Penapisan Bakteri Filosfer Padi Penghasil Senyawa Bioaktif Anti-Xanthomonas Oryzae Pv. Oryzae Dan Deteksi Sekuen Gen Penyandi Peptida Non-Ribosomal Sintetase

PENAPISAN BAKTERI FILOSFER PADI PENGHASIL
SENYAWA BIOAKTIF ANTI-Xanthomonas oryzae pv. oryzae
DAN DETEKSI SEKUEN GEN PENYANDI PEPTIDA NONRIBOSOMAL SINTETASE

EKA SEPTIA WARDHANI

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul “Penapisan Bakteri
Filosfer Padi Penghasil Senyawa Bioaktif Anti-Xanthomonas oryzae pv. oryzae
dan Deteksi Sekuen Gen Penyandi Peptida Non-ribosomal Sintetase” adalah benar
karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam
bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal
atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain
telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian

akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Desember 2015
Eka Septia Wardhani
NIM G34110005

ABSTRAK
EKA SEPTIA WARDHANI. Penapisan Bakteri Filosfer Padi Penghasil Senyawa
Bioaktif Anti-Xanthomonas oryzae pv. oryzae dan Deteksi Sekuen Gen Penyandi
Peptida Non-ribosomal Sintetase. Dibimbing oleh ARIS TRI WAHYUDI dan
ALINA AKHDIYA.
Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) adalah bakteri penyebab penyakit
hawar daun yang dapat menyebabkan penurunan produksi padi. Bakteri filosfer
mampu menghasilkan senyawa bioaktif anti-Xoo yang dapat dijadikan sebagai
alternatif agens biokontrol. Penelitian ini bertujuan menyeleksi isolat bakteri
filosfer padi penghasil senyawa bioaktif penghambat pertumbuhan Xoo dan
mendeteksi keberadaan gen penyandi peptida non-ribosomal sintetasenya.
Sepuluh isolat bakteri filosfer padi yang diuji mampu menghasilkan senyawa
bioaktif anti-Xoo yang ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening di sekitar

koloni. Analisa sekuen gen penyandi 16S rRNA menunjukkan bahwa enam isolat
(BFR 35, BFR 64, BFR 69, BFR 153, BFR 162, dan BFR 266) termasuk anggota
genus Bacillus, tiga isolat (BFR 183, BFR 217, BFR 238) termasuk anggota genus
Pseudomonas, dan satu isolat (BFR 203) diidentifikasi sebagai Staphylococcus
sciuri. BFR 64, BFR 69, BFR 153, dan BFR 183 terdeteksi memiliki gen
penyandi domain A dari peptida non-ribosomal sintetase dengan homologi 91%,
89%, 98%, dan 76% berturut-turut untuk keempat isolat tersebut. Bacillus aerius
BFR 153, Pseudomonas cremoricolorata BFR 183, Staphylococcus sciuri BFR 203, dan
Pseudomonas parafulva BFR 217 bersifat non-hemolitik sehingga potensial dan
aman dikembangkan sebagai agens biokontrol untuk mengendalikan Xoo.
Kata kunci: Bacillus, domain A, gen 16S rRNA, hemolisis darah

ABSTRACT
EKA SEPTIA WARDHANI. Screening of Rice Phyllosphere Bacteria Producing
Anti-Xanthomonas oryzae pv. oryzae Bioactive Compounds and Detection of
Non-ribosomal Peptide Syntetase Gene. Supervised by ARIS TRI WAHYUDI
dan ALINA AKHDIYA.
Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) is the causal agent of bacterial leaf
blight disease which affecting the decline of rice production. Phyllosphere
bacteria capable producing anti-Xoo bioactive compound that can be used as an

alternative biocontrol agent. This research aimed to screen rice phyllosphere
bacteria isolates producing anti-Xoo bioactive compound and to detect the
existence of non-ribosomal peptide synthetase gene. A total of 10 rice
phyllosphere bacteria isolates which tested was capable producing anti-Xoo
bioactive compound shown by clear zone formation around the colony. Analysis
of 16S rRNA gene showed that 6 isolates (BFR 35, BFR 64, BFR 69, BFR 153,
BFR 162, BFR 266) are belong to genus Bacillus, 3 isolates (BFR 183, BFR 217,
BFR 238) are belong to genus Pseudomonas and one isolate (BFR 203) was

identified as Staphylococcus sciuri. BFR 64, BFR 69, BFR 153 and BFR 183
were detected to have the domain A of non-ribosomal peptide synthetase gene
with homogeneity percentage 91%, 89%, 98%, and 76% respectively. Bacillus
aerius BFR 153, Pseudomonas cremoricolorata BFR 183, Staphylococcus sciuri
BFR 203, and Pseudomonas parafulva BFR 217 are non-hemolytic bacteria, thus
can be potential and safe to develop as biocontrol agent to control Xoo.
Key words: 16S rRNA gene, Bacillus, blood hemolysis, domain A

PENAPISAN BAKTERI FILOSFER PADI PENGHASIL
SENYAWA BIOAKTIF ANTI-Xanthomonas oryzae pv. oryzae
DAN DETEKSI SEKUEN GEN PENYANDI PEPTIDA NONRIBOSOMAL SINTETASE

EKA SEPTIA WARDHANI

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penulisan skripsi yang
berjudul “Penapisan Bakteri Filosfer Padi Penghasil Senyawa Bioaktif AntiXanthomonas oryzae pv. oryzae dan Deteksi Sekuen Gen Penyandi Peptida Nonribosomal Sintetase” ini dengan baik, untuk mendapatkan gelar Sarjana Sains,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Penulis menyadari bahwa penelitian ini dapat terselesaikan dengan baik
karena dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis
mengucapkan rasa terima kasih kepada Prof Dr Aris Tri Wahyudi, MSi dan Dr
Alina Akhdiya, MSi selaku pembimbing yang telah banyak memberikan waktu
konsultasi, bimbingan, saran, dan motivasi selama proses penyelesaian penulisan
skripsi. Saya juga mengucapkan terima kasih kepada Dr Ir Miftahudin, MSi
selaku penguji yang telah banyak memberikan saran. Sebagian besar penelitian ini
didanai dari proyek penelitian Hibah Kompetensi, Kementerian Riset, Teknologi,
dan Pendidikan Tinggi tahun 2015, atas nama Prof Dr Aris Tri Wahyudi, MSi
untuk itu kami juga mengucapkan terima kasih.
Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Mbak Gege, Kak Noor,
Mbak Wiwik, Mbak Sari, Mbak Siska, Mbak Wulan, Kak Sasa, Dewi, Desi,
Mbak Adit, Kak Cessa, Kak Sipri, Kak Ciko yang telah membantu peneliti dalam
penelitian. Kepada semua Staf Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi
khususnya Pak Jaka dan Mbak Heni.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada ayah, ibu, dan seluruh keluarga,
atas segala do’a dan kasih sayangnya serta motivasi paling besar untuk
penyelesaian skripsi ini. Ucapan terima kasih juga ditujukan kepada dosen-dosen
Departemen Biologi atas ilmu pengetahuan yang diberikan, sahabat dan temanteman Biologi 48 serta kakak-kakak S2, S3 Laboratorium Mikrobiologi yang telah
menghiasi perjalanan penulis selama menempuh pendidikan S1 di Departemen

Biologi .
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Desember 2015
Eka Septia Wardhani

