Identifikasi Dan Karakterisasi Rizobakteri Penghasil Giberelin Yang Diisolasi Dari Tanah Hutan Di Banten.

IDENTIFIKASI DAN KARAKTERISASI RIZOBAKTERI
PENGHASIL GIBERELIN YANG DIISOLASI DARI TANAH
HUTAN DI BANTEN

HADI SUSILO

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Identifikasi dan Karakterisasi
Rizobakteri Penghasil Gibrelin yang Diisolasi dari Tanah Hutan di Banten adalah
benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan
dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir tesis ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.

Bogor, November 2015
Hadi Susilo
NIM P051120131

RINGKASAN
HADI SUSILO. Identifikasi dan Karakterisasi Rizobakteri Penghasil Giberelin
yang Diisolasi dari Tanah Hutan di Banten. Dibimbing oleh NISA RACHMANIA
MUBARIK dan TRIADIATI.
Giberelin adalah zat pengatur tumbuh yang memacu pemanjangan sel,
perkecambahan biji, inisiasi pembungaan, dan pemasakan buah. Rizobakteri
menghasilkan giberelin yang berperan untuk memacu pertumbuhan tanaman.
Tanah hutan merupakan salah satu sumber keragaman rizobakteri. Pandeglang
memiliki sumber daya alam yang belum banyak dieksplorasi terutama rizobakteri
tanah yang menghasilkan giberelin, salah satunya ialah kawasan Hutan Penelitian
Carita Pandeglang Banten.
Tujuan penelitian ini untuk: (1) mengisolasi rizobakteri penghasil giberelin
asal tanah rizosfer sekitar pohon keruing (Dipterocarpus sp.) dari Hutan

Penelitian Carita Pandeglang Banten, (2) menganalisis pengaruh suhu, pH dan
kondisi pencahayaan terhadap pertubuhan sel rizobakteri terpilih dalam
memproduksi giberelin, dan (3) mengidentifikasi isolat terpilih berdasarkan
identifikasi molekuler.
Pengambilan sampel tanah menggunakan metode Composite sampling.
Rizobakteri penghasil giberelin diisolasi mengggunakan media seleksi: Tripticase
Soy Agar (TSA), King’s B, Nitrogen Free-Base (NFB), dan Lactose Glucose
Induce (LGI). Analisis kandungan giberelin diukur menggunakan metode
Unyayar et al.. Pengaruh faktor lingkungan terhadap pertumbuhan sel dan
produksi giberelin diukur secara bertahap berdasarkan pengaruh: suhu, pH, dan
kondisi cahaya.
Delapan isolat rizobakteri menghasilkan giberelin. Isolat rizobakteri BC2
menghasilkan giberelin tertinggi yaitu: 0.756 mg mL-1. Isolat rizobakteri BC2
dipilih untuk diidentifikasi berdasarkan karakter fisiologi dan molekuler. Isolat
rizobakteri BC2 dikarakterisasi berdasarkan pengaruh media pertumbuhan sel
terhadap perlakuan suhu, pH, dan kondisi cahaya. Uji fisiologi menunjukkan
bahwa isolat sel rizobakteri BC2 negatif pada produksi indol, urease positif, dan
karbohidrat oksidatif. Analisis pohon filogenetik menunjukkan bahwa isolat sel
rizobakteri BC2 sebagai Stenotrophomonas maltophilia dengan tingkat kesamaan
98 %. Pertumbuhan sel dan produksi giberelin isolat rizobakteri BC2 optimum

pada suhu 30 °C, pH 7, dan kondisi cahaya gelap.
Penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan isolat rizobakteri penghasil
giberelin unggul yang dapat dimanfaatkan untuk aplikasi praktis sebagai pupuk
hayati.

