasarkan
yang
ada termasuk rendah, yaitu sekitar 49 - 79%.
Berdasarkan hal tersebut, isolat Iso 10
berhomologi dengan domain KS walaupun
hanya 49-51%.
9
SIMPULAN
Dua belas isolat bakteri dari 18
isolat asal spons
sp. (66,67%)
menghasilkan senyawa bioaktif dengan
aktivitas antibakteri dan antifungi.
Sepuluh isolat termasuk bakteri
endofit dan dua isolat berasal dari bagian
permukaan spons. Kedua belas isolat diduga
mengandung domain .
(KS) dari
(PKS) dan domain
(
(A) dari
(NRPS). Homologi antara isolat
Iso 10 KS dengan sekuen domain KS
lainnya sekitar 49-51%.
DAFTAR PUSTAKA
Abubakar E. 2009. Bakteri yang berasosiasi
dengan spons &
sp. : analisis
penghasil senyawa antimikrob dan
keragaman genetiknya [tesis]. Bogor:
Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor.
Ansari MZ, Yadav G, Gokhale RS, Mohanty
D. 2004. NRPS-PKS: a knowledgebased resource for analysis of
NRPS/PKS megasynthases.
(
32:405-413.
Bahkuni DS, Rawat DS. 2005.
!
. New Delhi:
Anamaya Publishers.
Blunt JW, Copp BR, Hu WP, Munro MH,
Prinsep MR. 2007. Marine natural
products.
24 :31-86.
Calderone RA, Fonzi WA. 2001. Virulence
factors of
. /
!
9:327-325.
Kennedy J, Codling CE, Jones BV, Dobson
ADW, Marchesi JR. 2008. Diversity
of microbes associated with the
marine sponge,
,
isolated from Irish water and
identification of polyketide synthase
genes from the sponge metagenome.
(
!
10:18881902.
Kennedy J, Baker P, Piper C, Cotter PD,
Walsh M.
. 2009. Isolation and
analysis of bacteria with antimicrobial
activities from the marine sponge
ans collected from
Irish waters. !
11:384396.
Lanen SGV, Shen B. 2006. Microbial
genomics for the improvement of
atural product discovery.
'
9:252-260.
Madigan MT, Martinko JM, Dunlap PV,
Clark DP. 2006.
+
!
Ed ke-12. San
Fransisco: Pearson Education.
Otsuka M, Ichinose K, Fujii I, Ebizuka Y.
2004. Cloning, sequencing, and
functional analysis of an iterative type
I polyketide synthase gene cluster for
biosynthesis of the antitumor
chlorinated polyenone neocarzilin in
*
.(
(
9:3468-3476.
Pangan ACG, Uy FA, Oclarit JM. 2007.
Antimicrobial properties of some
marine sponges (porifera) from
Mactan, Cebu, Philiphines.
44: 35-45.
Piel J. 2003. Metabolites from symbiotic
bacteria
21: 519-538.
Radjasa OK, Kencana DS, Sabdono A,
Hutagalung RA, Lestari ES. 2007.
Antibacterial activity of marine
bacteria associated with sponge
Aaptos sp. against Multi Drugs
Resistant (MDR) strains. & !
12: 148-152.
Sambrook J, Russel DW. 2001. !
( $
!
Vol
1. Ed-3. New York: Cold Spring
Harbor Laboratory Press.
Schirmer
2005. Metagenomisc analysis
reveals diverse polyketide synthase
gene clusters in microorganisms
associated with the marine sponge
'
. (
!
8:4840-4849.
Shen QT, Chen XL, Sun CY, Zhang YZ.
2004. Dissecting and exploiting nonribosomal peptide synthase. (
36:243–249.
Schwarger D, Finking R, Marahiel MA.
2003. Nonribosomal peptides: from
genes to products.
20:275-287.
Thomas TRA, Kavlekar DP, Lokabharathi
PA. 2010. Marine drugs from spongemicrobe association. !
'
8:1417-1468.
10
Tokasaya P. 2010. Sponge-associated
bacteria producing antimicrobial
compounds and their genetic diversity
analysis [tesis]. Bogor: Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam, Institut Pertanian Bogor.
Zhang W, Li Z, Miao X, Zhang F. 2008.The
screening of antimicrobial bacteria
with diverse novel non-ribosomal
peptide synthase (NRPS) genes from
South China Sea sponges !
11 :346-355.
Zhang W, Zhang F, Li Z, Miao X, Zhang X.
2009. Investigation of bacteria with
polyketide synthase genes and
antimicrobial activity isolated from
South China Sea sponges. & (
!
107 :567-575.
Zhao J, Yang N, Zeng R. 2007. Phylogenetic
analysis of tipe I polyketide synthase
and nonribosomal peptide synthase
genes
in
antartic
sediment.
%
12 :97-10
Zhu, Peng, Zheng Y, Yan X, Shao J. 2009.
Molecular phylogeny and modular
structure of hybrid NRPS/PKS gene
fragmet og
sp.
NJ6-3-2 isolated from marine sponge
. & !
19 :229-237.
Zucko J, Skunca N, Curk, Zupans B, Long
PF.
2007. Polyketide synthase
genes and the natural products
potential
of
'
.
+
23 :25432549.
Xiao HC, Vater J, Piel J, Franke P, Scholz
R.
. 2006. Structural and
functional characterization of three
polyketide synthase genes clusters in
- +
FZB 42. &
188 :4024-4036.
11
LAMPIRAN
12
Lampiran 1 Komposisi macam-macam media yang digunakan dalam proses penapisan bakteri
yang berasosiasi dengan spons
sp.
Media
3
(SWC)
Komposisi
Jumlah
5g
1g
15 g
750 ml
1000 ml
4
%
(
Air laut
Aquades
Media
' %
(
Komposisi
Agar-agar
Dekstrosa
Kentang
Aquades
(PDA)
Jumlah
20 g
20 g
300 g
1000 ml
Media
' %
Komposisi
' %
Aquades
(PDB)
Jumlah
24 g
1000 ml
Lampiran 2 Bahan-bahan dan media yang digunakan dalam proses transformasi
/
+
++ (TFB)
Komposisi
Jumlah
CaCl2
0,1 M
5 mM
MgCl2
5 mM
Tris-Cl (pH 7)
10 g
NaCl
Media $
(
Komposisi
4
%
/
NaCl
(
(LA)
Jumlah
5g
10 g
10 g
15 g
13
Lampiran 3 Sekuen dari Iso 10 KS (dalam bentuk FASTA)
GCATGCTCCC GGCCGCCATG GCGGCCGCGG
CCCAGCAGCG GCTGGAAGGG GTGCGGGCCG
CTGCGCCAGC TGAGCGTGGT GCCGGGCGAT
TGCCGCGGCC GTGGCGCTGC TGGCCGATGC
TCTGCTTCAG CGACCAGATG GCGCTGGGTG
CTGGGCATCC GCGTGCCGGA CGAGTTGTCC
GGCGTCTTCG CGTTACCTCA
CGCCGCCGCT
TGCGGGAGAT CGGCGCGCGC GCGGTCAACC
CAGGTGGATG TTCCGCTTCA ACAGACGCTG
GGGGTCGACG GCGGCACCTG
GGCCCAGGTG
TCGAGTCCTT
GATCCCGAAT TGACGTAAAG
AGCCCGGCAG GGGCCGGGGT GGAACGTGCG
ATGCCGTTCT TGACTGACTC
GACGGAGGTC
GGGGACAATC ACTAGTGAAT
TCGCGGCCGC
GAATTCGATT
CCGGCAAGGC
TTCTCGGTGG
GTCGGCGCCG
CGCTGGCGGC
ATCGTCGGTT
GACGACCATC
TGCTGCTCGC
GATTTCAGCC
AGGCCAGGGA
CTGTCAGACT
ATCGCGCAAG
GCGGTCGAGG
CTGCAGGTCG
Lampiran 4 Homologi antara sekuen-sekuen domain KS dengan Iso 10 KS
1. Homologi antara sekuen domain KS AAW84218 dengan Iso 10 KS
GCCATGGACC
GCGTGGCCGC
AATCCGGGCA
ACCGCAGTCT
CTGCCGCGAT
TCGATGACCT
CGGCAGCCGA
CATCGTTGAA
TGATGGTGCG
CGCTGCAGGT
CACGACAGGC
GGGGTCGGCA
GCCACGGCAC
ACCAT
14
2.
Homologi antara sekuen domain KS AAW84215 dengan Iso 10 KS
15
16
3.
Homologi antara sekuen domain KS AAW84293 dengan Iso 10 KS
17
4.
Homologi antara sekuen domain KS AAW84190 dengan Iso 10 KS
18
Keterangan: nukleotida Iso 10 yang
dengan tanda titik (.)
dengan sekuen-sekuen domain KS ditampilkan
i
ABSTRAK
MEGASARI. Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa Antimikrob yang Berasosiasi dengan Spons
sp. dan Deteksi Gen Penyandi Poliketida Sintase dan Peptida Sintase Nonribosom.
Dibimbing oleh ARIS TRI WAHYUDI dan NISA RACHMANIA MUBARIK.
Spons tergolong dalam Filum Porifera memiliki kemampuan bersimbiosis dengan
mikroorganisme. Simbiosis tersebut menghasilkan produk alami yang menguntungkan seperti
poliketida dan peptida nonribosom yang memiliki aktivitas antimikrob. Poliketida dan peptida
nonribosom masing-masing dibentuk oleh gen
(PKS) dan
(NRPS). Keduanya merupakan enzim multifungsional yang terlibat dalam
biosintesis senyawa bioaktif yang penting dalam bidang farmasi dan industri. Penelitian ini
bertujuan menapis bakteri asal spons penghasil senyawa antimikrob dan mendeteksi gen yang
berperan dalam biosintesis senyawa bioaktif tersebut. Sebanyak 18 isolat bakteri yang diisolasi
dari spons
sp. dan diuji aktivitas antimikrobnya, didapatkan 12 isolat bakteri yang
menghambat pertumbuhan empat bakteri patogen, yaitu
,
(EPEC),
,
, dua bakteri nonpatogen, yaitu
,
, dan dua cendawan patogen, yaitu
, dan
Deteksi gen penyandi PKS dan NRPS dilakukan dengan teknik
(PCR) menggunakan primer spesifik yang masing-masing menghasilkan amplikon
berukuran 700 pb dan 1000 pb. Satu isolat yang memiliki aktivitas antimikrob terbaik dan
memiliki kedua gen penyandi PKS dan NRPS yaitu Iso 10 dipilih untuk analisis homologinya.
