Konstuksi Vektor Dan Ekspresi Protein Rekombinan Lipase Candida Antarctica (Calb) Dengan Cellulose Binding Module (Cbm) Pada Pichia Pastoris

KONSTRUKSI VEKTOR DAN EKSPRESI PROTEIN REKOMBINAN
LIPASE Candida antarctica (CALB) dengan Cellulose Binding
Module (CBM) pada Pichia pastoris

FEBRIANA DWI WAHYUNI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Konstruksi Vektor dan
Ekspresi Protein Rekombinan Lipase Candida antarctica (CALB) dengan
Cellulose Binding Module (CBM) pada Pichia pastoris adalah benar karya saya
dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun
kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari
karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan
dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.
Bogor, Februari 2016
Febriana Dwi Wahyuni
NIM P051130241

RINGKASAN
FEBRIANA DWI WAHYUNI. Konstuksi Vektor dan Ekspresi Protein
Rekombinan Lipase Candida antarctica (CALB) dengan Cellulose Binding Module
(CBM) pada Pichia pastoris. Dibimbing oleh SUHARSONO dan ASRUL
MUHAMAD FUAD.
Gen CalBsyn telah dikonstruksi secara sintetik untuk menyandi Candida
antarctica lipase B (CALB). Enzim tersebut memiliki peranan penting sebagai
biokatalis yang efektif di bidang bioteknologi dan industri. Sekuens gen CalBsyn
telah dimodifikasi dengan mengintroduksi mutasi pada tiga asam amino, yaitu
V210I, A281E, dan V221D untuk meningkatkan termostabilitas enzim tersebut.
Fragmen gen cellulose binding module (cbm) endoglukanase I (egl1) dari
Trichoderma reesei difusikan pada ujung karboksil gen CalBsyn pada plasmid
rekombinan pGAPZα-CalBsyn. CBM merupakan suatu domain protein yang umum
dijumpai pada enzim selulase dan berfungsi dalam pengikatan enzim pada matrik
selulosa. Dalam penelitian ini CBM digunakan untuk memfasilitasi imobilisasi

CALB pada matrik selulosa melalui fusi dari dua protein tersebut. Penelitian ini
bertujuan mengkonstruksi vektor ekspresi gen CalBsyn yang difusi dengan cbm
dan mengekspresikan CALB pada Pichia pastoris SMD1168H. Baik plasmid
maupun gen cbm dipotong dengan enzim ClaI. Plasmid rekombinan pGAPZαCalBsyn-cbm dikonstruksi dengan cara meligasikan gen cbm ke dalam plasmid
pGAPZα-CalBsyn. Plasmid rekombinan pGAPZα-CalBsyn-cbm diklon dan
diseleksi pada Eschericia coli TOP10F’. Plasmid rekombinan pGPAZα-CalBsyn
telah berhasil diintroduksi ke dalam genom P. pastoris SMD1168H melalui metode
elektroporasi. Efisiensi transformasi yang diperoleh sebesar 1,01 x 102 cfu/µg
DNA. Analisis ekspresi protein rekombinan dilakukan terhadap beberapa galur
rekombinan P. pastoris terpilih. Uji aktivitas lipase secara kualitatif pada media
seleksi menunjukkan bahwa galur transforman P. pastoris yang diperoleh positif
mensekresikan lipase rekombinan (CALB) dan memiliki aktivitas lipolitik. Uji
aktivitas lipase secara kuantitatif dari salah satu galur transforman P. pastoris
menunjukkan bahwa aktivitas enzim mencapai 6,35 Units/ml pada jam ke-48.
Analisis protein dengan SDS-PAGE menunjukkan bahwa CALB berhasil
diekspresikan secara ekstraseluler dengan ukuran sekitar 45 kDa.

Kata kunci: Candida antarctica lipase B, cellulose binding module, recombinant
Pichia pastoris

SUMMARY
FEBRIANA DWI WAHYUNI. Construction of Candida antarctica Lipase B
(CalB) and Cellulose Binding Module (CBM) and Expression of Recombinant
Protein in Pichia pastoris. Supervised by SUHARSONO and ASRUL
MUHAMAD FUAD.
CalBsyn gene was previously constructed synthetically encoding Candida
antarctica lipase B (CALB). The enzyme has important role as the effective
biocatalyst in biotechnology and industrial fields. Lipase from this CalBsyn gene
(CALB-syn) is slightly different from wild type CALB (CALB-wt) in which it has
three amino acids substitutions at different positions, including V210I, A281E, and
V221D to improve thermal stability characteristics and catalytic efficiency of the
enzyme. In order to immobilize the enzyme to any cellulose-based matrix, a
cellulose binding module (cbm) fragment of endoglucanase-1 (egl1) from
Trichoderma reesei was fused to the carboxyl end of the CALBsyn. CBM is a protein
domain which is frequently found in many microbial cellulases that facilitate the
binding of enzyme to cellulose matrix. This feature of cbm was used in this reseach
to facilitate immobilization of CALB through fusion of both protein. This research
was aimed to construct a fusion gene CalBsyn-cbm into pGPAZα expression vector
and to study the expression of CALB in Pichia pastoris SMD1168H. Both plasmid
and cbm gene were digested with ClaI restriction enzyme. pGAPZα-CalBsyn-cbm

recombinant plasmid was constructed by ligation between cbm gene and pGAPZαCalBsyn plasmid. pGAPZα-CalBsyn-cbm recombinant plasmid was cloned and
selected in Eschericia coli TOP10F’. pGAPZα-CalBsyn recombinant plasmid has
been sccesfully introduced into P. pastoris SMD1168H using electroporation
method. Transformation efficiency was 1,01 x 102 cfu/µg DNA. Recombinant
protein expression was analyzed in several strains P. pastoris recombinant selected.
Qualitative lipase activity assays showed that transformant P. pastoris secreted
lipase recombinant (CALB) and has lipolitic activity. Quantitative lipase activity
assays showed that activity of lipase was 63,5 Units/ml in 48 hours. Analysis with
SDS-PAGE showed that CALB protein was expressed successfully and the
recombinant protein showed a molecular size of approximately 45 kDa.

Keywords: Candida antarctica lipase B, cellulose binding module, recombinant
Pichia pastoris

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau
menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB

Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

KONSTRUKSI VEKTOR DAN EKSPRESI PROTEIN REKOMBINAN
LIPASE Candida antarctica Lipase B (CALB) DENGAN Cellulose
Binding Module (CBM) PADA Pichia pastoris

FEBRIANA DWI WAHYUNI

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Bioteknologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr. I Made Artika, M.App.Sc

Judul Tesis : Konstruksi Vektor dan Ekspresi Protein Rekombinan Lipase Candida
antarctica (CALB) dengan Cellulose Binding Module (CBM) pada
Pichia pastoris
Nama
: Febriana Dwi Wahyuni
NIM
: P051130241

Disetujui oleh
Komisi Pembimbing

Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA
Ketua

Dr. Asrul Muhamad Fuad
Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi
Bioteknologi