Kata kunci: Giberelin, rizobakteri, Stenotrophomonas maltophilia

SUMMARY
HADI SUSILO. Identification and Characterization of Gibberellin Producing
Rhizobacteria Isolated from Forest Soil in Banten. Supervised by NISA
RACHMANIA MUBARIK and TRIADIATI.
Gibberellin is plant growth regulator that stimulate cell elongation, seed
germination, flowering, and fruit ripening. Rhizobacteria produce gibberrelin to
improve the plant growth. Forest soil have rhizobacterial biodiversity resources.
Pandeglang district have a lot of natural biodiversity, but not yet to be explored
mostly gibberellins producing rhizobacteria. One of them is Forest Research
Carita, Pandeglang.
This study was conducted: (1) to isolate gibberellin producing rhizobacteria
from forest soil of keruing (Dipterocarpus sp.) tree in forest research Carita
Pandeglang Banten, (2) to analyze the effect of temperature, pH, and light

treatments to the growth culture, and (3) to identify selected rizhobacteria with
molecular method.
Soil from rhizosfer was collected by using composite sampling methods.
Tripticase Soy Agar (TSA), King’s B, Nitrogen Free-Base (NFB), and Lactose
Glucose Induce (LGI) media were used for isolation and selection of
rhizobacteria. Analysis of gibberellin contents was measured by Unyayar et al.
method. The selected rhizobacteria was identified by using 16S rRNA gene. The
influence of environmental factor to the growth of rhizobacteria and gibberellin
production was measured step by step based on temperature, pH, and light
treatments.
Eight of rhizobacterial isolates produced gibberellins. Among of them BC2
isolate produced the highest of gibberellin (0.756 mg mL-1). The isolate was
selected to identify based on physiology and molecular, and characterized based
on effect to the growth culture by temperature, pH, and light treatments. The
result of physiological test indicated that BC2 isolate was negative on producing
of indole, positive on urease, and oxidative carbohydrate. The phylogenetic tree
analysis of BC2 isolate was belonged to Stenotrophomonas maltophilia with 98 %
similarity level. The environment condition for growth culture media of BC2
isolate was optimum temperature at 30 °C, optimum pH 7, and dark condition.
This research is expected to produce potential gibberellins producing

rhizobacteria which can be exploited for practical application as a biofertilizer.

Keywords: Gibberellin, rhizobacteria, Stenotrophomonas maltophilia

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apapun tanpa izin IPB

IDENTIFIKASI DAN KARAKTERISASI RIZOBAKTERI
PENGHASIL GIBERELIN YANG DIISOLASI DARI TANAH
HUTAN DI BANTEN

HADI SUSILO

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Bioteknologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Rahayu Widyastuti, MScAgr

PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya
sehingga penelitian ini berhasil diselesaikan. Penelitian yang berjudul Identifikasi
dan Karakterisasi Rizobakteri Penghasil Giberelin yang Diisolasi dari Tanah
Hutan Di Banten, ini ditujukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada Program Studi Bioteknologi Sekolah Pascasarjana IPB

Bogor.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah
membantu dalam penyusunan penelitian ini baik secara langsung maupun tidak
langsung. Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Dr Nisa Rachmania
Mubarik, MSi, sebagai ketua komisi pembimbing, dan Dr Triadiati, MSi, sebagai
anggota komisi pembimbing atas bimbingan dan motivasi yang diberikan kepada
penulis, kepada Prof Dr Ir Suharsono, DEA selaku ketua Program Studi
Bioteknologi IPB yang telah memberi motivasi selama studi, kepada Dr Rahayu
Widyastuti, MSc Agr yang telah menjadi dosen penguji dan memberikan saran
penulisan tesis. Kepada DIKTI melalui Beasiswa Program Pendidikan Dalam
Negeri (BPPDN) selama menempuh pendidikan pascasarjana di IPB, dan terima
kasih atas hibah penelitian PDP DIKTI 2015 a.n. Hadi Susilo sehingga penelitian
yang penulis lakukan dapat terlaksana dengan baik.
Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada Istri Hasanah, anak
Hudzaifah Al Faruq dan Hafidz Shalahudin Al Bantani atas doa dan kasih
sayangnya, Ibu Heni dan Bapak Jaka selaku staf Laboratorium Mikrobiologi IPB,
Aldi, Nezharia, Tika, Asa, Rike, Faloe dan teman-teman di Laboratorium
Mikrobiologi IPB serta teman-teman di Sekolah Pascasarjana Bioteknologi
angkatan 2012.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, November 2015