Fragmen DNA dari genom Iso 10 KS (700 pb) yang telah berhasil diklon ke dalam plasmid
pGEMT dan disekuen, menyatakan homologinya dengan domain KS sekitar 49-51%.
Keyword: senyawa bioaktif, antimikrobial, PKS, NRPS, spons
ABSTRACT
MEGASARI. Screening of Bacteria Producing Antimicrobial Compounds which is Associated
with
sp. Sponge and Detection Its Encoding Peptide Synthase and Non-ribosomal
Polyketide Synthase Gene. Supervised by ARIS TRI WAHYUDI and NISA RACHMANIA
MUBARIK.
Sponges are classified in the Porifera phylum have the ability to symbiosis with
microorganisms. The symbiont produced useful natural products such as polyketides and nonribosomal peptides that possessed antimicrobial activities. Each polyketide and non-ribosomal
peptide are synthesized by the
(PKS) dan
(NRPS) gene. Both of them are multifunctional enzymes that involved in the biosynthesis
bioactive compounds that are important in pharmaceutical and other industries.The aims of study
was to screened the bacteria producing antimicrobial compounds which is associated with sponge
and detect the genes that play a role in the biosynthesis of bioactive compounds. A total of 18
isolates bacteria that associated with
sp. was tested their antimicrobial activity and
finally 12 isolates bacteria that inhibited four pathogenic bacteria growth that consist of
,
(EPEC),
,
, and two non-pathogenic bacteria that consist of
,
,
and the two pathogenic fungus
and
. Detection of PKS and
NRPS encoding gene performed by
(PCR) using specific primers,
producing 700 bp and 1000 bp amplicon. One isolate that possessed the best antimicrobial
activities and both of PKS and NRPS gene which is Iso 10 are selected for homology test. DNA
fragment from Iso 10 KS genome (700 bp) that have been successfully cloned into plasmid
pGEMT and sequenced and its homology with other KS domain sequences of about 49-51%.
Keyword: bioactive compounds, antimicrobial, PKS, NRPS, sponge
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Mikrob dapat berinteraksi dengan
organisme laut, seperti spons, dan
menghasilkan berbagai produk alami.
Produk alami yang berasal dari metabolit
sekunder mikrob berperan penting dalam
penelitian medis dan pengembangan obat.
Produk alami tersebut dapat secara lansung
menjadi obat atau menjadi struktur dasar
sintesis obat kimia baru (Bahkuni
.
2005). Sejak tahun 1981, dilaporkan bahwa
sekitar 40% produk kimia berasal dari
turunan produk alami mikrob (Lanen &
Shen 2006). Keuntungan dari produk alami
sebagai senyawa bioaktif karena dapat
memiliki aktivitas antimikrob, antiviral,
antimalaria, antikanker, antitumor, bahkan
memiliki aktivitas
% .
Spons yang sudah diteliti dan
menghasilkan senyawa bioaktif antara lain
&
sp.,
#
#
'
#
# dan
Kennedy
(2008, 2009) melaporkan, pada
ditemukan sekitar
delapan filum bakteri. Filum yang paling
banyak
ditemukan
ialah
filum
#
#
(
# dan )
. Metabolit
yang diisolasi dari bakteri yang berasosiasi
dengan spons
sp., misalnya:
sterol, steroid, alkaloid, avarol, nukleosida,
peptida, dan poliketida (Blunt
. 2007).
Peptida nonribosom sebagai salah satu
senyawa bioaktif memiliki kemampuan
untuk menjadi antibiotik hingga racun. Oleh
karena itu, investigasi biosintesis peptida
sangat menarik untuk pembentukan obat
baru dalam bidang farmasi modern. Selain
peptida nonribosom, poliketida juga
memiliki peran penting dalam industri
agrokimia, farmasi, dan bioteknologi
(Schwarger
. 2003, Kennedy
2008).
Peptida nonribosom atau poliketida
masing-masing dibentuk oleh enzim besar
yang multifungsional dengan kelompok situs
katalitik yang terkoordinasi, yaitu
(PKS) dan
(NRPS) (Zhao
2007). NRPS
terdiri atas organisasi modular, yaitu
serangkaian situs aktif terkoordinasi yang
dapat dideteksi untuk analisis genetik bakteri
yang berasosiasi dengan spons. Setiap
modul terdiri atas domain minimal dan
domain opsional. Domain minimal adalah
domain dengan jumlah minimum yang
diperlukan untuk seluruh proses sintesis
peptida nonribosomal, terdiri atas domain
(A), domain
(PCP), domain
(C),
dan domain
(TE). Sedangkan
domain opsional terdiri atas domain
*
(Cy), domain
+
(MT), dan domain
*
(Er) (Shen
2004). Seperti halnya NRPS, PKS juga
merupakan
enzim
besar
yang
multifungsional dengan organisasi modular.
Persyaratan minimal yang dibutuhkan oleh
PKS ialah tiga domain, yaitu domain
+
(AT), domain
(KS), dan domain
(ACP)
(Otsuka
2004, Xiao
2006, Zucko
2007).
Domain KS dan domain A masingmasing memiliki peran penting dalam
sintesis
poliketida
dan
peptida
nonribosomal. Domain A berperan dalam
tugas inti yaitu mengaktifkan dan memilih
asam amino yang sama asal dari kelompok
substrat bebas dalam pembentukan nonribosomal peptida (Schwarger
2003,
Shen
2004, Zhao
2007).
Sedangkan Domain KS bertanggung jawab
untuk
kondensasi
unit
luar
yang
ditambahkan pada rantai poliketida selama
biosintesis poliketida (Xiao
2006,
Zucko
2007). Menurut Shen (2004),
modifikasi NRPS dengan pengubahan
substrat pada domain A akan menjadi
rekayasa sintesis peptida baru. Seperti
halnya domain A, keragaman struktur
poliketida
dapat
dilakukan
dengan
pengubahan starter, perluasan unit, dan
jumlah kondensasi pada modifikasi domain
KS (Otsuka
2004). Selain itu,
persamaan domain KS dan domain A yaitu
keduanya lebih sesuai dalam analisis
filogenetik keanekaragaman PKS dan NRPS
(Zhang
2008, 2009). Oleh karena itu,
analisis domain KS dan domain A
memudahkan penelitian untuk mendeteksi
gen yang berperan dalam pembentukan
senyawa bioaktif yang berperan penting
dalam bidang farmasi dan industri.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan menapis
bakteri yang berasosiasi dengan spons
sp. yang menghasilkan senyawa
antimikrob serta mendeteksi gen yang
berperan dalam biosintesis senyawa
antimikrob tersebut.
2
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan dari bulan
Maret hingga Oktober 2010 di Laboratorium
Bagian Mikrobiologi, Departemen Biologi,
FMIPA, IPB.
BAHAN DAN METODE
Bahan
Bahan yang digunakan dalam
penelitian ini ialah 16 bakteri endofit (HAL
87, Iso act 6, Iso 40, Iso 46, Iso 8, Iso 47, Iso
67, Iso 95, Iso act 1, Iso act 16, Iso act 2, Iso
53, Iso 20, Iso 23, Iso 100, dan Iso 10), dan
2 bakteri permukaan (HAA 02, HAA 06)
yang berasosiasi dengan spons
sp.
asal Pulau Wigeo, wilayah Raja Ampat,
Provinsi Papua Barat (Tokasaya 2010), dua
bakteri uji nonpatogen (
,
), empat bakteri uji patogen
(
,
#
,
[EPEC]), dan dua fungi uj
PENAPISAN BAKTERI PENGHASIL SENYAWA ANTIMIKROB
YANG BERASOSIASI DENGAN SPONS
sp. DAN
DETEKSI GEN PENYANDI POLIKETIDA SINTASE
DAN PEPTIDA SINTASE NONRIBOSOM
MEGASARI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
2
PENAPISAN BAKTERI PENGHASIL SENYAWA ANTIMIKROB
YANG BERASOSIASI DENGAN SPONS
sp. DAN
DETEKSI GEN PENYANDI POLIKETIDA SINTASE
DAN PEPTIDA SINTASE NONRIBOSOM
MEGASARI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
i
ABSTRAK
MEGASARI. Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa Antimikrob yang Berasosiasi dengan Spons
sp. dan Deteksi Gen Penyandi Poliketida Sintase dan Peptida Sintase Nonribosom.
Dibimbing oleh ARIS TRI WAHYUDI dan NISA RACHMANIA MUBARIK.
Spons tergolong dalam Filum Porifera memiliki kemampuan bersimbiosis dengan
mikroorganisme. Simbiosis tersebut menghasilkan produk alami yang menguntungkan seperti
poliketida dan peptida nonribosom yang memiliki aktivitas antimikrob. Poliketida dan peptida
nonribosom masing-masing dibentuk oleh gen
(PKS) dan
(NRPS). Keduanya merupakan enzim multifungsional yang terlibat dalam
biosintesis senyawa bioaktif yang penting dalam bidang farmasi dan industri. Penelitian ini
bertujuan menapis bakteri asal spons penghasil senyawa antimikrob dan mendeteksi gen yang
berperan dalam biosintesis senyawa bioaktif tersebut. Sebanyak 18 isolat bakteri yang diisolasi
dari spons
sp. dan diuji aktivitas antimikrobnya, didapatkan 12 isolat bakteri yang
menghambat pertumbuhan empat bakteri patogen, yaitu
,
(EPEC),
,
, dua bakteri nonpatogen, yaitu
,
, dan dua cendawan patogen, yaitu
, dan
Deteksi gen penyandi PKS dan NRPS dilakukan dengan teknik
(PCR) menggunakan primer spesifik yang masing-masing menghasilkan amplikon
berukuran 700 pb dan 1000 pb. Satu isolat yang memiliki aktivitas antimikrob terbaik dan
memiliki kedua gen penyandi PKS dan NRPS yaitu Iso 10 dipilih untuk analisis homologinya.