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian: 3 Februari 2016

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian yang
dilaksanakan sejak November 2014 dengan judul “Konstruksi Vektor dan Ekspresi
Protein Rekombinan Lipase Candida antarctica (CALB) dengan Cellulose Binding
Module (CBM) pada Pichia pastoris”. Tesis ini merupakan hasil penelitian yang

dilakukan di Laboratorium Rekayasa Protein dan Sistem Penyampaian Obat, Pusat
Penelitian Bioteknologi-LIPI, Cibinong. Sebagian dari hasil penelitian ini sedang
dalam penelaahan untuk dipublikasikan pada Malaysian Journal of Microbiology
(MJM) dengan judul “Expression of CALB recombinant protein in Pichia pastoris”.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA dan
Bapak Dr. Asrul Muhamad Fuad selaku pembimbing yang telah memberikan
bimbingan dan arahan selama penelitian hingga penyusunan tesis ini. Penulis juga
mengucapkan terima kasih kepada Dr. I Made Artika, M.App.Sc selaku penguji di
luar komisi pembimbing yang memberikan kritik dan saran dalam penyusunan tesis
ini. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Kepala beserta seluruh
staf Laboratorium Rekayasa Protein dan Sistem Penyampaian Obat, Pusat Penelitian
Bioteknologi-LIPI, Cibinong yang telah banyak membantu dalam menyelesaikan
penelitian ini. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada bapak, ibu, serta
seluruh keluarga, dan teman-teman Pascasarjana Bioteknologi 2013 atas segala doa
dan kasih sayangnya.
Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam penyusunan tesis ini.
Penulis mengharapkan adanya saran dan kritik yang bersifat membangun. Penulis
juga berharap semoga tesis ini bermanfaat.

Bogor, Februari 2016

Febriana Dwi Wahyuni

DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR

vi

DAFTAR LAMPIRAN

vi

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian

1
1
2
2

2 TINJAUAN PUSTAKA
Lipase
Candida antarctica Lipase B (CALB)
Cellulose-Binding-Module (CBM)
Pichia pastoris
Vektor ekspresi pGAPZα

3
3
4
5
6
7

3 METODE
Waktu dan Tempat
Bahan
Metode Penelitian

9
9
9
9

4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Subklon gen cbm ke dalam vektor pengklonan
Transformasi Pichia pastoris dengan Plasmid Rekombinan
Seleksi P. pastoris Transforman
Uji aktivitas lipase
Ekspresi protein rekombinan CALB

13
13
16
17
19
20

5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran

22
22
22

DAFTAR PUSTAKA

23

LAMPIRAN

26

RIWAYAT HIDUP

35

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18

Lipatan α/β hidrolase pada lipase
Struktur Candida antarctica lipase B (CALB)
Struktur Cellulose Binding Module
Vektor kloning pGAPZα dalam inang E. coli TOP10F’ dan Vektor
ekspresi pGAPZα dalam inang P. pastoris SMD1168H
Hasil amplifikasi gen cbm dan isolasi plasmid rekombinan pGAPZαCalBsyn
Hasil Site Directed Mutagenesis faktor-α
Hasil potong dengan enzim restriksi ClaI
Vektor rekombinan pGAPZα-CalBsyn-cbm yang dikonstruksi
Hasil transformasi pGAPZα-CalBsyn-cbm ke dalam E. coli TOP10F’
Hasil PCR koloni dengan pasangan primer CBM F/R
Hasil pemotongan pGAPZα-CalBsyn dengan enzim BspHI
Hasil transformasi plasmid rekombinan pGAPZα-CalBsyn ke dalam
genom P. pastoris SMD1168H
Integrasi vektor rekombinan pada genom P. pastoris
Analisis stabilitas genetik koloni P. pastoris transforman dan non
transforman di media YPD agar dengan beberapa konsentrasi zeosin
Uji aktivitas enzim ekstrak kasar lipase secara kualitatif
Kurva pertumbuhan P. pastoris transforman
Uji aktivitas lipase secara kuantitatif
Analisis ekspresi gen CalBsyn dengan SDS-PAGE

3
5
6
8
13
14
14
15
15
16
16
17
17
18
19
20
20
21

DAFTAR LAMPIRAN
1 Primer yang digunakan
2 Komposisi larutan dan media yang digunakan beserta cara
pembuatannya
3 Kurva Standar ρ-Nitrophenyl Butyrate (PNPB)
4 Komposisi gel poliakrilamid
5 Analisis urutan DNA plasmid pGAPZα-CalBsyn dengan primer
GAP_F
6 Penentuan Efisiensi Transformasi
7 Hasil Penghitungan OD P. pastoris transforman

26
27
30
31
32
33
34

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Lipase merupakan enzim yang diaplikasikan dalam proses hidrolisis
triasilgliserol menjadi asam lemak, diasilgliserol, monoasilgliserol dan gliserol
(Sharma et al. 2001). Pemanfaatan lipase dalam berbagai bidang sangat beragam,
misalnya dalam teknologi pangan, aplikasi industri dan pengetahuan biomedik
(Gupta 2004). Lipase juga memiliki sifat enzimatis dan spesifisitas substrat yang
beragam sehingga banyak diaplikasikan dalam bidang industri (Blank et al. 2006).
Lipase dapat diekstraksi dari berbagai mikroba, seperti bakteri, fungi, dan
ragi/khamir (Gunasekaran dan Das 2005). Keuntungan lipase yang berasal dari
mikroorganisme adalah memiliki aktivitas katalitik yang beragam, mudah untuk
dimanipulasi secara genetik dan mudah untuk diproduksi secara massal (Hasan et
al. 2006).
Candida antarctica lipase B (CALB) merupakan salah satu jenis lipase yang
berasal dari mikroorganisme dan telah banyak diaplikasikan sebagai biokatalis
dalam beberapa bidang industri. Pemanfaatan enzim CALB dalam bidang industri
ini karena sifat enzim CALB yang dapat diaplikasikan pada suhu rendah dan dapat
memiliki termostabilitas yang baik terhadap peningkatan suhu serta memiliki
stabilitas yang tinggi dalam pelarut organik (Joseph et al. 2008; Pfeffer et al. 2006).
Protein rekombinan yang berasal dari eukariot telah banyak diekspresikan di
dalam sistem ekspresi khamir. Khamir memiliki beberapa keunggulan sebagai
sistem ekspresi untuk memproduksi protein rekombinan dibandingkan dengan
bakteri. Sel khamir memungkinkan terjadinya modifikasi protein pada tahap pasca
translasi. Pembentukan ikatan disulfida dan pelipatan protein yang benar
meningkatkan ketahanan protein terhadap degradasi protease dan aktivitas biologis.
Sel eukariot seperti khamir memiliki kemampuan untuk melakukan proses
glikosilasi pada protein melalui penambahan residu gula pada asparagin (Nglikosilasi) atau serin/threonin (O-glikosilasi). Struktur protein pasca translasi yang
terjadi di dalam khamir dapat membentuk protein rekombinan yang aktif secara
biologis (Cho et al. 1998).
Organisme yang pertama kali digunakan sebagai sistem ekspresi protein
rekombinan pada khamir adalah Saccharomyces cereviciae. Namun, sistem
ekspresi protein rekombinan juga dikembangkan melalui jenis khamir lainnya,
misalnya Pichia pastoris (P. pastoris). P. pastoris merupakan khamir metilotropik
yang mampu memanfaatkan metanol sebagai sumber karbon. Produksi protein
rekombinan pada P. pastoris mempunyai beberapa keuntungan, diantaranya tingkat
ekspresi protein rekombinan yang tinggi, DNA yang diintroduksi terintegrasi ke
dalam genom P. pastoris sehingga stabil serta produktivitas protein yang lebih
tinggi (Daly dan Hearn 2005).
Produksi protein rekombinan sudah banyak dilakukan dengan teknologi
rekombinan, baik itu pada organisme prokariot maupun eukariot. Penambahan
peptida sinyal digunakan sebagai salah satu cara untuk mensekresikan protein
rekombinan yang dihasilkan pada khamir sehingga menjadi protein ekstraseluler.
Banyak jenis sinyal-sinyal peptida yang telah digunakan dalam sistem ekspresi

