AKTIVITAS ANTIMIKROBA CAMPURAN METABOLIT Lb.

5. AKTIVITAS ANTIMIKROBA CAMPURAN METABOLIT Lb.

plantarum kik-MAG MINYAK KELAPA TERHADAP MIKROBA PATOGEN PANGAN ABSTRAK Penelitian ini mengkaji aktivitas antimikroba campuran metabolit bakteri Lb. plantarum kik dan monoasilgliserol Lb. plantarum kik-MAG terhadap empat jenis bakteri patogen, yaitu L. monocytogenes, B. cereus, Salmonella Typhimurium, E. coli dan kapang Aspergillus flavus. Daya hambat campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa terhadap pertumbuhan ke empat jenis bakteri patogen diuji dengan metode difusi sumur, sedangkan untuk mengetahui nilai MIC dari campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa digunakan metode kontak dalam medium broth. Hasil penelitian menunjukkan bahwa campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa mampu menghambat pertumbuhan semua jenis bakteri uji dengan diameter penghambatan di atas 22,2 mm. Diameter penghambatan tertinggi 30,7mm ditemukan pada L. monocytogenes, sedangkan diameter penghambatan terendah pada E. coli 22,2 mm. Nilai MIC campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa berbeda-beda untuk setiap jenis bakteri patogen. Nilai MIC campuran metabolit Lb. plantarum kik – MAG minyak kelapa berkisar antara 1,2-3 vv. E. coli adalah bakteri yang paling resisten dibandingkan bakteri lainnya, dengan nilai MIC sebesar 3, sedangkan bakteri L. monocytogenes adalah bakteri yang terpeka dengan nilai MIC sebesar 1,2 . Aktivitas antikapang dari campuran metabolit Lb. plantarum kik dan MAG secara tunggal menyebabkan penurunan berat miselia kapang sebesar 0,35 -1,54 mgml, sedangkan penggunaan campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG menyebabkan penurunan lebih besar , yaitu 0,82-2,75 mgml pada penggunaan 5- 20. PENDAHULUAN Lactobacillus plantarum merupakan bakteri asam laktat BAL dari famili Lactobacillaceae yang berbentuk batang dan pada umumnya berukuran tunggal atau membentuk rantai pendek, bersifat anaerob fakultatif, dengan suhu pertumbuhan minimum 10 o C dan maksimum 40 o C Surono 2004. Pembentukan asam yang tinggi dalam metabolit Lb. Plantarum, baik dalam bentuk tunggal maupun campuran dengan metabolit BAL lain, telah diketahui dapat menghambat pertumbuhan bakteri perusak dan bakteri patogen atau bahkan tidak dapat bertahan hidup. Untuk lebih meningkatkan aktivitas antimikroba dari metabolit Lb. Plantarum yang diketahui memiliki kandungan asam yang relatif tinggi yang dapat mempengaruhi cita rasa dari produk, maka perlu dilakukan penggabungan dengan bahan antibakteri lain seperti MAG. Dengan penggabungan ini diharapkan dapat mereduksi rasa asam dari bahan antibakteri tersebut, dan sekaligus memperluas penggunaannya sebagai antibakteri bahan pangan. Monoasilgliserol MAG dari minyak kelapa selain berfungsi sebagai pengemulsi, juga dapat berfungsi sebagai antimikroba. Sifat ini tidak dimiliki oleh MAG dari minyak nabati lain yang mengandung asam lemak rantai panjang jenuh dan tidak jenuh Wang et al. 1993; Lee et al. 2002; Mappiratu et al. 2002. Perbedaan tersebut disebabkan oleh jenis asam lemak minyak kelapa yang didominasi oleh asam lemak jenuh rantai pendek dan menengah C8:0 sampai C14:0. MAG minyak kelapa dalam bahan pangan menunjukkan efek sinergi dengan asam-asam organik yang telah umum digunakan pada bahan pangan, seperti asam atau garam laktat, asam atau garam sorbat, dan asam atau garam sitrat Davidson dan Branen 1994. Penggunaan campuran asam laurat dan kalsium laktat dapat meningkatkan waktu simpan kamaboko pasta ikan dari enam hari menjadi 20 hari pada penyimpanan suhu rendah. Selain itu, penggunaan asam sitrat 0,2 dan asam laurat 0,025 pada daging ayam tanpa tulang dan sosis ayam dapat memperpanjang masa simpan produk tersebut masing- masing 5, 7, dan 8 hari di suhu ruang Baker et al. 1982. Campuran monolaurin dan asam organik selain memiliki aktivitas antibakteri, juga dapat menghambat aktivitas kapang yang bersifat patogen pada bahan pangan. Lb. plantarum sa 28k dilaporkan mampu menghambat pertumbuhan A. flavus dan R. oligosporus Hidayat 2001, dan campuran Lb. plantarum kik dengan garam 7,5 mampu menghambat pertumbuhan A. flavus sebesar 3 unit log dari jumlah awal 10 6 CFUml setelah 3 jam perendaman Situngkir 2005. