Asal inang rumput KERAGAMAN

41 ruangan. Dinding ruangan berupa plastik berwarna hitam. Selanjutnya, tanaman dipindahkan ke ruang terang pada suhu 25 °C-30 °C dan kelembapan 70-80 Silue et al. 1992. Pengamatan kemampuan infeksi terhadap inang berupa kemunculan bercak, dilakukan setiap hari yang dimulai pada hari ke-4 sampai ke- 9 setelah inokulasi. Kemampuan infeksi silang ditentukan secara kualitatif Tanabe et al. 2006 melalui modifikasi kriteria infeksi. Infeksi dinyatakan positif bila inokulasi menghasilkan bercak blas pada daun dan bercak tersebut bersporulasi ketika dilembapkan semalam dalam cawan petri steril, bercak dicuci dahulu pada air mengalir sebelum dilembapkan. Sebaliknya, infeksi dinyatakan negatif bila infeksi melalui injeksi tidak menghasilkan bercak pada daun. Konidium tunggal dari bercak yang dilembapkan diisolasi ulang. Isolat yang diperoleh dari hasil infeksi tahap ke-1 ini diberi kode d~inang1. Nama inang1 hanya berupa inisial saja. Inang1 ialah tanaman hasil infeksi ke-1 yang bercaknya sebagai sumber konidium tunggal dari isolat tersebut. Tahap kedua, hanya isolat d~inang1 yang berasal dari padi saja yang digunakan sebagai sumber inokulum uji infeksi, dan hanya diinfeksikan ke padi saja. Bercak hasil uji infeksi ke-2 ini digunakan sebagai sumber isolat konidium tunggal dengan metode yang sama seperti sebelumnya. Isolat yang diperoleh diberi kode d~inang1~inang2. Setiap isolat yang diinfeksikan silang diulang tiga kali. Metode inokulasi yang sama juga dilakukan pada o173 ke semua tanaman uji, seperti memperlakukan Pyricularia d4. Perwakilan isolat yang diperoleh dari infeksi tahap ke-1 dan ke-2, serta inokulumnya isolat awal, yaitu Pyricularia d4 dari rumput D. ciliaris digunakan sebagai sumber DNA. Isolasi dan Pemeliharaan Kultur Cendawan . Untuk memperoleh isolat konidium tunggal hasil pergantian inang hasil infeksi silang dari Pyricularia d4 maka satu bercak blas yang dihasilkan dari infeksi silang dicuci menggunakan air mengalir dan dilembapkan semalam, kemudian sejumlah konidium tunggal diisolasi menggunakan bantuan mikroskop modifikasi Bonman et al. 1986. Konidium tunggal dikecambahkan pada medium agar-agar Bacto air 4 wv yang mengandung antibiotik kloramfenikol 250 mg L -1 . Isolat hasil perkecambahan ditumbuhkan pada medium cawan Potato Dextrose Agar PDA, Difco dan disimpan pada agar-agar miring PDA. 42 Isolat cendawan dari konidium tunggal yang disolasi dari hasil infeksi silang diamati morfologi konidiumnya menggunakan bantuan mikroskop. Isolat terlebih dahulu ditumbuhkan pada medium sporulasi, yaitu medium oatmeal 30 g oatmeal L -1 , 20 g agar-agar L -1 , 5 g sukrosa L -1 , modifikasi Tsurushima et al. 2005. Hifa aerial kultur cendawan berumur 7-8 hari dihilangkan secara aseptik menggunakan bantuan kaca objek dan akuades steril. Selanjutnya kultur ditutup plastik transparan dan diberi lubang untuk aerasi serta disinari n-UV terus menerus selama 4-5 hari untuk menginduksi pembentukan konidium. Isolasi DNA . DNA genom cendawan diisolasi dari miselium yang ditumbuhkan pada 25 mL medium cair 5 g L -1 sukrosa, 2 g L -1 ekstrak khamir, dan 2 g L -1 pepton, modifikasi Crawford et al. 1986 selama enam hari pada mesin pengocok. Miselium dipanen dan diisolasi genomnya menurut prosedur