2
pada khamir, seperti peptida sinyal yang berasal dari gen pho1, yeast invertase, dan
sinyal sekresi alfa-mating factor (AMF). Peptida sinyal yang digunakan pada
penelitian ini adalah peptida sinyal AMF karena cukup efektif dalam
mensekresikan protein ke luar sel (Cereghino et al. 2013).
Cellulose-Binding Module (CBM) merupakan suatu domain protein yang
umum dijumpai pada berbagai jenis enzim selulase. CBM umumnya berfungsi
dalam proses pengikatan enzim selulase pada substratnya, yaitu selulosa sehingga
dapat memfasilitasi kerja dari enzim selulosa tersebut (Wang et al. 2001). Fungsi
CBM ini dapat dimanfaatkan untuk proses pengikatan (binding) dan imobilisasi
suatu protein pada matriks selulosa. Pada penelitian ini protein khimera (protein
fusi) Lipase dari Candida antarctica (CALB) difusikan dengan domain CBM dari
Endoglukanase I (EGL1) dari Trichoderma reesei. Trichoderma adalah
mikroorganisme penghasil sistem enzim selulase yang telah sering digunakan
dalam industri terutama industri selulosa maupun dalam penelitian sebagai model
dalam degradasi selulosa menggunakan fungi. Untuk menghasilkan protein
rekombinan tersebut, domain CBM difusikan pada ujung C terminal dari enzim
CALB.
Plasmid ekspresi yang digunakan dalam penelitian ini adalah pGAPZα. Vektor
ini memiliki promoter GAP yang menyandi gliseraldehid-3-fosfat dehidrogenase
(GAPDH) untuk mengekspresikan protein rekombinan pada P.pastoris dan bersifat
konstitutif. Plasmid tersebut juga mengandung fragmen myc epitope untuk deteksi
dan polihistidin tag untuk purifikasi yang dapat difusi pada ujung-C dari protein
target. Seleksi pada vektor ini menggunakan gen penanda resistensi terhadap
antibiotik zeosin (Invitrogen, 2002).

Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan mengkonstruksi vektor ekspresi gen CalB sintetik
(CalBsyn) yang difusikan dengan gen penyandi cellulose binding module (cbm)
pada plasmid ekspresi pGAPZα dan mengekspresikan gen CalB pada P. pastoris
SMD1168H.

Manfaat Penelitian
Penelitian ini bermanfaat untuk menghasilkan suatu protein khimera atau
protein fusi antara CALB dan CBM yang dapat memfasilitasi imobilisasi enzim
CALB pada matrik selulosa.

3

2 TINJAUAN PUSTAKA
Lipase
Lipase merupakan enzim yang diaplikasikan dalam proses hidrolisis
triasilgliserol menjadi asam lemak, diasilgliserol, monoasilgliserol dan gliserol
serta pada kondisi tertentu dapat mengkatalisis reaksi sebaliknya yaitu membentuk
gliserida dari gliserol dan asam lemak (Sharma et al. 2001). Lipase termasuk ke
dalam kelas enzim hidrolase yang anggotanya antara lain adalah protease, selulase,
esterase, amilase, dan lipase. Lipase dan esterase dapat mengkatalis tipe reaksi yang
sama, namun berbeda dalam spesifisitas substrat dan kinetika enzim (Fernandez
2000). Sebagian besar substrat bagi lipase adalah molekul dengan rantai yang lebih
panjang dan tidak larut dalam air, sedangkan substrat bagi esterase adalah molekul
yang larut dalam air seperti asam karboksilat atau ester dengan rantai yang lebih
pendek (Pleiss et al. 1998). Karakteristik beberapa lipase yang tidak dimiliki
esterase adalah aktivasi antarmuka, yaitu aktivitas enzimatik yang mulai teramati
ketika lipase berada pada antarmuka minyak dan air (Nardini dan Dijkstra 1999;
Santarossa et al. 2005). Aktivitas antarmuka terjadi karena adanya lid yang
menutup sisi aktif substrat, yang akan terbuka pada keadaan aktif ketika berada
pada antarmuka minyak dan air. Terbukanya lid memungkinkan masuknya substrat
pada sisi aktif lipase (Kim et al. 1997).
Reaksi yang dikatalisis oleh kedua enzim ini pada lingkungan alaminya
(fisiologis) adalah hidrolisis trigliserida menjadi digliserida, monogliserida, asam
lemak dan gliserol. Pada lingkungan reaksi yang sesuai seperti dalam pelarut
organik atau lingkungan dengan konsentrasi air yang rendah, lipase dapat
mengkatalisis reaksi sebaliknya yaitu reaksi esterifikasi (Zhao et al. 2008; Iso et
al2001; Ghaly et al. 2010; Mittelbach 1990). Beberapa lipase menunjukkan
aktivitas yang lebih baik pada lingkungan reaksi dengan konsentrasi air yang lebih
rendah. Kemampuan lipase untuk mengkatalisis reaksi esterifikasi dimanfaatkan
dalam sintesis biodiesel, senyawa obat, senyawa deterjen, surfaktan, industri
oleokimia, dan kosmetik (Sharma et al. 2001). Banyaknya jenis reaksi dan jenis
substrat yang dapat dikatalisis oleh lipase menyebabkan enzim ini dipelajari dan
digunakan secara ekstensif dalam sintesis senyawa kimia.

Gambar 1 Lipatan α/β hidrolase pada lipase
Sumber : Pfeffer, 2008

4
Struktur protein yang dimiliki oleh beberapa lipase termasuk dalam keluarga
α/β-hydrolase fold. Struktur ini juga diadaptasi oleh hidrolase lainnya seperti
protease, esterase, dehalogenase, dan epoksidase (Nardini dan Dijkstra 1999).
Semua enzim yang termasuk dalam keluarga α/β-hydrolase fold mengadopsi
struktur dimana terdapat delapan β-strand pada interior protein dengan diselingi
adanya α-heliks diantara strand (Gambar 1). Tipe fold ini dipertahankan dengan
sangat baik pada semua anggota keluarga, bahkan antara protein dengan sekuens
yang berbeda jauh. Sisi aktif protein pada keluarga fold ini juga dipertahankan, yaitu
katalitik triad yang bersifat nukleofil (serin, sistein, dan asam aspartat) serta residu
histidin. Residu histidin dapat ditemui pada sisi aktif seluruh protein keluarga α/βhydrolase fold (Nardini dan Dijkstra 1999; Ollis et al. 1992).
Lipase memiliki spesifitas substrat yang beragam. Triasilgliserida bukan satusatunya substrat yang dapat dihidrolisis oleh lipase. Beberapa lipase juga memiliki
spesifitas terhadap substrat asilgliserida yang lain, seperti monoasilgliserida,
diasilgliserida, dan fosfolipid. Lipase yang berasal dari Penicilium camemberti,
misalnya, memiliki aktivitas yang tinggi terhadap monoasilgliserida dan digliserida,
serta tidak memiliki aktivitas terhadap trigliserida. Lipase tertentu ada yang
memiliki spesifitas tinggi terhadap asam lemak, misalnya lipase yang berasal dari
Geottichum candidum. Lipase tersebut spesifik terhadap Δ9-asam lemak tidak
jenuh (Pfeffer 2008).