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mempelajari aktivitas antibakteri dan antikapang dari metabolit yang dihasilkan oleh Lb.plantarum kik dengan MAG minyak kelapa terhadap beberapa bakteri dan kapang patogen, seperti L. monocytogenes, B. cereus, S. Typhimurium, E. coli dan kapang Aspergillus flavus. METODOLOGI Bahan dan Alat Isolat BAL yang digunakan adalah Lb. plantarum kik isolat kecap ikan yang merupakan hasil seleksi tahapan sebelumnya. MAG minyak kelapa diperoleh dari Laboratorium Agroindustri Fakultas Pertanian Universitas Tadulako. Bakteri uji yang digunakan adalah L. monocytogenes FNCC 0156, Bacillus aureus FNCC 057, S. Typhimurium FNCC 0734 yang diperoleh dari Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi UGM dan E. coli ATCC 25922 diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Pangan Seafast Southeast Asian Food and agriculture Science and Technology Center IPB. Semua media mikrobiologi diperoleh dari Oxoid Ltd, sedangkan peralatan berupa inkubator, sentrifus, oven, dan alat-alat gelas diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia Pangan IPB. Persiapan kultur bakteri uji Sebanyak satu ose bakteri uji dari stok agar miring diinokulasikan ke dalam medium nutrien broth NB dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Sebanyak 1 ml kultur bakteri ditambahkan ke dalam 9 ml media NB dan diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37 o C. Kultur bakteri uji 10 6 CFUml digunakan dalam uji antimikroba dari campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa. Produksi metabolit bakteri asam laktat Produksi metabolit BAL dipersiapkan secara bertahap dengan mengikuti metode Jenie et al. 2000 sebagai berikut. Kultur Lb. plantarum kik sebanyak 1 ml diambil dari stok masing- masing dan diinokulasikan ke dalam 9 ml MRS Broth, diinkubasi pada suhu 37 o C selama 2 hari. Sebanyak 4 vv kultur Lb. plantarum kik tersebut diinokulasikan ke dalam media steril MRSB modifikasi dengan penambahan 2 glukosa, 2 ekstrak khamir, dan 1 tripton, selanjutnya diinkubasi selama 2 hari pada suhu 37 o C. Produk fermentasi dipisahkan dari masa sel dengan cara sentrifus pada 10.000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang terbentuk dipisahkan dari endapan menggunakan kertas saring whatman ukuran 0.22 µm, dalam proses penyaringan larutan diambil dan dicampur dengan MAG minyak kelapa dengan perbandingan 5:3 vv yang merupakan rasio terbaik dari hasil penelitian sebelumnya. Selanjutnya campuran yang dihasilkan diuji aktivitasnya terhadap beberapa mikroba uji dengan menggunakan metode difusi sumur dan penentuan nilai MIC dari beberapa jenis bakteri uji. Aktivitas antimikroba metabolit Lb. plantarum kik-MAG Minyak Kelapa terhadap beberapa bakteri patogen Kultur yang diambil dari persiapan bakteri uji dihomogenkan dengan vorteks lalu diambil sebanyak 25 µ l, dimasukkan ke dalam erlenmeyer yang berisi 25 ml media agar cair steril, dikocok merata lalu dituang ke dalam cawan petri steril dan dibiarkan sampai membeku, selanjutnya dibuat lubang sumur dengan diameter sekitar 6 mm menggunakan pipa kapiler, yang sebelumnya terlebih dahulu disterilkan. Campuran metabolit BAL-MAG minyak kelapa dengan rasio 5:3 vv yang akan diujikan diambil sebanyak 60 µ l, kemudian dimasukkan dalam sumur dan dibiarkan berdifusi pada suhu dingin selama 120 menit 2 jam. Selanjutnya cawan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. Areal bening yang menunjukkan daerah hambat di sekitar sumur diukur mulai dari tepi sumur menggunakan jangka sorong. Penentuan MIC untuk beberapa bakteri patogen Minimum Inhibitory Concentration MIC didefenisikan sebagai konsentrasi terkecil dari senyawa antimikroba yang dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme pada periode inkubasi tertentu. Penentuan MIC dapat dilakukan dengan metode difusi sumur atau dengan metode pengenceran broth. Pada penelitian ini penentuan MIC dilakukan dengan metode pengenceran yang mengacu pada metode Kubo et al. 1995 dengan beberapa deret pengenceran dalam tabung yang berisi nutrien Broth NB. Ke dalam masing- masing tabung serial pengenceran diinokulasikan bakteri uji yang berjumlah 10 6 CFUml. Kemudian ditambahkan campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa 5:3 pada berbagai konsentrasi secara aseptis. Selanjutnya diinkubasi dalam shaker goyang dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 37 o C, kecuali untuk L. monocytogenes dilakukan pada suhu ruang selama 24 jam. Nilai MIC dinyatakan sebagai konsentrasi terendah yang dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme sebesar 90. Persiapan spora kapang uji Kim et al. 2000 Kultur murni A. flavus disegarkan dengan cara menggores kembali kultur murni tersebut pada medium PDA, kemudian diinkubasi pada suhu ruang 28 o C selama 7 hari. Suspensi spora dibuat dengan menambahkan larutan garam fisiologis yang mengandung 0,5 Tween 80 ke dalam agar miring. Suspensi spora kapang dihitung dengan menggunakan hemasitometer kemudian diatur konsentrasinya menjadi 10 6 CFU ml dan digunakan untuk uji selanjutnya. Aktivitas metabolit Lb. plantarum kik-MAG terhadap berat miselia