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

viii

DAFTAR GAMBAR

viii

DAFTAR LAMPIRAN

viii

PENDAHULUAN

1

Latar Belakang

1

Tujuan Penelitian

2

METODE

2

Waktu dan Tempat Penelitian

2

Bahan

2

Alat

2

Prosedur

2

HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Pembahasan

4
4
11

SIMPULAN

14

DAFTAR PUSTAKA

14

LAMPIRAN

17

RIWAYAT HIDUP

23

DAFTAR TABEL
1 Indeks penghambatan bakteri filosfer padi terhadap Xoo
2 Homologi sekuen gen 16S rRNA dari isolat bakteri filosfer penghasil
senyawa bioaktif anti-Xoo
3 Homologi sekuen penyandi gen domain A dari NRPS

4 Hasil uji hemolisis bakteri filosfer pada media agar-agar darah

5
7
10
11

DAFTAR GAMBAR
1 Penghambatan pertumbuhan Xoo oleh senyawa bioaktif yang
terkandung dalam supernatan isolat BFR 35 (a), BFR 153 (b), BFR
183 (c), BFR 217 (d), K- (e), dan rifampisin kontrol (K+) 10 ppm (f)
pada uji antagonisme menggunakan metode disk diffusion assay
2 Visualisasi amplikon gen 16S rRNA isolat BFR 35 (a), BFR 162 (b),
BFR 183 (c), BFR 266 (d), BFR 64 (e), BFR 69 (f), BFR 153 (g),
BFR 203 (h), BFR 217 (i), BFR 238 (j), dan Marker 1 kb ladder (M)
pada gel agarose 1%
3 Pohon filogenetik 10 isolat bakteri filosfer penghasil senyawa bioaktif
anti-Xoo berdasarkan gen 16S rRNA-nya
4 Visualisasi amplikon gen NRPS domain A isolat BFR 64 (a), BFR 69
(b), BFR 153 (c), BFR 183 (d), BFR 35 (e), BFR 162 (f), BFR 203

(g), BFR 217 (h), BFR 238 (i), BFR 266 (j), dan Marker 1 kb ladder
(M) pada gel agarose 1%
5 Pohon filogenetik isolat bakteri filosfer berdasarkan sekuen asam
amino domain A
6 Uji hemolisis pada isolat bakteri BFR 35 (a), BFR 64 (b), BFR 69 (c),
BFR 162 (d), BFR 238 (e), dan BFR 266 (f) yang digoreskan pada
media agar-agar darah (umur 48 jam)

5

6
8

9
10

11

DAFTAR LAMPIRAN
1 Sekuen gen 16S rRNA
2 Sekuen gen penyandi peptida non-ribosomal sintetase

17
21

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Hawar daun bakteri (HDB) disebabkan oleh Xanthomonas oryzae pv.
oryzae (Xoo). Penyakit ini merupakan salah satu penyakit utama padi di kawasam
Asia yang dapat mempengaruhi penurunan produksi padi khususnya Indonesia.
HDB menyerang padi di sawah beririgasi atau tadah hujan (Mew 1987). Xoo
dapat menginfeksi setiap fase pertumbuhan tanaman padi, sehingga sangat sulit
untuk dikendalikan (Suparyono et al. 2004). Serangan penyakit HDB diawali
dengan masuknya Xoo melalui hidatoda, perbanyakan sel Xoo di epitelium,
perpindahan massa Xoo ke pembuluh xilem, dan akhirnya menyebabkan
kerusakan pada bagian daun (Ou 1985). Daun yang terinfeksi HDB akan cepat
mengering (Mew 1987). Hawar daun bakteri merupakan penyakit vaskular pada
padi dan infeksinya bersifat sistemik. Gejala penyakit HDB dapat berupa hawar
daun atau kresek (Ou 1985). Serangan HDB dengan gejala kresek sangat merusak
tanaman padi karena daun dari seluruh tanaman secara bertahap berubah menjadi
kuning pucat dan layu dari tahap bibit sampai anakan awal sehingga
mengakibatkan panen gagal total (Mew dan Vera 1979).
Serangan HDB di Indonesia pada tahun 2012 mencapai 72 169 Ha dan
meningkat menjadi 82 636 Ha pada tahun berikutnya (Kementan 2014).
Pengendalian HDB selama ini dilakukan melalui tindakan preventif dan setelah
terjadi serangan di lapang. Tindakan preventif yang dilakukan adalah dengan
menggunakan varietas yang tahan (resisten). Namun hal ini tidak selalu berhasil
dalam mengendalikan penyakit HDB, karena Xoo merupakan bakteri yang sangat
adaptif (Kadir 2007). Pengendalian di lapang biasanya menggunakan bakterisida
kimia, akan tetapi penggunaan bakterisida kimia yang berlebihan dapat
mengakibatkan pencemaran lingkungan dan meningkatkan resistensi patogen
(Hastuti et al. 2012). Oleh karena itu, suatu agens biokontrol berbasis mikroba
yang dapat menghasilkan senyawa bioaktif anti-Xoo diperlukan dalam
mengendalikan penyakit HDB. Menurut Krishanti et al. (2015), bakteri yang
berasal dari filosfer daun padi dapat menghasilkan senyawa bioaktif anti-Xoo.
Sebagian senyawa bioaktif antimikrob yang dihasilkan oleh bakteri dapat
berupa peptida non-ribosomal dan poliketida yang penting untuk mengendalikan
mikrob patogen. Enzim peptida non-ribosomal sintetase (NRPS) dan poliketida
sintase (PKS) adalah enzim multidomain yang berperan dalam biosintesis
senyawa bioaktif dari golongan protein non-ribosom dan poliketida yang banyak
terdapat pada kelompok bakteri, cendawan, dan tanaman (Cane dan Walsh 1999).
Kluster gen-gen peptida non-ribosomal untuk sintesis beragam senyawa bioaktif
(NRPS) dari golongan antibiotik, toksin (Cane et al. 1998), anti-inflamasi dan
immunosuppressant (Cane dan Walsh 1999), serta siderophore (Crosa dan Walsh
2002) telah ditemukan. Modul NRPS biasanya berisi domain adenilasi (A),
peptidyl carrier protein, dan kondensasi. Peptida non-ribosomal sintetase berakhir
dengan domain tioesterase yang mengkatalisis terminasi pemanjangan rantai
peptida (Schwarzer et al. 2003).
Sebanyak 18 isolat bakteri filosfer asal daun padi sehat penghambat Xoo
telah berhasil diisolasi. Sepuluh isolat di antaranya memiliki indeks

2
penghambatan tertinggi terhadap Xoo (Nurfitriani 2014), namun keragaman
genetik bakteri dan gen penyandi senyawa bioaktif isolat-isolat tersebut belum
diketahui.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan menapis bakteri filosfer padi penghasil senyawa
bioaktif anti-Xanthomonas oryzae pv. oryzae dan mendeteksi serta menganalisis
sekuen gen yang berperan dalam biosintesis senyawa tersebut.

METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan pada bulan Maret hingga Agustus 2015 di
Laboratorium Penelitian Mikrobiologi Departemen Biologi, FMIPA IPB.

Bahan
Bahan yang digunakan adalah 10 isolat-isolat bakteri filosfer padi (BFR 35,
BFR 64, BFR 69, BFR 153, BFR 162, BFR 183, BFR 203, BFR 217, BFR 238,
dan BFR 266) yang telah diseleksi oleh Nurfitriani (2014), media Luria Bertani
Agar (LA) (bacto agar 20 g, tripton 10 g, NaCl 10 g, yeast extract 5 g, dan
akuades 1000 mL), ethidium bromide (EtBr), dan gel agarosa 1%.