Candida antarctica Lipase B (CALB)
Candida antarctica lipase B (CALB) merupakan salah satu enzim yang
dihasilkan oleh khamir psychrophilic Candida antarctica. Mikroorganisme
psychrophilic adalah kelompok mikroorganisme yang dapat tumbuh dengan baik
pada suhu 00C, memiliki temperatur pertumbuhan optimal pada suhu 150C, serta
mampu hidup pada temperatur maksimum pada suhu 200C (Prescott et al. 2002).
Mikroorganisme psychrophilic juga merupakan kelompok penghasil lipase yang
dapat diaplikasikan pada suhu rendah, misalnya enzim CalB. Enzim CalB tersusun
atas 317 asam amino dan memiliki berat molekul sebesar 33 kDa (Rotticci et al.
2000). Enzim tersebut memiliki ukuran yang lebih kecil dan bersifat lebih asam
daripada enzim CalA (Joseph et al. 2008). Sifat enzim CalB cenderung termostabil,
khususnya di bawah kondisi tidak ada air dimana katalis tetap aktif berjam-jam dan
adanya konsentrasi yang tinggi dari reaktan. Namun, enzim CalB wild type dapat
terdenaturasi dengan cepat pada saat suhu meningkat sampai 400C (Zhang et al.
2003). Salah satu metode yang dapat digunakan untuk mendapatkan enzim CalB
yang resisten terhadap peningkatan suhu adalah Site Directed Evolution. Melalui
metode ini, enzim CalB dimodifikasi dengan melakukan mutasi pada tiga asam
amino, yaitu V210I (mutasi pada asam amino ke 210 dari valin menjadi isoleusin),
A281E (mutasi pada asam amino ke 281 dari alanin menjadi asam glutamat), dan
V221D (mutasi pada asam amino ke 221 dari valin menjadi asam aspartat (Zhang
et al. 2003).
Struktur enzim CalB memiliki lipatan α/β hidrolase dengan situs aktif yang
tersusun atas triad katalitik berupa Thr-x-Ser-x-Gly (Gambar 2) (Joseph et al. 2008).
Situs aktif tersebut tersusun atas dua kanal yang berperan terhadap sifat
stereoselektivitas dan regioselektivitas yang tinggi terhadap alkohol sekunder

5
(Blank 2006). Rottici-Mulder (2001) menyatakan bahwa enzim CalB memiliki situs
aktif yang dapat dijangkau pelarut. Situs aktif enzim tersebut berupa saluran yang
sempit sehingga enzim CalB memiliki aktivitas yang tinggi terhadap ester asam
karboksilat seperti etiloktanoat daripada terhadap trigliserida. Enzim CalB juga
memiliki selektivitas hidrolisis ikatan ester pada posisi sn-3.
Enzim CalB merupakan enzim yang banyak diaplikasikan di bidang
bioteknologi dan industri. Enzim CalB rekombinan telah digunakan di dalam
industri detergen. Sekitar 1000 ton lipase telah digunakan dalam setahun untuk
mengurangi polusi lingkungan akibat produk detergen. Enzim CalB juga digunakan
dalam industri makanan, misalnya untuk menghidrolisis lemak pada susu serta
meningkatkan cita rasa keju (Hasan et al. 2006).

Gambar 2 Struktur Candida antarctica lipase B (CalB)
Sumber : Uppenberg et al. 1994

Cellulose Binding Module (CBM)
Polikarbohidrat tidak larut, seperti selulosa, merupakan substrat yang sulit
untuk degradasi enzim. Hal ini karena sulitnya jangkauan substrat yang padat untuk
situs katalitik enzim dan sebagian karena heterogenitas struktur fisik. Karakteristik
substrat ini menetapkan persyaratan khusus untuk hidrolisis enzim. Salah satu
solusi untuk degradasi enzim dengan substrat terlarut yaitu dihasilkan substratebinding module yang berbeda. Contoh modul tersebut dapat ditemukan dalam
carbohydrate-active enzyme seperti selulase, hemiselulase, dan kitinase.
Cellulose-Binding Module (CBM) merupakan suatu domain protein yang
umum dijumpai pada berbagai jenis enzim selulase. CBM umumnya berfungsi
dalam proses pengikatan enzim selulase pada substratnya, yaitu selulosa sehingga
dapat memfasilitasi kerja dari enzim selulosa tersebut (Wang 2001). Fungsi dari
CBM ini dapat dimanfaatkan untuk proses pengikatan (binding) dan imobilisasi
suatu protein pada matriks selulosa.
CBM awalnya diklasifikasikan sebagai Cellulose Binding Domain (CBD)
berdasarkan penemuan awal dari beberapa modul yang mengikat selulosa (Gilkes
et al. 1988; Ito et al. 2004 ). CBM mengandung 30 sampai 200 asam amino dan ada
sebagai single domain atau double domain dalam satu protein. Posisi CBM bisa

6
berada di ujung C-terminal atau N-terminal dan kadang-kadang terpusat dalam
rantai polipeptida (Shoseyov et al. 2006).
CBM telah ditemukan di dalam protein hidrolitik dan non hidrolitik. Protein
yang memiliki aktivitas hidrolitik (contoh: selulase dan xylanase) meliputi
molekular kompleks yang berisikan modul yang mempunyai ciri-ciri tersendiri
(biasanya modul katalitik), yang biasanya bergabung dengan urutan linker yang
relatif tidak terstruktur (Shoseyov et al. 2006). CBM juga telah ditemukan pada
beberapa polisakarida selain selulase dan xylanase. Pada Trichoderma reesei, CBM
telah diidentifikasi dalam hemiselulosa, endomananase, dan acetilxylanase
(Margolles et al. 1996; Stalbrand et al. 1995).
Beberapa tahun belakangan, penggunaan CBM telah dimanfaatkan dalam
beberapa bidang bioteknologi. Ada beberapa sifat dasar CBM yang menjadikannya
banyak diaplikasikan dalam beberapa bidang, diantaranya yaitu CBM biasanya
dapat melipat sendiri dan dapat berfungsi secara otonom pada protein kimera,
penempelan matrix yang berlimpah dan murah, memiliki sifat fisik dan kimia yang
baik, serta dapat mengendalikan pengikatan yang spesifik (Shoseyov 2006).

Gambar 3 Struktur Cellulose Binding Module
Sumber : Lehtio 2001

Pichia pastoris
Pichia pastoris merupakan khamir metilotropik yang mampu melakukan
metabolisme metanol sebagai sumber karbon. Reaksi kimia yang dilakukan P.
pastoris adalah oksidasi metanol menjadi formaldehid dengan bantuan alkohol
oksidase. Salah satu produk sampingan dari reaksi oksidasi metanol adalah
hidrogen peroksida (H2O2) yang akan diuraikan menjadi hidrogen dan air di
peroksisom. Alkohol oksidase memiliki afinitas yang sangat rendah terhadap
oksigen. P. pastoris mengatasi hal tersebut dengan menghasilkan sejumlah besar
enzim (Invitrogen 2001)
Sebagai organisme eukariotik, P. pastoris memiliki banyak keuntungan lebih
dalam hal sistem ekspresi protein terutama modifikasi pasca-translasi seperti
penambahan residu gula, pelipatan protein dan sekresi protein ke dalam media yang
kemudian memfasilitasi purifikasi. Protein rekombinan yang diproduksi pada E.
coli mungkin tidak terlipat dengan tepat sehingga tidak aktif dan tidak larut. Protein
eukariotik yang disintesis pada sistem ekspresi bakteri umumnya tidak stabil atau
aktivitas biologisnya berkurang yang diakibatkan oleh tidak terjadinya modifikasi