A. flavus Uji aktivitas antikapang campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG terhadap A. flavus menggunakan metode kontak. Potensi anti kapang campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG terhadap A. flavus pada metode ini ditunjukkan dengan berat kering miselia setelah inkubasi 48 jam pada suhu kamar. Semakin sedikit miselia yang dihasilkan kapang, berarti semakin besar aktivitas penghambatan dari campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa yang ditambahkan. Hal ini disebabkan miselium merupakan kumpulan hifa yang terbentuk dari germinasi spora kapang, sehingga dapat digunakan sebagai parameter pertumbuhan kapang Gourama dan Bullerman 1995. Suspensi spora kapang dengan konsentrasi 10 6 CFUml diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam 25 ml media PDB steril secara aseptik. Kemudian dimasukkan campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa pada berbagai konsentrasi 0, 5, 10, 15, dan 20, dan diinkubasi pada inkubator bergoyang agitasi 100 rpm pada suhu ruang selama 48 jam. Masa sel kapang yang tumbuh setelah 48 jam dipisahkan dengan penyaringan vakum menggunakan corong Buchner, kemudian dikeringkan dalam oven bersuhu 100 o C sampai beratnya tetap. Sebagai kontrol adalah perlakuan tanpa penambahan metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa. Masa sel kontrol – masa sel metabolit BAL-MAG Reduksi masa sel = Masa sel kontrol HASIL DAN PEMBAHASAN Aktivitas campuran metabolit BAL-MAG terhadap beberapa bakteri patogen Hasil pengukuran diameter penghambatan yang tertinggi sampai ke yang terendah ditemukan berturut-turut pada L. monocytogenes, B. cereus, S. Typhimurium dan E. coli masing- masing sebesar 30,7 mm, 28,2 mm, 22,1 mm dan 20,2 mm. Campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG memberikan pengaruh yang berbeda nyata P0,01 terhadap masing- masing bakteri uji. Zona penghambatan L. monocytogenes dan B. cereus tidak berbeda nyata , demikian pula antara S. Typhimurium dan E. coli. Aktivitas antibakteri metabolit Lb. plantarum kik-MAG lebih kuat terhadap bakteri Gram positif L. monocytogenes dan B. cereus dibandingkan dengan Gram negatif S. Typhimurium dan E. coli yang ditandai dengan tingginya diameter penghambatan pada L. monocytogenes dan B. cereus dibanding S. Typhimurium dan E. coli Gambar 5.1 dan Lampiran 5. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa dapat menghambat pertumbuhan semua jenis bakteri uji yang meliputi bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Hal ini disebabkan karena komponen yang ada pada campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG mampu membunuh semua jenis mikroba atau dengan kata lain komponen yang ada pada campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG memiliki spektrum penghambatan yang luas. Dari hasil analisis asam-asam lemak dalam campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG dengan menggunakan gas kromatografi Tabel 5.1 diketahui bahwa kandungan asam lemak jenuh rantai pendek dan menengah sebesar 86,8 dan jumlah terbesar didominasi oleh asam laurat. Hasil analisis kandungan asam organik dari metabolit Lb. plantarum kik dengan HPLC menunjukkan bahwa asam laktat terdapat dalam jumlah besar, sedangkan asam asetat, propionat, dan sitrat dalam jumlah kecil Tabel 4.1. Gambar 5.1. Aktivitas antibakteri campuran metabolit Lb.plantarum kik-MAG terhadap beberapa bakteri patogen Keberadaan asam lemak maupun asam-asam organik dalam campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG ikut memperkuat sifat antibakteri campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa. Kedua senyawa tersebut dapat bekerja secara sinergi dalam menghambat pertumbuhan bakteri dan pada akhirnya kematian bakteri dipercepat. Asam-asam organik seperti asam laktat, sitrat, propionat maupun asam-asam organik lainnya yang terdapat dalam campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa telah dilaporkan oleh beberapa peneliti mempunyai aktivitas antibakteri yang cukup besar, selain itu peranan asam lemak dalam campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa juga berperan untuk menghambat pertumbuhan bakteri uji. Hal ini terbukti dari hasil penelitian Wang et al. 1993; Mappiratu 1999, Mappiratu et al. 2002, August 2000 yang menemukan adanya penghambatan terhadap bakteri Gram positif dan Gram negatif oleh asam lemak seperti kaprilin, kaprat, laurat, maupun meristin yang diketahui asam-asam lemak ini banyak ditemukan dalam MAG dari minyak kelapa. Sementara Indriyati 2003 menemukan efek penghambatan dari MAG minyak kelapa hanya terhadap bakteri Gram positif sedangkan pada gram negatif tidak ada penghambatan. 