Fragmen DNA dari genom Iso 10 KS (700 pb) yang telah berhasil diklon ke dalam plasmid
pGEMT dan disekuen, menyatakan homologinya dengan domain KS sekitar 49-51%.
Keyword: senyawa bioaktif, antimikrobial, PKS, NRPS, spons
ABSTRACT
MEGASARI. Screening of Bacteria Producing Antimicrobial Compounds which is Associated
with
sp. Sponge and Detection Its Encoding Peptide Synthase and Non-ribosomal
Polyketide Synthase Gene. Supervised by ARIS TRI WAHYUDI and NISA RACHMANIA
MUBARIK.
Sponges are classified in the Porifera phylum have the ability to symbiosis with
microorganisms. The symbiont produced useful natural products such as polyketides and nonribosomal peptides that possessed antimicrobial activities. Each polyketide and non-ribosomal
peptide are synthesized by the
(PKS) dan
(NRPS) gene. Both of them are multifunctional enzymes that involved in the biosynthesis
bioactive compounds that are important in pharmaceutical and other industries.The aims of study
was to screened the bacteria producing antimicrobial compounds which is associated with sponge
and detect the genes that play a role in the biosynthesis of bioactive compounds. A total of 18
isolates bacteria that associated with
sp. was tested their antimicrobial activity and
finally 12 isolates bacteria that inhibited four pathogenic bacteria growth that consist of
,
(EPEC),
,
, and two non-pathogenic bacteria that consist of
,
,
and the two pathogenic fungus
and
. Detection of PKS and
NRPS encoding gene performed by
(PCR) using specific primers,
producing 700 bp and 1000 bp amplicon. One isolate that possessed the best antimicrobial
activities and both of PKS and NRPS gene which is Iso 10 are selected for homology test. DNA
fragment from Iso 10 KS genome (700 bp) that have been successfully cloned into plasmid
pGEMT and sequenced and its homology with other KS domain sequences of about 49-51%.
Keyword: bioactive compounds, antimicrobial, PKS, NRPS, sponge
ii
Judul
Nama
NIM
: Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa Antimikrob yang Berasosiasi dengan
Spons
sp. dan Deteksi Gen Penyandi Poliketida Sintase dan
Peptida Sintase Nonribosom
: Megasari
: G34061194
Disetujui:
Pembimbing I,
Pembimbing II,
(Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si.)
NIP 19630705 199103 1 005
(Dr.Nisa Rachmania Mubarik, M.Si.)
NIP 19671127 199302 2 001
Diketahui:
Ketua Departemen Biologi
Institut Pertanian Bogor
(Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si.)
NIP 19641002 198903 1 002
iii
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yesus Kristus karena dengan berkat, kuasa,
dan roh kudus-Nya penulis dapat menyelesaikan penelitian dan menyusun skripsi ini. Tema
penelitian ini yaitu Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa Antimikrob yang Berasosiasi dengan
Spons
sp. dan Deteksi Gen Penyandi Poliketida Sintase dan Peptida Sintase
Nonribosom. Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Februari sampai Oktober 2010 di
Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi, Institut Pertanian Bogor.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si. dan Ibu Dr.
Nisa Rachmania Mubarik, M.Si. selaku pembimbing atas saran dan bimbingannya dalam
pelaksanaan penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Terima kasih disampaikan kepada Ibu Dr.
Ir. Raden Roro Dyah Perwitasari, M.Sc. sebagai wakil komisi pendidikan atas saran dan diskusi
yang diberikan. Terima kasih juga kepada Bang Yonathan Banoet, Mbak Rika Astuti, Mbak Ari
untuk saran dan bantuannya selama penelitian di laboratorium. Selain itu, ucapan terima kasih
penulis sampaikan kepada teman-teman terdekat, keluarga besar laboratorium mikrobiologi
FMIPA IPB, keluarga perwira 52, Komisi Literatur PMK IPB, serta teman-teman seperjuangan di
Biologi 43 yang tidak dapat disebutkan satu per satu, atas segala bantuan dan semangat yang telah
diberikan. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Mama, Papa, Robby Sutady,
Angela Meliana, atas do`a, dukungan, semangat, dan segala cinta yang diberikan.
Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.
Bogor, November 2010
!
iv
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 4 Mei 1988 dari Bapak Wijaya Sutady dan Ibu
Lenny. Penulis merupakan anak ketiga dari tiga bersaudara. Tahun 2006 penulis lulus dari SMU
TARAKANITA 1 JAKARTA dan lolos seleksi masuk IPB melalui jalur Seleksi Penerimaan
Mahasiswa Baru (SPMB) pada Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam, Institut Pertanian Bogor.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif sebagai anggota Unit Kegiatan Mahasiswa
Persekutuan Mahasiswa Kristen Institut Pertanian Bogor (UKM PMK IPB) dan aktif sebagai
anggota Komisi Literatur pada tahun 2006-2010 serta pernah menjabat sebagai Sekretaris Komisi
Literatur PMK IPB pada tahun 2008-2009. Penulis menjadi asisten praktikum mata kuliah Botani
Umum pada tahun 2010. Penulis melakukan Praktik Kerja Lapang di Laboratorium Iradiasi
Pangan, Pusat Aplikasi Teknologi Isotop dan Radiasi Badan Tenaga Nuklir Nasional (PATIRBATAN) dari bulan Juli sampai Agustus 2009 dengan judul Pengaruh Iradiasi pada Kandungan
Gizi Nasi.
v
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ……………………………………………………………………………
vii
DAFTAR GAMBAR……...……………………………………………………………….…
vii
DAFTAR LAMPIRAN…..………………………………………………………………..…
vii
PENDAHULUAN
Latar Belakang……………………………………………………………………………….
1
Tujuan…..................................................................................................................................
1
Waktu dan Tempat Penelitian………………………………………………………………..
2
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat………………………………………………………………………...……
2
Metode……………………………………………………………………………………….
2
Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa Antibakteri……………………………...………..
2
Pengujian Bakteri Penghasil Senyawa Antifungi……………………………...………….
2
Isolasi DNA Genom………………………………………………………………………
2
Amplifikasi Domain KS dan Domain A………………………………………………….
2
Kloning Domain KS dan Domain A ke dalam Sel
DH5α...……………………..
3
Analisis Bioinformatika………………………………………...…………………...……
3
HASIL
Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa Antibakteri…...…………………………………
3
Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa Antifungi………...…………………………….
4
Amplifikasi Domain KS dan Domain A………………………………………………....
5
Kloning Domain KS dan Domain A dalam Sel
6
DH5α…………………………..
Verifikasi Hasil Kloning Domain KS dan Domain A……………………………………
6
Analisis Bioinformatika………………………………………………………………….
6
PEMBAHASAN………………………………………………………………………………
7
SIMPULAN……………………………………………………………………………………
8
DAFTAR PUSTAKA…………………………………………………………………………
8
LAMPIRAN……………………………………………………………………………………
9
vi
DAFTAR TABEL
1
2
Halaman
Hasil penapisan bakteri yang berasosiasi dengan spons yang memiliki aktivitas antibakteri
dan antifungi………………………….……………………………..………………….….............
5
Analisis homologi sekuen Iso 10 KS terhadap sekuen domain KS asal "
.......................
7
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
Zona bening di sekitar koloni terhadap (a)
2
Zona bening di sekitar koloni terhadap (a)
, (b)
# ( c)
#
(d) EPEC…………………………………………………………………………………………….
(b)
3
4
dan (b)
……………………………………………………………………………..……….
4
Elektroforesis gel agarosa 1% (b/v) hasil amplifikasi domain KS untuk 12 isolat yang berasosiasi
dengan spons
sp. Ket: (L) 1 Kb $
, (1) HAA 02, (2) Iso act 6, (3) Iso 8, (4) Iso act 2,
(5) Iso 95, (6) Iso act 1, (7) Iso 40, (8) HAA 06, (9) HAL 87, (10) Iso 23, (11) Iso 20, (12) Iso 10…. 5
4
Elektroforesis gel agarosa 1% (b/v) hasil amplifikasi domain A untuk 12 isolat yang berasosiasi
dengan spons
sp. Ket: (L) 1 Kb $
, (1) HAA 02, (2) Iso act 6, (3) Iso 8, (4) Iso act 2,
(5) Iso 95, (6) Iso act 1, (7) Iso 40, (8) HAA 06, (9) HAL 87, (10) Iso 23, (11) Iso 20, (12) Iso 10… 5
5
Koloni putih
6
Elektroforesis agarosa 1% dari pGEMT-Easy-10-KS dipotong dengan
DH5α pada isolat Iso 10 yang diduga membawa plasmid rekombinan…………
6
RI……………………… 6
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
Halaman
Komposisi macam-macam media yang digunakan dalam proses penapisan bakteri yang
berasosiasi dengan spons
sp……………………………..………………….…...........
11
Bahan-bahan dan media yang digunakan dalam proses transformasi……………......................
11
Sekuen dari Iso 10 KS (dalam bentuk FASTA)………...………………………………………...
11
Homologi antara sekuen-sekuen domain KS dengan Iso 10 KS…………………………...…......
12
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Mikrob dapat berinteraksi dengan
organisme laut, seperti spons, dan
menghasilkan berbagai produk alami.
Produk alami yang berasal dari metabolit
sekunder mikrob berperan penting dalam
penelitian medis dan pengembangan obat.
Produk alami tersebut dapat secara lansung
menjadi obat atau menjadi struktur dasar
sintesis obat kimia baru (Bahkuni
.
