Konstruksi Vektor Ekspresi Dan Ekspresi Protein Rekombinan Superoksida Dismutase (Cuznsod) Dari Melastoma Malabathricum L. Pada Escherichia Coli.

KONSTRUKSI VEKTOR EKSPRESI DAN EKSPRESI
PROTEIN REKOMBINAN SUPEROKSIDA DISMUTASE
(CuZnSOD) DARI Melastoma malabathricum L.
PADA Escherichia coli

NURUL HOLIFAH

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Konstruksi Vektor
Ekspresi dan Ekspresi Protein Rekombinan Superoksida Dismutase (CuZnSOD)
dari Melastoma malabathricum L. pada Escherichia coli adalah benar karya saya
bersama komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, November 2015
Nurul Holifah
NRP P051130141

RINGKASAN
NURUL HOLIFAH. Konstruksi Vektor Ekspresi dan Ekspresi Protein
Rekombinan Superoksida Dismutase (CuZnSOD) dari Melastoma malabathricum
L. pada Escherichia coli. Dibimbing oleh SUHARSONO dan UTUT
WIDYASTUTI
Gen CuZn-SOD penyandi superoksida dismutase yang diisolasi dari
tanaman Melastoma malabathricum L. telah berhasil diintroduksikan ke dalam
genom tanaman tembakau dan padi. Namun sampai saat ini analisis protein yang
diekspresikan belum dilakukan karena belum adanya antibodi spesifik untuk
MmCuZnSOD. Pembuatan Antibodi MmCuZnSOD dapat dilakukan dengan
memasukkan protein MmCuZnSOD kedalam tubuh hewan. Namun, kandungan
protein ini pada tanaman sangat rendah, sehingga protein ini sulit diisolasi dan
dipurifikasi dari tanaman. Hal ini dapat diatasi dengan melakukan ekspresi protein
MmCuZnSOD secara berlebih di dalam sel bakteri Escherichia coli. Tujuan

penelitian ini adalah mengkonstruksi vektor ekspresi untuk gen MmCuZnSOD dan
mengekspresikan secara berlebih untuk memproduksi protein antigen.
Penelitian dimulai dari konstruksi vektor ekspresi pET-14b-CuZnSOD yang
membawa gen MmCuZnSOD dan vektor tersebut diintroduksi ke dalam E. coli
strain Rosetta (DE3) sebagai sel inang. Optimasi ekspresi protein dilakukan
dengan penentuan konsentrasi IPTG (0.1 mM, 0.3 mM, 0.5 mM dan 1 mM), lama
waktu induksi (2 jam, 4 jam, 6 jam dan 8 jam) dan suhu (30 oC dan 37 oC)
optimum. Analisis protein dilakukan dengan fraksinasi protein untuk memisahkan
fraksi insoluble dan soluble dengan enzim lisosim dan sonikasi. Protein
MmCuZnSOD dipurifikasi menggunakan kromatografi afinitas Ni-NTA dan
elektroelusi protein. Protein hasil pemurnian diendapkan menggunakan aseton.
Pada penelitian ini gen MmCuZnSOD berhasil disisipkan ke dalam vektor
pET-14b. Verfikasi dilakukan dengan PCR koloni menggunakan primer T7 dan
SOD-R menghasilkan amplikon yang berukuran 609 pb yang sesuai dengan
ukuran dari daerah promoter sampai multiple cloning site (150 pb) dan gen
MmCuZnSOD (459 pb). Pemotongan dengan enzim restriksi NdeI dan EcoRI
menghasilkan dua pita DNA berukuran 4152 pb dan 978 pb. Pengurutan urutan
DNA menunjukkan bahwa gen ini telah berfusi dengan penyandi His-tag pada
ujung N-terminal. Berdasarkan hasil optimasi ekspresi, kondisi optimum untuk
sintesis protein MmCuZnSOD adalah konsentrasi IPTG 0.5 mM dengan induksi

selama enam jam pada suhu 37 oC. Analisis lebih lanjut menggunakan SDS-PAGE
menunjukkan bahwa protein MmCuZnSOD yang telah berfusi dengan 6x histidin
memiliki ukuran 15 kDa dan terdapat pada kedua fraksi soluble dan insoluble.
Analisis western blot dengan anti-histidin menunjukkan bahwa protein
rekombinan MmCuZnSOD berhasil dipurifikasi dari fraksi insoluble dalam
kondisi denaturasi dengan 8M urea menggunakan kromatografi afinitas Ni-NTA.
Purifikasi dengan metode elektroelusi menghasilkan protein dengan kemurnian
tinggi tetapi dalam konsentrasi rendah sehingga dilakukan pengendapan
menggunakan aseton dengan konsentrasi aseton 50%. Protein murni yang
dihasilkan adalah sebesar 3.75 mg dari 350 mL kultur sel.
Kata kunci: Superoksida dismutase, MmCuZnSOD, protein rekombinan.

SUMMARY
NURUL HOLIFAH. Construction of Expression Vector and Expression of
Superoxide dismutase (CuZnSOD) Recombinant Protein from Melastoma
malabathricum L. in Escherichia coli. Supervised by SUHARSONO and UTUT
WIDYASTUTI
The cDNA CuZnSOD encoding superoxide dismutase successfully isolated
from Melastoma malabathricum L was successfully introduced into the genom of
Nicotiana tabacum and Rice. Development of antibody and antigen can be carried

out to reveal the presence of protein or enzyme in complex biochemical reactions.
Antibodies synthesis can be done by inserting the MmCuZnSOD antigen into the
animal. This MmCuZnSOD enzyme is difficult to be purified from plants due to
insufficient quantity for production of high quality antibodies. Molecular biology
techniques are currently use to express the genes of interest in heterologous
systems to produce high quantity and pure antigen for antibody production. The
aim this research was to construct the expression vector for MmCuZnSOD and to
over-express the MmCuZnSOD gene in Escherichia coli to prepare large
quantities of antigen.
In this study, cDNA-MmCuZnSOD was successfully inserted into pET-14b
expression vector and introduced into E. coli strain Rosetta (DE3) as host cells.
Optimization of protein expression was done by determining the concentration of
IPTG (0.1 mM, 0.3 mM, 0.5 mM dan 1 mM), induction time (2h, 4h, 6h, and 8h)
and optimum temperature (30 oC and 37 oC). The proteins were extracted by
sonication and lysozime to separate the insoluble and soluble fractions. Pellet
cells as an insoluble fraction and the supernatant containing soluble proteins were
analyzed using SDS-PAGE. The MmCuZnSOD protein was purified by affinity
chromatography column of Ni-NTA agarose under denaturing condition and
electroelution. The purified protein was precipited by aceton.
The results showed that MmCuZnSOD gene was successfully inserted into

pET-14b. Verification was done by colony PCR using T7P-F and SOD-R
amplifying 609 bp composed of 150 bp of the region from promoter to multiple
cloning site and 459 bp of MmCuZnSOD gene). The recombinant pET-14bMmCuZnSOD was identified by double digestion analysis with NdeI and EcoRI
enzymes. Two separated bands of 4152 bp and 978 bp were visualized.
Sequencing analysis showed that the MmCuZnSOD gene was fused with His-tag
at N-terminal. Optimum expression condition was achieved through induction by
adding 0.5 mM IPTG for six hours at 37 oC. The cDNA encodes MmCuZnSOD
protein of 154 amino acids was expressed at size 15 kDa and it was present in
both soluble and insoluble fraction. Western blott analysis used anti-histidin
antibody showed that fusion protein was purified from insoluble fraction under
denaturing conditions with 8M urea using affinity chromatography. Purified
protein from electroelution generated high purity but the concentration was low.
Precipitation with 50 % of aceton can increase the concentration of protein
yielding 3 mg protein per 350 mL.
Keywords: Superoxide dismutase, MmCuZnSOD, recombinant protein

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,

penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB.