Alat
Laminar Air Flow Cabinet, mesin PCR 2720 thermal cycler, sentrifugator
galaxy 7D, silica gel 60 GF254, inkubator bergoyang, autoklaf, dan hot plate.

Prosedur
Uji Antagonisme Bakteri Filosfer terhadap Xanthomonas oryzae pv. oryzae
Uji antagonisme dilakukan menggunakan metode disk diffusion assay pada
satu lapis media (Lisboa et al. 2006). Sebanyak 1000 μL (107cfu/mL) kultur cair
Xoo diinokulasikan ke dalam 100 mL LA 0.8% kemudian dituang ke dalam cawan
Petri masing-masing sebanyak ±10 mL. Setelah media LA 0.8% memadat,
sebanyak 20 μL supernatan kultur bakteri filosfer umur 48 jam diteteskan ke
kertas cakram (Ф=6 mm). Selanjutnya kertas cakram yang telah ditetesi
supernatan kultur bakteri filosfer diletakkan pada permukaan media LA 0.8%.
Inkubasi dilakukan pada suhu 27 ⁰C selama 24 jam. Kemudian indeks
penghambatan masing-masing isolat dihitung. Indeks penghambatan (IP) dihitung
dengan menggunakan rumus persamaan sebagai berikut:

3
IP = Dz2 – Dz1
Dz1
Keterangan:
Dz1 = diameter bakteri atau cakram (mm)
Dz2 = diameter zona bening (mm)
Isolasi DNA Genom
Metode cetyl trimethyl ammonium bromide (CTAB) digunakan untuk
mengekstraksi DNA genom isolat bakteri filosfer (Sambrook dan Russel 2001).
Sepuluh isolat bakteri filosfer masing-masing dikulturkan di dalam media cair
(Luria Broth) selama 24 jam pada suhu 27 ⁰C dalam shaker. Sebanyak 1.5 mL
kultur disentrifugasi pada 10000 rpm selama 10 menit. Setelah supernatan
dibuang, pelet selnya dicuci dua kali dengan 760 µL bufer Tris-EDTA (TE) 0.5 M
pH 8. Pelet yang telah dicuci, ditambah bufer Tris-EDTA (TE) 0.5 M pH 8
sebanyak 200 μL dan 45 μL lysozyme selanjutnya tabung Eppendorf dibolak-balik
sebanyak 10 kali dan diinkubasi pada suhu 37 ⁰C selama 30 menit. Kemudian
ditambahkan 500 μL sodium dodecyl sulfate (SDS) 10% dan 10 μL proteinase K
lalu diinkubasi pada suhu 37 ⁰C. Setelah diinkubasi pada suhu 37 ⁰C selama 60
menit, sebanyak 80 μL NaCl dan 100 μL CTAB 10% ditambahkan setelah itu
diinkubasi pada suhu 65 ⁰C selama 20 menit. Berikutnya sebanyak 650 μL
phenol: chloroform: isoamylalcohol (25:24:1) ditambahkan ke dalam campuran
tersebut dan dicampur dengan cara membolak-balikan tabung, disentrifugasi
10000 rpm selama 10 menit. Lapisan atas yang terbentuk diambil menggunakan
pipet mikro dan dimasukkan ke dalam tabung baru yang telah diberi chloroform
isoamylalcohol 650 µL. Tabung Eppendorf yang berisi campuran dibolak-balik
sebanyak 10 kali sebelum disentrifugasi 10000 rpm selama10 menit. Lapisan atas
diambil dan ditambah etanol 96% dingin sebanyak 0.6 kali volume cairan lapisan
atas. Campuran tersebut diinkubasi di freezer suhu -20 ⁰C selama semalam. Etanol
dibuang dan pelet DNA terbentuk dicuci dengan 1 mL etanol 70%. Setelah
disentrifugasi 10000 rpm selama 10 menit etanol sisa pencucian dibuang dan
dikeringkan pada suhu 27 ⁰C dengan cara membalikkan Eppendorf di atas tisu,
DNA dilarutkan kembali dengan 50 μL deionised distilled water (ddH2O)
kemudian disimpan dalam freezer sampai saat digunakan.
Amplifikasi Gen Penyandi 16S rRNA
Gen penyandi 16S rRNA diamplifikasi menggunakan primer khusus untuk
penyandi gen 16S rRNA yaitu primer 63F (5’-CAG GCC TAA CAC ATG CAA
GTC-3’) dan 1387R (5’-GGG CGG WGT GTA CAA GGC-3’) (Marchesi et al.
1998). Komposisi campuran reaksi PCR terdiri atas 25 µL GoTaq Green Master
Mix 1x (Promega®, USA), 4 µL (10 pmol/µL) masing-masing primer, 3 µL DNA
cetakan (~100 ng/µL), dan 14 µL air bebas nuklease. Reaksi amplifikasi
dilakukan pada kondisi: pre-denaturasi (94 ⁰C, 4 menit), proses denaturasi (94 ⁰C,
30 detik), penempelan primer (55 ⁰C, 30 detik), proses pemanjangan (72 ⁰C, 1
menit) dan pemanjangan akhir (72 ⁰C, 7 menit). Proses amplifikasi dilakukan
sebanyak 30 siklus. Sebanyak 5 µL DNA hasil amplifikasi dilarikan pada gel
elektroforesis (1% agarosa) selama 45 menit pada 80 volt dengan bufer TAE 1x
sebagai running buffer-nya. Sebagai penanda ukuran digunakan Benchtop DNA

4
ladder 1kb (Promega®, USA). DNA pada agarosa diwarnai dengan EtBr dan
divisualisasi di atas UV transiluminator. DNA amplikon dikirim ke perusahaan
jasa sekuensing untuk menentukan runutan sekuen DNA-nya.
Amplifikasi Domain A dari NRPS
Domain A dari NRPS (1000 pb) diamplifikasi menggunakan mesin PCR.
Campuran reaksi PCR dibuat dengan mencampurkan berturut-turut 12.5 μL bufer
GC II, 4 μL dNTPs (2.5 mM), 0.25 μL (5 unit/μL) enzim La taq DNA
Polymerase, 1 μL (50 pmol) primer spesifik (forward dan reverse), 3.25 μL
ddH2O, 3 μL sampel DNA genom. Sekuen degenerated primer untuk domain A,
forward: 5’AARDSIGGIGSIGSITAYBICC-3’; reverse: 5’CKRWAICCICKIAIYTTIAYYTG-3’ (Schirmer et al. 2005). Reaksi amplifikasi dilakukan dengan
kondisi: pre-denaturasi (94 ⁰C, 4 menit), proses denaturasi (94 ⁰C, 4 menit),
penempelan primer (50 ⁰C, 30 detik), proses pemanjangan (72 ⁰C, 1 menit),
pemanjangan akhir (72 ⁰C, 7 menit). Proses amplifikasi dilakukan sebanyak 35
siklus. Visualisasi hasil PCR domain A dari gen NRPS dilakukan sebagaimana
dilakukan untuk amplikon gen 16S rRNA. DNA amplikon dikirim ke perusahaan
jasa sekuensing untuk menentukan runutan sekuen DNA-nya.
Analisis Bioinformatika
Sekuen DNA yang didapat dari perusahaan jasa sekuensing (Lampiran 1 dan
Lampiran 2), kemudian disejajarkan dengan sekuen DNA yang ada di GenBank
(NCBI) menggunakan BLAST-N untuk analisis gen 16S rRNA dan BLAST-X
untuk analisis gen NRPS sehingga didapatkan berbagai sekuen lain yang memiliki
kemiripan terdekat. Setelah itu, sekuen DNA diterjemahkan ke dalam runutan
protein menggunakan perangkat lunak Molecular Evoluationary Genetics
Analysis (MEGA) versi 6.0.
Uji Hemolisis Darah
Uji hemolisis darah dilakukan pada media agar-agar darah. Isolat digores
pada media agar-agar darah, kemudian hasil goresan diinkubasi pada suhu 27 ⁰C
selama 48 jam. Kemampuan hemolisis ditandai dengan adanya zona bening atau
hijau di sekitar koloni isolat yang diuji. Ada 3 hasil uji hemolisis yaitu kelompok
alpha, beta, dan gamma.

HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Aktivitas Antagonisme Bakteri Filosfer terhadap Xanthomonas oryzae pv.
oryzae
Difusi rifampisin (K+) 10 ppm dan supernatan kultur bakteri filosfer dari
kertas cakram ke dalam media menyebabkan terbentuknya zona bening di sekitar
kertas cakram. Zona bening tersebut menunjukkan adanya antagonisme atau
penghambatan terhadap pertumbuhan Xoo. Nilai indeks penghambatan rifampisin
terhadap pertumbuhan Xoo mencapai 32, sedangkan indeks penghambatan

5
tertinggi pada supernatan kultur ditunjukkan oleh supernatan isolat BFR 64 yang
mencapai 16. Sebaliknya kertas cakram yang ditetesi media steril tidak
menghasilkan zona bening sebagaimana pada cakram kontrol positif yang ditetesi
rifampisin 10 ppm (Tabel 1; Gambar 1).
Tabel 1 Indeks penghambatan bakteri filosfer padi terhadap Xoo
Kode isolat
BFR 35
BFR 64
BFR 69
BFR 153
BFR 162
BFR 183
BFR 203
BFR 217
BFR 238
BFR 266
KK+

Diameter koloni
(mm)
19
6
6
8
6
14
13.1
9
13.5
11.8
0
6

a

6 mm
cd

6 mm

Diameter zona
bening (mm)
25
15
8
11
9
16
13.5
12
14
13
0
25

b

Indeks
penghambatan
3
16
3
4
5
1
0.5
3
0.5
0.8
0
32

c

6 mm

6 mm

e

f

6 mm

6 mm

Gambar 1 Penghambatan pertumbuhan Xoo oleh senyawa bioaktif yang
terkandung dalam supernatan isolat BFR 35 (a), BFR 153 (b), BFR
183 (c), BFR 217 (d), K- (e), dan rifampisin kontrol (K+) 10 ppm (f)
pada uji antagonisme menggunakan metode disk diffusion assay

6
Identifikasi Molekuler Gen 16S rRNA dan Konstruksi Pohon Filogenetik
Sebanyak 10 isolat bakteri filosfer berhasil diisolasi dengan metode cetyl
trimethyl ammonium bromide (CTAB). Kemudian hasil isolasi DNA diamplifikasi
dengan kondisi reaksi sebagaimana telah dijelaskan pada metode. Hasil
amplifikasi gen 16S rRNA isolat bakteri filosfer menunjukkan bahwa DNA
amplikon berukuran ~1300 pb (Gambar 2).

Gambar 2 Visualisasi amplikon gen 16S rRNA isolat BFR 35 (a), BFR 162
(b), BFR 183 (c), BFR 266 (d), BFR 64 (e), BFR 69 (f), BFR 153
(g), BFR 203 (h), BFR 217 (i), BFR 238 (j), dan Marker 1 kb
ladder (M) pada gel agarosa 1%
Analisis BLAST sekuen parsial gen 16S rRNA menunjukkan isolat BFR 35
dan BFR 64 memiliki kemiripan dengan Bacillus anthracis str. Ames, BFR 69
memiliki kemiripan dengan Bacillus stratrophericus 41KF2a, BFR 153 memiliki
kemiripan dengan Bacillus aerius 24K, BFR 162 memiliki kemiripan dengan
Bacillus idriensis SMC 4352-2, BFR 183 memiliki kemiripan dengan
Pseudomonas cremoricolorata NBRC 16634, BFR 203 memiliki kemiripan
dengan Staphylococcus sciuri DSM 20345, BFR 217 memiliki kemiripan dengan
Pseudomonas parafulva AJ 2129, BFR 238 memiliki kemiripan dengan
Pseudomonas stutzeri ATCC 17588, dan BFR 266 memiliki kemiripan dengan
Bacillus toyonensis BCT 7112. Persentase kemiripan sekuen DNA isolat dengan
sekuen DNA pembanding di GenBank adalah 93-100% dengan persentase query
cover antara 96-100% (Tabel 2).

7
Tabel 2 Homologi sekuen gen penyandi 16S rRNA dari isolat bakteri filosfer
penghasil senyawa bioaktif anti-Xoo
Kode
isolat
BFR 35
BFR 64
BFR 69
BFR 153
BFR 162
BFR 183

BFR 203
BFR 217
BFR 238
BFR 266

Homologi
Bacillus anthracis str.
Ames
Bacillus anthracis str.
Ames
Bacillus stratosphericus
41KF2a
Bacillus aerius 24K
Bacillus idriensis SMC
4352-2
Pseudomonas
cremoricolorata NBRC
16634
Staphylococcus sciuri
DSM 20345
Pseudomonas parafulva
AJ 2129
Pseudomonas stutzeri
ATCC 17588
Bacillus toyonensis BCT
7112

Identity/
query
cover (%)
99/100

Evalue

Score

No. akses

0.0

1138

NR074453.1

100/100

0.0

2037

NR074453.1

99/100

0.0

2122

NR118441.1

100/100
93/96

0.0
0.0

1652
1266

NR118439.1
NR043268.1

99/100

0.0

1040

NR113855.1

100/100

0.0

2039

NR025520.1

98/100

0.0

1007

NR040859.1

99/100

0.0

1059

NR103934.1

99/100

0.0

760

NR121761.1

Hubungan pohon filogenetik dibuat berdasarkan sekuen partial DNA gen
16S rRNA 10 isolat bakteri filosfer yang dibandingkan dengan database di
GenBank tersebut menunjukkan isolat BFR 162 berkerabat dekat dengan Bacillus
altitudinis strain 41KF2b, BFR 153, Bacillus aerius strain 24K, BFR 69, dan
Bacillus stratosphericus strain SAFR-032. Isolat BFR 64 memiliki kerabat dekat
dengan Bacillus anthracis str. Ames strain Ames, Bacillus thuringiensis Bt407,
Bacillus thuringiensis strain ATCC 10792, Bacillus cereus ATCC 14579, Bacillus
thuringiensis NBRC 101235, BFR 35, BFR 266, dan Bacillus toyonensis strain
BCT-7112. Isolat BFR 203 memiliki kekerabatan yang dekat dengan
Staphylococcus sciuri strain DSM 20345, Staphylococcus lentus strain MAFF
911385, dan Staphylococcus sciuri subsp rodentium strain GTC 844. Isolat BFR
238 berkerabat dekat dengan Pseudomonas stutzeri strain ATCC 17588,
Pseudomonas stutzeri strain DSM 5190, dan Pseudomonas stutzeri strain VKM
B-975. Isolat BFR 183 berkerabat dekat dengan Pseudomonas cremoricolorata
strain NBRC, Pseudomonas parafulva strain AJ2129, Pseudomonas parafulva
strain NBRC 16636, dan Pseudomonas cremoricolorata strain NBRC 16634.
Ketujuh bakteri tersebut berkerabat dekat dengan BFR 217 (Gambar 3).

