menjadi suatu sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Metode ini dikenal sebagai kromatografi cair kinerja tinggi Depkes RI, 1995.
2.5.1 Bagian-Bagian dalam Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
1. Pompa Fase gerak dalam KCKT sudah tentu zat cair dan untuk menggerakkannnya
melalui kolom diperlukan alat. Ada dua jenis utama pompa yang digunakan yaitu tekanan-tetap dan pendesakan-tetap. Pompa pendesakan tetap dapat dibagi dalam
lagi menjadi pompa torat dan pompa semprit. Pompa torat menghasilkan aliran yang berdenyut, jadi memerlukan peredam denyut atau peredam elektronik untuk
menghasilkan garis alas detektor yang stabil jika detektor peka terhadap aliran. Kelebihan utamanya ialah tandonnya tidak terbatas. Pompa semprit menghasilkan
aliran yang tak berdenyut, tetapi tandonnya terbatas Johnson, 1991. 2.
Injektor Cuplikan harus dimasukkan ke dalam pangkal kolom kepala kolom,
diusahakan agar sesedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom. Ada tiga jenis dasar injektor, yaitu :
a. aliran-henti
Aliran dihentikan, penyuntikan dilakukan pada tekanan atmosfer, sistem ditutup, dan aliran dilanjutkan lagi biasanya sistem aliran utama tetap pada
tekanan kerja. Cara ini dapat dipakai karena difusi di dalam zat cair kecil, jadi umumnya daya pisah tidak dipengaruhi.
b. septum
Universitas Sumatera Utara
Ini adalah injektor langsung pada aliran yang sama dengan injektor yang lazim dipakai pada kromatografi gas. Injektor tersebut dapat dipakai pada tekanan
sampai sekitar 60-70 atmosfer. Setpum tidak dapat dipakai pada semua pelarut kromatografi cair
c. katup jalan-kitar
Biasanya dipakai untuk menyuntikkan volum yang lebih besar dari 10 mikro liter dan sekarang dipakai dipakai dalam sistem yang diotomatkan Johnson,
1991. 3.
Kolom Kolom merupakan jantung kromatograf. Keberhasilan atau kegagalan
analisis bergantung pada pilihihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :
a. kolom analitik
Garis tengah dalam 2-6 mm. Panjang bergantung pada jenis kemasan, untuk kemasan pelikel biasanya panjang kolom 50-100 cm, untuk kemasan
mikropartikel berpori biasanya 10-30 cm b.
kolom preparatif Umumnya bergaris tengah 6 mm atau lebih besar dan panjang 25-100 cm
Johnson, 1991. 4.
Detektor Detektor diperlukan untuk mengindera adanya komponen cuplikan di dalam
efluen kolom dan mengukur jumlahnya. Detektor yang baik sangat peka, tidak banyak berderau, rentang tanggapan liniernya lebar, dan menanggapi semua jenis
Universitas Sumatera Utara
senyawa. Detektor yang merupakan tulang punggung kromatografi cair kecepatan tinggi modern ialah detektor UV 254 nm Johnson, 1991.
5. Elusi landaian
Elusi landaian ialah peningkatan kekuatan fase gerak selama analisis kromatografi. Hasil elusi landaian ialah perpendekan waktu tambat senyawa yang
ditahan dengan kekuatan dalam kolom. Dasar-dasar elusi landaian diuraikan oleh Snyder. Elusi landaian mempunyai beberapa keuntungan yaitu :
a. waktu analisis keseluruhan dapat dikurangi secara berarti
b. daya pisah keseluruhan per satuan waktu campuran ditingkatkan
c. bentuk puncak diperbaiki pembentukan ekor lebih kecil
d. kepekaan efektif ditingkatkan karena bentuk puncak kurang beragam Johnson,
1991. 6.
Fase Gerak Pada kromatografi cair, susunan pelarut atau fase gerak merupakan salah
satu peubah yang mempengaruhi pemisahan. Berbagai macam pelarut dipakai dalam semua ragam KCKT, tetapi ada beberapa sifat yang diinginkan yang
berlaku umum. Fase gerak haruslah: a.
murni, tanpa cemaran; b.
tidak bereaksi dengan kemasan; c.
sesuai dengan detektor; d.
dapat melarutkan cuplikan; e.
mempunyai viskositas rendah; f.
memungkinkan memperoleh kembali cuplikan dengan mudah, jika diperlukan;
Universitas Sumatera Utara
g. harganya wajar
Pada umumnya pelarut dibuang setelah dipakai karena tata kerja pemurnian memakan waktu dan mahal Jayanti, 2011.
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya
elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal fase diam lebih
polar daripada fase gerak, kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik fase diam kurang polar dari pada
fase gerak, kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik
adalah campuran larutan buffer dengan methanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering
digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan
fase terbalik Jayanti, 2011. 7.
Wadah Fase Gerak Wadah fase gerak harus bersih dan lembam inert. Wadah pelarut kosong
ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak
sebelum digunakan harus dilakukan degassing penghilangan gas yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama
dipompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Pada saat membuat
Universitas Sumatera Utara
pelarut untuk fase gerak, maka sangat dianjurkan untuk menggunakan pelarut, buffer, reagen dengan kemurnian yang sangat tinggi, dan lebih terpilih lagi jika
pelarut-pelarut yang akan digunakan untuk KCKT berderajat KCKT HPLC grade . Adanya pengotor dalam dapat terkumpul dalam kolom atau dalam tabung
yang sempit, sehingga dapat mengakibatkan suatu kekosongan pada kolom atau tabung tersebut. Karenanya, fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih
dahulu untuk menghindari partikel kecil ini Jayanti, 2011.
2.5.2 Keuntungan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