Hadi Susilo

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN

vi
vi
vi

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
2 TINJAUAN PUSTAKA

1
1
2
2
3

Rizobakteri Pemacu Pertumbuhan Tanaman
Giberelin
Aplikasi Giberelin
Analisis Sekuen Gen 16 S rRNA
Pengaruh Pertumbuhan Sel dan Produksi Giberelin

3 METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Bahan
Alat
Prosedur Kerja
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi Rizobakteri

Uji Kandungan Giberelin Isolat Rizobakteri
Uji Hipersensitivitas Isolat Rizobakteri
Identifikasi dan Karakterisasi Isolat Rizobakteri Terpilih
Pengaruh Suhu terhadap Pertumbuhan dan Produksi Giberelin
Pengaruh pH terhadap Pertumbuhan dan Produksi Giberelin
Pengaruh Cahaya terhadap Pertumbuhan dan produksi Giberelin
5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
RIWAYAT HIDUP

3
3
4
4
5

7

7
7
7
8
12
17
18
18
19
19
20
20
22
22
22
23
29
36

DAFTAR TABEL
1 Mikrob penghasil giberelin pada berbagai kondisi lingkungan
2 Karakterisasi isolat rizobakteri asal tanah rizosfer pohon keruing
(Dipterocarpus sp.)
3 Uji hipersensitivitas isolat rizobakteri BC2 pada daun tembakau
4 Karakteristik fisiologi isolat rizobakteri BC2
5 Analisis kesamaan sekuen gen 16S rRNA isolat rizobakteri
BC2 menggunakan BLASTN
6 Pertumbuhan sel dan produksi giberelin isolat rizobakteri BC2

5
9
11
11
14
15

DAFTAR GAMBAR
1 Kerangka penelitian
2 Kandungan giberelin yang dihasilkan isolat rizobakteri asal rizosfer
pohon keruing (Dipterocarpus sp.)
3 Gejala hipersensitivitas isolat rizobakteri BC7 pada daun tembakau
seperti pada Pseudomonas syringae sebagai kontrol positif
4 Isolat rizobakteri BC2 dengan pewarnaan Gram
5 Pita gen 16S rRNA isolat rizobakteri BC2 berukuran ±1300 bp
6 Konstruksi pohon filogenetik isolat rizobakteri BC2 dengan metode
Neighbour Joining
7 Kurva pertumbuhan dan produksi giberelin isolat rizobakteri BC2
8 Pertumbuhan sel dan produksi giberelin isolat rizobakteri BC2 pada
berbagai suhu dengan kondisi pH netral dan cahaya terang
9 Pertumbuhan sel dan produksi giberelin isolat BC2 pada berbagai
pH berbeda dengan suhu 27 °C

6
10
11
12
12
12
14
18
20

DAFTAR LAMPIRAN
1 Diagram alir pengukuran kandungan giberelin
2 Komposisi media seleksi isolat rizobakteri
3 Karakterisasi dan jumlah sel/g tanah rizobakteri asal tanah rizosfer
pohon keruing (Dipterocarpus sp.)
4 Kurva standar pertumbuhan isolat rizobakteri BC2
5 Uji kualitas DNA isolat rizobakteri BC2
6 Data sekuen DNA isolat rizobakteri BC2
7 Kromatogram DNA isolat rizobakteri BC2