8

Bacillus altitudinis strain 41KF2b
BFR 162
BFR 153
87
Bacillus aerius strain 24K
71 Bacillus stratosphericus strain 41KF2a
BFR 69
Bacillus pumilus SAFR-032 strain SAFR-032
82
Bacillus pumilus strain ATCC 7061
85
99
Bacillus pumilus strain NRRL NRS-272
Bacillus idriensis strain SMC 4352-2
Bacillus amyloliquefaciens strain BCRC 11601
Bacillus thuringiensis Bt407
80
Bacillus thuringiensis strain ATCC 10792
Bacillus cereus ATCC 14579
BFR 64
Bacillus thuringiensis strain NBRC 101235
100 100 Bacillus toyonensis strain BCT-7112
Bacillus anthracis str. Ames strain Ames
BFR 35
BFR 266
Staphylococcus lentus strain MAFF 911385
BFR 203
100
Staphylococcus sciuri strain DSM 20345
75
Staphylococcus sciuri subsp. rodentium strain GTC 844
Pseudomonas stutzeri strain VKM B-975
100 Pseudomonas stutzeri strain DSM 5190
Pseudomonas stutzeri strain ATCC 17588
BFR 238
100
BFR 217
Pseudomonas koreensis strain Ps 9-14
94 Pseudomonas fulva strain IAM1529
77
BFR 183
83 Pseudomonas cremoricolorata strain NBRC
Pseudomonas parafulva strain AJ 2129
62
Pseudomonas parafulva strain NBRC 16636
Pseudomonas cremoricolorata strain NBRC 16634
Streptomyces nanhaiensis strain SCSIO 01248
0.05

Gambar 3 Pohon filogenetik 10 isolat bakteri filosfer penghasil senyawa
bioaktif anti-Xoo berdasarkan gen 16S rRNA-nya. Konstruksi
pohon filogenetik menggunakan metode Neighbor-Joining dengan
bootstrap 1000x

9
Amplifikasi dan Konstruksi Pohon Filogenetik Domain A dari NRPS
Hasil amplifikasi gen penyandi domain A dengan kondisi reaksi
sebagaimana diuraikan pada bagian metode menunjukkan bahwa hanya empat
isolat yang berhasil teramplifikasi dengan ukuran amplikon ~1000 pb (Gambar 4).
Hasil analisis BLAST-X terhadap sekuen amplikon tersebut menunjukkan
persentase homologi yang berbeda untuk masing-masing isolat seperti
ditunjukkan pada Tabel 3. Isolat BFR 64, BFR 69, dan BFR 153 memiliki
kemiripan sekuen gen peptida non-ribosomal sintetase dengan sekuen gen NRPS
domain A Bacillus, sedangkan gen NRPS domain A dari BFR 183 memiliki
kemiripan dengan gen penyandi peptide sintetase dari Pseudomonas fulva.
Persentase kemiripan dari keempat isolat tersebut berkisar antara 76-98% dengan
query cover antara 83-95%. Tingkat kemiripan dari gen penyandi senyawa
bioaktif yang dihasilkan setiap isolat dapat membentuk suatu hubungan
filogenetik (Gambar 5). Hasil konstruksi pohon filogenetik menunjukkan bahwa
domain A NRPS dari isolat BFR 69 memiliki kekerabatan yang dekat dengan
sekuen partial peptida non-ribosomal sintetase domain adenilation dari Bacillus
safensis, peptide synthetase Bacillus aerophilus, peptide synthetase Bacillus
pumilus, dan surfactin synthetase Bacillus stratosphericus. Isolat BFR 64, BFR
153, dan BFR 183 memiliki jarak yang jauh dari BFR 69.

Gambar 4 Visualisasi amplikon gen NRPS domain A isolat BFR 64 (a), BFR
69 (b), BFR 153 (c), BFR 183 (d), BFR 35 (e), BFR 162 (f), BFR
203 (g), BFR 217 (h), BFR 238 (i), BFR 266 (j), dan Marker 1 kb
ladder (M) pada gel agarosa 1%

10
Tabel 3 Homologi sekuen penyandi gen penyandi domain A dari NRPS
Kode
isolat
BFR
64
BFR
69
BFR
153
BFR
183

Homologi
Non-ribosomal peptide
synthetase (Bacillus
mycoides)
Non-ribosomal peptide
synthetase adenylation
domain (Bacillus safensis)
Non-ribosomal peptide
synthetase adenylation
domain (Bacillus safensis)
Peptide synthetase
(Pseudomonas fulva)

14

93
51

Identity/
query cover
(%)
91/83

E-value

Score

No. Akses

6e-161

462

AHG59391.1

89/95

3e-167

532

AFY62950.1

98/85

4e-139

406

AFY62950.1

76/90

3e-41

202

WP03373709
4.1

74 peptide synthetase Bacillus pumilus
surfactin synthetase Bacillus stratosphericus
99
BFR 69
non-ribosomal peptide synthetase adenyation domain partial Bacillus safensis
96
peptide synthetase Bacillus aerophilus
peptide synthetase partial Bacillus amyloliquefaciens
peptide synthetase Aneurinibacillus tyrosinisolvens
89
nonribosomal peptide synthetase partial Bacillus mycoides
hypothetical protein Bacillus cereus
100
91 hypothetical protein Bacillus anthracis
peptide synthetase Pseudomonas fulva
99 amino acid adenylation domain protein Pseudomonas putida S610
BFR 64
BFR 153
BFR 183

0.5

Gambar 5 Pohon filogenetik isolat bakteri filosfer berdasarkan sekuen asam
amino domain A. Pohon filogenetik dikonstruksi menggunakan
metode Maximum-Likelihood boostrap 1000x
Uji Hemolisis Darah
Sebanyak 10 isolat yang mampu menghambat Xoo, enam isolat di antaranya
ternyata mampu melisiskan sel darah merah (Tabel 4). Aktivitas hemolisis
ditandai dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni (Gambar 6). Enam
isolat termasuk ke dalam kelompok beta hemolisis dan isolat tersebut berpotensi
patogen terhadap manusia dan hewan sehingga keenam isolat tersebut tidak
diikutsertakan untuk uji selanjutnya.

11
Tabel 4 Hasil uji hemolisis bakteri filosfer pada media agar-agar darah
Kode isolat
Uji hemolisis
BFR 35
++
BFR 64
++
BFR 69
+++
BFR 153
BFR 162
+
BFR 183
BFR 203
BFR 217
BFR 238
++++
BFR 266
++++
Ket: +:1-5 mm, ++:6-10 mm, +++: 11-15 mm, ++++: 16-20 mm, - : Tidak menunjukkan
adanya aktivitas

a

b
c

d
e

f

Gambar 6 Uji hemolisis isolat bakteri BFR 35 (a), BFR 64 (b), BFR 69 (c),
BFR 162 (d), BFR 238 (e), dan BFR 266 (f) yang digoreskan pada
media agar-agar darah (umur 48 jam)
Pembahasan
Sepuluh bakteri filosfer anti-Xoo yang memiliki indeks penghambatan
tertinggi hasil penapisan Nurfitriani (2014) diuji kembali antagonisme terhadap
Xoo dengan menggunakan supernatan. Hal ini digunakan untuk melihat
kemampuan bakteri dalam menghasilkan senyawa bioaktif secara ekstraseluler.
Hasil pengujian menunjukkan bahwa sepuluh isolat dapat menghasilkan senyawa
bioaktif anti-Xoo secara ekstraseluler, karena isolat-isolat tersebut menghasilkan
zona bening di sekitar kertas cakram pada uji antagonisme menggunakan
supernatan. Luas zona bening yang dihasilkan oleh setiap isolat dipengaruhi oleh
perbedaan jenis dan jumlah atau kuantitas senyawa bioaktif yang dihasilkan oleh
setiap bakteri filosfer. Menurut Sugita et al. (1998), senyawa bioaktif yang
dihasilkan oleh bakteri meningkat ketika supernatan berumur 48 jam. Produksi
senyawa bioaktif juga dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu suhu, pH, dan
komposisi media. Inkubasi kultur bakteri pada 20 ⁰C dan pH media 6.5 dapat