KONSTRUKSI VEKTOR EKSPRESI DAN EKSPRESI
PROTEIN REKOMBINAN SUPEROKSIDA DISMUTASE
(CuZnSOD) DARI Melastoma malabathricum L.
PADA Escherichia coli

NURUL HOLIFAH

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Bioteknologi

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si

PRAKATA
Puji syukur kepada Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya
sehingga penulis dapat menyelesaikan rangkaian penelitian dan penulisan tesis
yang berjudul Konstruksi Vektor Ekspresi dan Ekspresi Protein Rekombinan
Superoksida Dismutase (CuZnSOD) dari Melastoma malabathricum L. pada
Escherichia coli. Penelitian ini di biayai oleh Program Riset Pengembangan
IPTEK Tahun Anggaran 2015 Nomor: 064/SP2H/PL/Dit.Litabmas/V/2015
Tanggal 28 Mei 2015 atas nama Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA. Penelitian ini
dilakukan di Laboratorium BIORIN (Biotechnology Research Indonesia-The
Netherlands), Institut Pertanian Bogor dan Laboratorium Genetik Universitas
Kassel, Jerman.
Penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada bapak
Prof. Dr. Suharsono, DEA dan Ibu Dr. Utut Widyastuti, M.Si selaku pembimbing
penelitian atas segala perhatian dan bimbingannya selama penelitian dan

penulisan naskah tesis ini. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Prof.
Wolfgang Nellen yang telah membimbing selama penulis mengikuti program
Exchange Student Indonesian Germany Network (IGN ttrc) dan Dr. Ir. Iman
Rusmana, M.Si selaku penguji yang telah memberikan masukan sehingga
memperkaya tulisan ini. Penulis mengucapkan terimakasih kepada ayah, ibu,
Zainollah, serta seluruh keluarga atas segala doa dan kasih sayangnya. Terima
kasih kepada teknisi laboratorium yang telah banyak membantu dalam penelitian
ini. Ungkapan terima kasih juga kepada keluarga besar Laboratorium Biorin,
Laboratorium Genetik Uni-Kassel, Bioteknologi 2013 dan Himawipa IPB yang
telah banyak membantu penulis.
Penyusunan karya ilmiah ini tentunya tidak terlepas dari kekurangan. Oleh
karena itu, penulis mengharapkan adanya saran dan kritik yang membangun untuk
menyempurnakan penulisan karya ilmiah ini. Penulis berharap semoga penelitian
ini dicatat sebagai amal ibadah dan bermanfaat bagi masyarakat.
Bogor, November 2015
Nurul Holifah

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

vi

DAFTAR GAMBAR

vi

DAFTAR LAMPIRAN

vi

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian

1
1
2
2

2

3 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Bahan
Prosedur

3
3
3
3

4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Konstruksi Vektor Rekombinan
Optimasi Ekspresi Protein Rekombinan MmCuZnSOD
Purifikasi Protein Rekombinan MmCuZnSOD

8
8
10

14

5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran

16
16
16

DAFTAR PUSTAKA

17

LAMPIRAN

20

RIWAYAT HIDUP

26

DAFTAR TABEL
1

Hasil pengukuran protein rekombinan MmCuZnSOD

13

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9

Peta plasmid pGEM-MmCuZnSOD
Konstruksi vektor rekombinan
Hasil transformasi E. coli DH5α dengan pET-14b-MmCuZnSOD
Verifikasi konstruksi cDNA-MmCuZnSOD pada plasmid pET-14b
dalam Escherichia coli.
Optimasi konsentrasi IPTG dan waktu induksi ekspresi protein
rekombinan MmCuZnSOD.
Optimasi suhu induksi ekspresi protein rekombinan MmCuZnSOD
Analisis SDS-PAGE fraksinasi protein rekombinan MmCuZnSOD
Purifikasi protein rekombinan MmCuZnSOD menggunakan kolom
afinitas Ni-NTA
Analisis SDS-PAGE protein rekombinan MmCuZnSOD hasil
elektroelusi dan pengendapan dengan aseton

3
9
9
10
11
12
13
14
15

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6

Urutan basa nitrogen plasmid rekombinan pET-14b-MmCuZnSOD
Komposisi media pertumbuhan bakteri Luria-Bertani (LB)
Komposisi reagen lowry
Komposisi gel SDS-PAGE 15%
Komposisi larutan western blot
Komposisi larutan elektroforesis SDS-PAGE

19
20
21
22
23
24

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Reactive oxygen species (ROS) merupakan molekul tidak stabil karena
mengalami reduksi oleh elektron sehingga bersifat sangat reaktif. Radikal
superoksida (O2-), hidrogen peroksida (H2O2) dan radikal hidroksil (OH-) adalah
bentuk molekul ROS (Qu et al. 2010). Produksi ROS dalam sel terjadi pada
metabolisme secara normal dalam kondisis aerob. Peningkatan produksi ROS
terjadi saat tanaman mengalami cekaman lingkungan (Shaban et al. 2013) yang
dapat menyebabkan sel menuju kearah kematian (Verma dan Dubey 2003).
Tanaman memiliki mekanisme pertahanan terhadap efek cekaman oksidatif secara
enzimatik dengan produksi enzim-enzim antioksidan, salah satunya adalah
superoksida dismutase (SOD) (Aydin et al. 2014).
Superoksida dismutase (SOD) merupakan enzim antioksidan yang
berperan sebagai barisan pertahanan pertama dalam menetralkan radikal bebas
dengan mengkatalisis perubahan O2- menjadi molekul O2 dan H2O2 (Rueda et al.
2013). Enzim ini diklasifikasikan kedalam tiga tipe berdasarkan kofaktor logam
pada sisi aktif enzim dan distribusinya dalam sel yaitu: enzim copper/zinc (CuZnSOD) di sitosol, kloroplas, dan peroksisom, besi (Fe-SOD) di kloroplas, dan
mangan (Mn-SOD) di mitokondria dan peroksisom (Alscher 2002). Ekspresi SOD
pada tanaman menjadi sangat penting terkait akumulasi ROS yang disebabkan
oleh cekaman lingkungan seperti seperti ozon, kekeringan, suhu rendah, salinitas
dan logam berat. Pengetahuan enzim SOD pada tanaman untuk mekanisme
pertahanan menjadi dasar dalam meningkatkan resistensi tanaman terhadap
cekaman lingkungan.
Saat ini banyak penelitian mengarah ke peningkatan toleransi tanaman
terhadap cekaman lingkungan melalui rekayasa genetika dengan melakukan
ekspresi enzim SOD secara berlebih (overexpression). Pada beberapa tanaman
transgenik, contohnya Festuca arundinacea (Lee et al. 2007), kapas (Luo et al.
(2013) dan sawi (Basu et al. 2001). Ekspresi gen CuZn-SOD secara berlebih dapat
meningkatkan toleransi tanaman tersebut terhadap cekaman lingkungan akibat
meningkatnya aktivitas enzim SOD.
Gen CuZn-SOD penyandi superoksida dismutase berhasil diisolasi dari
tanaman Melastoma malabathricum L. (Hannum 2012). Gen ini telah digunakan
dalam perakitan beberapa tanaman yang toleran teradap cekaman Al3+ melalui
ekspresi gen MmCuZnSOD secara berlebih, antara lain pada tanaman tembakau
(Hannum 2012) dan padi (Davis 2012). Namun sampai saat ini belum dilakukan
analisis ekspresi pada tingkat protein karena belum adanya antibodi spesifik
MmCuZnSOD. Pada perkembangannya ikatan antibodi dan antigen dapat
dimanfaatkan untuk mengungkapkan keberadaan dari suatu protein ataupun enzim
dalam kompleks reaksi biokimia. Analisis ekspresi protein dapat dilakukan
dengan beberapa metode antara lain: western blotting (Lauterbach et al. 2007),
ELISA (Shakuja et al. 2009), dan immunohistokimia (Hackell et al. 2006)
menggunakan antibodi spesifik. Pembuatan Antibodi MmCuZnSOD dapat
dilakukan dengan memasukkan protein MmCuZnSOD ke dalam tubuh hewan.
Namun, kandungan protein ini pada tanaman sangat rendah, sehingga sulit