29
30
31
31
31
32
33

1

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Giberelin adalah produk penting dalam bioteknologi yang mempunyai nilai
ekonomi tinggi, sebagai hormon pertumbuhan tanaman alami banyak digunakan
dalam bidang pertanian, pembibitan, pemeliharaan anggur, kultur jaringan, dan
perkebunan teh (Bandelier dan Renaud 1997; Sukla et al. 2005). Giberelin adalah
senyawa organik kelompok diterpenoid, tersusun dari unit isopren yang terdiri
atas 5 atom karbon dengan struktur cincin tulang hidrokarbon (giberelan) dan
gugus karboksil bebas. Giberelin diisolasi dari cendawan Gibberella fujikuroi
yang patogen pada tanaman padi pertama kali di Jepang (Santner et al. 2009).
Biosintesis giberelin di dalam sel melalui jalur asam mevalonat (Gomi dan
Matsuoka 2003).
Giberelin pada tumbuhan berfungsi sebagai berikut: mematahkan dormansi
pembungaan (Bomke dan Tudzynki 2009; Kang et al. 2014), meningkatkan
tinggi tanaman kerdil (Swain dan Singh 2005; Pereg dan McMillan 2015),
meningkatkan inisiasi pembungaan (Ribeiro dan Cardoso 2012; Goldberg-Moeller
et al. 2013; Sumanasiri et al. 2013), memacu proses perkecambahan biji
(Komatsu et al. 2001; Taiz dan Zeiger 2010), meningkatkan pembentukan enzim
α-amilase dan pemanjangan sel (Fernie dan Willmitzer 2001; Kazmierczak 2003;
Miransari dan Smith 2014). Giberelin dihasilkan oleh tanaman, cendawan
(MacMillan 2002); lumut (Ergun et al. 2002), mikroalga (Strik et al. 2014), dan
bakteri (Bottini et al. 1989; Atzorn et al. 1998). Bakteri yang mampu
menghasilkan giberelin, yaitu: Azotobacter, Azospirillum, Pseudomonas,
Acetobacter, Burkholderia, dan Bacillus (Gutierrez-Manero et al. 2001; Mansour
et al. 2004).
Widiastuti et al. (1993) melaporkan bahwa giberelin yang disemprotkan
dengan konsentrasi 50 ppm dapat meningkatkan hasil Phyllanthus niruri L. selain
itu giberelin meningkatkan luas daun Plantago major L. (Khristiyana et al. 2005).
Aplikasi giberelin dapat meningkatkan perkecambahan biji Parthenium
argentatum Gray (Dissanayake et al. 2010), mematahkan dormansi biji Panicum
virgatum L. (Duclos et al. 2014), meningkatkan pembentukan enzim α-amilase
pada biji gandum (Kondhare et al. 2014).
Salah satu penghasil giberelin ialah rizobakteri tanah. Tanah hutan
merupakan salah satu sumber keragaman rizobakteri, diharapkan salah satu
rizobakteri penghasil giberelin yang potensial diperoleh dari tanah hutan.
Kabupaten Pandeglang terletak di Provinsi Banten, hampir lebih 80.07 % wilayah
di Pandeglang sebagai lahan pertanian (BPS 2013). Pandeglang memiliki sumber
daya alam yang belum banyak dieksplorasi terutama rizobakteri tanah yang
menghasilkan giberelin, salah satunya ialah kawasan Hutan Penelitian Carita
Pandeglang Banten.

2

Rumusan Masalah
Penelitian mengenai isolasi, karakterisasi, dan pengaruh media pertumbuhan
rizobakteri indigenous penghasil giberelin di Indonesia sangat sedikit. Hutan
Penelitian Carita Banten adalah hutan penelitian yang didominasi oleh pohon
keruing (Dipterocarpus sp.) dan belum banyak dieksplorasi keanekaragaman
hayatinya, khususnya rizobakteri penghasil giberelin. Sehubungan dengan hal
tersebut, maka perlu dilakukan penelitian mengenai rizobakteri penghasil
giberelin asal tanah hutan di Carita Banten.
Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini ialah: (1) mengisolasi sel rizobakteri penghasil
giberelin, (2) mengidentifikasi isolat rizobakteri berdasarkan karakter morfologi,
fisiologi, dan molekuler berdasarkan gen 16S rRNA, dan (3) menganalisis
pengaruh suhu, pH, serta kondisi cahaya terhadap pertumbuhan sel rizobakteri
dan produksi giberelin.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan isolat rizobakteri penghasil
giberelin unggul yang dapat dimanfaatkan untuk aplikasi praktis sebagai pupuk
hayati.
Hipotesis
Hipotesis dalam penelitian ini: (1) isolat rizobakteri dari tanah di sekitar
pohon keruing (Dipterocarpus sp.) mempunyai aktivitas untuk menghasilkan
giberelin, (2) pertumbuhan sel isolat rizobakteri dan produksi giberelin
dipengaruhi oleh suhu, pH, dan kondisi cahaya media kultur.