12
meningkatkan produksi senyawa bioaktif. Mekanisme biosintesis senyawa
bioaktif secara ekstraseluler tidak memerlukan faktor pembawa untuk melintasi
periplasma menuju ke permukaan sel bakteri. Ujung C dan domain β pada lintasan
autotransporter dapat langsung menyisip ke fosfolipid bilayer yang kemudian
membentuk saluran β-barrel secretion (Thanassi dan Hultgren 2000).
Isolat penghasil senyawa bioaktif tersebut diidentifikasi lebih lanjut secara
molekuler berdasarkan gen 16S rRNA-nya. Sekuen 16S rRNA digunakan dalam
identifikasi bakteri, karena mengandung daerah yang sangat stabil, jarang sekali
mengalami transfer gen secara lateral dan mengalami perubahan yang sangat
lambat selama evolusi (Atlas dan Bartha 1997; Joung dan Cote 2001).
Berdasarkan hasil analisis BLAST-N, tujuh isolat bakteri filosfer memiliki
kemiripan dengan bakteri Gram positif dan tiga isolat memiliki kemiripan dengan
bakteri Gram negatif. Enam isolat yang memiliki kemiripan dengan bakteri Gram
positif diidentifikasi sebagai anggota dari genus Bacillus yaitu Bacillus anthracis,
B. stratosphericus, B. aerius, B. idriensis, dan B. toyonensis, serta 1 isolat diidentifikasi
sebagai genus Staphylococcus yaitu Staphylococcus sciuri. Tiga isolat yang
memiliki kemiripan dengan bakteri Gram negatif diidentifikasi sebagai genus
Pseudomonas. Hal ini juga telah dilaporkan pada penelitian Krishanti et al. (2015)
bahwa bakteri filosfer yang dapat menghambat pertumbuhan Xoo dari bakteri
Gram positif diidentifikasi sebagai genus Bacillus yaitu Bacillus aerophilus, B.
stratosphericus, B. pumilus, dan B. cereus. Bacillus aerius dan B. stratosphericus
adalah bakteri yang dapat tumbuh pada suhu 8-37 ⁰C, pH 6-10, resisten terhadap
radiasi sinar UV, dan toleran terhadap NaCl hingga konsentrasi 11.6% untuk B.
aerius sedangkan B. stratosphericus toleran terhadap NaCl sampai konsentrasi
17.4% (Shivaji et al. 2006). Bacillus adalah salah satu genus bakteri yang aktif
menghasilkan berbagai senyawa metabolit, diantaranya antimikrob, antifungi, atau
senyawa toksik lainya (Zheng et al. 2005). Diffisidin dan basilisin adalah dua
contoh senyawa bioaktif antimikrob yang dihasilkan oleh Bacillus
amyloliquefaciens FZB42 dan diketahui mampu menghambat X. oryzae (Wu et al.
2015).
Hasil perbandingan sekuen partial gen 16S rRNA isolat bakteri filosfer
terhadap sekuen gen 16S rRNA bakteri yang berkerabat dekat dapat dikonstruksi
menjadi pohon filogenetik dengan metode statistika Neighbor-joining. Konstruksi
pohon filogenetik yang dihasilkan menunjukkan isolat BFR 35, BFR 64, BFR 69,
BFR 162, BFR 153, BFR 183, BFR 203, dan BFR 266 berada pada kluster yang
sama yaitu bakteri Gram positif dari genus Bacillus dan Staphylococcus. Isolat
BFR 183, BFR 238, dan BFR 217 berada pada kluster II yang merupakan kluster
dari bakteri Gram negatif yaitu genus Pseudomonas. Streptomyces yang dikenal
sebagai bakteri penghasil berbagai senyawa antimikrob dan dipilih sebagai
outgroup membentuk kluster tersendiri dan memiliki jarak genetik yang terpisah
jauh dengan dua kluster di atas (Gambar 3). Pohon filogenetik tersebut konsisten
dengan hasil analisis BLAST sekuen parsial gen 16S rRNA.
Bakteri yang berpotensi menghasilkan senyawa bioaktif memiliki
karakteristik molekuler salah satunya adalah adanya gen penyandi enzim peptida
non-ribosomal sintetase (NRPS). NRPS merupakan enzim yang berperan dalam
sintesis senyawa bioaktif seperti antibiotik, toksin, siderofor, dan
immunosuppressant. NRPS disebut sebagai enzim multifungsional karena
memiliki modul-modul yang diperlukan untuk sintesis suatu senyawa. Ukuran

13
enzim ini antara 200 sampai 2000 kDa (Cane dan Walsh 1999). Domain A
digunakan dalam menentukan gen NRPS, karena domain adenilase (A) adalah
domain yang ada di setiap modul dan memperlihatkan derajat konservasi yang
tinggi di antara domain lainnya (Moffit dan Neilan 2003). Sebanyak 10 genom
isolat yang dideteksi keberadaan gen penyandi domain A NRPS-nya, hanya empat
isolat yang menunjukkan adanya pita DNA berukuran ~1000 pb (Gambar 4). Hal
ini mengindikasikan bahwa empat isolat tersebut (BFR 64, BFR 69, BFR 153, dan
BFR 183) memiliki gen penyandi domain A yang diduga berperan dalam
biosintesis senyawa bioaktif anti-Xoo yang diekskresikannya. Suhu annealing
yang digunakan pada amplifikasi gen tersebut adalah 50 ⁰C. Keberhasilan
amplifikasi gen dapat dipengaruhi oleh konsentrasi DNA yang digunakan dan
suhu penempelan primer (annealing). Suhu penempelan primer (annealing) yang
terlalu tinggi menyebabkan primer tidak menempel pada sisi DNA cetakan
(template) atau sebaliknya suhu yang terlalu rendah menyebabkan primer
menempel pada sisi lain DNA cetakan yang bukan sisi homolognya (Rybikcy
2001).
Hasil analisis BLAST domain A dari NRPS menunjukkan bahwa BFR 64
memiliki kemiripan sebesar 91% dengan enzim peptida non-ribosomal sintetase
dari Bacillus mycoides, sedangkan BFR 69 dan BFR 153 memiliki kemiripan
dengan enzim peptida non-ribosomal adenilat sintetase dari Bacillus safensis
berturut-turut sebesar 89% dan 98% untuk kedua isolat tersebut. Domain A NRPS
BFR 183 memiliki kemiripan yang rendah (76% dengan query cover 90%) dengan
enzim peptida sintetase Pseudomonas fulva. Hal ini diduga bahwa domain A
NRPS BFR 183 tersebut merupakan enzim dengan urutan sekuen baru sehingga
ketika sekuennya disejajarkan dengan data GenBank, nilai kemiripannya rendah.
Analisis domain A NRPS dari 4 isolat bakteri filosfer (BFR 64, BFR 69, BFR 153
dan BFR 183) tersebut menunjukkan hasil yang sesuai dengan analisis gen 16S
rRNA-nya yaitu BFR 64, BFR 69, dan BFR 153 memiliki kemiripan dengan gen
penyandi enzim yang berasal dari genus Bacillus, sedangkan BFR 183 berasal dari
genus Pseudomonas. Konstruksi pohon filogenetik sekuen domain A dianalisis
menggunakan metode statistika maximum likelihood dengan bootstrap 1000
ulangan. Hasil konstruksi pohon filogenetik model jones-taylor-thorton dengan
beberapa sekuen referensi terdekat hasil analisis BLAST menunjukkan bahwa
pembentukan pohon filogenetik antara BFR 69 dengan sekuen referensi peptida
non-ribosomal sintetase terjadi sebanyak 740 kali, sedangkan sekuen domain A
BFR 64, BFR 153, BFR 183 berkerabat jauh dari BFR 69 (Gambar 6). Peptida
sintetase merupakan protein multifungsional non-ribosom yang mensintesis
peptida dengan berat molekul kecil yang berasal dari mikroba. Antibiotik dari
genus Bacillus umumnya berupa polipeptida yang disintesis oleh enzim peptida
non-ribosomal sintetase. Salah satu contohnya adalah surfaktin (Edward dan
Demain 1977; Nakano et al. 1988).
Isolat bakteri filosfer yang telah diuji secara molekuler berdasarkan gen
16S rRNA dan gen penyandi protein enzimnya kemudian diuji aktivitas
hemolitiknya pada media agar-agar darah. Uji hemolisis darah ini dilakukan untuk
menguji bahwa isolat bakteri filosfer yang diperoleh tersebut aman bagi manusia
dan hewan mamalia jika diaplikasikan sebagai agens biokontrol (biobakterisida).
Ada beberapa tipe bakteri dalam melisiskan sel darah merah dan hemoglobin yaitu
beta hemolisis, alpha hemolisis, dan gamma hemolisis. Hasil uji menunjukkan 6