2
melakukan isolasi dan purifikasi secara langsung dari sel tanaman. Hal ini dapat
diatasi dengan melakukan ekspresi protein MmCuZnSOD secara berlebih pada sel
bakteri Escherichia coli untuk produksi protein dalam jumlah banyak.
Teknik ekspresi protein secara berlebih dalam sel Escherichia coli telah
digunakan untuk produksi protein mantel Pelargonium zonate spot virus (Shakuja
et al. 2009), protein Interferon-gamma manusia (HIFN-gamma) (Babaeipour et al.
2007) dan protein Malaysian Highly Virulent Infectious Bursal Disease Virus
(hvIBDV) pada tanaman tembakau (Mohtar et al. 2013). Escherichia coli sering
digunakan dalam produksi protein rekombinan karena memiliki pertumbuhan
yang cepat, ekonomis dalam jumlah yang besar (Donahue dan Bebee 1999) dan
sedikit modifikasi pasca translasi (Shakuja et al. 2009).
Pada penelitian ini, cDNA MmCuZn-SOD digunakan sebagai materi
genetik untuk produksi protein rekombinan superoksida dismutase dan
dikonstruksi ke dalam vektor ekspresi pET-14b yang mengandung 6x-His•Tag
sebagai penanda dalam purifikasi. Plasmid ini di introduksikan kedalam E. coli
strain Rosetta (DE3) dibawah promotor kuat T7. Protein rekombinan
MmCuZnSOD yang diperoleh, selanjutnya digunakan sebagai antigen untuk
pembuatan antibodi MmCuZnSOD.
Perumusan Masalah
Pembuatan antibodi spesifik MmCuZnSOD membutuhkan protein
MmCuZnSOD sebagai antigen. Namun, kandungan protein ini pada tanaman
sangat rendah menyebabkan sulitnya melakukan isolasi dan purifikasi secara
langsung dari sel tanaman sehingga perlu dilakukan ekspresi protein rekombinan
melalui cDNA-MmCuZnSOD pada sel bakteri Escherichia coli untuk produksi
protein dalam jumlah banyak.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengkonstruksi vektor ekspresi
rekombinan, mengekspresikan protein rekombinan MmCuZnSOD melalui
ekspresi cDNA-MmCuZnSOD secara berlebih pada sel bakteri Escherichia coli
dan mempurifikasi protein rekombinan untuk mendapatkan protein murni yang
akan digunakan sebagai antigen.
Manfaat Penelitian
Teknik rekayasa genetika memberikan keuntungan untuk memproduksi
protein rekombinan MmCuZnSOD dalam jumlah banyak dan waktu cepat dengan
kondisi murni. Protein yang diperoleh dari penelitian ini digunakan sebagai
antigen dalam pembuatan antibodi MmCuZnSOD. Antibodi yang terbentuk
digunakan untuk analisis ekspresi protein MmCuZnSOD pada tanaman.

3

2 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan pada bulan April 2014 sampai Juli 2015 di
Laboratorium BIORIN (Biotechnology Research Indonesia - The Netherlands),
PPSHB (Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi) Institut Pertanian
Bogor dan Laboratorium Genetik Universitas Kassel, Jerman.
Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah bakteri E. coli strain
DH5α yang mengandung plasmid rekombinan pGEM-MmCuZn-SOD sebagai
sumber gen (Gambar 1.). Fragmen gen di isolasi dengan teknik polymerase chain
reaction (PCR) menggunakan pasangan primer spesifik dengan penambahan situs
restriksi yaitu SOD-XhoI-F: 5’-TTCTCGAGATGGTGAAGGCTGTGG-3’ dan
SOD-BamHI-R 5’-GCGGATCCAGAGGTAGCTTAACCCT-3’. Fragmen gen
SOD dan pET-14b sebagai vektor ekspresi dipotong menggunakan enzim restriksi
BamHI dan XhoI yang kemudian diligasikan dengan T4 ligase. Bakteri DH5α
sebagai sel inang untuk konstruksi vektor rekombinan dengan penanda seleksi
antibiotik ampisilin. Bakteri E. coli strain Rosetta (DE3) digunakan sebagai sel
inang untuk ekspresi protein MmCuZnSOD dengan penanda seleksi antibiotik
kloramfenikol.

Gambar 1.

Peta plasmid pGEM-MmCuZn SOD (3839 bp) yang terdiri dari
vektor pGEM-T Easy (3015 pb) dan full length cDNA-MmCuZnSOD (824 pb)
Prosedur

Konstruksi cDNA- MmCuZn-SOD pada
cDNA-MmCuZnSOD telah diisolasi dari Melastoma malabathricum L.
dan dikonstruksi dalam vektor pGEMT-Easy (Hannum 2012). Fragmen open
reading frame (ORF) diisolasi menggunakan polymerase chain reaction (PCR)