2005). Sejak tahun 1981, dilaporkan bahwa
sekitar 40% produk kimia berasal dari
turunan produk alami mikrob (Lanen &
Shen 2006). Keuntungan dari produk alami
sebagai senyawa bioaktif karena dapat
memiliki aktivitas antimikrob, antiviral,
antimalaria, antikanker, antitumor, bahkan
memiliki aktivitas
% .
Spons yang sudah diteliti dan
menghasilkan senyawa bioaktif antara lain
&
sp.,
#
#
'
#
# dan
Kennedy
(2008, 2009) melaporkan, pada
ditemukan sekitar
delapan filum bakteri. Filum yang paling
banyak
ditemukan
ialah
filum
#
#
(
# dan )
. Metabolit
yang diisolasi dari bakteri yang berasosiasi
dengan spons
sp., misalnya:
sterol, steroid, alkaloid, avarol, nukleosida,
peptida, dan poliketida (Blunt
. 2007).
Peptida nonribosom sebagai salah satu
senyawa bioaktif memiliki kemampuan
untuk menjadi antibiotik hingga racun. Oleh
karena itu, investigasi biosintesis peptida
sangat menarik untuk pembentukan obat
baru dalam bidang farmasi modern. Selain
peptida nonribosom, poliketida juga
memiliki peran penting dalam industri
agrokimia, farmasi, dan bioteknologi
(Schwarger
. 2003, Kennedy
2008).
Peptida nonribosom atau poliketida
masing-masing dibentuk oleh enzim besar
yang multifungsional dengan kelompok situs
katalitik yang terkoordinasi, yaitu
(PKS) dan
(NRPS) (Zhao
2007). NRPS
terdiri atas organisasi modular, yaitu
serangkaian situs aktif terkoordinasi yang
dapat dideteksi untuk analisis genetik bakteri
yang berasosiasi dengan spons. Setiap
modul terdiri atas domain minimal dan
domain opsional. Domain minimal adalah
domain dengan jumlah minimum yang
diperlukan untuk seluruh proses sintesis
peptida nonribosomal, terdiri atas domain
(A), domain
(PCP), domain
(C),
dan domain
(TE). Sedangkan
domain opsional terdiri atas domain
*
(Cy), domain
+
(MT), dan domain
*
(Er) (Shen
2004). Seperti halnya NRPS, PKS juga
merupakan
enzim
besar
yang
multifungsional dengan organisasi modular.
Persyaratan minimal yang dibutuhkan oleh
PKS ialah tiga domain, yaitu domain
+
(AT), domain
(KS), dan domain
(ACP)
(Otsuka
2004, Xiao
2006, Zucko
2007).
Domain KS dan domain A masingmasing memiliki peran penting dalam
sintesis
poliketida
dan
peptida
nonribosomal. Domain A berperan dalam
tugas inti yaitu mengaktifkan dan memilih
asam amino yang sama asal dari kelompok
substrat bebas dalam pembentukan nonribosomal peptida (Schwarger
2003,
Shen
2004, Zhao
2007).
Sedangkan Domain KS bertanggung jawab
untuk
kondensasi
unit
luar
yang
ditambahkan pada rantai poliketida selama
biosintesis poliketida (Xiao
2006,
Zucko
2007). Menurut Shen (2004),
modifikasi NRPS dengan pengubahan
substrat pada domain A akan menjadi
rekayasa sintesis peptida baru. Seperti
halnya domain A, keragaman struktur
poliketida
dapat
dilakukan
dengan
pengubahan starter, perluasan unit, dan
jumlah kondensasi pada modifikasi domain
KS (Otsuka
2004). Selain itu,
persamaan domain KS dan domain A yaitu
keduanya lebih sesuai dalam analisis
filogenetik keanekaragaman PKS dan NRPS
(Zhang
2008, 2009). Oleh karena itu,
analisis domain KS dan domain A
memudahkan penelitian untuk mendeteksi
gen yang berperan dalam pembentukan
senyawa bioaktif yang berperan penting
dalam bidang farmasi dan industri.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan menapis
bakteri yang berasosiasi dengan spons
sp. yang menghasilkan senyawa
antimikrob serta mendeteksi gen yang
berperan dalam biosintesis senyawa
antimikrob tersebut.
2
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan dari bulan
Maret hingga Oktober 2010 di Laboratorium
Bagian Mikrobiologi, Departemen Biologi,
FMIPA, IPB.
BAHAN DAN METODE
Bahan
Bahan yang digunakan dalam
penelitian ini ialah 16 bakteri endofit (HAL
87, Iso act 6, Iso 40, Iso 46, Iso 8, Iso 47, Iso
67, Iso 95, Iso act 1, Iso act 16, Iso act 2, Iso
53, Iso 20, Iso 23, Iso 100, dan Iso 10), dan
2 bakteri permukaan (HAA 02, HAA 06)
yang berasosiasi dengan spons
sp.
asal Pulau Wigeo, wilayah Raja Ampat,
Provinsi Papua Barat (Tokasaya 2010), dua
bakteri uji nonpatogen (
,
), empat bakteri uji patogen
(
,
#
,
[EPEC]), dan dua fungi uji
patogen (
,
).
Metode
Penapisan Bakteri Penghasil
Senyawa Antibakteri. Teknik lapis ganda
(
) digunakan dalam pengujian
aktivitas antibakteri. Teknik ini dilakukan
dengan cara mengkulturkan bakteri uji, baik
yang patogen (
,
,
, EPEC) maupun nonpatogen (
dan
) pada media
,
(SWC) cair (Lampiran 1),
kemudian diinkubasi selama 18 jam. Kultur
cair bakteri uji diambil sebanyak 1 ml
kemudian dimasukkan ke dalam 100 ml
media agar-agar SWC steril. Campuran
antara kultur bakteri dan media SWC
dijadikan
sebagai
lapisan
kedua.
Selanjutnya, sebanyak 15 ml campuran
dituangkan ke dalam cawan petri yang telah
berisi dengan media agar-agar SWC yang
telah padat (lapisan pertama). Setelah padat,
18 isolat bakteri asal spons masing-masing
digoreskan pada permukaan media SWC
yang telah mengandung kultur bakteri uji,
kemudian diinkubasi selama 3 hari pada
suhu 37 0C. Senyawa bioaktif antibakteri
diindikasikan dengan terbentuknya zona
jernih di sekitar koloni.
Penapisan Bakteri Penghasil
Senyawa
Antifungi.
Metode
yang
dilakukan
sama
dengan
pengujian
antibakteri yaitu dengan teknik lapis ganda.
Kultur cair
yang telah diinkubasi
selama 24 jam dalam
%
(PDB), diambil sebanyak 1ml kemudian
dimasukkan ke dalam 100 ml media
%
(PDA) steril (Lampiran 1).
Campuran antara kultur fungi dan media
PDA dijadikan sebagai lapisan kedua.
Selanjutnya, sebanyak 15 ml campuran
dituangkan ke dalam cawan petri yang telah
berisi dengan media PDA yang telah padat
(lapisan pertama). Setelah padat, 18 isolat
bakteri
asal
spons
masing-masing
digoreskan pada permukaan media PDA
yang telah mengandung kultur fungi, lalu
diinkubasi selama 3 hari pada suhu 37 0C.
Senyawa bioaktif antifungi diindikasikan
dengan terbentuknya zona jernih di sekitar
koloni.
Isolasi DNA Genom. DNA genom
dari bakteri yang berasosiasi dengan spons
sp. diisolasi dengan menggunakan
metode
(CTAB) yang diacu dari Sambrook dan
Russel (2001).
Amplifikasi Domain KS dan
Domain A. Domain KS (700 pb) dan
domain A (1000 pb) diamplifikasi dengan
PCR. PCR diawali dengan pembuatan
larutan campuran PCR. Larutan campuran
PCR dibuat dengan mencampurkan berturutturut 12,5 µl bufer GC II, 4 µl dNTPs (2,5
mM), 0,25 µl (5 unit/µl) enzim $
- DNA
, 1 µl (50 pmol) primer spesifik
(+ ,
dan
) untuk masing-masing
PKS dan NRPS, 3,25 µl ddH2O, 3 µl sampel
DNA genom. Sekuen primer spesifik untuk
domain
KS
yaitu
+ , :
5’GCSATGGAYCCSCARCARCGSVT-3’ ;
: 5’-GTSCCSG-TSCCRTGS-SCYTCSAC-3’. Sedangkan sekuen primer spesifik
untuk domain A yaitu + ,
: 5’-AARDSIGGIGSIGSITAYBICC-3’ ;
: 5’CKRWAICCICKIAIYTTIAYYTG-3’.
Sekuen primer yang digunakan adalah
primer yang dirancang khusus untuk gen
PKS dan NRPS. Primer tersebut diacu dari
Schirmer
(2005).
Reaksi PCR untuk kedua pasang
primer dilakukan sebanyak 35 siklus, tiap
siklus terdiri atas predenaturasi, denaturasi,
, dan
. Tahap awal dalam
reaksi PCR adalah predenaturasi pada suhu
94 0C selama 5 menit. Selanjutnya
denaturasi kedua dilakukan pada suhu 94 0C
selama 1 menit,
pada suhu 50 0C
3
selama 1 menit, dan
pada suhu 72
C selama 1 menit. Tahap terakhir dilakukan
pada suhu 72 0C selama 10 menit.
Produk PCR dielektroforesis pada gel
agarosa 1 % (b/v) menggunakan tegangan
70 volt selama ±30-40 menit. Proses
selanjutnya ialah purifikasi produk PCR dari
gel menggunakan Gel/PCR DNA )
%
. (Geneaid Biotech. Ltd.,
Taiwan).
0
Kloning Domain KS dan Domain
A ke dalam Sel E. coli DH5α. Amplikon
diligasi ke dalam vektor kloning pGEMTEasy. Ligasi fragmen pengkode DNA
domain KS dan domain A ke plasmid
pGEMT-Easy
dilakukan
dengan
mencampurkan berturut-turut 5 µl 2x
$
++
(Promega), 2 µl (60 ng
domain KS dan 72 ng domain A) DNA
sisipan, 1µl (3 Weiss units/µl) enzim T4
DNA ligase (Promega), 1 µl (50 ng) vektor
kloning pGEMT-Easy. Campuran kemudian
dilarutkan dengan ddH2O hingga volume
reaksi 10 µl dan diinkubasi semalam (±24
jam) dengan suhu 4 OC. Proses transformasi
hasil ligasi dilakukan ke dalam
DH5α, yang terlebih dahulu disiapkan
menjadi sel kompeten.