14
isolat (BFR 35, BFR 64, BFR 69, BFR 162, BFR 238, dan BFR 266) termasuk
kelompok bakteri yang bersifat beta hemolitik karena terbentuk zona bening di
sekitar koloninya. Zona bening ini disebabkan oleh aktivitas enzim hemolisin
yang melisiskan sel darah merah dan hemoglobin secara keseluruhan. Contoh
bakteri yang memiliki karakteristik beta hemolitik adalah Streptococcus pyogenes
dan beberapa strain dari Staphylococcus aureus. Sedangkan tipe alpha hemolitik
hanya melisiskan sebagian sel darah merah dan meninggalkan warna hijau di
sekitar pertumbuhan bakteri. Warna hijau yang dihasilkan ini berasal dari
biliverdin yang merupakan produk sampingan dari pemecahan hemoglobin
(Madigan et al. 2006). Berbeda dengan 6 isolat sebelumnya, pertumbuhan isolat
BFR 153, BFR 183, BFR 203, dan BFR 217 pada agar-agar darah tidak
menghasilkan zona bening (hemolitik) di sekitar koloninya. Hal ini menunjukkan
bahwa keempat isolat tersebut tidak melisiskan sel darah merah sehingga aman
untuk dijadikan sebagai kandidat agens biokontrol.

SIMPULAN
Simpulan
Sepuluh isolat bakteri filosfer (BFR 35, BFR 64, BFR 69, BFR 153, BFR
162, BFR 183, BFR 203, BFR 217, BFR 238, dan BFR 266) mampu
menghasilkan senyawa bioaktif anti-Xoo secara in vitro. Berdasarkan gen
penyandi 16S rRNA, isolat BFR 35 dan BFR 64 memiliki kemiripan dengan
Bacillus anthracis, BFR 69 memiliki kemiripan dengan Bacillus stratosphericus
(99% dari 100%), BFR 153 memiliki kemiripan dengan Bacillus aerius (100%
dari 100%), BFR 162 memiliki kemiripan dengan Bacillus idriensis (93% dari
96%), BFR 183 memiliki kemiripan dengan Pseudomonas cremoricolorata (99%
dari 100%), BFR 203 memiliki kemiripan dengan Staphylococcus sciuri (100%
dari 100%), BFR 217 memiliki kemiripan dengan Pseudomonas parafulva (98%
dari 100%), BFR 238 memiliki kemiripan dengan Pseudomonas stutzeri (99%
dari 100%), dan BFR 266 memiliki kemiripan dengan Bacillus toyonensis (99%
dari 100%). Isolat BFR 64, BFR 69, BFR 153, dan BFR 183 terdeteksi memiliki
gen penyandi domain A NRPS. Isolat-isolat BFR 153, BFR 183, BFR 203, dan
BFR 217 merupakan isolat yang bersifat non-hemolitik sehingga aman untuk
dikembangkan sebagai kandidat agens biokontrol.

DAFTAR PUSTAKA
Atlas RM, Bartha R. 1997. Microbial Ecology. Fundamental and Application.
New York (US): An Imprint of Addison Wesley Longman, Inc.
Cane DE, Walsh CT, Khosla C. 1998. Harnessing the biosynthetic code:
combinations, permutations, and mutations. Science’s Compass. 282:63-68.
Cane DE, Walsh CT. 1999. This parallel and convergent universes of poliketide
synthetase and nonribosomal peptide synthetase. Chem Biol. 6(12):319-325.

15
Crosa JH, Walsh CT. 2002. Genetics and assembly line enzymology of
siderophore biosynthesis in bacteria. Microbiol Mol Biol Rev. 66:223-249.
Edward K, Demain AL. 1977. The peptide antibiotics of Bacillus: chemistry,
biogenesis and possible functions. Bacteriol Rev. 41(2):449-474.
Hastuti RD, Lestari Y, Suwanto A, Saraswati R. 2012. Endophytic Streptomyces
spp. as biocontrol agents of rice bacterial leaf blight pathogen
(Xanthomonas oryzae pv. oryzae). Hayati J Biosci. 19(4):155-162.
Joung KB, Cote JC. 2001. Phylogenetic analysis of Bacillus thuringiensis
serovars based on 16S rRNA gene restriction fragment length
polymorphisms. App Microbiol. 90:115-122.
Kadir TS. 2007. Influence of Races III, IV and VIII of Xanthomonas oryzae
pv.oryzae to Production of Double Haploid Population Crosses IR-64 and
Wild Species Oryza rufipogon. Proceedings The Third Asian Conference on
Plant Phatology. Yogyakarta (ID): Gajah Mada University.
[Kementan] Kementerian Pertanian. 2014. Analisis Data Hulu Sektor Pertanian.
Jakarta (ID): Kementerian Pertanian.
Krishanti NPRA, Wahyudi AT, Nawangsih AA. 2015. Non-pathogenic
phyllosphere bacteria producing bioactive compounds as biological control
of Xanthomonas oryzae pv oryzae. Int J Pharm Bio Sci. 6(1):801-810.
Lisboa MP, Bonato D, Bizani D, Henriques JAP, Brandelli A. 2006.
Characterization of bakteriosin-like substance produced by Bacillus
amyloliquefaciens isolated from the Brazilian Atlantic forest. Int Microbial.
9:111-118.
Madigan MT, Martinko JM, Dunlap PV, Clark DP. 2006. Brock Biology of
Microorganisms.12th ed. San Francisco (US): Pearson Education.
Marchesi JR, Sato T, Weightman AJ, Martin TA, Fry JC, Hiom SJ, Wade WG.
1998. Design and evaluation of useful bacterium-specific PCR primers that
amplify genes coding for bacterial 16S rRNA. App Envirol Microbial.
64(2):795-799.
Mew TW, Vera CCM. 1979. Variability of Xanthomonas oryzae: specificity in
infection of rice differentials. Phytopathology. 69:152.
Mew TW. 1987. Current status and future prospects of research on bacterial blight
of rice. Annu Rev Phytopathol. 25:359-382.
Moffitt MC, Neilan BA. 2003. Evolutionary affiliations within the superfamily of
ketosynthases reflect complex pathway associations. J Mol Evol. 56:446457.
Nakano MM, Marahiel MA, Zuber P. 1988. Identification of genetic locus
required for biosynthesis of the lipopeptide antibiotic surfactin in Bacillus
subtilis. J Bacteriol. 170(12):56-62.
Nurfitriani R. 2014. Penapisan bakteri filosfer penghasil senyawa bioaktif anti
Xanthomonas oryzae pv. oryzae penyebab penyakit hawar daun bakteri pada
padi [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Ou SH. 1985. Rice Disease. England (GB): Commonwealth Agricultural Bureaux.
Rybicky EP. 2001. PCR Primer Design and Reaction Optimisation: Molecular
Biology Techniques Manual. 3rd ed. South Africa (tZA): University of Cape
Town.
Sambrook W, Russel DW. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd
ed. New York (US): Gold Spring Harbor Laboratory.