30.66 28.25 22.12 20.2 5 10 15 20 25 30 35 Diameter penghambatan mm L.m on oc yto ge ne s B. ce reu s S. T yp him uri um E. coli Jenis bakteri uji Tabel 5.1. Kandungan asam-asam lemak pada campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa Jenis asam lemak Berat molekul Komposisi Asam lemak MAG minyak kelapa Campuran Metabolit Lb.plantarum kik-MAG minyak kelapa Kaprilat C8:0 Kaprat C10:0 Laurat C12:0 Meristat C14:0 Palmitat C16:0 Stearat C18:0 Oleat C18:1 Linoleat C18:2 144 172 200 228 258 284 282 280 7,50 9,20 49,90 17,66 9,3 2,14 4,30 0,00 9, 89 10,71 45,42 18,24 9,90 2,00 3,84 0,00 Menurut Lee et al. 2002 ester MAG dalam bentuk monolaurin, monokaprilin dan monokaprin memiliki daya antibakteri, terutama terhadap S. aureus, B. cereus dan B. subtilis. Mappiratu 1999 juga menemukan hal yang sama, yaitu aktivitas antibakteri MAG terhadap S. aureus, B. cereus dan V. parahaemoliticus tertinggi diperoleh pada waktu reaksi 96 jam dengan jumlah asam lemak jenuh rantai pendek dan menengah tertinggi dalam MAG minyak kelapa. Daya hambat campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa lebih kuat terhadap bakteri Gram positif , yaitu 30,66 mm untuk L. monocytogenes dan 28,25 mm untuk B. cereus dibandingkan dengan bakteri Gram negatif 22,12 mm untuk S. typhimurium dan 20,2 mm untuk E. coli. Menurut Elgayyar et al. 2000, jika senyawa memiliki zona hambat termasuk diameter sumur lebih besar atau sama dengan = 28 mm menunjukkan penghambatan yang kuat, jika = 28 – 16 mm menunjukkan penghambatan sedang, dan jika 16 sampai 10 mm menunjukkan penghambatan kecil. Perbedaan daya hambat ini disebabkan oleh struktur dinding sel bakteri. Bakteri Gram positif hanya mempunyai satu lapisan membran yang mengandung peptidoglikan, sedangkan bakteri Gram negatif mempunyai membran dalam dan membran luar. Lapisan membran luar disebut juga Outer Wall Layer. Lapisan ini mengandung fosfolipid, lipopolisakarida dan lipoprotein. Lipopolisakarida dan peptidoglikan merupakan saringan untuk berbagai senyawa antibakteri seperti bakteriosin, enzim, maupun senyawa yang bersifat non polar Alakomi et al. 2000. Senyawa antibakteri yang terkandung dalam campuran metabolit Lb. plantarum kik -MAG selain mengandung senyawa yang bersifat polar asam organik juga mengandung senyawa yang bersifat non polar, terutama asam lemak–asam lemak dari MAG minyak kelapa, seperti laurat, kaprilin dan kaprat memiliki sifat kurang hidrofilik atau cenderung bersifat non polar, sehingga lebih sulit berpenetrasi ke dalam sel bakteri Gram negatif daripada bakteri Gram positif Blaszyk et al. 1998. Lebih lanjut dikemukakan oleh Davidson dan Branen 1994 bahwa pada senyawa antimikroba yang bersifat hidrofobik lebih efektif menghambat bakteri Gram positif dibandingkan Gram negatif. Ketahanan bakteri Gram negatif terhadap senyawa antibakteri dari monolaurin, karena pada dinding selnya terdapat lapisan lipopolisakarida LPS yang akan menyaring masuknya asam-asam lemak yang terdapat dalam monolaurin tersebut agar tidak dapat masuk ke dalam sel Outarra et al. 1997. Adanya gugus hidrofobik inilah yang menjadi pembatas dari metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa dalam melakukan aksinya terhadap bakteri Gram negatif sehingga diperoleh penghambatan yang relatif kecil. August 2000 menemukan adanya aktivitas antibakteri dari MAG minyak kelapa terhadap B. subtilis dan S aureus bakteri Gram positif, lalu diikuti oleh S. Typhimurium Gram negatif. Outarra et al. 1997 dalam penelitiannya tidak menemukan adanya aktivitas antibakteri dari monolaurin terhadap P. fluorescens dan S. liquefaciens, sedangkan terhadap L. curvatus dan Candida pisciola diperoleh penghambatan yang cukup tinggi. Penentuan Nilai MIC Minimum Inhibitory Concentration Minimum Inhibitory Concentration MIC didefenisikan sebagai konsentrasi terkecil dari senyawa antimikroba yang dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme pada masa inkubasi 24 jam Kubo et al. 1993. Penentuan nilai MIC dilakukan menggunakan metode kontak pada berbagai konsentrasi campuran metabolit Lb. Plantarum kik-MAG minyak kelapa. Pengujian MIC dengan difusi sumur, dilakukan dengan memasukkan bahan antimikroba ke dalam sumur agar. A B A B C D Gambar 5.2. Diameter penghambatan campuran metabolit Lb.plantarum kik- MAG terhadap L. monocytogenes ; B B. cereus ; C E. Coli; dan D S. Typhimurium. Nilai MIC memberikan perbedaan yang nyata P0.01 antara bakteri Gram positif L. monocytogenes dan B.cereus dan bakteri Gram negatif S. Typhimurium dan E. coli, tetapi antara sesama bakteri Gram positif maupun bakteri Gram negatif sendiri memiliki nilai MIC yang relatif sama. Dengan kata lain jenis bakteri yang sama memiliki respon yang sama terhadap campuran metabolit