Pembuatan sel kompeten dilakukan
dengan mengkulturkan satu koloni
ke
media LB selama 16 jam. Kemudian kultur
diambil 500 µl dan dikulturkan kembali ke
dalam media LB baru selama 2 jam. Hasil
kultur
diambil sebanyak 1,5 ml dan
diinkubasi di dalam es selama 10 menit.
Setelah itu disentrifugasi dengan kecepatan
3000 rpm (372,29 g) selama 10 menit,
kemudian pelet sel
diresuspensi
dengan /
+
++
(TFB)
sebanyak 250 µl (Lampiran 2). Hasil
resuspensi diinkubasi ke dalam es selama 20
menit. Proses resuspensi dengan TFB
diulang kembali dan diinkubasi kembali ke
dalam es selama 10 menit.
Plasmid
DNA
rekombinan
sebanyak 10 µl dicampur dengan
dan
diinkubasi kembali ke dalam es selama 45
menit. Campuran diberi perlakuan renjatan
panas (
0. Proses renjatan panas
dilakukan dengan memasukan campuran ke
dalam penangas air yang bersuhu 42 0C
selama 45 detik dan segera dimasukkan ke
dalam es selama 5 menit. Kemudian
campuran ditambahkan TFB sebanyak 100
µl dan diinkubasi dalam penangas air
dengan suhu 37 0C selama 45-60 menit.
Setelah itu campuran disebar dalam media
(LA) yang di dalamnya
terkandung ampisilin, X-gal, dan IPTG
kemudian diinkubasi dengan suhu 37 OC
selama 16 jam (Lampiran 2). Koloni putih
yang tumbuh dikulturkan dalam media LA
yang mengandung ampisilin sebagai
simpanan dan dikulturkan juga ke media LB.
Kultur dalam media
(LB)
diisolasi plasmid rekombinannya.
Plasmid rekombinan (pGEMT-EasyKS dan pGEMT-Easy-A) yang telah
diisolasi selanjutnya dipotong dengan
menggunakan enzim restriksi
RI.
Visualisasi hasil restriksi dilakukan dengan
elektroforesis menggunakan gel agarosa 1 %
(b/v). Plasmid rekombinan selanjutnya
disekuen
dan
dilakukan
analisis
bioinformatika.
Analisis Bioinformatika. Sekuen
dari domain KS dan domain A pada plasmid
rekombinan dianalisis dengan menggunakan
program
dan BLAST dari
+
1 +
(NCBI). Sekuen dicari homologinya dengan
sekuen domain KS yang sudah dipublikasi
dengan menggunakan CLUSTAL W
(ncbi.nlm.nih.gov).
HASIL
Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa
Antibakteri
Sebanyak 18 isolat bakteri yang
Iso act 6spons diuji aktivitas
berasosiasi dengan
antibakterinya terhadap bakteri uji, baik
yang patogen (
,
#
, dan EPEC K-11) maupun nonpatogen (
dan
). Hasil dari
penapisan bakteri didapatkan beberapa isolat
bakteri
yang
dapat
menghambat
pertumbuhan bakteri uji. Hal ini ditandai
dengan zona bening di sekitar goresan
bakteri pada permukaan media yang
mengandung bakteri uji (Tabel 1). Bakteri
endofit dapat menghambat sekitar 2-4
bakteri uji. Bakteri uji yang dapat dihambat
bakteri endofit ialah
,
#
, dan
. Bakteri
permukaan dapat menghambat sekitar 2-5
bakteri uji. Bakteri uji yang dapat dihambat
bakteri permukaan ialah
,
#
,
, dan
.
EPEC merupakan bakteri uji yang tidak
dapat dihambat pertumbuhannya, sedangkan
bakteri uji
hanya dapat dihambat
oleh satu bakteri permukaan.
4
40, Iso 46, Iso 8, Iso 47, Iso 67, Iso 95,Iso
act 1, Iso act 16, Iso act 2, Iso 53, Iso 20, Iso
23, Iso 100, dan Iso 10). Demikian pula
bakteri permukaan HAA 02 dan HAA 06
hanya dapat menghambat pertumbuhan
. Baik bakteri endofit ataupun
bakteri permukaan tidak ada yang dapat
menghambat pertumbuhan
(Gambar 2, Tabel 1).
Iso 95
Iso 8
(a)
(b)
Iso 8
Iso 10
Iso 23
HAA 06
c)
(d)
Gambar 1 Zona hambatan di sekitar koloni
bakteri pada pengujian dengan
(a)
# (b)
# (c)
# dan (d) EPEC.
Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa
Antifungi
Hasil penapisan bakteri yang dapat
menghambat pertumbuhan
yaitu bakteri endofit (HAL 87, Iso act 6, Iso
Iso 10
(a)
(b)
Gambar 2 Zona hambatan di sekitar koloni
bakteri pada pengujian dengan
(a)
# dan (b)
Berdasarkan
uji
aktivitas
antimikrob didapatkan 12 isolat bakteri yang
mampu menghambat pertumbuhan bakteri
Tabel 1 Hasil penapisan bakteri yang berasosiasi dengan spons yang memiliki aktivitas antibakteri dan antifungi
Bakteri Uji
Isolat
Fungi Uji
EPEC
HAA 02
+++
+++
-
++++
+++
-
+++
-
Iso act 6
+++
-
-
+++
+++
-
+++
-
Iso 40
+++
-
-
-
-
-
-
-
Iso 46
-
-
-
-
-
-
-
-
Iso 8
-
+++
-
+++
+++
-
+++
-
Iso 47
-
-
-
-
-
-
-
-
Iso 67
-
-
-
-
-
-
-
-
Iso 95
+++
+++
-
-
-
++
-
-
-
-
-
+++
+++
-
-
-
iso act 1
Iso act 16
-
-
-
-
-
-
-
-
Iso act 2
-
+++
-
+++
+++
-
+++
-
Iso 53
-
-
-
-
-
-
-
-
HAA 06
-
-
-
+++
+++
-
+ +++
-
Iso 20
-
-
-
+++
+++
-
+++
-
HAL 87
-
+++
-
-
-
-
-
-
Iso 23
-
+ ++
-
+++
+++
-
++++
-
Iso 100
-
-
-
-
-
-
-
-
Iso 10
+++
+++
+++
++++
Keterangan ukuran zona bening = (+): 1-5 mm, (++): 5-10 mm, (+++): 10-15 mm, (++++): 15-20
mm; (-): tidak menunjukkan adanya aktivitas
HAA
: Isolat yang diisolasi dari permukaan
Iso, HAL : Isolat yang diisolasi dari endofit
5
uji dan fungi uji yang lebih baik. Isolatisolat bakteri tersebut ialah HAA 02, Iso act
6, Iso 8, Iso act 2, Iso 95, Iso act 1, Iso 40,
HAA 06, HAL 87, Iso 23, Iso 20, dan Iso
10.
Amplifikasi Domain KS dan Domain A
DNA genom dari 12 isolat bakteri
diamplifikasi dengan proses
(PCR). Hasil amplifikasi
domain KS dan domain A pada gel agarosa
L 1 2
1% (b/v) menunjukkan pita berukuran
sekitar 700 pb untuk domain KS (Gambar 3)
dan sekitar 1000 pb untuk domain A
(Gambar 4). Hasil amplifikasi domain KS
dan domain A dari 12 isolat bakteri yang
berasosiasi
dengan
spons
tersebut
menunjukkan bahwa ke-12 isolat tersebut
memiliki domain KS dan domain A.
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
3000 pb
1000 pb
domain KS
(700 pb)
750 pb
Gambar 3 Elektroforesis gel agarosa 1% (b/v) hasil amplifikasi domain KS untuk 12 isolat yang
berasosiasi dengan spons
sp. Ket: (L) 1 Kb $
, (1) HAA 02, (2) Iso act
6, (3) Iso 8, (4) Iso act 2, (5) Iso 95, (6) Iso act 1, (7) Iso 40, (8) HAA 06, (9) HAL 87,
(10) Iso 23, (11) Iso 20, (12) Iso 10.
L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
3000 pb
1000 pb
domain A
(1000 pb)
Gambar 4 Elektroforesis gel agarosa 1% (b/v) hasil amplifikasi domain A untuk 12 isolat yang
berasosiasi dengan spons
sp. Ket: (L) 1 Kb $
, (1) HAA 02, (2) Iso act
6, (3) Iso 8, (4) Iso act 2, (5) Iso 95, (6) Iso act 1, (7) Iso 40, (8) HAA 06, (9) HAL 87,
(10) Iso 23, (11) Iso 20, (12) Iso 10.
6
Kloning Domain KS dan Domain A
Dalam Sel
DH5α
Dua isolat dipilih untuk proses
pengklonan domain KS dan domain A ke
dalam sel
DH5α, yaitu isolat Iso 10
dan HAA 02. Iso 10 menjadi contoh dari
bakteri endofit dan HAA 02 menjadi contoh
dari bakteri permukaan. Keduanya memiliki
aktivitas antimikrob. Selain itu Iso 10 dan
HAA 02 juga memiliki domain KS dan
domain A berdasarkan hasil verifikasi
dengan elektroforesis. Hasil klon domain KS
dari Iso 10 menunjukkan adanya koloni
putih dan koloni biru (Gambar 5), sedangkan
hasil klon dari domain A dari isolat Iso 10
tidak terdapat koloni putih dan biru. Hasil
klon domain KS dan domain A dari isolat
HAA 02 tidak menunjukkan adanya koloni
putih. Hal ini menandakan proses
pengklonan domain KS dan domain A dari
isolat HAA 02 tidak berhasil.