yang dijelaskan oleh Raeder dan Broda 1985 pada volume lebih besar dan sedikit modifikasi. Miselium digerus dalam mortar steril sampai berbentuk pasta. Pasta disuspensikan dalam 4 mL larutan penyangga ekstrak 200 mM Tris HCl pH 8.5; 250 mM NaCl; 25 mM EDTA; 0.5 SDS. Sebanyak 2.8 mL fenol dan 1.2 mL campuran kloroform dan isoamil alkohol CIA=24:1 ditambahkan ke dalam suspensi dan suspensi dibolak-balik secara perlahan. Suspensi disentrifugasi selama 30 menit pada 4,000 rpm dengan suhu 6 °C. Fase cairan bagian atas segera dipindahkan ke tabung baru dan dipresipitasi dengan menambahkan 1x volume isopropanol dingin. Hasil presipitasi disentrifugasi selama 20 menit pada 4,000 rpm dengan suhu 6 °C. Endapan dibilas menggunakan etanol dingin konsentrasi 70 dan disentrifugasi kembali selama 10 menit. Endapan dikeringkan menggunakan pompa vakum selama 15 menit, dan dilarutkan dalam 100 uL TE 1x 10 mm Tris HCl pH 8, 1 mmol EDTA, serta ditambahkan 0.2x volume RNAse 20 mg mL -1 . Larutan diinkubasi semalam pada 37 °C, kemudian ditambahkan 900 uL TE 1x dan larutan diekstrak kembali melalui penambahan 1 x volume CIA, dan disentrifugasi selama 10 menit pada 4,000 rpm dengan suhu 6 °C. Cairan bagian atas dipresipitasikan kembali melalui penambahan isopropanol dingin seperti tahapan sebelumnya sampai diperoleh endapan yang dilarutkan dalam 100 uL TE 1x. DNA yang dianalisis memiliki tingkat kemurnian A 260 A 280 1.6-1.9. 43 Selanjutnya riwayat genetik turunan d4 dari hasil pergantian inang ditelusuri melalui lima jenis penanda yang terdiri atas tiga penanda SCAR Cut1, PWL2, Erg2, AFLP, rep-PCR Pot2 dan ras fisiologi, dan sekuen ITS beserta 5.8S rDNA. Penanda SCAR . DNA cendawan hasil isolasi diamplifikasi melalui PCR dengan sepasang primer Cut1, PWL2, dan Erg2 yang merupakan bagian dari 16 penanda SCAR yang dihasilkan oleh Soubabere et al. 2001. Susunan nukleotida ketiga pasang primer sebagai berikut: Cut1F:5’TATAGCGTTGACCTTGTGGA-3’, Cut1R:5-TATAGCATCTCAGACCGAACC-3’ PWL2F:5’-TCCGCCACTTTTCTCATTCC-3’ PWL2R: 5’-GCCCTCTTCTCGCTGTTCAC-3’ Erg2 F:5’-GCAGGGCTCATTCTTTTCTA-3’ Erg2 R:5’-CCGACTGGAAGGTTTCTTTA-3’ Total reaksi PCR sebanyak 20 μL, mengandung sekitar 100 ng DNA genom; 10 μL 2x PCR master mix 0.05 unit μL -1 Taq DNA polymerase, 4 mM MgCl, 0.4 mM masing-masing dNTP, dan 0.6 ρmol masing-masing primer. Program PCR meliputi predenaturasi pada suhu 95 °C selama 15 menit, dilanjutkan 35 siklus pada suhu 94 °C selama 1 menit, suhu pelekatan annealing primer Cut1, PWL2, dan Erg2 adalah 60 °C selama 45 detik. Program selanjutnya adalah pemanjangan elongation pada suhu 72 °C selama 2 menit. Tahap akhir proses PCR pada suhu 72 °C selama 15 menit. Produk PCR di visualisasi melalui elektroforesis pada gel agarosa 1 wv dalam TAE 1x 0.04 M Tris-asetat dan 0.001 M EDTA, dan dilanjutkan perendaman gel dalam 0.5 μg mL -1 etidium bromida. Pengamatan dilakukan terhadap keberadaan pita DNA pada gel agarosa yang diletakkan pada UV transluminator Geldoc Labquip yang dilengkapi kamera digital Olymphus. Data molekuler diperoleh melalui dua kali ulangan. Penanda AFLP. Tahapan AFLP meliputi restriksi dan ligasi, pre- amplifikasi, amplifikasi selektif, dan visualisasi, mengikuti metode Vos et al. 1995 sebagai berikut: 44 a. Restriksi DNA genom dan ligasi