7
pasca translasi (Glick dan Pasternak 2003). Keuntungan lainnya digunakannya P.
pastoris sebagai sel inang untuk ekspresi protein yaitu manipulasi P. pastoris
semudah seperti manipulasi pada E. coli atau S. cerevisiae. Sistem ekspresi dengan
P. pastoris lebih cepat, mudah dan murah untuk digunakan bila dibandingkan
dengan sistem ekspresi lainnya seperti Baculovirus atau sistem mamalia. P. pastoris
menggunakan beberapa manipulasi fitur molekuler dan genetik dari Saccharomyces
sehingga menambahkan keuntungan tingkat ekpresi yang lebih tinggi. Fitur dengan
perawatan yang mudah, scale up dan persyaratan pertumbuhan murah membuat P.
pastoris sebagai sistem ekspresi protein yang sangat berguna. Proses ini dapat
ditingkatkan ke tingkat ekspresi, yaitu 10-100 kali lebih tinggi daripada E. coli
(Balamurugan et al. 2007).
Ekspresi gen asing pada P. pastoris meliputi tiga langkah dasar, yaitu
penyisipan gen asing ke dalam vektor ekspresi, integrasi vektor rekombinan ke
dalam genom P. pastoris dan seleksi galur P. pastoris hasil transformasi yang dapat
mengekspresikan gen asing (Li et al. 2007). Studi biokimia menunjukkan bahwa
pemanfaatan metanol membutuhkan jalur metabolisme yang melibatkan beberapa
enzim. Enzim alkohol oksidase (AOX) mengkatalisis pada tahapan pertama di jalur
metabolisme metanol. Berada di dalam peroksisom, AOX mengoksidasi metanol
menjadi formaldehid dan hidrogen peroksida (Cereghino & Cregg 2000). Ada dua
gen yang menyandikan alkohol oksidase dalam P. pastoris yaitu AOX1 dan AOX2.
Gen AOX1 diekspresikan oleh promotor AOX1 yang sangat tergantung kepada
regulasi dan induksi dari metanol yang terkandung dalam medium. Total protein
yang dihasilkan dapat mencapai lebih dari 30% dari total protein terlarut ketika sel
ditumbuhkan dalam medium yang mengandung metanol sebagai sumber karbon.
Tingkat ekspresi dari AOX1 diatur pada tingkat transkripsi (Zhang 2009). AOX1
sebagian besar bertanggung jawab pada aktivitas alkohol oksidase dalam sel. AOX2
memiliki sekitar 97% homologi dengan AOX1 (Balamurugan et al. 2007).
Promotor alternatif yang dapat digunakan selain promotor AOX yaitu promotor
GAP, FLD1, PEX8, dan YPT7. Promotor GAP merupakan promotor konstitutif
yang tidak memerlukan induksi. Promotor GAP berasal dari gen yang mengkode
GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) dan gen tersebut
merupakan salah satu housekeeping gene. GAPDH adalah enzim yang sangat
diperlukan pada proses glikolisis. Enzim tersebut mengkatalis glyceraldehyde-3phospate menjadi 1,3 biphosphoglycerate. Enzim GAPDH juga berperan pada
beberapa proses non metabolisme seperti inisiasi apoptosi dan transportasi RNA
binding protein dalam aktivasi transkripsi. Enzim GAPDH terdiri dari subunit
tetramer yang identik (Thanonkeo et al. 2010). Penggunaan promotor GAP dalam
sistem ekspresi protein rekombinan pada P. pastoris dapat mengurangi biaya dan
penggunaan metanol sebagai penginduksi promotor AOX. Sumber karbon yang
dapat digunakan pada sistem ekspresi PGAP adalah glukosa, gliserol, asam oleat, dan
metanol (Zhang et al. 2009).

Vektor Ekspresi pGAPZα
Vektor ekspresi pGAPZα adalah vektor yang menggunakan promotor GAP
dari gen yang mengkode GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase).
Vektor ekspresi pGAPZα dapat digunakan untuk ekspresi protein rekombinan

8
secara konstitutif pada P. pastoris. Vektor pGAPZα dapat mengekspresikan protein
tanpa menggunakan metanol dan lebih disukai untuk ekspresi skala besar.
Penggunaan promotor GAP tidak disarankan jika produksi protein toksik terhadap
khamir sebagai sel inang. Vektor pGAPZα berukuran 3,1 kb, mengandung myc
epitope untuk deteksi dan polyhistidine tag untuk purifikasi pada ujung C,
mengandung sinyal sekresi faktor α yang berfungsi untuk sekresi protein
rekombinan, memiliki multiple cloning site (MCS) dengan situs restriksi yang unik.
Vektor pGAPZα juga memiliki promotor TEFI, EM7, CYCI transcription
termination region, dan pUC origin. Origin pUC merupakan situs replikasi plasmid
pada E. coli (Invitrogen 2008). Gambar vektor ekspresi pGAPZα dapat dilihat pada
Gambar 4.
Vektor pGAPZα mengandung gen Sh ble (Streptoalloteichus hindustanus
bleomycin). Gen ini berukuran 375 bp dan memiliki resistensi terhadap antibiotik
zeosin sehingga dapat digunakan untuk seleksi vektor rekombinan pada E. coli, P.
pastoris dan eukariot lain. Promotor TEF1 yang berasal dari S. cerevisiae
digunakan untuk mengekspresikan gen Sh ble pada P. pastoris sebagai gen resisten
zeosin. Promotor EM7 merupakan promotor konstitutif mengekspresikan gen Sh
ble pada E. coli sebagai gen resisten zeosin, serta CYCI transcription termination
region berasal dari S. cerevisiase yang berfungsi untuk meningkatkan stabilitas gen
Sh ble (Invitrogen 2001).

Gambar 4 Vektor kloning pGAPZα dalam inang E.coli TOP10F’ dan vektor
ekspresi pGAPZα dalam inang P.pastoris SMD1168H

9

3 METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini berlangsung dari November 2014 sampai Januari 2016 di
Laboratorium Rekayasa Protein dan Sistem Penyampaian Obat, Pusat Penelitian
Bioteknologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Cibinong, Bogor.

Bahan
Plasmid DNA dan gen: Plasmid ekspresi yeast pGAPZα (Gambar 4) berasal
dari Invitrogen, Gen CalBsyn dibuat secara sintetik dari DNA2.0 dengan optimasi
kodon P. pastoris. Fragmen gen cbm dibuat secara sintetik dari IDT.
Mikroorganisme Escherichia coli TOP 10F’ (Invitrogen) sebagai sel inang replikasi
plasmid rekombinan, Pichia pastoris SMD 1168 H (Invitrogen) sebagai sel inang
untuk ekspresi protein rekombinan. Media tumbuh dan antibiotik: LSLB (Low Salt
Luria Bertani), YPD (Yeast Peptone Dextrose), Ampisilin dan Zeosin. Primer DNA
berasal dari IDT. Sekuen primer DNA yang digunakan dalam penelitian ini
disajikan pada Lampiran 1. Komposisi media dan larutan yang digunakan dalam
penelitian ini disajikan pada Lampiran 2.