Koloni
putih
3000 pb
pGEMT-Easy
750 pb
domain KS
(700 pb)
Gambar 6 Elektroforesis gel agarosa 1% dari
pGEMT-Easy-10-KS
yang
dipotong dengan
RI.
Analisis Bioinformatika
Palsmid rekombinan dari isolat Iso
10 yang diduga membawa domain KS
selanjutnya dilakukan sekuensi (Lampiran
3). Hasil analisis didapatkan sekuen Iso 10
KS tidak sesuai dengan domain KS.
Berdasarkan hasil dari amplifikasi PCR dan
verifikasi hasil restriksi Iso 10 sesuai dengan
domain KS, sehingga sekuen Iso KS
Koloni
dihomologikan
dengan
sekuen
dari
biru
yang
telah
dipublikasikan dan dinyatakan telah
memiliki domain KS (Lampiran 4).
Gambar 5 Koloni putih
DH5α pada
(
dari sekuen-sekuen
isolat Iso 10 yang diduga
tersebut,
yaitu
membawa plasmid rekombinan.
AAW84215, AAW84218, AAW84193, dan
AAW84190. Proses ini digunakan untuk
Verifikasi Hasil Kloning Domain KS dan
mendapatkan homologi antara sekuen Iso
Domain A
KS dengan sekuen domain KS lainnya. Hasil
Koloni putih dari Iso 10 untuk
analisis didapatkan bahwa 49-51% dengan
domain KS dipilih untuk proses isolasi
sekuen-sekuen domain KS lainnya (Tabel
plasmid. Plasmid rekombinan hasil isolasi
2).
plasmid dari beberapa koloni putih
DH5α diduga ialah pGEMT-Easy-10-KS.
Plasmid yang diduga rekombinan dipotong
dengan enzim
RI dan menghasilkan dua
pita dengan ukuran yang berbeda. Pita
pertama berukuran 3000 pb yang
menunjukkan
ukuran
pGEMT-Easy,
sedangkan pita kedua berukuran 700 pb
yang sesuai dengan ukuran domain KS
berdasarkan Schirmer
(2005) (Gambar
6). Hal ini menunjukkan bahwa pengklonan
domain KS Iso 10 berhasil disisipkan pada
DH5α. Selain itu, plasmid
rekombinan yang membawa domain KS
tersebut telah terpotong oleh enzim
RI.
7
Tabel 2 Analisis homologi sekuen Iso 10 KS terhadap sekuen domain KS asal "
(
Organisme
Homologi (%)
AAW84215
2
51 %
AAW84218
2
50 %
AAW84193
2
49 %
AAW84190
2
49 %
PEMBAHASAN
Proses penapisan bakteri yang
berasosiasi dengan
sp. dilakukan
dengan menguji adanya aktivitas antibakteri
dan antifungi. Penapisan dilakukan terhadap
bakteri yang terdapat pada bagian endofit
dan permukaan dari spons
sp.
yang berasal dari Pulau Waigeo, wilayah
Raja Ampat, Provinsi Papua Barat
(Tokasaya 2010). Sebanyak dua isolat
bakteri permukaan dan 16 isolat bakteri
endofit yang digunakan dalam proses
penapisan bakteri. Isolat bakteri endofit
adalah bakteri yang berasal dari bagian
, yaitu lapisan yang luas dari
jaringan ikat spons bagian dalam. Umumnya
bakteri yang berasal dari
terdapat
dalam jumlah yang berlimpah. Hal ini
karena aliran air yang mengandung partikel
makanan dialirkan ke dalam
oleh
sel
yang
berflagella
(
).
Berlimpahnya nutrisi menjadikan
sebagai tempat tinggal komunitas bakteri
yang padat (Taylor
2007).
Isolat bakteri endofit berbeda
dengan bakteri yang terdapat pada bagian
permukaan spons. Bakteri permukaan
terdapat dalam jumlah yang lebih sedikit
dibandingkan bakteri
Ketersediaan
nutrisi yang lebih sedikit pada bagian
permukaan dibandingkan dengan bagian
dapat menjadi penyebabnya (Taylor
2007).
Bakteri uji yang digunakan dalam
penelitian ini, yaitu
adalah
bakteri aerob, berbentuk batang, dan
termasuk bakteri Gram negatif. Isolat ini
termasuk
dalam
bakteri
patogen
oportunistik, yaitu bakteri yang dapat
mengeksploitasi inang saat pertahanan
inangnya melemah. Bakteri patogen yang
lain yaitu
, adalah bakteri Gram
positif yang sering ditemukan dalam bagian
pernapasan manusia. Hal ini menjadikan
sebagai penyebab beberapa infeksi
serius pada manusia seperti, pneumonia dan
meningitis. Bakteri
merupakan
bakteri patogen terhadap udang dan ikan,
sedangkan EPEC merupakan bakteri yang
patogen terhadap manusia. EPEC dapat
menyebabkan diare dan banyak ditemukan
pada negara berkembang (Madigan
2006).
Fungi uji yang digunakan ialah
dan
, keduanya
merupakan khamir patogen pada manusia.
menyerang bagian mulut, organ
pencernaan, dan organ kelamin, sedangkan
menyerang kulit, bagian
pencernaan, organ kelamin wanita, dan
kerongkongan (Calderone & Fonzi 2001).
Hasil uji aktivitas antibakteri,
menunjukkan isolat-isolat bakteri dapat
menghambat pertumbuhan bakteri uji
bakteri patogen (P.
,
,
dan
) dan nonpatogen (
dan
). Zona bening di sekitar koloni
yang merupakan zona hambatan berukuran
rata-rata 10-15 mm (Gambar 1). Bakteri uji
yang dapat dihambat bakteri endofit ialah
,
#
,
, dan
. Bakteri uji yang dapat dihambat
bakteri permukaan ialah
,
#
, dan
. Bakteri uji
yang tidak dapat dihambat pertumbuhannya
ialah EPEC, sedangkan bakteri uji
hanya dapat dihambat oleh satu
bakteri permukaan. Zona bening yang
terdapat pada
berukuran rata-rata
5-10 mm (Gambar 2). Seperti dilaporkan
pada penelitian Abubakar (2009), isolat
bakteri endofit yang berasosiasi dengan
&
sp. dapat menghambat pertumbuhan
bakteri uji lebih baik dibanding isolat bakteri
permukaan.
Hasil uji aktivitas antifungi
menunjukkan, bakteri endofit hanya dapat
menghambat pertumbuhan
. Baik
bakteri endofit ataupun bakteri permukaan
tidak ada yang dapat menghambat
pertumbuhan
(Gambar 2)
Seperti yang dilaporkan Tokasaya (2010),
dalam penelitiannya menguji aktivitas
antifungi, sebanyak 6 isolat dari 31 isolat
bakteri endofit yang mampu menghambat
pertumbuhan
. Selain itu, hanya
5 isolat dari 8 isolat bakteri permukaan yang
mampu menghambat pertumbuhan
. HAL 87 merupakan isolat bakteri
8
endofit yang sama digunakan dalam
penelitian ini dan dalam penelitian Tokasaya
(2010). Hasilnya didapatkan bahwa HAL 87
memang
tidak
dapat
menghambat
pertumbuhan
. Selain itu, isolat
bakteri permukaan yang digunakan dalam
penelitian ini sama dengan penelitian
Tokasaya (2010) ialah HAA 02 dan HAA
06. Namun hasil penelitian Tokasaya HAA
02 dan HAA 06 dapat menghambat
pertumbuhan
, sedangkan dalam
penelitian ini tidak. Diduga bahwa khamir
yang digunakan berasal dari
galur yang berbeda.
Hasil penapisan 18 isolat bakteri
didapatkan 12 isolat (66,67%) yang
memiliki potensi sebagai penghasil senyawa
antimikrob (Tabel 1). Isolat-isolat bakteri
tersebut memiliki aktivitas antibakteri dan
antifungi dengan spektrum luas. Salah satu
contoh isolat bakteri yang memiliki aktivitas
antimikrob dengan spektrum luas ialah HAA
02.
HAA
02
dapat
menghambat
pertumbuhan tiga bakteri uji dan satu fungi
uji. Selain HAA 02, terdapat lima isolat
bakteri lain yang dapat menghambat
pertumbuhan tiga bakteri uji dan satu fungi
uji. Isolat-isolat bakteri tersebut ialah Iso act
6, Iso 8, Iso act 2, Iso 23, dan Iso 10. Isolat
bakteri lainnya hanya dapat menghambat
pertumbuhan sekitar dua sampai tiga bakteri
uji. Radjasa (2007) menyatakan bahwa,
bakteri yang berasosiasi dengan
sp. memiliki spektrum aktivitas antimikrob
yang luas. Sehingga bakteri asosiasi dengan
sp. dapat dimungkinkan sebagai
sumber
senyawa
antimikrob
untuk
mengendalikan bakteri patogen.
Senyawa bioaktif dari bakteri yang
berasosiasi dengan spons laut mungkin
memiliki gen biosintesis metabolit sekunder
yaitu PKS dan NRPS. Proses PCR dapat
dilakukan untuk melihat ada atau tidaknya
gen PKS dan NRPS pada suatu bakteri.
Metode PCR dapat menjadi suatu cara untuk
memperkirakan
kekayaan
produsen
metabolit sekunder hasil asosiasi dengan
spons
sp. dan mempelajari
keragaman gen bakteri pada spons lain
(Radjasa
2007).
