31 Trait Loci yang bernilai ekonomis sehingga dapat digunakan untuk meningkatkan
akurasi, kecepatan dan intensitas seleksi. Untuk dapat mengkonfirmasi keberadaan gen IGF-1 dan Callypige tersebut maka dilakukanlah beberapa tahapan kerja yaitu
pengambilan sampel darah, ekstraksi DNA, kuantifikasi DNA, PCR serta elektroforesis dan visualisasi.
A. Pengambilan Sampel Darah
Sampel darah diambil dari dua ekor sapi perah Fries Holland dengan umur
…tahun dan bobot
..Kg yang hampir sama. Pengambilan sampel
dilakukan melalui arteri caudalis dan menggunakan vacutainer EDTA yang mengandung antikoagulan agar darah tidak cepat menggumpal
. Sebutkan berapa ml vol darah yg dikoleksi
B. Ekstraksi DNA
a. Koleksi White Blood Cell Koleksi sel darah putih dilakukan melaui penambahan reagen RCLB
yang berfungsi untuk melisiskan sel darah merah dan menarik sel darah putih keluar. Setelah penambahan RCLB untuk dapat mengoptimakkan reaksi nya
maka sampel didiamkan dan divortex agar rragen RCLB menjadi homogen dengan sampel dan pelisisan sel darah merah menjadi optimal. Penambahan
RCLB terus dilakukan hingga sampel menjadi berwarna bening dan tidak kemerahan lagi. Untuk dapat memisahkan sel darah putih dan pengotor ataupun
sel darah merah maka dilakukan sentrifugasi. Dengan sentrifugasi maka akan terbentuk dua fasa zat yaitu supernatan dan pellet. Sampel darah merah yang
diinginkan berada pada dasar tube atau dinamakan pellet. Prinsip kerja
32 sentrifuge sendiri berdasarkan gaya sentrifugal untuk memisahkan zat-zat
dengan komponennya. Zat yang beratnya lebih berat akan tertinggal di dasar sedangkan yang berat nya lebih ringan akan melayang.
Setelah sampel menjadi bening maka dilakukan penambahan reagen TBS yang berfungsi untuk memisahkan sel darah putih dari sel darah merah dan
pengotor. TBS ditambahkan beberapa kali dengan jumlah yang berbeda-beda hingga sampel menjadi bening. Setelah dirasa cukup bening TBS terakhir
ditambahkan dan sampel disimpan dalam kulkas. b. Protein Lysis
Untuk mendapatkan DNA yang murni maka terlebih dahulu harus dipisahkan dari protein-protein pengotor. Demi keperluan tersebut maka
ditambahkan lah proteinase K solution ke dalam sampel. Proteinase K merupakan protease tipe subsitin yang sangat aktif yang dimurnikan dari mold
Tritirachium album limber. Enzim tersebut memiliki dua sisi pengikatan untuk Ca++. Karena adanya aktifitas turunannya sering kali mencukupi untuk
mendegradasi protein yang umumnya mengkontaminasi asam nukleat maka digesti dengan proteinase K sering digunakan bersamaan dengan penggunaan
EDTA untuk menghambat aksi Mg++ yang merupakan dependen nuklease Sambrook. dkk, 1988.
Untuk mengoptimalkan kerja dari proteinase K, maka setelah penambahan proteinase K sampel diinkubasi dalam inkubator shaker selama
overnight. Diharapkan dalam waktu overnight tersebut seluruh protein pengotor yang tidak diinginkan akan mengalami pelisisan sehingga didapatkan DNA
murni
33 c. Pemancingan Isolasi DNA
Isolasi DNA menggunakan metode Nacl Pekat yang mudah untuk diaplikasikan. Setelah sampel diambil dari inkubator shaker kemudian
ditambahkan Nacl Pekat ke dalam tabung reaksi. Nacl Pekat berfungsi untuk mengikat DNA dan mengendapkan DNA. Setelah penambahan Nacl sampel
kembali di sentrifugasi untuk memisahkan DNA dengan pengotor-pengotornya. Setelah sentrifugasi selesai dilakukan maka supernatan dituang ke dalam tabung
reaksi yang telah berisi alkohol 96 dingin. Alkohol 96 dingin berfungsi untuk menarik benang DNA keluar,
setelahnya akan didapatkan benang DNA yang melayang yang kemudian dipancing menggunakan pipet pasteur yang sudah dimodifikasi ujungnya.
Benang DNA yang telah terpancing kemudian dikeringkan diatas tissue Kimwipe. Digunakan tissue kimwipe karena serat pada tissue ini merupakan
serat khusus yang tidak akan menempel pada DNA. Setelah itu DNA dicuci ke dalam alhohol 70 dan diletakkan dalam tabung eppendorf berisi dH2O. Harus
dipastikan terlebih dahulu bahwa sebelum memulai tahapan isolasi DNA ini seluruh peralatan yang digunakan telah disterilisasi di dalam autoklaf untuk
mencegah resiko kontaminasi.
C. Kuantifikasi DNA