Metode Penelitian
Subklon gen cbm ke dalam Plasmid Ekspresi
Gen cbm dan plasmid pGAPZα-CalBsyn dipotong dengan enzim restriksi
ClaI dan dipurifikasi menggunakan Gel DNA Extraction Kit (GeneAid).
Selanjutnya gen cbm disubklon ke dalam plasmid pGAPZα-CalBsyn pada situs ClaI
menggunakan teknik umum ligasi dan diintroduksi ke dalam E.coli TOP 10F’.
Transformasi pada E.coli dilakukan dengan metode kejut panas (Ausubel 2002).
E.coli transforman diseleksi dengan menggunakan medium seleksi LSLB (Low Salt
Luria Bertani) agar yang mengandung antibiotik zeosin 25 µg/ml. Analisis PCR
dilakukan terhadap E.coli transforman yang diperoleh menggunakan primer
spesifik, CBM_F dan CBM_R dengan metode PCR koloni dan PCR plasmid.
Selanjutnya plasmid rekombinan yang diperoleh dianalisis potong dengan enzim
restriksi serta analisis sekuen urutan DNA.
Transformasi P. pastoris dengan Plasmid Rekombinan
Transformasi sel khamir dilakukan dengan metode elektroporasi
menggunakan protokol dari invitrogen (2008). Plasmid rekombinan pGAPZαCalBsyn yang akan diintroduksi ke dalam sel P. pastoris SMD1168H terlebih
dahulu dipotong menjadi bentuk linier dengan enzim BspHI (Invitrogen 2002).
Plasmid yang telah terpotong dipurifikasi menggunakan Gel DNA Extraction Kit
(Geneaid). Koloni tunggal P. pastoris SMD1168H ditumbuhkan dalam 5 ml
medium YPD pada suhu 30ᴼC, 250 rpm selama semalam. Sebanyak 100 µl biakan

10
diinokulasikan ke dalam 50 ml media YPD dan diinkubasi semalam pada suhu 30ᴼC,
250 rpm hingga OD600 mencapai 1,3-1,5. Sel dipanen dengan cara sentrifugasi (4ᴼC,
3000 g, 5 menit). Endapan sel diresuspensi dengan 50 mL akuades dingin steril dan
disentrifugasi (4ᴼC, 4000 g, 7 menit). Endapan sel diresuspensi kembali dengan 25
ml akuades dingin steril dan disentrifugasi (4ᴼC, 4000 g, 7 menit). Endapan sel
diresuspensi dalam 2 ml 1 M sorbitol dingin steril dan disentrifugasi (4ᴼC, 3500 g,
5 menit). Endapan sel diresuspensi kembali dalam 200 µl 1M sorbitol dingin steril.
Sebanyak 70 µl sel kompeten P.pastoris dicampurkan dengan 0,5 µg
plasmid linier (pGAPZα-CalB). Sel kompeten dan plasmid diinkubasi terlebih
dahulu pada suhu 0ᴼC selama 10 menit. Sel kompeten dan plasmid dimasukkan ke
dalam kuvet elektroporasi (2 mm gap) yang telah didinginkan. Kuvet yang
mengandung sel kompeten dan plasmid diinkubasi pada suhu 0ᴼC (dalam es)
selama 5 menit. Elektroporasi dilakukan dengan kondisi 2 kV, 25 µF 400Ω pada
elektroporator Gene Pulser Xcell Electroporation System (Biorad). Sebanyak 150
µl 1M sorbitol dingin segera ditambahkan ke dalam kuvet tersebut. Isi kuvet
ditransfer ke dalam mikrotube steril dan diinkubasi di dalam es selama 1-2 jam. Sel
hasil transformasi disebar pada media agar YPDS (Yeast Potato Dextrose Sorbitol)
yang mengandung zeosin dengan konsentrasi 100 µg/mL dan diinkubasi selama 34 hari pada suhu 30ᴼC sampai terbentuk koloni.
Seleksi Koloni P. pastoris Transforman
Koloni yang tumbuh pada media seleksi yang mengandung 100 µg/ml
zeosin ditumbuhkan kembali pada media YPD agar dengan berbagai tingkat
konsentrasi zeosin (100 - 1000 µg/ml) secara bertahap. Seleksi ini bertujuan untuk
memperoleh koloni transforman yang memiliki stabilitas genetik yang tinggi serta
koloni dengan salinan gen multikopi. Koloni transforman juga ditumbuhkan pada
media YPD agar tanpa zeosin sebagai kontrol. Seleksi dilakukan dengan
menggoreskan koloni transforman pada media seleksi YPD agar dengan
konsentrasi zeosin 100 µg/mL dan diinkubasi selama 1-2 hari pada suhu 30ᴼC.
Koloni yang tumbuh digoreskan kembali pada media YPD agar dengan zeosin 200
µg/mL. Koloni yang tumbuh pada medium tersebut digoreskan lagi pada media
dengan konsentrasi zeosin yang lebih tinggi, yaitu 500 µg/mL dan 1000 µg/mL.
Koloni yang hidup pada media dengan konsentrasi zeosin tertinggi digunakan untuk
ekspresi protein skala kecil.
Uji Aktivitas Lipase Kualitatif dan Kuantitatif
Uji Aktivitas Lipase secara Kualitatif
Uji aktivitas lipase secara kualitatif dilakukan dengan menggunakan metode
Rhodamin olive oil berdasarkan Koeker dan Jaeger (1987). Koloni P. pastoris yang
tumbuh diseleksi kemampuannya dalam menghasilkan lipase. Identifikasi koloni
penghasil lipase serta penentuan aktivitas lipase dilakukan menggunakan media
seleksi plate Rhodamin B agar (modifikasi Kouker dan Jaeger 1987) yang
mengandung PDA 39 g/L, Rhodamin B 0,01%, PVA 1,5% dan substrat olive oil
4%. Koloni P. pastoris transforman diinokulasikan ke dalam cawan petri yang
berisi media seleksi. Koloni yang tumbuh diseleksi berdasarkan pada zona yang
terbentuk disekeliling koloni yang tumbuh pada media. Rhodamin B merupakan
pewarna yang akan membentuk kompleks dengan asam lemak bebas sehingga
ketika koloni penghasil lipase di bawah sinar ultraviolet (UV) akan memberikan