Sebanyak 12 genom dari isolat
bakteri diuji dengan PCR. Primer PCR
dirancang secara khusus untuk domain KS
dan domain A. Primer degeneratif tersebut
diacu berdasarkan Schirmer (2005). Hasil
amplifikasi domain KS dan domain A pada
gel agarosa 1% (b/v) menunjukkan pita
berukuran sekitar 700 pb untuk domain KS
(Gambar 3) dan sekitar 1000 pb untuk
domain A (Gambar 4). Hal ini menunjukkan
bahwa 12 isolat tersebut memiliki domain
KS dan domain A. Hal ini memungkinkan
12 isolat memiliki gen hibrid PKS-NRPS
(Gambar 3 & 4). Hibrid PKS-NRPS dapat
terjadi dengan kombinasi domain pada
modul NRPS dengan domain pada modul
PKS dalam satu
+
. Gen
hibrid PKS-NRPS dapat menghasilkan
senyawa bioaktif dengan struktur hibrid
(Ansari
2004, Zhu
2009)
Sebanyak dua isolat dipilih dari 12
isolat untuk pengklonan domain KS dan
domain A ke dalam sel
DH5α yaitu
HAA 02 dan Iso 10. Isolat Iso 10 untuk
domain KS menghasilkan koloni putih dan
biru (Gambar 5). Isolat Iso 10 memiliki
domain KS. Hal tersebut didukung dengan
verifikasi hasil isolasi plasmid dan proses
pemotongan plasmid (restriksi) dengan
RI. Hasil verifikasi mendapatkan dua
pita dengan ukuran yang berbeda berukuran
3000 pb dan 700 pb (Gambar 6).
Pengklonan domain A untuk Isolat Iso 10
dan HAA 02 tidak menghasilkan koloni
putih dan biru. Hal ini diduga proses
pengklonan domain A pada Iso 10 dan HAA
02 tidak berhasil.
Hasil analisis dengan BLAST
diidentifikasikan Iso 10 tidak memiliki
domain KS. Iso 10 memiliki
%
sebesar 92% sebagai
(
). Berdasarkan
hasil amplifikasi PCR dan verifikasi hasil
pemotongan plasmid (restriksi) didapatkan
ukuran pita dari plasmid Iso 10 sesuai
dengan domain KS. Hasil analisis
didapatkan bahwa Iso 10 memiliki
kemiripan sekitar 49-51% dengan sekuensekuen domain KS. Sekuen domain KS yang
mirip merupakan organisme
yang
telah
dipublikasikan
(Lampiran 4). Seperti dilaporkan dalam
penelitian Schirmer (2005), sebanyak 256
sekuen dari isolat bakteri yang berasosiasi
dengan spons memiliki tingkat homologi
yang cukup rendah. Tingkat kehomologian
untuk sekuen KS berdasarkan
yang
ada termasuk rendah, yaitu sekitar 49 - 79%.
Berdasarkan hal tersebut, isolat Iso 10
berhomologi dengan domain KS walaupun
hanya 49-51%.
9
SIMPULAN
Dua belas isolat bakteri dari 18
isolat asal spons
sp. (66,67%)
menghasilkan senyawa bioaktif dengan
aktivitas antibakteri dan antifungi.
Sepuluh isolat termasuk bakteri
endofit dan dua isolat berasal dari bagian
permukaan spons. Kedua belas isolat diduga
mengandung domain .
(KS) dari
(PKS) dan domain
(
(A) dari
(NRPS). Homologi antara isolat
Iso 10 KS dengan sekuen domain KS
lainnya sekitar 49-51%.
DAFTAR PUSTAKA
Abubakar E. 2009. Bakteri yang berasosiasi
dengan spons &
sp. : analisis
penghasil senyawa antimikrob dan
keragaman genetiknya [tesis]. Bogor:
Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor.
Ansari MZ, Yadav G, Gokhale RS, Mohanty
D. 2004. NRPS-PKS: a knowledgebased resource for analysis of
NRPS/PKS megasynthases.
(
32:405-413.
Bahkuni DS, Rawat DS. 2005.
!
. New Delhi:
Anamaya Publishers.
Blunt JW, Copp BR, Hu WP, Munro MH,
Prinsep MR. 2007. Marine natural
products.
24 :31-86.
Calderone RA, Fonzi WA. 2001. Virulence
factors of
. /
!
9:327-325.
Kennedy J, Codling CE, Jones BV, Dobson
ADW, Marchesi JR. 2008. Diversity
of microbes associated with the
marine sponge,
,
isolated from Irish water and
identification of polyketide synthase
genes from the sponge metagenome.
(
!
10:18881902.
Kennedy J, Baker P, Piper C, Cotter PD,
Walsh M.
. 2009. Isolation and
analysis of bacteria with antimicrobial
activities from the marine sponge
ans collected from
Irish waters. !
11:384396.
Lanen SGV, Shen B. 2006. Microbial
genomics for the improvement of
atural product discovery.
'
9:252-260.
Madigan MT, Martinko JM, Dunlap PV,
Clark DP. 2006.
+
!
Ed ke-12. San
Fransisco: Pearson Education.
Otsuka M, Ichinose K, Fujii I, Ebizuka Y.
2004. Cloning, sequencing, and
functional analysis of an iterative type
I polyketide synthase gene cluster for
biosynthesis of the antitumor
chlorinated polyenone neocarzilin in
*
.(
(
9:3468-3476.
Pangan ACG, Uy FA, Oclarit JM. 2007.
Antimicrobial properties of some
marine sponges (porifera) from
Mactan, Cebu, Philiphines.
44: 35-45.
Piel J. 2003. Metabolites from symbiotic
bacteria
21: 519-538.
Radjasa OK, Kencana DS, Sabdono A,
Hutagalung RA, Lestari ES. 2007.
Antibacterial activity of marine
bacteria associated with sponge
Aaptos sp. against Multi Drugs
Resistant (MDR) strains. & !
12: 148-152.
Sambrook J, Russel DW. 2001. !
( $
!
Vol
1. Ed-3. New York: Cold Spring
Harbor Laboratory Press.
Schirmer
2005. Metagenomisc analysis
reveals diverse polyketide synthase
gene clusters in microorganisms
associated with the marine sponge
'
. (
!
8:4840-4849.
Shen QT, Chen XL, Sun CY, Zhang YZ.
2004. Dissecting and exploiting nonribosomal peptide synthase. (
36:243–249.
Schwarger D, Finking R, Marahiel MA.
2003. Nonribosomal peptides: from
genes to products.
20:275-287.
Thomas TRA, Kavlekar DP, Lokabharathi
PA. 2010. Marine drugs from spongemicrobe association. !
'
8:1417-1468.
10
Tokasaya P. 2010. Sponge-associated
bacteria producing antimicrobial
compounds and their genetic diversity
analysis [tesis]. Bogor: Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam, Institut Pertanian Bogor.
Zhang W, Li Z, Miao X, Zhang F. 2008.The
screening of antimicrobial bacteria
with diverse novel non-ribosomal
peptide synthase (NRPS) genes from
South China Sea sponges !
11 :346-355.
Zhang W, Zhang F, Li Z, Miao X, Zhang X.
2009. Investigation of bacteria with
polyketide synthase genes and
antimicrobial activity isolated from
South China Sea sponges. & (
!
107 :567-575.
Zhao J, Yang N, Zeng R. 2007. Phylogenetic
analysis of tipe I polyketide synthase
and nonribosomal peptide synthase
genes
in
antartic
sediment.
%
12 :97-10
Zhu, Peng, Zheng Y, Yan X, Shao J. 2009.
Molecular phylogeny and modular
structure of hybrid NRPS/PKS gene
fragmet og
sp.
NJ6-3-2 isolated from marine sponge
. & !
19 :229-237.
Zucko J, Skunca N, Curk, Zupans B, Long
PF.
2007. Polyketide synthase
genes and the natural products
potential
of
'
.
+
23 :25432549.
Xiao HC, Vater J, Piel J, Franke P, Scholz
R.
. 2006. Structural and
functional characterization of three
polyketide synthase genes clusters in
- +
FZB 42. &
188 :4024-4036.
11
LAMPIRAN
12
Lampiran 1 Komposisi macam-macam media yang digunakan dalam proses penapisan bakteri
yang berasosiasi dengan spons
sp.
Media
3
(SWC)
Komposisi
Jumlah
5g
1g
15 g
750 ml
1000 ml
4
%
(
Air laut
Aquades
Media
' %
(
Komposisi
Agar-agar
Dekstrosa
Kentang
Aquades
(PDA)
Jumlah
20 g
20 g
300 g
1000 ml
Media
' %
Komposisi
' %
Aquades
(PDB)
Jumlah
24 g
1000 ml
Lampiran 2 Bahan-bahan dan media yang digunakan dalam proses transformasi
/
+
++ (TFB)
Komposisi
Jumlah
CaCl2
0,1 M
5 mM
MgCl2
5 mM
Tris-Cl (pH 7)
10 g
NaCl
Media $
(
Komposisi
4
%
/
NaCl
(
(LA)
Jumlah
5g
10 g
10 g
15 g
13
Lampiran 3 Sekuen dari Iso 10 KS (dalam bentuk FASTA)
GCATGCTCCC GGCCGCCATG GCGGCCGCGG
CCCAGCAGCG GCTGGAAGGG GTGCGGGCCG
CTGCGCCAGC TGAGCGTGGT GCCGGGCGAT
TGCCGCGGCC GTGGCGCTGC TGGCCGATGC
TCTGCTTCAG CGACCAGATG GCGCTGGGTG
CTGGGCATCC GCGTGCCGGA CGAGTTGTCC
GGCGTCTTCG CGTTACCTCA
CGCCGCCGCT
TGCGGGAGAT CGGCGCGCGC GCGGTCAACC
CAGGTGGATG TTCCGCTTCA ACAGACGCTG
GGGGTCGACG GCGGCACCTG
GGCCCAGGTG
TCGAGTCCTT
GATCCCGAAT TGACGTAAAG
AGCCCGGCAG GGGCCGGGGT GGAACGTGCG
ATGCCGTTCT TGACTGACTC
GACGGAGGTC
GGGGACAATC ACTAGTGAAT
TCGCGGCCGC
GAATTCGATT
CCGGCAAGGC
TTCTCGGTGG
GTCGGCGCCG
CGCTGGCGGC
ATCGTCGGTT
GACGACCATC
TGCTGCTCGC
GATTTCAGCC
AGGCCAGGGA
CTGTCAGACT
ATCGCGCAAG
GCGGTCGAGG
CTGCAGGTCG
Lampiran 4 Homologi antara sekuen-sekuen domain KS dengan Iso 10 KS
1. Homologi antara sekuen domain KS AAW84218 dengan Iso 10 KS
GCCATGGACC
GCGTGGCCGC
AATCCGGGCA
ACCGCAGTCT
CTGCCGCGAT
TCGATGACCT
CGGCAGCCGA
CATCGTTGAA
TGATGGTGCG
CGCTGCAGGT
CACGACAGGC
GGGGTCGGCA
GCCACGGCAC
ACCAT
14
2.