4
melalui amplifikasi dari plasmid rekombinan pGEM-MmCuZn-SOD dengan
pasangan primer spesifik SOD-XhoI-F dan SOD-BamHI-R yang telah didesain
dengan penambahan situs restriksi XhoI dan BamHI pada ujungnya. Kondisi PCR
untuk mengamplifikasi gen MmCuZnSOD adalah pra-denaturasi 94 oC selama 10
menit, denaturasi 94 oC selama 1 menit, annealing 55 oC selama 45 detik, ekstensi
72 oC selama 1 menit dan final ekstensi 72 oC selama 10 menit dengan jumlah
siklus 35. Produk PCR dan vektor pET-14b dipotong dengan enzim restriksi XhoI
dan BamHI pada suhu 37 oC selama semalam. Hasil pemotongan DNA sisipan
dan vektor, masing-masing dipurifikasi dari gel agarosa menggunakan kit
(Geneaid) dan diligasi menggunakan enzim T4 DNA ligase selama semalam pada
suhu 4 oC (Sambrook et al. 1989). Hasil ligasi diintroduksikan ke dalam bakteri
E. coli strain DH5α dengan metode heat shock . Enam koloni E. coli yang tumbuh
pada media seleksi antibiotik ampisilin dikonfirmasi dengan PCR koloni
menggunakan pasangan primer spesifik promoter T7-P dan SOD-BamHI-R. E.
coli transforman yang mengandung gen target ditumbuhkan pada media LB cair
untuk isolasi plasmid menggunakan Gene JET Plasmid Miniprep KIT (Thermo
Scientific), kemudian dipotong dengan enzim restriksi NdeI dan EcoRI. Plasmid
rekombinan yang diperoleh diintroduksi ke dalam E. coli Rosetta (DE3) untuk
ekspresi protein rekombinan MmCuZnSOD. Bakteri yang mengandung plasmid
rekombinan kemudian dianalisis dengan PCR koloni dan dilanjutkan dengan
analisis sekuensing.
Transformasi Escherichia coli
Transformasi E. coli dilakukan dengan metode heat shock (Sambrook et
al. 2001). Pembuatan sel kompeten dilakukan dengan menumbuhkan E. coli strain
DH5α dalam 2 mL LB (Luria-Bertani broth) dan diinkubasi pada suhu 37 oC
dalam inkubator goyang pada kecepatan 150 rpm selama semalam. Selanjutnya
200 µL kultur E. coli di subkultur dalam 5 mL LB dan diinkubasi kembali pada
suhu 37 oC sampai OD600 ~ 0.4. Pemanenan dilakukan dengan sentrifugasi pada
kecepatan 5000 rpm, suhu 4 oC selama 10 menit. Supernatan hasil sentrifugasi
dipisahkan dari pellet sel, sebanyak 495 µL larutan buffer CaCl2 ditambahkan
kedalam pellet kemudian diinkubasi dalam es selama 10 menit. Suspensi sel
disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm, suhu 4 oC selama 10 menit. Pellet sel
yang diperoleh dilarutkan dalam 125 µL buffer CaCl2 dan 8.8 µL DMSO. Sel
kompeten yang diperoleh selanjutnya digunakan dalam proses transformasi.
Proses transformasi dilakukan dengan mencampur 50 µL sel kompeten dan 20 µL
hasil ligasi, kemudian diinkubasi di dalam es selama 30 menit. Proses heat shock
dilakukan pada suhu 42 oC selama 45 detik, dengan segera dipindahkan ke dalam
es selama lima menit. Sel diberi 100 µL LB dan diinkubasi pada suhu 37 oC
selama satu jam. Setelah proses recovery selesai, sel bakteri ditumbuhkan ke
dalam media LB agar yang mengandung 50 mg L−1 ampisilin sebagai penanda
seleksi. Sel kompeten juga ditumbuhkan di media LB agar yang mengandung
antibiotik dan tanpa antibiotik sebagai kontrol.
Transfrormasi E. coli strain Rosetta (DE3) dengan plasmid rekombinan
pET-14b-MmCuZnSOD juga dilakukan dengan metode heat shock menggunakan
penanda seleksi antibiotik ampisilin 50 mg L−1 dan kloramfenikol 34 mg L−1.

5
Ekspresi Protein Rekombinan CuZnSOD di Escherichia coli
Ekspresi protein rekombinan dilakukan dengan menumbuhkan klon
terpilih bakteri E. coli strain Rosetta (DE3) yang telah membawa konstruk
plasmid rekombinan ke dalam 2 ml media LB mengandung 50 mg L−1 ampisilin
selama 16 jam dalam inkubator shaker pada suhu 37 oC dengan kecepatan 220
rpm sebagai kultur starter. Sebanyak 10 mL medium di inokulasi dengan 1 mL
kultur starter lalu di tumbuhkan pada 37 oC sampai mencapai OD600 = 0.5.
Optimasi ekspresi protein diinduksi dengan dengan perlakuan berupa perbedaan
penambahan konsetrasi IPTG yaitu 0 mM (tanpa IPTG), 0. 1 mM, 0.3 mM, 0.5
mM dan 1 mM selama 4 jam. Analisis ekspresi dilakukan dengan mengambil 1.5
mL dari kultur bakteri kemudian sentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama
10 menit. Endapan diresuspensi dalam buffer Laemmli untuk analisis SDS-PAGE.
Konsentrasi IPTG yang optimum digunakan untuk menentukan lama waktu
induksi optimum. Periode waktu induksi yang digunakan adalah 2, 4, 6 dan 8 jam.
Kombinasi konsentrasi IPTG dan lama waktu diinduksi digunakan untuk
menentukan suhu ekspresi protein yang optimum. Delapan klon bakteri E. coli
rekombinan terpilih ditumbuhkan pada dua suhu yang berbeda yaitu suhu 30oC
dan 37oC dan diinduksi dengan 0.5 mM IPTG selama 6 jam pada suhu tersebut.
Sebanyak 1.5 mL dari kultur bakteri kemudian sentrifugasi pada 10.000 rpm
selama 10 menit. Endapan sel diresuspensi dalam buffer Laemmli untuk western
blot menggunakan anti-histidin sebagai antibodi primer dan Goat anti-mouse IgG
sebagai antibodi sekunder.
Analisis selanjutnya fraksinasi protein dilakukan dengan memisahkan
fraksi insoluble dan soluble. Protein diekstraksi dari endapan sel yang
diresuspensi dalam buffer lisis mengandung (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl,
lisosim) dan disonikasi sampai larut. Fraksi insoluble dan soluble dipisahkan
dengan sentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm, 4oC selama 30 menit. Endapan
sel sebagai fraksi insoluble dan supernatan mengandung protein soluble dianalisis
menggunakan sodium dodecyl sulphete-polyacrilamide gel (SDS-PAGE).
Purifikasi Protein menggunakan Kolom Afinitas Kromatografi Ni-NTA resin
Purifikasi protein menggunakan kolom afinitas kromatografi Ni-NTA
resin (Jena Bioscience). Protein kasar diekstrak dari fraksi intraseluler (pellet sel).
Ekstraksi protein dilakukan dengan penambahan buffer NPI-10 pH 8.0 (50 mM
NaH2PO4, 300 mM NaCl dan 10 mM imidazol) dan 1 mg mL-1 lisosim pada pellet
sel bakteri. Suspensi sel disonikasi selama tiga menit dan disentrifugasi pada
kecepatan 12.000 rpm, suhu 4 oC selama 20 menit. Endapan yang merupakan
fraksi insoluble disolubelisasi dengan menambahkan buffer DNP1-10 pH 8.0 (50
mM NaH2PO4, 300 mM NaCl dan 10 mM imidazol dan 8 M Urea) dan disonikasi
sampai endapan terlarut sempurna. Suspensi disentrifiugasi dengan kecepatan
12.000 rpm pada suhu 20 oC selama 20 menit. Cairan yang diperoleh digunakan
untuk analisis SDS-PAGE dan purifikasi.
Resin diequilibrasi dengan memasukkan buffer DNPI-10 kedalam kolom.
Selanjutnya sampel protein dimasukkan kedalam kolom dengan perbandingan
resin: protein (1:1) dan inkubasi 30 menit. Larutan yang keluar dari kolom
(protein unbinding) ditampung dalam microtube untuk analisis. Kemudian