11
zona berpendar sedangkan olive oil berfungsi sebagai sumber lipida (Gupta et al.
2003).
Uji aktivitas Lipase secara Kuantitatif
Uji aktivitas lipase secara kuantitatif dilakukan dengan metode Continuous
Spectrophotometric Rate Determination (Quinn et al. 1982; Sirai and Jackson
1982). Pengujian aktivitas lipase dilakukan dengan menggunakan substrat berupa
ρ-Nitrophenyl Butyrate (PNPB) dan sebagai kontrol positif digunakan lipase dari
Candida rugosa (CRL). PNPB dan CRL merupakan produk dari Sigma. Reagen
yang digunakan diantaranya yaitu Reagen A yang terdiri dari 100 mM Sodium
Phosphate Buffer, 150 mM Sodium Chloride dan 0,5% Triton X-100. Substrat
dibuat dengan cara mencampur 50 mM ρ-Nitrophenyl Butyrate (PNPB) dengan
acetonitrile. Sebagai kontrol positif, lipoprotein lipase dari Candida rugosa (CRL)
dilarutkan dalam reagen A. Aktivitas lipase diukur dengan melihat absorbansi pada
panjang gelombang 400 nm dan penghitungan dilakukan setiap menit sampai menit
ke-5. Kurva standar PNPB untuk menentukan aktivitas lipase secara kuantitatif
disajikan pada Lampiran 3.
Ekspresi Protein Rekombinan CALB
Koloni P. pastoris transforman yang mengandung plasmid pGAPZα-CalBsyn
ditumbuhkan pada media agar miring YPD dengan zeosin 100 µg/mL, kemudian
dilakukan uji ekspresi protein rekombinan. Uji ekspresi protein rekombinan
mengikuti prosedur pada manual Pichia Expression Kit versi G (invitrogen). Koloni
tunggal dari koloni transforman diinokulasikan ke dalam 10 mL media YPD.
Biakan selanjutnya diinkubasi selama 24 jam pada suhu 30ᴼC dengan agitasi 250
rpm. Sebanyak 0,1 ml kultur yang tumbuh diinokulasikan ke 50 ml media YPD dan
ditumbuhkan pada suhu 30ᴼC dengan agitasi 250 rpm. Pengambilan contoh untuk
analisis dilakukan setiap jam ke-24, 48, dan 72. Biakan dipanen dengan cara
sentrifugasi pada suhu 4ᴼC, 3000 g selama 10 menit.
Pemekatan Protein dengan metode presipitasi menggunakan larutan TCA
(Trichloroacetic acid).
Presipitasi protein dilakukan untuk memekatkan protein yang terdapat pada
contoh supernatan. Presipitasi protein menggunakan larutan TCA dilakukan
berdasarkan prosedur dari Sanchez (2001). Sebanyak 1 mL supernatan
dicampurkan dengan 250 µl larutan TCA 100%. Campuran tersebut diinkubasi
selama 10 menit pada suhu 40C. Selanjutnya campuran tersebut disentrifugasi
dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit pada suhu 40C. Supernatan dibuang
sedangkan protein akan terpresipitasi membentuk pelet. Pelet dicuci menggunakan
200 µl aseton dingin untuk menghilangkan larutan TCA yang tersisa dan
disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 12.000 rpm pada suhu 40C. Aseton
dibuang sedangkan pelet protein dikering-anginkan pada suhu ruang untuk
menguapkan aseton yang tersisa. Pelet protein digunakan sebagai sampel untuk
analisis protein menggunakan SDS-PAGE, slot blot, dan western blot. Komposisi
gel poliakrilamida disajikan pada Lampiran 4.

12

Analisis protein rekombinan CALB dengan metode SDS-PAGE
Analisis dan visualisasi protein rekombinan CALB hasil ekspresi dilakukan
dengan metode SDS-PAGE (Ausubel 2002). Cara kerja SDS-PAGE diawali dengan
pembuatan separating gel dan stacking gel (lampiran 4). Sebanyak 1 ml contoh
supernatan dipresipitasi menggunakan larutan TCA 100% dengan perbandingan
contoh dan larutan TCA adalah 4:1. Selanjutnya presipitat protein diresuspensi
dengan 30 µl 4X sample buffer dalam tabung mikro 1,5 ml. Campuran tersebut
dipanaskan pada suhu 950C selama 5 menit lalu disentrifugasi selama 5 detik untuk
menurunkan uap. Masing-masing contoh sebanyak 15 µl dan marka protein
sebanyak 5 µl dimasukkan ke dalam sumur. Kabel elektroda dipasangkan dengan
perangkat elektroforesis kemudian gel diberi tegangan 90 Vselama 120 menit.
Setelah proses elektroforesis selesai, gel diangkat lalu direndam dalam larutan
pewarna Comassie Briliant Blue (CBB) selama 1 jam dan selanjutnya direndam
dalam akuades.

13

4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Subklon gen cbm ke dalam vektor pengklonan
Konstruksi gen cbm dirancang berdasarkan informasi sekuens gen cbm (wild
type) yang terdapat pada GeneBank dengan nomor akses P07981 melalui UniProt.
Sekuen gen cbm ini telah dioptimasi dengan kodon preferensi P. pastoris. Gen ini
diamplifikasi dan ditambah situs restriksi ClaI dengan teknik PCR. Hasil PCR
dengan primer CBM-F dan CBM-R menghasilkan produk amplifikasi berupa gen
cbm dengan ukuran 261 pb (Gambar 5). Plasmid rekombinan pGAPZα-CalBsyn
merupakan vektor ekspresi yang mengandung beberapa perangkat gen penting
untuk mengekspresikan protein rekombinan, yaitu promotor GAP sebagai
promotor konstitutif, fragmen MF-α (mating factor-α) sebagai gen penyandi sinyal
peptida supaya protein dapat disekresikan keluar sel, gen she ble sebagai gen
penyandi resisten terhadap antibiotik zeosin untuk menyeleksi transforman, pUC
ORI untuk replikasi plasmid pada E. coli. Plasmid rekombinan diperbanyak di
dalam sel E. coli TOP10F’ dan diperoleh dengan cara isolasi menggunakan teknik
alkali lisis (Gambar 5 ).

A
B
Gambar 5 Hasil amplifikasi gen cbm dan isolasi plasmid rekombinan pGAPZαCalBsyn. A= Hasil PCR gen cbm yang berukuran sekitar 261 pb. B=
hasil isolasi plasmid rekombinan pGAPZα-CalBsyn
Sekuen sinyal peptida MFα pada plasmid rekombinan pGAPZα-CalBsyn
mengalami mutasi titik berupa delesi satu nukleotida. Site Directed Mutagenesis
(SDM) dilakukan untuk mengganti basa nitrogen pada salah satu titik yang
diinginkan. SDM dilakukan untuk mengubah residu asam amino spesifik pada
protein. Pada teknik mutagenesis ini, urutan DNA yang mengkode protein dan
posisi asam amino yang akan diganti harus diketahui dengan akurat (Glick dan
Pasternak 2003). SDM dilakukan untuk memperbaiki sekuen sinyal peptida pada
alpha-mating factor dengan melakukan satu mutasi titik. SDM dilakukan melalui
amplifikasi PCR dengan menggunakan primer MFα-F dan MFα-R yang
mengandung modifikasi fosforilasi pada ujung 5’. Selanjutnya dilakukan ligasi
pada produk PCR dengan DNA ligase T4 yang dilanjutkan dengan transformasi ke
E. coli TOP10F’. Kemudian dilakukan verifikasi produk SDM dengan teknik
sekuensing. Hasil dari sekuensing menunjukkan adanya penambahan basa nitrogen
adenin (Gambar 6). Hasil analisis sekuen pGAPZα-CalBsyn dengan primer GAP-F
disajikan pada Lampiran 5.

14

Gambar 6 Hasil Site Directed Mutagenesis faktor-α dengan penambahan basa
nitrogen adenin
Plasmid rekombinan pGAPZα-CalBsyn-cbm dikonstruksi dengan cara
menyisipkan gen cbm pada plasmid rekombinan pGAPZα-CalBsyn. Gen cbm
diligasikan pada situs restriksi ClaI. Situs restriksi ClaI diintroduksikan ke ujung 5’
dan ujung 3’ gen cbm dengan teknik PCR. Sebelum diligasi, plasmid rekombinan
pGAPZα-CalBsyn dan gen cbm dipotong terlebih dahulu dengan enzim ClaI.
Enzim ClaI memiliki pola pemotongan sticky end sehingga akan mempermudah
proses ligasi. Vektor pGAPZα-CalBsyn yang telah dipotong, diinkubasi dengan
enzim Fast AP (alkaline phosphatase) untuk mencegah terjadinya self ligation
dengan cara menghilangkan gugus fosfat pada ujung 5’ (Glick dan Pasternak 2003).
Hasil potong plasmid rekombinan tersebut memperlihatkan adanya satu fragmen
DNA berukuran 4236 pb sedangkan hasil potong dari gen cbm memiliki ukuran
sekitar 249 pb (Gambar 7).