3

2 TINJAUAN PUSTAKA
Rizobakteri Pemacu Pertumbuhan Tanaman
Rizobakteri pemacu pertumbuhan tanaman (RPPT) merupakan kelompok
bakteri yang hidup bebas dan menguntungkan yang secara aktif mengkoloni
rizosfer untuk memacu pertumbuhan tanaman (Shruti et al. 2013). Menurut
Agustian et al. (2010), RPPT berperan penting dalam meningkatkan pertumbuhan,
hasil panen, dan kesuburan lahan. RPPT dapat bekerja secara langsung atau tidak
langsung. Secara langsung, RPPT merangsang pertumbuhan tanaman dengan
menghasilkan hormon pertumbuhan, vitamin, dan asam organik, serta
meningkatkan serapan unsur hara bagi tanaman. Secara tidak langsung, RPPT
akan menghasilkan senyawa antimikrob patogen yang dapat menekan
pertumbuhan cendawan penyebab penyakit tumbuhan dan menghasilkan siderofor
(MacMillan 2007; Yadzani et al. 2009; Kumar et al. 2012; Shruti et al. 2013;
Kumar et al. 2014). Siderofor adalah senyawa pengompleks Fe3+ atau pengkelat
ion logam besi (Fe3+) dan mereduksi Fe3+ menjadi Fe2+ (Ahemad dan Kibret
2014). Kelompok utama dari siderofor adalah asam hidroksamat yang mampu
mengikat ion logam besi. Hidroksamat akan mengikat ion logam besi yang tidak
larut kemudian ditranspor ke dalam sel. Hidroksamat yang telah dipakai akan
ditranspor ke luar sel untuk mengikat ion logam besi lainnya (Madigan et al.
2012).
Potensi RPPT antara lain: mampu memproduksi hormon pertumbuhan
yaitu: asam indol asetat, asam giberelin, sitokinin dan etilen; menambat N2;
menekan pertumbuhan organisme fitopatogen dengan memproduksi siderofor,
kitinase, antibiotik, dan sianida; melarutkan fosfat dan menyediakan nutrien
lainnya (Glick 2012; Gunes et al. 2014). RPPT berperan penting dalam memacu
pertumbuhan tanaman sereal dan legum untuk meningkatkan hasil tanaman
(Perez-Montano et al. 2014), dan kandungan metabolit sekunder (Capellari et al.
2013), selain itu rizobakteri tidak berbahaya terhadap lingkungan (Taufik 2010).

Giberelin
Giberelin termasuk dalam metabolit sekunder, berbentuk kristal, sedikit larut
dalam air, dan larut dalam etil asetat. Giberelin pertama kali diisolasi dari
cendawan Giberella fujikuroi, dengan nama baru Fusarium fujikuroi (O’Donnell
et al. 1998). Biosintesis giberelin berasal dari geranil difosfat dengan dikatalislis
enzim ent-Kauren siklase, GA3 β-hidroksilase, dan GA 20-oksidase (Morrone et
al. 2009; Marti et al. 2010). Giberelin yang dihasilkan rizobakteri dapat berperan
sebagai hormon endogen pada tanaman (Karakoc dan Aksoz 2006). Giberelin
dapat memacu sintesis protein kinase pada kacang polong (Pisum sativum L.)
yang kerdil (Anggarwal dan Sachar 1995), mereduksi gen kerdil Rht-B1b dan
meningkatkan tinggi tanaman Triticum aestivum L. (Rebetzke et al. 2012).
Hormon tumbuhan adalah senyawa organik yang dalam jumlah kecil dapat
mendorong atau menghambat pertumbuhan dan perkembangan tanaman,