Homologi antara sekuen domain KS AAW84215 dengan Iso 10 KS
15
16
3.
Homologi antara sekuen domain KS AAW84293 dengan Iso 10 KS
17
4.
Homologi antara sekuen domain KS AAW84190 dengan Iso 10 KS
18
Keterangan: nukleotida Iso 10 yang
dengan tanda titik (.)
dengan sekuen-sekuen domain KS ditampilkan
i
ABSTRAK
MEGASARI. Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa Antimikrob yang Berasosiasi dengan Spons
sp. dan Deteksi Gen Penyandi Poliketida Sintase dan Peptida Sintase Nonribosom.
Dibimbing oleh ARIS TRI WAHYUDI dan NISA RACHMANIA MUBARIK.
Spons tergolong dalam Filum Porifera memiliki kemampuan bersimbiosis dengan
mikroorganisme. Simbiosis tersebut menghasilkan produk alami yang menguntungkan seperti
poliketida dan peptida nonribosom yang memiliki aktivitas antimikrob. Poliketida dan peptida
nonribosom masing-masing dibentuk oleh gen
(PKS) dan
(NRPS). Keduanya merupakan enzim multifungsional yang terlibat dalam
biosintesis senyawa bioaktif yang penting dalam bidang farmasi dan industri. Penelitian ini
bertujuan menapis bakteri asal spons penghasil senyawa antimikrob dan mendeteksi gen yang
berperan dalam biosintesis senyawa bioaktif tersebut. Sebanyak 18 isolat bakteri yang diisolasi
dari spons
sp. dan diuji aktivitas antimikrobnya, didapatkan 12 isolat bakteri yang
menghambat pertumbuhan empat bakteri patogen, yaitu
,
(EPEC),
,
, dua bakteri nonpatogen, yaitu
,
, dan dua cendawan patogen, yaitu
, dan
Deteksi gen penyandi PKS dan NRPS dilakukan dengan teknik
(PCR) menggunakan primer spesifik yang masing-masing menghasilkan amplikon
berukuran 700 pb dan 1000 pb. Satu isolat yang memiliki aktivitas antimikrob terbaik dan
memiliki kedua gen penyandi PKS dan NRPS yaitu Iso 10 dipilih untuk analisis homologinya.
Fragmen DNA dari genom Iso 10 KS (700 pb) yang telah berhasil diklon ke dalam plasmid
pGEMT dan disekuen, menyatakan homologinya dengan domain KS sekitar 49-51%.
Keyword: senyawa bioaktif, antimikrobial, PKS, NRPS, spons
ABSTRACT
MEGASARI. Screening of Bacteria Producing Antimicrobial Compounds which is Associated
with
sp. Sponge and Detection Its Encoding Peptide Synthase and Non-ribosomal
Polyketide Synthase Gene. Supervised by ARIS TRI WAHYUDI and NISA RACHMANIA
MUBARIK.
Sponges are classified in the Porifera phylum have the ability to symbiosis with
microorganisms. The symbiont produced useful natural products such as polyketides and nonribosomal peptides that possessed antimicrobial activities. Each polyketide and non-ribosomal
peptide are synthesized by the
(PKS) dan
(NRPS) gene. Both of them are multifunctional enzymes that involved in the biosynthesis
bioactive compounds that are important in pharmaceutical and other industries.The aims of study
was to screened the bacteria producing antimicrobial compounds which is associated with sponge
and detect the genes that play a role in the biosynthesis of bioactive compounds. A total of 18
isolates bacteria that associated with
sp. was tested their antimicrobial activity and
finally 12 isolates bacteria that inhibited four pathogenic bacteria growth that consist of
,
(EPEC),
,
, and two non-pathogenic bacteria that consist of
,
,
and the two pathogenic fungus
and
. Detection of PKS and
NRPS encoding gene performed by
(PCR) using specific primers,
producing 700 bp and 1000 bp amplicon. One isolate that possessed the best antimicrobial
activities and both of PKS and NRPS gene which is Iso 10 are selected for homology test. DNA
fragment from Iso 10 KS genome (700 bp) that have been successfully cloned into plasmid
pGEMT and sequenced and its homology with other KS domain sequences of about 49-51%.
Keyword: bioactive compounds, antimicrobial, PKS, NRPS, sponge
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Mikrob dapat berinteraksi dengan
organisme laut, seperti spons, dan
menghasilkan berbagai produk alami.
Produk alami yang berasal dari metabolit
sekunder mikrob berperan penting dalam
penelitian medis dan pengembangan obat.
Produk alami tersebut dapat secara lansung
menjadi obat atau menjadi struktur dasar
sintesis obat kimia baru (Bahkuni
.
2005). Sejak tahun 1981, dilaporkan bahwa
sekitar 40% produk kimia berasal dari
turunan produk alami mikrob (Lanen &
Shen 2006). Keuntungan dari produk alami
sebagai senyawa bioaktif karena dapat
memiliki aktivitas antimikrob, antiviral,
antimalaria, antikanker, antitumor, bahkan
memiliki aktivitas
% .
Spons yang sudah diteliti dan
menghasilkan senyawa bioaktif antara lain
&
sp.,
#
#
'
#
# dan
Kennedy
(2008, 2009) melaporkan, pada
ditemukan sekitar
delapan filum bakteri. Filum yang paling
banyak
ditemukan
ialah
filum
#
#
(
# dan )
. Metabolit
yang diisolasi dari bakteri yang berasosiasi
dengan spons
sp., misalnya:
sterol, steroid, alkaloid, avarol, nukleosida,
peptida, dan poliketida (Blunt
. 2007).
Peptida nonribosom sebagai salah satu
senyawa bioaktif memiliki kemampuan
untuk menjadi antibiotik hingga racun. Oleh
karena itu, investigasi biosintesis peptida
sangat menarik untuk pembentukan obat
baru dalam bidang farmasi modern. Selain
peptida nonribosom, poliketida juga
memiliki peran penting dalam industri
agrokimia, farmasi, dan bioteknologi
(Schwarger
. 2003, Kennedy
2008).
Peptida nonribosom atau poliketida
masing-masing dibentuk oleh enzim besar
yang multifungsional dengan kelompok situs
katalitik yang terkoordinasi, yaitu
(PKS) dan
(NRPS) (Zhao
2007). NRPS
terdiri atas organisasi modular, yaitu
serangkaian situs aktif terkoordinasi yang
dapat dideteksi untuk analisis genetik bakteri
yang berasosiasi dengan spons. Setiap
modul terdiri atas domain minimal dan
domain opsional. Domain minimal adalah
domain dengan jumlah minimum yang
diperlukan untuk seluruh proses sintesis
peptida nonribosomal, terdiri atas domain
(A), domain
(PCP), domain
(C),
dan domain
(TE). Sedangkan
domain opsional terdiri atas domain
*
(Cy), domain
+
(MT), dan domain
*
(Er) (Shen
2004). Seperti halnya NRPS, PKS juga
merupakan
enzim
besar
yang
multifungsional dengan organisasi modular.
Persyaratan minimal yang dibutuhkan oleh
PKS ialah tiga domain, yaitu domain
+
(AT), domain
(KS), dan domain
(ACP)
(Otsuka
2004, Xiao
2006, Zucko
2007).
Domain KS dan domain A masingmasing memiliki peran penting dalam
sintesis
poliketida
dan
peptida
nonribosomal. Domain A berperan dalam
tugas inti yaitu mengaktifkan dan memilih
asam amino yang sama asal dari kelompok
substrat bebas dalam pembentukan nonribosomal peptida (Schwarger
2003,
Shen
2004, Zhao
2007).
Sedangkan Domain KS bertanggung jawab
untuk
kondensasi
unit
luar
yang
ditambahkan pada rantai poliketida selama
biosintesis poliketida (Xiao
2006,
Zucko
2007). Menurut Shen (2004),
modifikasi NRPS dengan pengubahan
substrat pada domain A akan menjadi
rekayasa sintesis peptida baru. Seperti
halnya domain A, keragaman struktur
poliketida
dapat
dilakukan
dengan
pengubahan starter, perluasan unit, dan
jumlah kondensasi pada modifikasi domain
KS (Otsuka
2004). Selain itu,
persamaan domain KS dan domain A yaitu
keduanya lebih sesuai dalam analisis
filogenetik keanekaragaman PKS dan NRPS
(Zhang
2008, 2009). Oleh karena itu,
analisis domain KS dan domain A
memudahkan penelitian untuk mendeteksi
gen yang berperan dalam pembentukan
senyawa bioaktif yang berperan penting
dalam bidang farmasi dan industri.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan menapis
bakteri yang berasosiasi dengan spons
sp. yang menghasilkan senyawa
antimikrob serta mendeteksi gen yang
berperan dalam biosintesis senyawa
antimikrob tersebut.
2
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan dari bulan
Maret hingga Oktober 2010 di Laboratorium
Bagian Mikrobiologi, Departemen Biologi,
FMIPA, IPB.
BAHAN DAN METODE
Bahan
Bahan yang digunakan dalam
penelitian ini ialah 16 bakteri endofit (HAL
87, Iso act 6, Iso 40, Iso 46, Iso 8, Iso 47, Iso
67, Iso 95, Iso act 1, Iso act 16, Iso act 2, Iso
53, Iso 20, Iso 23, Iso 100, dan Iso 10), dan
2 bakteri permukaan (HAA 02, HAA 06)
yang berasosiasi dengan spons
sp.
asal Pulau Wigeo, wilayah Raja Ampat,
Provinsi Papua Barat (Tokasaya 2010), dua
bakteri uji nonpatogen (
,
), empat bakteri uji patogen
(
,
#
,
[EPEC]), dan dua fungi uj