denan gas N
2
, dipanaskan kembali 15 menit pada suhu 50
o
C. selanjutnya ditambahkan 1 ml n-heksan, dihembuskan dengan N
2
dan divortek. Selanjutnya ditambahkan NaCl jenuh sebanyak 3 ml dan divortek. Kemudian dibiarkan hingga
terpisah menjadi dua fase. Lapisan atas diambil asam lemak dalam heksan dan disaring dengan Na
2
SO
4
anhydrous dan ditampung dalam vial. Metil ester siap disuntikkan pada gas kromatografi.
Sebelum dilakukan penyuntikan, gas kromatografi di konsisikan terlebih dahulu. Suhu injector diatur pada suhu 225
o
C, suhu detektor 225
o
C, dan suhu kolom 100
o
C dengan tekanan gas helium 1 kgcm
2
. Detector dinyalakan dengan tekanan udara dan tekanan hidrogen masing-masing 0.5 kgcm
2
. Suhu diprogram pada 120
o
C selama 6 menit kemudian dinaikkan secara gradient linier dengankecepatan kenaikan suhu 3
o
C menit sehingga suhu mencapai 230
o
C dan ditahan selama β0 menit. Contoh disuntikkan sebanyak 1 μl dengan tehnik split
pada rasio 1:30. Pengkondisian selesai saat base line yang terbentuk lurus, tanpa terbentuk
peak-peak tertentu. Selanjutnya disuntikkan standar eksternal FAME Mix C8-C22 dan contoh yang akan dianalisa.
Kromatogram yang diperoleh dari hasil analisa asam- asam lemak diidentifikasi dengan membandingkan dengan kromatogram standar eksternal.
Kemudian dihitung respon faktor dari setiap asam lemak pada standar eksternal dengan rumus:
Asam lemak pada contoh dihitung dengan rumus:
contoh g
C area
RF C
mg AL
Area contoh
g AL
mg lemak
asam Kadar
17 17
× ×
× =
5. Analisa bilangan peroksida metode asam asetat-chloroform AOCS
Official method Cd 8-53
Ditimbang contoh kedalam erlenmeyer, kemudian ditambahkan 30 ml asam asetat-kloroform 3:2, digoyang hingga larut, kemudian ditambahkan 0.5 ml KI
jenuh, dibiarkan dengan penggoyangan selama 1 menit tepat, kemudian segera
ditambahkan 30 ml aquadest. Selanjutnya dititrasi dengan sodium tiosulfat 0.1 N. titrasi dilanjutkan hingga warna iod kuning hampir hilang. Kemudian
ditambahkan 2 ml indikator pati, titrasi dilanjutkan hingga warna biru baru hilang. Dilakukan titrasi dengan blanko. Titrasi blanko tidak boleh melebihi 0.1 ml dari
0.1N larutan sodium tiosulfat. Kemudian dihitung dengan cara PV=
B= ml titrasi blanko S= ml titrasi contoh
N=normalitas sodium tiosulfat Bila titrasi membutuhkan kurang dari 0.5 ml dengan 0.1N sodium tiosulfat,
maka digunakan 0.01N sodium tiosulfat
6. Analisa TBA metode langsung dengan spektrofotometer AOCS Official
method Cd 19-90
Uji TBA yang dilakukan menggunakan metode langsung direct method. Metode ini dapat dilakukan untuk menentukan kandungan TBARS TBA Reactive
Substances dalam lemak dan minyak tanpa isolasi awal dari produk oksidasi sekunder. Metode ini dapat digunakan bagi minyak dan lemak nabati dan hewani,
termasuk sam lemak, ester glikol dan ester parsial. Bahan dan alat yang digunakan dalam uji ini adalah contoh, 1-Butanol
kadar air 0.5, ACS kualitas spektrofotometrik, 0.2 wv 2-asam thiobarbiturat TBA dalam 1-butanol, kemudian disonifikasi untuk melarutkan
TBA dan disimpan paling lama 1 minggu pada suhu 4
o
C; 0.2mM TMP dalam 1- butanol, 25 ml labu ukur, tabung reaksi dengan tutup ulir, dan waterbath 95
o
C. Prosedur uji TBA dimulai dengan persiapan contoh, mula-mula contoh
ditimbang dengan akurat kemudian dicatat 50-200 mg kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml. lalu dilarutkan ke dalam sedikit 1-butanol, kemudian labu
dipenuhi dengan 1-butanol sampai batas tera. Dicampur dengan baik. Bila tersedia ultrasonik waterbath, labu dapat disonik untuk menghasilkan campuran yang
sempurna. Proses ini perlu diperharikan karena paparan 1-butanol dapat menyebabkan sakit kepala dan berkunang-kunang, sehingga uji disarankan
dilakukan di dalam ruang asam.
Setelah contoh siap reaksi TBA dapat dilakukan mula-mula 5.0 ml contoh dipindahkan ke dalam tabung reaksi bertutup yang kering. Ditambahkan
50 ml 0.2 TBA dalam 1 butanol dan tabung ditutup. Disiapkan juga blanko 5 ml 1-butanol dan 5 ml 0.2 TBA pada waktu yang sama. Sebagai catatan bahwa
contoh harus disiapkan duplo. Kemudian contoh divortek dan diinkubasi selama 2 jam dalam waterbath 95
o
C. Setelah selesai tabung diambil dari waterbath dan didinginkan di bawah air mengalir selama 10 menit sampai mencapai suhu
ruang. Kemudian spektrofotometer dihidupkan dan diset panjang gelombang pada 532 nm. Spektrofotometer dipanaskan minimum selama 30 menit sebelum
dilakukan pembacaan. Spektrofotometer dinolkan dengan blanko kemudian diukur serapannya menggunakan kuvet. Bila A
532
dari contoh 1, harus digunakan contoh yang lebih sedikit, atau dilakukan pengenceran dan uji diulangi.
Nilai TBA dapat dihitung dengan metode AOCS, dengan mengekspresikan hasil sebagai peningkatan penyerapan pada panjang gelombang 532 nm karena
reaksi contoh 1 mg eqivalent per 1 ml volume dengan TBA. Nilai TBA dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Nilai TBA = 50 x A
532
m Faktor 50 berdasar pada volume 25 ml dari labu ukur dan panjang kuvet 1
cm. A532 adalah penyerapan contoh yang telah dikoreksi menggunakan blanko. m adalah berat mg dari contoh.
7. Analisa jumlah asam lemak bebas ALB metode spektrofotometri