16
Schirmer A, Gadkari R, Reeve CD, Ibrahim F, DeLong EF, Hutchison CR. 2005.
Metagenomics analysis reveals diverse polyketide synthase gene clusters in
microorganisms associated with the marine sponge Discodermia dissoluta.
Appl Environ Microbiol. 71(8):4840-4849.
Schwarzer D, Finking R, Marahiel MA. 2003. Nonribosomal peptides: from genes
to products. Nat Prod Rep. 20:275-287.
Shivaji S, Chaturvedi P, Suresh K, Reddy GSN, Dutt CBS, Wainwright M,
Narlikar JV, Bhargava PM. 2006. Bacillus aerius sp. nov., Bacillus
aerophilus sp. nov., Bacillus stratosphericus sp. nov. and Bacillus
altitudinis sp. nov., isolated from cryogenic tubes used for collecting air
samples from high altitudes. J Syst Evol Microbiol. 56:1465-1473.
Sugita H, Hirose Y, Matsuo R, Deguchi Y. 1998. Production of the antibacterial
substance by Bacillus sp. strain NM 12, an intestinal bacterium of Japanese
coastal fish. Aquaculture. 165:269-280.
Suparyono, Sudir, Suprihanto. 2004. Pathotype profil of Xanthomonas oryzae
pv.oryzae isolates from the rice ecosystem in Java. Indones J Agr ScI. 5:6369.
Thanassi DG, Hultgren SJ. 2000. Multiple pathways allow protein secretion
across the bacterial outer membrane. Curr Opin Cell Biol. 12:420-430.
Wu L, Wu H, Chen L, Yu X, Borriss R, Gao X. 2015. Difficidin and bacilysin
from Bacillus amyloliquefaciens FZB42 have antibacterial activity against
Xanthomonas oryzae rice pathogens. Sci Rep. 5:12975.
Zheng L, Chen H, Han X, Yan X. 2005. Antimicrobial screening and active
compound isolation from marine bacterium NJ6-3-1 associated with the
sponge Hymeniacidon perleve. World J Microbiol Biotechnol. 21:201-206.

17

LAMPIRAN

Lampiran 1 Sekuen gen 16S rRNA
 BFR 35
ATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCA
TAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACAT
TTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTA
TGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACC
AAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGG
GACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATC
TTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATG
AAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTA
GTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCT
AACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCC
GGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATG
TGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGAC
TTGAGTGCAGAATAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGC
G
 BFR 64
CTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGG
ATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTG
TCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACG
GCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCC
ACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA
GGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTG
AGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACA
AGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGC
CACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAG
CGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAA
GTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACT
GGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGG
TGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTT
CTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAG
GATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGT
TAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCC
GCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGG
GGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGA
AGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGC
TTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCT
CGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGA
TCTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGAC
AAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATG
ACCTGGGCT

18
 BFR 69
ATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAG
ACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAGTTCCTTGA
ACCGCATGGTTCAAGGATGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTACAGAT
GGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGC
GACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTG
AGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCG
CAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGT
TTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCAAGAGTA
ACTGCTTGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTAC
GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATT
ATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAG
CCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAAACTTGAGT
GCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGA
GATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTG
ACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTG
GTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGC
CCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACG
GTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCG
GTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGT
CTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCTTCGGGGAC
AGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGT
TGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCA
TTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGG
TGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACCACC
GTGCTACAAT
 BFR 153
ATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAG
ACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAGTTCCTTGA
ACCGCATGGTTCAAGGATGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTACAGAT
GGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGC
GACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTG
AGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCG
CAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGT
TTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCAAGAGTA
ACTGCTTGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTAC
GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATT
ATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAG
CCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAAACTTGAGT
GCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGA
GATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTG
ACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTG
GTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGC
CCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACG
GTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCG

19
GTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGT
CTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCTTCGGGGAC
AGAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGGGAGATGT
TGGGTTAAGTCCCCCCACCAAGCGCAACCCTTTGATCTTAGTTGCCAG
CATTCAGTTGGGGCACTCTAAGGTGACTGCCCGGTGACAAACC
 BFR 162
TAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACC
GGAGCTAATACCGGATAGTTCCTTGAACCGCATGGTTCAAGGATGAAA
GACGGTTTCGGCTGTCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAG
TTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGA
GAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGG
AGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTT
GTTAGGGAAGAACAAGTGCAAGAGTAACTGCTTGCACCTTGACGGTAC
CTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATA
CGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCA
GGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCACCGGGGAGGG
TCATTGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGTAATTC
CACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGCAGGAACACCAGTGGC
GAAGCGACTCTCTGGTCTGTACTGACGCTGAGGGCGAAGCGTGTGGAG
CGAACAGGATAGATCCCTGGTAGTCACGCCGCAACGATGAGGCTAAG
TGTTAGGGGCTTCCGCCCATAGTGCTGCGCTACGTATAAGCACTCCGC
CTGAGAGTCTGGCGCAGACTGAACTCAAGGATTGACGGGGTCGCCAA
GCGTTGAGATGTGTTTATTCGAGCACGCGTAAACTTACATGTCTGCATC
TCTGAAACCTAGAATAGGATTTCCTTC
 BFR 183
CGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAA
CGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGC
AGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAG
CTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTC
TGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCT
ACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGAT
CCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTT
TAAGTTGGGAGGAAGGGTTGTAGATTAATACTCTGCAATTTTGACGTT
ACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT
ACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCG
TAGGTGGTTTGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGA
ACTGCATCCAAAACTGGNAAGCTAGAGTACGGTAGAGGGGGTGG
 BFR 203
TGAGTAACACGTGGGTAACCTACCTATAAGACTGGGATAACTCCGGGA
AACCGGGGCTAATACCGGATAATATTTTGAACCGCATGGTTCAATAGT
GAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTATAGATGGACCCGCGCCGTATTAG
CTAGTTGGTAAGGTAACGG