6
dilakukan pencucian dengan menambahkan buffer DNPI-20 pH 8.0 (50 mM
NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole dan 8 M urea). Protein di elusi
dengan buffer DNPI-250 pH 8.0 (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM
imidazole dan 8 M urea). Protein rekombinan MmCuZnSOD murni kemudian
dianalisis secara kuantitatif dengan metode Lowry (Lowry et al. 1951) dan secara
kualitatif menggunakan SDS-PAGE (Garfin 1990).
Perhitungan Konsentrasi Protein
Perhitungan konsentrasi protein terlarut menggunakan metode Lowry
(Alakaline Copper Reduction assay). Kandungan protein diukur dengan
memasukkan 1 ml sampel ke dalam tabung reaksi yang berisi larutan pereaksi
mengandung 2 % natrium karbonat dalam NaOH 0.1 N dan 0.5 % CuSO45H2O
dalam 1% Na-K-Tartarat. Larutan diinkubasi dalam suhu ruang selama 10 menit,
kemudian di tambah dengan 0.5 mL larutan folin ciocalteau. Konsentrasi protein
diukur pada panjang gelombang 500 nm mengggunakan spektrofotometer.
Standart protein yang digunakan adalah protein BSA.
Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrilamide Gel (SDS-PAGE)
Analisis SDS-PAGE dilakukan dengan konsentrasi akrilamida 15% untuk
separating gel yang terdiri dari 5 mL akrilamid 30%, 2.5 mL Tris-HCl pH 8.8,
100 μL SDS 10%, 5 μL N, N, N', N'-tetramethylethylenediamine (TEMED) dan
50 μL ammonium persulfate (APS) 10% dan konsentrasi akrilamid 4,5% untuk
stacking gel terdiri dari 0.33 mL akrilamid 30%, 0.25 mL Tris-HCl pH 6.8, 20 μL
SDS 10 %, 10 μl APS dan 2 μl TEMED. Sampel protein ditambah dengan buffer
Laemmli mengandung (Tris-HCl pH 6.8, Bromophenol blue, SDS 10% dan
gliserol) dengan perbandingan 1:1, kemudian didenaturasi pada air mendidih
selama 10 menit. Sampel yang sudah didenaturasi dimasukkan ke dalam sumur
gel dan dielektroforesis pada 80 volt selama 3 jam. Hasil pemisahan protein
selanjutnya diberi pewarna Commasie Briliant Blue (CBB) 1% (Garfin 1990).
Western Blot
Protein yang telah dipisahkan dengan SDS-PAGE ditransfer ke dalam
membran nitroselulosa melalui aliran listrik sebesar 180 mA selama 45 menit
menggunakan semidry Trans-Blot Electrophoretic (BioRad). Membran dicuci
dengan PBS (Tris Buffered Saline) sebanyak 3 kali masing-masing 5 menit dan 1
kali dengan PBST mengandung tween. Setelah dicuci, protein pada membran
diblocking dengan cara direndam 5% skim milk dalam PBST selama 20 menit.
Membran diinkubasi dengan antibodi primer (anti-histidin antibodi) pada shaker,
suhu 4 oC selama semalam. Membran dicuci kembali dengan PBS sebanyak 3 kali
masing-masin
g 5 menit, lalu diberi antibodi sekunder (goat anti mouse IgG antibody)
dalam PBST dan diinkubasi selama 2 jam. Sebelum pewarnaan, membran dicuci
lagi dengan PBST selama lima menit dan buffer alkali fosfat pH 9.5 selama 10
menit. Pewarnaan dilakukan dengan pemberian 25 μl BCIP yang dilarutkan dalam

7
10 ml buffer alkali fosfat. Proses pewarnaan diinkubasi dalam kondisi bebas
cahaya sampai muncul pita protein pada membran.
Elektroelusi Protein
Protein rekombinan hasil SDS-PAGE yang masih tercampur dengan
protein lain dipotong dari gel poliakrilamida dan dikeluarkan dengan metode
elektroelusi protein. Gel poliakrilamida dipotong pada salah satu sumuran dan
diwarnai dengan dengan commasie 1%, sumuran lainnya tanpa diwarnai. Gel
yang telah diwarnai disejajarkan dengan gel tanpa pewarnaan, kemudian dipotong
pada bagian pita protein target. Potongan dimasukkan ke dalam membran dengan
buffer mengandung 25 mM Tris Base, 0.192 M glycine dan SDS 0.1%. Posisi gel
dalam membran diletakkan pada kutub negatif. Protein dalam gel dikeluarkan
dengan aliran listrik 100 Volt selama dua jam (Harrington 1990). Hasil purifikasi
dengan elektroelusi dihitung konsentrasinya menggunakan metode Lowry dan
visualisasi menggunakan SDS-PAGE.
Pengendapan Protein
Pengendapan protein menggunakan aseton dengan variasi konsentrasi
30%, 40% dan 50% untuk melihat konsentrasi optimum dari aseton dalam
mengendapkan protein MmCuZnSOD. Sampel protein sebanyak 750 µL hasil
purifikasi dengan elektroelusi dicampur dengan aseton sesuai konsentrasi yang
digunakan. Larutan diinkubasi pada suhu -20 oC selama 18 jam. Selanjutnya
disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4 oC selama 15 menit.
Pellet yang didapat dilarutkan dalam buffer fosfat pH 7.

8

3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Konstruksi Vektor Rekombinan
Gen penyandi protein MmCuZnSOD berhasil diisolasi dari vektor kloning
pGEM-MmCuZn-SOD dengan teknik PCR menggunakan primer yang didesain
dari start codon sampai stop codon dengan penambahan sekuen situs pemotongan
enzim XhoI (CTCGAG) pada ujung 5’ dan enzim BamHI (GGATTC) pada ujung
3’. Pemilihan situs restriksi yang berbeda pada posisi yang berbeda dimaksudkan
untuk menghindari orientasi DNA sisipan yang tidak benar. Amplifikasi gen
MmCuZnSOD menghasilkan fragmen pada posisi 475 pb (Gambar 2a) sesuai
dengan ukuran open reading frame (ORF) gen dan penambahan situs restriksi.
Gen ini disisipkan ke dalam vektor ekspresi pET-14b menggunakan metode
pemotongan dengan enzim restriksi XhoI dan BamHI (Gambar 2b) dan
penyambungan dengan enzim T4 ligase. Hasil ligasi antara fragmen sisipan (gen
MmCuZnSOD) dengan vektor pET-14b diintroduksikan ke dalam E. coli DH5α.
Hasil transformasi menggunakan metode heat shock menunjukkan bahwa terdapat
beberapa koloni yang mampu tumbuh dalam media seleksi yang mengandung
ampisilin 50 mg mL-1 (Gambar 3). Vektor pET-14b mengandung gen resisten
ampisilin yang menyandi enzim β-laktamase. Enzim tersebut dapat memecah
cincin β-laktam pada antibiotik ampisilin (Read 2000).

a

b

Gambar 2. Konstruksi vektor rekombinan. a) Hasil PCR gen MmCuZnSOD (475
bp) b) Peta konstruksi plasmid pET-14b- MmCuZnSOD (5130 bp)

Gambar 3. Hasil transformasi E. coli DH5α dengan pET-14b-MmCuZnSOD. a)
kontrol positif, b) kontrol negatif, c) DH5α- pET-14b-MmCuZnSOD.

9
Enam koloni E. coli transforman putatif yang tumbuh dalam media seleksi
dikonfirmasi dengan teknik PCR koloni menggunakan pasangan primer T7P-F
dan BamHISOD-R. Penggunaan kombinasi primer dari bagian vektor dan DNA
insert bertujuan untuk membuktikan bahwa gen telah tersisip pada situs yang
benar. Hasil amplifikasi menunjukkan bahwa empat dari enam koloni yang
diidentifikasi adalah positif membawa fragmen gen penyandi MmCuZnSOD pada
posisi 609 pb sesuai dengan ukuran dari daerah promoter sampai multiple cloning
site (150 pb) dan gen MmCuZnSOD (459 bp) (Gambar 4a).
Plasmid rekombinan pET-14b-MmCuZnSOD telah diperbanyak dalam E.
coli DH5α dan diisolasi untuk verifikasi menggunakan enzim restriksi NdeI dan
EcoRI. Pemotongan dengan kedua enzim tersebut menghasilkan dua pita DNA
berukuran 4152 pb dan 978 pb untuk pET-14b-MmCuZnSOD sedangkan pada
kontrol menghasilkan potongan yang berbeda yaitu pita berukuran 4159 pb dan
512 pb (Gambar 4b). Perbedaan ukuran ini dikarenakan vektor pET-14b telah
tersisipi gen MmCuZnSOD sebesar 459 pb sehingga ketika dipotong dengan
enzim restriksi yang sama menghasilkan ukuran DNA yang lebih besar
dibandingkan plasmid yang tidak tersisipi gen asing.