adaptor RL. Restriksi genom menggunakan kombinasi dua macam enzim restriksi, yaitu Pst1 dan Mse1, sedangkan ligasinya adalah menggabungkan dua jenis adaptor yang sesuai dengan enzim restriksinya. Volume pereaksi untuk 1x reaksi restriksi dan ligasi adaptor adalah 20 µL, dengan komposisi sebagai berikut: 2.5 µL buffer RL 10x Tris- HCl 50 mM pH 7.5, Mg-asetat 5 mM, K-asetat 250 mM 0.125 µL enzim restriksi Pst I 20 unit µL -1 , 0.25 µL enzim restriksi Mse I 10 unit µL -1 , 0.5 µL Pst I adaptor 5 pMol µL -1 , 0.5 µl Mse I adaptor 50 pMol µL -1 , 0.5 µL ATP 10 mM, 0.16 µL T4 ligase 3 unit µL -1 dan 15.465 µL ddH 2 O. Untuk memudahkan pembuatan bahan reaksi tersebut, setiap bahan diambil untuk 16x reaksi. Volume DNA genom yang dipergunakan dalam reaksi restriksi dan ligasi adaptor adalah 5 µL 250-500 ng µL -1 , sehingga total volume campuran 25 µL. Campuran diinkubasi semalam pada suhu 37°C. Susunan nukleotida adaptor yang digunakan adalah sebagai berikut: Adaptor Pst I: 5’CTCGTAGACTGCGTACATGCA3’ 3’CATCTGACGCATGT5’ Adaptor Mse I: 5’GACGATGAGTCCTGAG3’ 3’TACTCAGGACTCAT5’ b. Pre-amplifikasi menggunakan sepasang primer yang komplemen terhadap sekuen adaptornya, yaitu primer P00 5’GACTGCGTACATGCAG3’ dan M02 5’GATGAGTCCTGAGTAAC3’. Sebanyak 5 µL hasil RL dicampur 0.6 µL primer P00 30 ng µL -1 , 0.6 µL primer M02 30 ng µL -1 , 0.4 µL dNTP 10 mM, 2 µL PCR buffer 10x, 0.08 µL super Taq 5 unit µL -1 dan 11.32 µL ddH 2 O, sehingga total volume campuran menjadi 20 µL. Semua campuran tersebut di pre-amplifikasi menggunakan alat PCR PTC-100 TM JM . PCR dilakukan sebanyak 24 siklus pada 94 °C selama 30 detik denaturasi, 56 °C selama 60 detik penempelan primer, 72 °C selama 60 detik ekstensi. Hasil dari proses ini disebut dilute pre-amp atau template sekunder. Untuk mengetahui hasil proses preamplifikasi dilakukan elektroforesis. Preamplifikasi yang baik akan menghasilkan fragmen DNA smear apusan. c. Amplifikasi selektif melalui sepasang primer, dengan salah satu primernya berlabel IRDye®-700 P11-IRDye®-700. Pada penelitian ini digunakan tiga macam pasangan primer, yaitu P11M48, P11M51, P11M53. Sekuen P11 45 seperti primer P00, hanya mendapatkan tambahan dua nukleotida selektif AA, sehingga sekuennya berupa 5’GACTGAGTACATGCAGAA3’. Susunan nukleotida primer lainnya sebagai berikut: M48: 5’GATGAGTCCTGAGTAAACAC3’ M51: 5’GATGAGTCCTGAGTAAACCA3’ M53: 5’GATGAGTCCTGAGTAAACCG3’ Produk preamplifikasi diencerkan 10x untuk digunakan sebagai template dalam amplifikasi selektif. Sebanyak 10 µL dilute pre-amp dicampur 0.6 µL primer M51 atau M53 atau M55 50 ng µL -1 , 1 µL primer P11-IRDye®-700 1 pmol µL -1 , 0.4 µL dNTP 10 mM, 2 µL super buffer 10x, 5.92 µL ddH 2 O, 0.08 µl Taq DNA polymerase 5 unit µL -1 , sehingga total volume campuran 20 µL. Campuran bahan-bahan tersebut diamplifikasi pada program PCR LI- COR. PCR LI-COR diawali 13 siklus dengan kondisi: siklus ke-1 proses denaturasi pada suhu 95 °C selama 30 detik, proses penempelan primer pada suhu 65 °C selama 30 detik, proses ekstensi 72 °C selama 60 detik. Siklus ke- 2 sampai ke-13, suhu denaturasi dan ekstensi tetap, namun suhu penempelan primer mengalami penurunan 0.7 °C tiap siklus. Proses dilanjutkan 24 siklus pada 94 °C selama 30 detik denaturasi, 56 °C selama 30 detik penempelan