Lb. plantarum kik- MAG minyak kelapa, dan sebaliknya bakteri yang berbeda jenisnya memiliki respon yang berbeda terhadap metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa. Nilai MIC dalam penelitian ini berkisar antara 1,2-3 Gambar 5.3. Bila dibandingkan dengan nilai MIC yang ditemukan oleh Wang et al. 1993 pada asam lemak monokaprilin minyak kelapa sebesar 10, Lee et al. 2002 pada gliserol monolaurat sebesar 5, Ardiansyah 2003 pada daun beluntas 2,26 - 3,19, Naufalin 2005 pada ekstrak kecombrang 3 - 13, demikian halnya dengan senyawa antimikroba alamiah lainnya seperti pada daun salam Nuraida dan Dewanti, 2001 sekitar 1,49 - 3,97 maupun pada biji picung Nuraida et al. 1999 sekitar 3,36 - 6,25 maka campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa yang digunakan dalam penelitian ini memiliki nilai MIC yang lebih rendah. Gambar 5.3. Nilai MIC Metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak Kelapa Terhadap Beberapa Bakteri Patogen Adanya perbedaan nilai MIC dari berbagai senyawa antimikroba yang telah dilaporkan oleh beberapa peneliti terdahulu disebabkan oleh berbagai faktor diantaranya komponen yang terdapat pada bahan antimikroba tersebut, metode uji yang digunakan maupun kriteria yang dipilih untuk menyatakan MIC. Pada penelitian ini, terlihat bakteri yang paling peka terhadap campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa adalah L. monocytogenes dengan nilai MIC sebesar 1,2 Gram positif dan yang paling tahan adalah bakteri E. coli dengan nilai MIC sebesar 3 Gram negatif. Hasil yang sama juga ditemukan oleh August 2000, Mappiratu et al. 2002 dan Lee et al. 2002, yaitu efek penghambatan dari MAG minyak kelapa yang lebih tinggi pada kelompok bakteri Gram positif dari pada bakteri Gram negatif. Membran terluar outer membran 1.2 1.4 2.5 3 0.5 1 1.5 2 2.5 3 Nilai MIC L. m on oc yto ge ne s B. ce re us S. T yp him ur ium E. coli bakteri Gram negatif akan memberikan ketegaran yang lebih kuat dibandingkan dengan bakteri Gram positif. Keadaan ini disebabkan oleh adanya senyawa lipopolisakarida, protein, fosfolipid dan peptidoglikan sehingga bakteri Gram negatif mempunyai ketahanan terhadap senyawa antimikroba dari campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa. Alakomi et al. 2000 menyatakan bahwa outer membran pada bakteri Gram negatif berfungsi sebagai penghalang masuknya senyawa-senyawa yang tidak diperlukan sel seperti bakteriosin, enzim dan senyawa hidrofobik. Mekanisme masuknya campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa ke dalam sel diduga diawali dengan kemampuan dari campuran metabolit Lb. plantarum kik- MAG minyak kelapa yang dalam bentuk tidak terdisoasiasi mudah menembus ke dalam sel, sehingg pH internal dari sel akan menurun. Penurunan pH ini akan menyebabkan enzim-enzim bekerja untuk mengembalikan pH internal sel menjadi normal. Warneclo dan Gill 2005 menyatakan bahwa asam-asam organik yang tidak terdisosiasi dapat menembus lapisan bilayer lipid pada bakteri E. coli dan akan melepaskan proton ke dalam sitoplasma. Kelebihan proton intraseluler akan mengasamkan sitoplasma dan menyebabkan denaturasi protein, serta kehilangan energi karena aktivasi pompa proton membutuhkan ATP, dan pada gilirannya akan menghambat pertumbuhan bakteri. Selain itu dengan adanya MAG minyak kelapa yang mengandung komponen asam lemak, maka interaksi dengan protein maupun fosfolipid dari dinding sel atau sitoplasma melalui ikatan hidrogen dan ikatan hidrofobik menjadi lebih mudah. Kondisi ini menyebabkan larutnya komponen penyusun membran sel, seperti protein, fosfolipid yang mengakibatkan permeabilitas membran meningkat dan memungkinkan keluarnya substansi sel seperti asam nukleat dan protein yang mengakibatkan kematian sel. Perbedaan komposisi dinding sel bakteri Gram positif dan Gram negatif ini yang menjadi penyebab terjadinya perbedaan dalam kemampuan campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa untuk berpenetrasi ke dalam membran sitoplasma yang merupakan sisi aktif dari kerja antibakteri asam lemak dan turunannya. Tingginya efek antibakteri dari metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa diduga karena adanya efek sinergi dari semua komponen yang terdapat pada metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa Wang et al. 1993; August 2000; dan Mappiratu 2002, yaitu asam lemak monokaprilin C8:0, monokaprat C10:0, monolaurat C12:0 dan monomeristin C14:0 dari MAG minyak kelapa yang dilaporkan memiliki sifat antimikroba, maupun berbagai komponen asam organik seperti propionat, asetat, sitrat dan laktat dari metabolit Lb. plantarum kik. Selain itu efek sinergi ini menyebabkan antibakteri dari campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa memiliki spektrum penghambatan yang besar dibanding penggunaannya secara tunggal. Menurut Ultee et al. 1998 mekanisme kerja dari senyawa antimikroba ada yang memiliki spektrum luas dan ada pula yang memiliki spektrum sempit dan hanya efektif terhadap mikroorganisme tertentu. Selanjutnya dinyatakan bahwa mekanisme yang dimaksud adalah mekanisme penghambatan yang berhubungan dengan kemampuan suatu senyawa antimikroba untuk mempengaruhi dinding sel. Pengaruh terhadap dinding sel dapat terjadi akibat akumulasi asam lemak maupun asam organik dari campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa yang dalam bentuk tidak terdisosiasi akan menyebabkan perubahan terhadap komposisi penyusun dinding sel. Senyawa aktif yang terdapat dalam campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa disamping bereaksi dengan dinding sel bakteri dapat pula bereaksi dengan membran sel, yaitu dengan menyerang membran sitoplasma dan mempengaruhi integritas membran sitoplasma sehingga mengakibatkan kebocoran materi intraseluler. Adanya gugus hidrofobik pada campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa akan menyebabkan perubahan komposisi dan pelarutan pada membran sel yang akhirnya membran mengalami kerusakan. Keadaan inilah yang menyebabkan pada konsentrasi tertentu, campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa mampu menghambat pertumbuhan bakteri uji yang ditandai dengan tidak terjadinya kenaikan jumlah koloni bakteri ketika dikontakkan selama 24 jam. Asam organik menurut Naidu dan Clemens 2000 mampu menghambat sel bakteri karena kemampuannya dalam meningkatkan aliran proton ke dalam sel, sehingga menembus membran yang mengakibatkan terganggunya fungsi kimiostatik sel seperti gangguan pada transport asam amino. Adanya gangguan pada asam amino ini akan mengakibatkan sintesis protein yang diperlukan pada proses germinasi juga terhambat. Pengaruh campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa terhadap berat miselia Aspergillus flavus Pengaruh campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa maupun penggunaan tunggal dari campuran metbolit Lb. plantarum kik dan MAG minyak kelapa terhadap berat kering miselia kapang Aspergillus flavus ditentukan berdasarkan berat kering miselia. Hal ini disebabkan oleh pertumbuhan kapang berbanding lurus dengan produksi miselia. Hasil pengukuran berat miselia kapang terlihat pada Gambar 5.4 Lampiran 8a – 8c. Campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa pada berbagai konsentrasi menurunkan berat miselia kapang. Pada Gambar 5.4 terlihat bahwa semakin tinggi konsentrasi yang digunakan semakin tinggi pula penurunan berat miselia kapang. Hal ini terjadi baik pada penggunaan tunggal dari Lb. plantarum kik, MAG minyak kelapa maupun penggunaan campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa. Penurunan berat miselia kapang terbesar diperoleh pada penggunaan campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG 2,75 mgml kemudian diikuti oleh MAG minyak kelapa 1,54 mgml, metabolit Lb. plantarum kik 1,33 mgml sedang perlakuan kontrol tanpa penggunaan antikapang tidak ditemukan penurunan berat miselia kapang. Hal ini menunjukkan bahwa aktivitas antikapang campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa lebih kuat dari pada aktivitas antikapang dari campuran metabolit Lb. plantarum kik atau MAG minyak kelapa secara tunggal. Berdasarkan hasil uji statistik terhadap perlakuan konsentrasi antikapang menunjukkan perbedaan sangat nyata pada P0,01 Lampiran 29. Perlakuan 15 sudah memberikan penurunan berat miselia kapang yang cukup berarti dan tidak berbeda dengan penurunan berat miselia yang diperoleh pada perlakuan 20. Tingginya aktivitas antikapang dari campuran metabolit Lb. plantarum kik- MAG minyak kelapa dibanding dengan perlakuan antikapang secara tunggal disebabkan adanya efek sinergi dari metabolit yang dihasilkan oleh bakteri Lb. plantarum kik dan asam-asam lemak yang terdapat dalam MAG minyak kelapa. Beberapa penelitian melaporkan bahwa bakteri asam laktat menghasilkan substansi dengan berat molekul rendah yang memiliki aktivitas antikapang, antara lain asam phenyllactic, asam p-hydroksi fenillaktik, asam benzoat, metilhidantoin, asam laktat, asam asetat maupun asam sitrat Sjogren et al. 2003. Gambar 5.4. Berat kering miselia kapang Aspergillus flavus mgml yang diberi metabolit Lb. plantarum kik, MAG dan campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa Pada MAG minyak kelapa Kabara 1993 yang berperan adalah asam laurat C12:0 dan asam kaprat C10:0 maupun asam kaprilat C8:0. Mappiratu 1999 melaporkan efek antikapang dari MAG minyak kelapa tidak hanya berasal dari monolaurat