a)

b)

Gambar 4. Verifikasi konstruksi cDNA-MmCuZnSOD pada plasmid pET-14b
dalam Escherichia coli. a) Analisis PCR koloni menggunakan
pasangan primer T7-F & SODBamHI-R; (1, 2, 5, 6) koloni positif dan
(3,4) koloni negatif. b) Analisis enzim restriksi menggunakan NdeI
dan EcoRI; 1: plasmid rekombinan pET-14b- MmCuZnSOD, 2:
plasmid kontrol pET-14b
Plasmid rekombinan dengan promotor kuat T7 diintroduksikan ke dalam
E. coli strain Rosetta (DE3) yang mengandung gen T7 RNA polymerase (λDE3
lisogen) yang terintegrasi dalam kromosom E. coli dibawah kontrol promoter
inducible lacUV5. E. coli rekombinan yang tumbuh dalam media yang
mengandung penanda seleksi antibiotik ampisilin dan kloramfenikol diverifikasi
dengan PCR koloni dan pengurutan DNAnya. Analisis pengurutan DNA plasmid
rekombinan pET-14b-MmCuZnSOD menunjukkan bahwa gen MmCuZnSOD
tersisip ke dalam vektor pET-14b dengan orientasi yang sesuai pada situsnya yaitu
setelah penanda 6x-His•Tag dan ribosome binding site (Lampiran 1). Gen tersebut
tersisip diantara situs restriksi XhoI pada daerah upstream dan situs restriksi
BamHI pada downstream. Promoter kuat T7 yang inducible dapat mensistesis
jumlah transkrip yang tinggi ketika diinduksi dengan IPTG. T7 RNA polimerase
ditranskripsi ketika IPTG mengikat dan merangsang pelepasan tetramer LacI dari

10
operator Lac (Sorensen dan Mortensen 2004). Vektor ini mengandung 6x-His•Tag
pada N-terminal yang digunakan untuk deteksi dalam verifikasi ekspresi protein
dan penanda dalam purifikasi afinitas. Histidin tag (6x-His•Tag) merupakan
penanda yang paling sering digunakan untuk purifikasi afinitas (Zhao et al. 2013).
Optimasi Ekspresi Protein Rekombinan MmCuZnSOD
Protein rekombinan MmCuZnSOD berhasil diekspresikan di dalam inang
E. coli strain Rosetta (DE3). E. coli strain Rosetta (DE3) dapat meningkatkan
ekspresi protein yang rendah yang disebabkan oleh kodon bias dibandingkan
dengan E. coli BL-21. Beberapa asam amino disandi oleh lebih dari satu kodon
dan masing-masing organisme membawa kodon bias dalam penggunaan 61 kodon
asam amino. Pada masing-masing sel, jumlah tRNA dalam E. coli sangat
berkaitan terhadap kodon bias. Ketika mRNA dari gen heterolog diekspresikan
secara berlebih dalam E.coli, perbedaan pada penggunaan kodon dapat
menghambat translasi karena jumlah tRNA yang tidak seimbang dengan
banyaknya mRNA. Kurangnya populasi tRNA dapat menyebabkan translasi
lambat, terminasi translasi yang prematur, pergeseran terjemahan, dan
melewatkan penterjemahan asam amino. Strain Rosetta (DE3) mengandung
plasmid pRARE yang membawa gen tRNA leuW, proL, met, argW, thrT, glyT,
tyrU, thrU, argU, dan ileX untuk meningkatkan ekspresi protein dari gen yang
mengandung kodon langka pada E. coli (Novy et al. 2001).
Optimasi ekspresi protein rekombinan dilakukan dengan menentukan
konsentrasi induser (IPTG), lama waktu induksi dan suhu induksi. IPTG
(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) merupakan induser yang umum digunakan
untuk induksi ekspresi protein heterolog. Dari empat variasi konsentrasi IPTG
yang digunakan, tidak terdapat perbedaan ekspresi protein MmCuZnSOD yang
signifikan (Gambar 5a) dan tidak ditemukan ekpresi protein rekombinan pada
kontrol tanpa induser. Hasil ini sesuai dengan pernyataan Donovon et al. (1996)
bahwa IPTG tidak dapat dimetabolisme oleh sel, sehingga tingkat induksi selalu
konstan meskipun ada penambahan konsentrasi IPTG. Namun, konsentrasi
induser yang terlalu rendah menyebabkan ekspresi tidak optimum seiring dengan
penambahan jumlah sel setiap satuan waktu sedangkan konsentrasi yang tinggi
akan menyebabkan kematian sel.
Konsentrasi induser 0.5 mM dipilih sebagai konsentrasi terbaik dan
digunakan untuk menentukan lama waktu induksi. Hasil analisis SDS-PAGE
menunjukkan bahwa lama induksi yang optimum adalah 6 jam setelah induksi
(Gambar 5b). Lama waktu induksi berpengaruh terhadap tingkat ekspresi protein
rekombinan MmCuZnSOD. Ekspresi protein terus meningkat seiring dengan
peningkatan waktu pada konsentrasi IPTG yang sama disebabkan oleh sel yang
terus membelah. Hasil yang sama pada beberapa penelitian sebelumnya yang
menunjukkan peningkatan produksi protein rekombinan dipengaruhi oleh
pertumbuhan sel ketika diinduksi dengan induser dan tidak bergantung pada
peningkatan konsentrasi IPTG (Khoo et al. 2010; Larentis et al. 2014).

11

a)
Gambar 5.

b)

Analisis optimasi kondisi ekspresi protein rekombinan
MmCuZnSOD menggunakan SDS-PAGE. a) Pengaruh
konsentrasi IPTG. M: prestained marker protein M: marker
protein; baris 1-4: setelah induksi dengan konsentrasi IPTG 0.1
mM, 0.3 mM, 0.5 mM dan 1 mM; CTRL: non-induksi. b)
Pengaruh lama waktu induksi. M: prestained marker protein;
baris 1-4: lama induksi 2 jam, 4 jam, 6 jam, dan 8 jam dengan
induksi 0.5 mM IPTG pada suhu 37 oC, CTRL: non-induksi.

Penentuan suhu optimum dianalisis menggunakan SDS-PAGE dan
western blot menggunakan antibodi monoklonal anti-histidin terhadap protein
kasar dari delapan klon E. coli rekombinan. Analisis SDS-PAGE menunjukkan
bahwa adanya pita protein yang tebal dengan ukuran 15 kDa pada semua klon
yang ditumbuhkan pada suhu 37 oC (Gambar 6a). Protein ini tidak ditemukan di
E. coli rekombinan yang ditumbuhkan pada suhu 30 oC dan kontrol yang tidak
diinduksi. Ukuran pita tersebut sesuai dengan berat molekul yang diprediksi pada
sekuen asam amino MmCuZnSOD. Hasil yang sama dibuktikan dengan analisis
western blot (Gambar 6b) dengan menggunakan anti-histidin yang bersifat
spesifik dan sensitif yang hanya mendeteksi protein fusi dengan 6x-His•Tag dan
tidak mengenali histidin alami dalam protein karena umumnya protein alami tidak
memiliki enam histidin yang berurutan.

a)
Gambar 6.

b)