A
B
Gambar 7 Hasil pemotongan pGAPZα-CalBsyn dan gen cbm dengan enzim ClaI.
(A) M= DNA marker 1kb, 1= pGAPZα-CalBsyn dipotong dengan
enzim ClaI, 2= pGAPZα-CalBsyn tidak dipotong; (B) M= DNA marker
100 pb, 1= gen cbm yang dipotong dengan enzim ClaI, 2= gen cbm
tidak dipotong.
Proses ligasi pGAPZα-CalBsyn dengan cbm untuk mengkonstruksi vektor
rekombinan pGAPZα-CalBsyn-cbm (Gambar 8) dilakukan dengan menggunakan
enzim T4 DNA ligase. Enzim ini berfungsi mensintesis pembentukan ikatan
fosfodiester yang menghubungkan nukleotida baru dengan nukleotida di
sebelahnya sehingga dihasilkan plasmid rekombinan. Hasil ligasi diintroduksi ke
dalam sel E.coli TOP10F’ dengan metode kejut panas (heat shock) dan
ditumbuhkan pada medium LSLB agar yang mengandung 25 µg/ml zeosin.

15

Gambar 8 Vektor rekombinan pGAPZα-CalBsyn-cbm yang dikonstruksi
Transformasi E. coli menghasilkan 8 koloni yang diduga membawa plasmid
pGAPZα-CalBsyn-cbm (Gambar 9). Kontrol religasi menggunakan plasmid
rekombinan pGAPZα-CalBsyn tanpa sisipan cbm yang dipotong dengan ClaI.
Adanya koloni yang tumbuh pada kontrol religasi menunjukkan bahwa telah terjadi
proses self ligation yang cukup banyak. Penyebab terjadinya religasi antara lain
adalah proses defosforilasi dengan enzim Fast AP yang belum optimal sehingga
plasmid pGAPZα-CalBsyn dapat tereligasi kembali (Cranenburgh 2003).

Gambar 9 Hasil transformasi pGAPZα-CalBsyn-cbm ke dalam E.coli TOP10F’.
(1) Hasil ligasi pGAPZα-CalBsyn-cbm; (2) kontrol negatif; (3) kontrol
positif.
Ada beberapa faktor yang berpotensi mempengaruhi efisiensi transformasi,
diantaranya kondisi inkubasi, konsentrasi plasmid, kondisi relatif sel kompeten dan
kehadiran DNA kontaminan (Classen et al. 2002). Faktor efisiensi ligasi juga turut
mempengaruhi keberhasilan insersi gen ke dalam plasmid. Efisiensi ligasi dapat
dipengaruhi oleh berbagai faktor seperti posisi situs restriksi, jenis situs restriksi
dan urutannya serta jenis enzim yang memotong situs restriksi (Dhesi 2005).
Berbagai enzim restriksi telah diteliti untuk menentukan pengaruh konten
nukleotida G-C dan atau panjang nukleotida yang menggantung yang mungkin
menjadi faktor dalam ligasi oleh T4 DNA ligase. Hasil penelitian Bola (2005)
menunjukkan bahwa ujung kohesif kaya G-C nukleotida memiliki efisiensi ligasi
terbaik dibandingkan dengan ujung kohesif lainnya. Efisiensi ligasi ujung kohesif
yang mengandung nukleotida A,T,G,C akan lebih tinggi jika daerah nukleotida
yang menggantung lebih panjang dibandingkan nukleotida yang menggantung

16
ukurannya pendek. Ujung kohesif kaya A,T nukleotida memliki efisiensi ligasi
yang paling rendah.
Koloni E.coli kemudian diverifikasi dengan beberapa cara, diantaranya
adalah melalui PCR koloni, pemotongan dengan menggunakan enzim restriksi dan
analisis sekuen DNA. PCR koloni dilakukan untuk verifikasi keberadaan sisipan
gen cbm di dalam plasmid rekombinan pGAPZα-CalBsyn-cbm. PCR koloni
dilakukan menggunakan pasangan primer CBM_F dan CBM_R. Hasil PCR koloni
menunjukkan bahwa 5 dari 8 sampel koloni yang dianalisis diduga mengandung
gen cbm dengan ukuran 249 pb (Gambar 10). Sampel tersebut kemudian
diverifikasi dengan penentuan arah orientasi dari struktur cbm.

Gambar 10 Hasil PCR koloni dengan pasangan primer CBM F/R. M= DNA marker
100 pb; 1-6= klon transforman pGAPZα-CalBsyn-cbm; 7= kontrol
positif; 8= kontrol negatif

Transformasi Pichia pastoris dengan Plasmid Rekombinan
Plasmid rekombinan pGAPZα-CalBsyn yang akan diintroduksikan ke dalam
genom P.pastoris terlebih dahulu dipotong menjadi bentuk linier dengan enzim
BspHI. Hasil potong kemudian dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa 1% dan
menunjukkan adanya pita tunggal berukuran sekitar 4236 pb (Gambar 11). Vektor
rekombinan yang telah dipotong dan dipurifikasi kemudian dihitung konsentrasinya
untuk selanjutnya diintroduksi ke dalam genom P.pastoris SMD1168H.

Gambar 11 Hasil pemotongan pGAPZα-CalBsyn dengan enzim BspHI (PagI). (M)
marker 1 kb; (1) hasil potong vektor rekombinan dengan enzim BspHI;
(2) vektor rekombinan yang tidak dipotong dengan enzim BspHI.

17
Plasmid rekombinan telah berhasil diintroduksikan ke dalam genom P.
pastoris SMD1168H (Gambar 12). Plasmid rekombinan ini menyisip ke dalam
genom P. pastoris melalui mekanisme rekombinasi homologus dengan
memanfaatkan kesamaan sekuen promotor GAP yang terdapat pada genom P.
pastoris dan vektor pGAPZα (Gambar 13). Vektor dirancang untuk terintegrasi ke
dalam genom P. pastoris sehingga memungkinkan ekspresi protein menjadi stabil.
Transformasi plasmid rekombinan menghasilkan 64 koloni tunggal transforman P.
pastoris dengan efisiensi transformasi sebesar 1,01 x 102 cfu/µg DNA (lampiran 6).
Efisiensi transformasi P. pastoris tergolong rendah karena plasmid tidak hanya
masuk ke dalam sel tetapi juga harus terintegrasi ke dalam genom melalui
rekombinasi homolog. Efisiensi transformasi yang rendah biasanya terjadi karena
situs integrasi yang tidak efisien, DNA sisipan yang sulit dan kondisi transformasi
tidak optimal (Wu dan Letchworth, 2004).

Gambar 12 Hasil introduksi plasmid rekombinan pGAPZα-CalBsyn ke dalam
genom P.pastoris SMD1168H.

Gambar 13. Integrasi vektor rekombinan pada genom P. pastoris
Sumber: Invitrogen 2002
Seleksi P. pastoris Transforman
Vektor telah dirancang mengandung gen penyandi resistensi zeosin, yaitu gen
Sh ble dari Streptoalloteichus hindustanus. Proses seleksi transforman pada media
seleksi zeosin bertujuan untuk memperoleh transforman yang memiliki kestabilan
genetik dan memiliki beberapa salinan gen. Konsenstrasi zeosin yang digunakan
yaitu 100 µg/mL, 200 µg/mL, 500 µg/mL, dan 1000 µg/mL. P