tapi juga berasal dari monokaprilin, monokaprin dan monomeristin dan yang paling dominan adalah monokaprin. Diduga asam-asam lemak tersebut memiliki aktivitas seperti detergen Kabara 1993 yang akan mempengaruhi struktur membran sel kapang dengan meningkatnya permeabilitas membran dan terbebasnya elektrolit serta protein intraseluler yang mengakibatkan disintegrasi sitoplasma sel kapang. Penggunaan antikapang dari campuran metabolit Lb. plantarum kik dan MAG minyak kelapa secara tunggal menunjukkan berat miselia yang rendah dibanding dengan penggunaan campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa. Pada penggunaan metabolit Lb. plantarum kik secara tunggal dengan konsentrasi 5, penurunan berat miselia kapang sebesar 0,35 mgml, sedangkan pada konsentrasi yang sama MAG minyak kelapa dapat mereduksi berat miselia kapang sebesar 0,76 mgml. Rendahnya aktivitas antikapang dari campuran metabolit Lb. plantarum kik dalam penelitian ini diduga karena komponen yang bersifat antikapang sebagian besar hanya berupa asam-asam 1 2 3 4 5 6 5 10 15 20 25 Konsentrasi antikapang Berat miselia mgml Plantarum kik-MAG Plantarum kik MAG organik asam laktat, asetat, sitrat dan propionat. Hasil penelitian yang dilakukan oleh Sjogren et al. 2003 menemukan bahwa aktivitas antikapang dari metabolit BAL sebagian besar ditentukan oleh adanya substansi dengan berat molekul rendah, antara lain asam fenillaktik, asam p-hydroksi fenil laktat, metil hidantoin. Roy et al. 1996 melaporkan bahwa efek antikapang dari BAL tidak hanya disebabkan oleh asam organik tetapi juga karena adanya senyawa protein dari metabolit BAL. Cabo et al. 2002 menemukan efek penghambatan dari Lb. plantarum yang lebih rendah terhadap kapang Aspergillus versicolor dibandingkan Lb. brevis. Lebih lanjut dijelaskan bahwa efek penghambatan yang lebih besar dari Lb. brevis dibandingkan Lb. plantarum karena konsentrasi dari asam organik yang dihasilkan oleh kedua jenis BAL tersebut berbeda. Pada Lb. brevis konsentrasi asam asetat yang dihasilkan lebih tinggi dibandingkan dengan konsentrasi asam laktat, sebaliknya pada Lb. plantarum asam laktat yang dihasilkan lebih besar dari pada asam asetat. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa konsentrasi yang dibutuhkan oleh campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG untuk menghambat kapang lebih besar dari pada bakteri. Dengan kata lain dapt dikatakan bahwa aktivitas antibakteri campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa lebih besar dari pada aktivitas antikapang. Sisi aktif mekanisme kerja dari campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa adalah pada membran sitoplasma. Perbedaan komponen membran sitoplasma pada sel prokariot bakteri dan eukariot kapang terlertak pada jenis fosfolipid dan protein yang menyusun membran tersebut, atau kemungkinan adanya perbedaan pada komponen penyusun dari dinding sel yang menyebabkan terjadinya perbedaan dalam penghambatan bakteri dan kapang. KESIMPULAN Campuran metabolit Lb. plantarum kik–MAG memiliki aktivitas antibakteri yang berbeda terhadap masing- masing bakteri uji. Aktivitas campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG lebih kuat terhadap L. monocytogenes dan B. cereus dari pada terhadap bakteri Gram negatif S. Typhimurium dan E. coli pada konsentrasi Lb. plantarum kik-MAG yang sama. Aktivitas antibakteri tersebut ditunjukkan dengan diameter penghambatan yang berkisar antara 20,2–30,7 mm untuk keempat bakteri uji. Nilai MIC untuk masing- masing bakteri uji adalah 1,2; 1,4 ; 2,5 dan 3, berturut-turut untuk bakteri L. monocytogenes, B. cereus, S. Typhimurium dan E. coli. Metabolit Lb. plantarum kik-MAG dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji, yaitu mencapai 2 – 4 log CFUml selama waktu kontak 24 jam. Efek penghambatan Lb. plantarum kik–MAG terhadap Gram negatif berkisar 2-2,5 kali lebih besar dibandingkan dengan bakteri Gram positif. Kemampuan campuran metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa dalam menghambat bakteri lebih besar dibandingkan dengan kapang. Reduksi berat miselia kapang lebih tinggi pada penggunaan campuran metabolit Lb. plantarum kik dan MAG minyak kelapa dari pada penggunaan secara tunggal. Penggunaan secara tunggal menunjukkan kemampuan mereduksi miselia kapang hanya sebesar 0,35-1,54 mgml sedangkan penggunaan campuran dari metabolit Lb. plantarum kik-MAG minyak kelapa diperoleh sebesar 0,86-2,75 mgml atau hampir 2 kali lebih kuat pada penggunaan 5-20. DAFTAR PUSTAKA Ardiansyah. 2003. Aktivitas antimikroba ekstrak daun beluntas Plucea indica L. dan stabilitas aktivitasnya pada berbagai konsentrasi garam dan tingkat pH. J. Ilmu dan Teknol Pangan XIV 2: 90-97. Alakomi HL, Skytta E, Saarela M, Mattila-Sandholm T. 2000. Lactic acid permeabilizes Gram- negatif bacteria by disrupting the outer membrane. Appl. Environ. Microbiol. 