Analisis optimasi suhu induksi ekspresi protein rekombinan
MmCuZnSOD (a) SDS-PAGE 15% gel poliakrilamid (b) Western
blot dengan anti-histidin sebagai antibodi primer dan Goat anti
mouse sebagai antibodi sekunder. Delapan klon ditumbuhkan pada
dua suhu yang berbeda yaitu suhu 30 oC dan suhu 37 oC. CTRL:
tanpa induksi, 1-8: klon yang di induksi dengan 0.5 mM IPTG, M:
prestained marker protein

12
Suhu optimum ekspresi protein rekombinan MmCuZnSOD adalah pada
suhu 37 oC. Meskipun dalam beberapa penelitian menyebutkan bahwa suhu
pertumbuhan E. coli pada 37 oC menyebabkan protein terakumulasi dalam bentuk
bodi inklusi dan ketika inkubasi pada suhu yang lebih rendah menyebabkan
sintesis protein menjadi lebih lambat dan menyediakan waktu yang cukup untuk
melipat membentuk konformasi asli protein sehingga akan meningkatkan protein
rekombinan dalam bentuk soluble (Baneyx dan Mujacic 2004), namun protein
rekombinan tidak terkespresi pada suhu 30 oC.
Berdasarkan hasil optimasi dari ketiga faktor, kondisi optimum untuk
ekspresi protein rekombinan MmCuZnSOD yang optimum adalah konsentrasi
IPTG 0.5 mM dengan lama induksi enam jam pada suhu 37 oC. Kondisi ini
selanjutnya digunakan dalam produksi dan purifikasi protein rekombinan.
Analisis lebih lanjut yang dilakukan menentukan fraksi ekpresi protein
rekombinan dengan memisahkan fraksi soluble dan insoluble. Ekstraksi protein
menggunakan lisosim dan sonikasi untuk memecah membran sel. Hasil SDSPAGE menunjukkan bahwa protein MmCuZnSOD terekspresi pada kedua fraksi
soluble dan insoluble (Gambar 7). Adanya protein dalam bentuk soluble ini terjadi
karena secara alami protein MmCuZnSOD memiliki berat molekul kecil yaitu 15
kDa. Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan oleh Dyson et al. (2004) dengan
membandingkan berat molekul dari beberapa protein yang memiliki berat molekul
berbeda terhadap tingkat solubelitas protein rekombinan menunjukkan bahwa
protein yang memiliki ukuran di bawah 30 kDa tidak membutuhkan fusi dengan
enhancer solubelitas dan protein cenderung terekspresi dalam bentuk soluble.
Sedangkan bentuk insoluble dikarenakan protein ini di ekspresikan secara berlebih
dan heterolog dalam E. coli sehingga masih memungkinkan terbentuknya bodi
inklusi. Jumlah protein rekombinan yang tinggi dalam sel tidak mempunyai cukup
waktu untuk melipat sehingga terjadi pengikatan antar protein rekombinan
membentuk agregat yang disebut bodi inklusi (Schein 1989). Terekspresinya
protein rekombinan dalam bentuk bodi inklusi memberikan keuntungan untuk
memudahkan proses isolasi protein dengan kemurnian yang lebih tinggi.

Gambar 7. Analisis SDS-PAGE fraksinasi protein rekombinan MmCuZnSOD.
Ekspresi protein diinduksi pada suhu 37 oC dengan konsentrasi 0.5
mM IPTG selama 6 jam. M: prestained marker protein; 1: non
induksi; 2: fraksi insoluble; 3: fraksi soluble.

13
Purifikasi Protein Rekombinan MmCuZnSOD
Protein MmCuZnSOD telah berfusi dengan residu 6x-His•Tag pada ujung
N-terminal sehingga dapat digunakan sebagai penanda dalam purifikasi
menggunakan resin mengandung ion nikel (Ni2+) yang telah di imobilisasi secara
kovalen dengan nitrilotriacetic acid (NTA). Pada prinsipnya resin Ni-NTA yang
mengandung ion nikel (Ni2+) akan berikatan dengan protein yang memiliki protein
fusi 6x-His•Tag. Ikatan tersebut dapat dielusi menggunakan imidazol dengan
konsentrasi yang tinggi yaitu 100-250 mM. Hal ini bertujuan untuk melepaskan
protein, imidazol menggantikan ikatan antara histidin dengan ion nikel (Sambrook
dan Russell 2001).
Analisis terhadap protein yang dipurifikasi dengan SDS-PAGE tidak
menunjukkan adanya protein, tetapi dengan western blot menggunakan antihistidin menunjukkan ada pita protein berukuran 15 kDa pada elusi pertama (E1)
yang mengindikasikan bahwa protein yang dapat dielusi masih rendah (Gambar
8a). Protein rekombinan MmCuZnSOD juga masih terdapat pada fraksi unbinding
karena histidin memiliki ikatan yang lemah dengan Ni-NTA. Deteksi dengan
anti-histidin sangat sensitive sehingga pita protein yang tidak dapat dideteksi
dengan commasie staining dapat dideteksi dengan anti-histidin (Gambar 8).

a)
Gambar 8.

b)

Purifikasi protein rekombinan MmCuZnSOD menggunakan kolom
afinitas Ni-NTA. a) Analisis SDS-PAGE dengan gel
poliakrilamida 15% yang diwarnai dengan Commasie brliant blue.
b) Analisis western blot mengunakan anti-histidin sebagai antibodi
primer dan Goat anti mouse sebagai antibodi sekunder. M:
prestained marker protein, E1-E2: fraksi elusi protein ke 1-4, S:
fraksi soluble, UB: unbinding, W: washing, CTRL: uninduced

Antigen yang baik adalah antigen dengan tingkat kemurniaan yang tinggi,
yaitu protein yang digunakan sebagai antigen mengandung tidak lebih 1%
kontaminan (Dunbar dan Schwebel 1990). Untuk mendapatkan protein dengan
tingkat kemurnian yang tinggi, protein hasil isolasi yang dimigrasikan di dalam
gel poliakrilamida selanjutnya dipurifikasi dengan elektroelusi. Elektroelusi
protein merupakan metode yang cukup mudah untuk mengisolasi protein dari gel
poliakrilamid dengan medan listrik (Harrington 1990). Hasil purifikasi dengan
metode ini cukup spesifik yaitu hanya terdapat satu pita protein rekombinan
MmCuZnSOD dengan ukuran 15 kDa (Gambar 9 baris ke-5). Spesifitas hasil

14
purifikasi secara elektroelusi dikarenakan hanya pita protein target yang dipotong
yang kemudian dikeluarkan menggunakan medan listrik.
Perhitungan kadar protein menggunakan metode Lowry untuk mengukur
kadar protein rekombinan MmCuZnSOD secara kuantitatif menggunakan standart
Bovine Serume Albumine (BSA). Hasil pengukuran konsentrasi protein
berdasarkan kurva standart dapat dilhat pada Tabel 1.
Tabel 1. Hasil pengukuran protein
Konsentrasi
Sampel
Ptotein MmCuZnSOD

0.0375 µg µL-1

Konsentrasi total
3.75 mg/350 mL kultur

Hasil purikasi dengan elektroelusi (Tabel 1) menunjukkan bahwa
konsentrasi protein sangat rendah yaitu 0.0375 µg µL-1 yang disebabkan protein
yang terukur adalah protein tunggal MmCuZnSOD. Konsentrasi total protein
murni yang dihasilkan sebesar 3.75 mg dari 350 mL kultur E. coli. Protein ini
selanjutnya diendapkan untuk mendapatkan konsentrasi yang lebih tinggi dengan
volume sedikit.
Pengendapan protein murni dilakukan dengan aseton sebagai pelarut
organik. Berdasarkan hasil visualisasi SDS-PAGE dari volume protein yang sama
dapat dilihat bahwa ketebalan pita protein berbeda-beda (Gambar 9). Pita protein
paling tebal pada lajur ke-4 yaitu pengendapan menggunakan aseton 50%.
Ketebalan pita ini sangat jauh berbeda dengan pita protein sebelum pengendapan
pada lajur ke-5. Protein dapat diendapkan dengan pelarut organik aseton yang
diinkubasi pada suhu -20oC. Solubelitas protein tergatung dari dielektrik konstan
dalam larutan. Umumnya larutan yang memiliki konstanta dielektrik yang tinggi,
seperti dapat menstabilkan interaksi molekul air dan protein sehingga protein larut
dalam air.