primer dan 72 °C selama 60 detik ekstensi. d. Visualisasi fragmen hasil amplifikasi primer selektif melalui elektroforesis pada LI-COR DNA Analyzer. Gel elektroforesis merupakan campuran 20 mL KB plus 6.5 gel matrix, 15 µL TEMED dan 150 µl ammonium persulfat 10 bv. Campuran tersebut dimasukkan pada plat kaca dan didiamkan selama kurang lebih satu jam hingga gel terpolimerasi atau membeku. Plat kaca berisi gel dimasukkan ke wadah elektroforesis, kemudian pada bagian atas ditambah bufer TBE 1x TBE 10x: Tris-HCl 1M pH 8.3, asam boraks 0.83 M, EDTA 10 mM. Pre-elektroforesis dilakukan selama 20 menit pada daya 20 Watt untuk menaikkan suhu hingga 50 °C. Produk amplifikasi selektif dicampur 1:1 dengan loading buffer [loading bufer mengandung formamid 2x: formamid 98 bv, EDTA 10 mM, bromofenol biru 0.025 bv, silen sianol 0.025 bv]. Campuran divortex dan dipanaskan selama 5 menit pada suhu 94 °C pada hotblock denaturasi, lalu didinginkan di dalam es selama kurang lebih 46 satu jam. Selanjutnya, sebanyak 1.5 µL masing-masing sampel yang telah dicampur dengan loading buffer dimasukkan pada sumur gel. Sumur gel paling kiri dan paling kanan, masing-masing diisi 1.5 µL DNA standar 1 µL DNA ladder 100 pb, 19 µL H 2 O, dan 20 µL loading bufer formamid 2x. Gel dielektroforesis selama kurang lebih tiga jam, daya 40 Watt dan tegangan 1500 Volt. Hasil elektroforesis langsung divisualisasikan melalui layar komputer yang dihubungkan ke mesin LI-COR 4300 DNA Analyzer. Analisis AFLP diulang sebanyak dua kali. Analisis Data AFLP . LI-COR 4300 analyzer menghasilkan file gambar gel elektroforesis AFLP Lampiran 2. Pola fragmen DNA yang dianalisis pada kisaran 50-700 bp ukuran DNA standar. Fragmen-fragmen dideteksi menggunakan bantuan piranti lunak SAGA Automated AFLP Generation 2 http:www.licor.com. Setiap fragmen DNA mewakili satu karakter, diberi nilai + positif bila ada fragmen, dan - negatif bila tidak ada fragmen pada ukuran fragmen yang sama. Selanjutnya nilai + dan - ditransformasi menjadi data biner, 1 dan 0. Koefisien simple match merupakan perhitungan yang sesuai untuk analisis data AFLP pada spesies haploid Kosman Leonars 2005. Analisis koefisien simple match dilakukan pada program Numerical Taxonomy System NTSYS melalui piranti lunak NTSYSpc version 2.0 pada menu pilihan Simqual dan metode pengelompokan clustering SAHN, UPGMA. Hasil analisis NTSYSpc tidak dapat menggambarkan filogenetik Rohlf 1998. Oleh karena itu analisis data untuk menggambarkan riwayat takson. juga dilakukan pada program seperti Phylogenetic Analysis Using Parsimony PAUP version 4.0b10 for 32-bit Microsoft Windows Swofford 2002 menggunakan pendekatan Maximum Parsimony. Pada program ini kemiripan antara sampel yang dibandingkan selalu dihitung melalui koefisien Nei dan Li Swofford 2002. Di sisi lain, koefisien Nei dan Lie tidak selalu sesuai untuk menginterpretasikan profil sidik DNA Kosman Leonars 2005. Koefisien Nei dan Li dihitung menggunakan formula sebagai berikut: h= 2a+b+c2; a=jumlah fragmen DNA yang dimiliki oleh kedua individu ke-1 dan ke-2, b=jumlah fragmen DNA yang dimiliki oleh individu ke-1 tetapi tidak dimiliki oleh individu ke-2; c=jumlah fragmen DNA yang dimiliki oleh individu ke-2 tetapi tidak dimiliki oleh individu ke-1, jumlah a dan b