66:2001-2005. Baker RC, Kline D, Poon W, Vadehra DH. 1982. Antimicrobial properties of lauricidin in mechanically deboned chicken and minced fish. J. Food Safety 4:177-182. Blaszyk M, Richard A, Holley. 1999. Interaction of monolaurin, eugenol and sodium citrate on growth of common meat spoilage and pathogenic organisms. J. Food Microbiology 39:175-183. Cabo ML, Braber AF, Koendraad PM. 2002. Apparent antifungal activity of several lactic acid bacteria against penicillium discolor is due to acetic acid in the medium. J. Food Protec. 65:1309 – 1316. Catsara M, Danjoy JP, Seynave R. 1987. Temperature and action of laurilac on multlipication of Salmonella in minced meat. Bull. Acad. Vef. Fr 60:359- 364. Davidson PM, Branen AL. 1994. Antimicrobial in Food. Mercel Dekker, New York. Duxbury DD. 1993. Combination emulsifieracidulant extends cheese sauce shelf life. Food Proc. 469:38-39. Fardiaz S. 1992. Mikrobiologi Pengolahan Pangan Lanjut. Bogor PAU Pangan dan Gizi Institut Pertanian Bogor. Gourama H, Bullerman LB. 1995. Inhibition on growth and aflatoxin production of Aspergillus flavus by Lactobacillus spp. J. Food Protect. 58:12490-1256. Hamilton RJ, Rosella JB. 1986. Analysis of oil and fats. Elsivier Applied Science Publisher London. 58:1249-1256. Hidayat A. 2001. Mempelajari Potensi Antimikotik Lactobacillus plantarum Sa28 terhadap pertumbuhan Aspergillus flavus. Skripsi. Fakultas Teknologi Pertanian, IPB, Bogor. Indriyati. 2003. Kajian Aktivitas Antimikroba Campuran Mono dan Diasilgliserol Hasil Pemanfaatan Destilat Asam Lemak Minyak Kelapa. Thesis Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Jenie BSL. 1996. Peranan bakteri asam laktat sebagai pengawet hayati makanan. J. Ilmu dan Teknol Pangan 20:60-73. Kabara J.J. 1993. Medium Chain Fatty Acids and Esters. Di dalam: Davidson PM, Branen AL ed. Antimicrobial in Food 2 nd Ed. Marcell Dekker, New York. Karunaratne A, Wezenberg E, Bullerman LB. 1990. Inhibition of mold growth and aflatoksin production by Lactobacillus spp. J. Food Protect. 53:230-236. Kubo I, Murphi H, Himejima M. 1992. Antimicrobial activity of green tea flavor component and their combination effects. J. Agric. and Food Chem. 40:245-246. Lee JY, Kim YS, Shin DH. 2002. Antimicrobial Synergistic Effect of linolenic acid and monoglyceride against Bacillus cereus and Staphylococcus aureus. J. Agric. and Food Chem. 50:2193-2199. Lisker N, Poster N. 1982. Antifungal activity of lauricidin and related compounds. J. Food Safety 4:27-32. Parish ME, Davidson PM. 1993. Method for evaluation. Di dalam: Davidson PM, Branen AL ed. Antimicrobial in food 2 nd Ed. Marcell Dekker, New York. Mappiratu, Fardiaz, Umrah, Ijirana. 2002. Pemanfaatan sabun hasil samping pengolahan minyak kelapa dalam pembuatan monoasilgliserol menggunakan lipase Aspergillus niger amobil isolat kapang kopra. Laporan Riset Unggulan Terpadu VIII bidang teknologi hasil pertanian. Naidu AS, Clemens RA. 2000. Lactic Acid. Di dalam: Naidu ASEd. Natural Food Antimicrobial System. CRC Press, LLC. Naufalin R. 2005. Kajian Sifat Antimikroba Ekstrak Bunga Kecombrang Nicolaia speciosa Horan Terhadap Berbagai Mikroba Patogen Dan Perusak Pangan. Disertasi Sekolah Pascasarjana Intitut Pertanian Bogor. Bogor. Ouattara B, Simard RE, Holley RA, Piette GJP, Begin A.1997. Antibacterial activity of selected fatty acid and essensial oils against six meat spoilage organisms. J. Food Microbiol. 37:155-162. Salminen S, Wright AV eds. 2004. Lactic Acid Bacteria: Micribiology and Functional Aspects. 2 nd edition. Marcel Dekker Inc. New York. Shibasaki I. 1982. Recent trends in the development of food preservatives. J. Food Safety 4:35-39. Situngkir R. 2005. Aplikasi kultur bakteri asam laktat dengan garam untuk mereduksi Aspergillus flavus dan aflatoksin pada proses pengolahan kacang asin. Thesis Sekolah Pascasarjana Intitut Pertanian Bogor, Bogor. Southwell LA, Hayes AJ, Markham J, Leach DN. 1993. The search for optimally bioactive Australian tea tree oil. Acta Horticulture 334:256–265. Sjogren J, Jesper M, Broberg A, Schnurer J, Kenne L. 2003. Antifungal 3 – Hydroxy Fatty Acids from Lactobacillus plantarum MiLAB. App. and Env. Microbio.Vol. 69, No12:7554-7557. Ultee A, Goris LGM, Smid EJ. 1998. Bacterial activity of carvacrol towards the food-borne pathogen Bacillus cereus. J. App. Microbiol. 85:213-218. Warneclo T, Gill RT. 2005. Organic Acid Toxicity, Tolerance, and Production in E. coli Biorefining Application. Microbial Cell Factories 4:25.

6. MEKANISME KERJA ANTIBAKTERI CAMPURAN METABOLIT