Gambar 9. Analisis SDS-PAGE protein rekombinan MmCuZnSOD hasil
elektroelusi dan pengendapan protein dengan aseton. M:
prestained marker protein,1: protein kasar, 2: pengendapan protein
murni dengan 30% aseton, 3: 40% aseton, 4: 50% aseton, 5:
protein hasil elektroelusi sebelum pengendapan

15
Pelarut organik seperti aseton memiliki konstanta dielektrik yang kecil,
sehingga mengurangi kelarutan protein dalam air sehingga solubelitas protein
dalam larutan menjadi rendah (Simpson dan Beynon 2010). Protein rekombinan
MmCuZnSOD dengan berat molekul 15 kDa dan tingkat kemurnian yang tinggi
dapat digunakan sebagai antigen dan bersifat imunogenik. Antigen yang
imunogenik memiliki berat molekul lebih besar dari 10 kDa (Rao 2002).

16

4 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Vektor ekspresi pET-14b-CuZnSOD yang telah berhasil dikonstruksi dan
telah diintroduksi ke dalam E. coli Rosetta (DE3). Protein MmCuZnSOD telah
berhasil di sintesis dengan kondisi optimal pada penggunaan induser IPTG 0.5
mM selama enam jam pada suhu 37oC. Protein ini berukuran 15 kDa yang
terdapat pada kedua fraksi soluble dan insoluble. Protein rekombinan
MmCuZnSOD murni diperoleh melalui purifikasi dengan kolom afinitas Ni-NTA
menggunakan 6x-His•Tag sebagai penanda dan elektroelusi. Protein murni yang
dihasilkan sebesar 3.75 mg dari 350 mL kultur E. coli.
Saran
Penelitian lebih lanjut dapat dilakukan untuk menentukan imunogenitas
antigen MmCuZnSOD sehingga dapat merangsang pembentukan antibodi yang
spesifik untuk MmCuZnSOD

17

DAFTAR PUSTAKA
Alscher RG, Erturk N, Heath LS. 2002. Role of superoxide dismutases (SODs) in
controlling oxidative stress in plants. Journal of Experimental Botany. 53
(372): 1331-1341. doi: 10.1093/jexbot/53.372.1331
Aydin S, Buyuk I, Sümer E, Aras. 2014. Expression of SOD gene and evaluating
its role in stress tolerance in NaCl and PEG Stressed Lycopersicum
esculentum. Turkey Jurnal Botany. 38: 89-98. doi:10.3906/bot-1305-1
Babaeipour V, Shojaosadati SA, Robatjazi SM, Khalilzadeh R, Maghsoudi N.
2007. Over-production of human interferon-g by HCDC of recombinant
Escherichia
coli.
Process
Biochemistry.
42:112–117.
doi:
10.1016/j.procbio.2006.07.009
Basu U, Good AG, Taylor G J. 2001. Transgenic Brassica napus plants
overexpressing aluminium-induced mitochondrial manganese superoxide
dismutase cDNA are resistant to aluminium. Plant Cell and Environment.
24: 1269–1278. doi: 10.1046/j.0016-8025.2001.00783.x
Baneyx F, Mujacic M. 2004. Recombinant protein folding and misfolding in
Escherichia
coli.
Nature
Biotechnology.
22:
1399-1407.
doi.org/10.1038/nbt1029
Davis LOMM. 2012. Transformasi genetik padi japonica (Oryza sativa L. subsp.
Japonica) dengan gen penyandi superoksida dismutase dari Melastoma
malabathricum menggunakan perantara Agrobacterium tumefaciens
[Tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor
Donahue JRA, Bebee RL. 1999. BL21-SITm competent cells for protein
expression in Escherichia coli. Life Technologies. 21: 49-51
Donovan RS, Robinson CW, Glick BR. 1996. Optimizing inducer and culture
conditions for expression of foreign proteins under the control of the lac
promoter. Journal of Industrial Microbiologi 16: 145-154. http:// link.
springer.com/article/10.1007%2FBF01569997
Dunbar BS, Schwoebel ED. 1990. Preparation of polyclonal antibodies. Methods
in Enzymology. 49: 663-760
Dyson MR, Shadbolt SP, Vincent KJ, Perera RL, McCafferty J. 2004. Production
of soluble mammalian proteins in Escherichia coli: identification of
protein features that correlate with successful expression. BMC
Biotechnology. 4: 32. doi.org/10.1186/1472-6750-4-32
Garfin DE. 1990. One-dimensial gel electrophoresis. Methods in Enzymology.
425:441
Hackel N, Schauer N, Carrari F, Fernie AR, Grimm B, Kuhn C. 2006. Sucrose
transporter LeSUT1 and LeSUT2 inhibition affects tomato fruit
development in different ways. The Plant Journal. 45: 180-192. doi:
10.1111/j.1365-313X.2005.02572
Hannum S. 2012. Isolasi, pengklonan, dan analisis ekspresi gen penyandi
Copper/Zinc Superoxide Dismutase (CuZn-SOD) dari Melastoma
malabathricum L [Disertasi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor
Harrington MG. 1990. Elution of protein from gel. Methods in Enzymology. 182:
448-495.

18
Khoo TK, Santhanam A, Noordin R, Arifin N. 2010. Production of Brugia malayi
BmSXP recombinant protein expressed in Escherichia coli. Malaysian
Journal of Microbiology. 6: 115-122.
Larentis AL, Nicolau JFMQ, Esteves GDS, Vareschini DT, Almeida FVR, Reis
MG, Galler R, Medeiros MA. 2014. Evaluation of pre-induction
temperature, cell growth at induction and IPTG concentration on the
expression of a leptospiral protein in Escherichia coli. using shaking
flasks and microbioreactor. BMC Research Notes. 7: 1-13. http://www.
biomedcentral.com/ 1756 – 0500 /7/671
Lauterbach M, Niedermeier R, Besenbeck R, Stadler, Sauer N. 2007.
Immunolocalization of the PmSUC1 sucrose transporter in plantago
major flowers and reporter-gene analysis of the PmSUC1 promoter
suggest a Role in sucrose release from the inner integument. Plant
Biology. 9: 357-65. doi 10.1055/s-2006-924659
Lee SH, Ahsana N, Leea K, Kima D, Leea D, Kwakc S, Kwonc S, Kimd T, Leea
B. 2007. Simultaneous overexpression of both CuZn superoxide
dismutase and ascorbate peroxidase in transgenic tall fescue plants
confers increased tolerance to a wide range of abiotic stresses. Journal of
Plant Physiology. 164: 1626-1638. doi.org/10.1016/j.jplph.2007.01.003
Lowry, Rosenbrough, Farr, Randal. 1951. Protein Measurement with the folin
phenol Reagent. New York: Kluwer Academic Publishers
Luo X, Wu J, Li Y, Nan Z, Guo X, Wang Y, Zhang A, Wang Z, Xia G, Tian Y.
2013. Synergistic Effe