4

disintesis di situs yang berbeda pada bagian tumbuhan seperti pada ujung batang,
akar, dan biji (Srivastava 2002). Hormon tumbuhan berperan dalam pengikatan
membran protein yang berpotensi untuk meningkatkan aktivitas enzim. Hasil
pengikatan ini mengaktifkan enzim tersebut dan mengubah substrat menjadi
produk. Produk ini selanjutnya menyebabkan serangkaian reaksi-reaksi sekunder,
yang salah satunya adalah pembentukan metabolit sekunder (Puga-Freitas dan
Blouin 2014).
Hormon tumbuhan memacu pertumbuhan dengan memberi isyarat kepada
sel target untuk membelah dan memanjang. Sebagian besar molekul hormon
tumbuhan dapat mempengaruhi metabolisme dan perkembangan sel-sel tumbuhan
dengan cara mempengaruhi lintasan sinyal transduksi pada sel target. Hormon
tumbuhan bekerja dengan cara mengubah ekspresi gen, mempengaruhi aktivitas
enzim, atau dengan cara mengubah ciri dan sifat-sifat membran (Campbell
et al. 2003). Pengaruh hormon tumbuhan tergantung pada spesies tumbuhan, situs
aksi hormon tumbuhan pada tumbuhan, dan konsentrasi hormon tumbuhan
(Watimena 1991; Liu et al. 2013; Gunes et al. 2014).

Aplikasi Giberelin
Aplikasi giberelin merupakan salah satu usaha untuk memaksimalkan
pertumbuhan dan hasil tanaman. Aplikasi giberelin dapat memacu pembungaan
Crysanthemum sp. (Sumitomo et al. 2009), menginisiasi pembungaan Citrus sp.
(Goldberg-Moeller et al. 2013), meningkatkan ukuran diameter tangkai bunga
Helleborus sp. (Christiaens et al. 2012), meningkatkan ukuran biji dan kandungan
pati gandum (Dian-liang et al. 2013).
Aplikasi giberelin secara eksogen dapat meningkatkan pertumbuhan
tanaman cabe (Joo et al. 2005), mematahkan dormansi umbi selama penyimpanan
(Liu et al. 2013), meningkatkan ukuran buah dan penundaan kerusakan warna
buah Prunus avium L. (Zhang dan Whiting 2011), memperlama masa
penyimpanan tomat (Solanum lycopersicum L.) (Ding et al. 2015), meningkatkan
produktivitas budidaya kapas (Pereg dan McMillan 2015), meningkatkan
produktivitas rumput dan mereduksi emisi NO2 (Whitehead dan Edward 2015).
Analisis Sekuen Gen 16S rRNA
Gen atau genom dua spesies dapat dibandingkan dengan analisis sekuen
DNA (DNA sequence analysis), yaitu: membandingan urutan nukleotida bagian
dari DNA. Teknik yang dipakai adalah dengan Polymerase chain reaction (PCR),
untuk amplifikasi DNA, yang kemudian dilanjutkan dengan pengurutan basa
secara otomatis menggunakan mesin pengurut DNA (DNA sequncer). Para ahli
sistematika menggunakan data sekuen nukleotida dari DNA nukleus, mtDNA atau
keduanya untuk menarik kesimpulan filogeni, membentuk pohon filogenetik, dan
mengelompokkan organisme (Madigan et al. 2000).
Daerah gen 16S rRNA merupakan daerah yang konservatif pada makhluk
hidup dan menunjukkan ciri spesifik pada setiap spesies. Ribosomal RNA adalah

5

salah satu molekul RNA yang berperan dalam pembentukan kerangka ribosom
dan merupakan organel yang penting dalam proses translasi RNA untuk
membentuk asam amino (Glick dan Pasternack 2003).
Molekul rRNA mempunyai sifat homolog, baik secara fungsional maupun
evolusinya pada organisme yang berbeda dan merupakan molekul yang
strukturnya konservatif. Ukuran molekul rRNA yang cukup besar memudahkan
proses isolasi terutama komponen 16S rRNA yang dijadikan sumber analisis
filogeni dan klasifikasi makhluk hidup (Broun-Houland et al. 1992). Analisis gen
16S rRNA digunakan untuk menentukan spesies, karena molekul ini terdapat
dalam setiap organisme, sehingga dapat dirancang primer universal untuk seluruh
kelompok (Pangastuti 2006).

Pengaruh Faktor Lingkungan terhadap Pertumbuhan Sel dan Produksi
Giberelin
Rizobakteri menghasilkan fitohormon secara ekstraseluler (Bottini et al.
1989; Gray dan Smith 2005; Hindersah dan Sudirja 2010). Rizobakteri dapat
menghasilkan giberelin yang optimal bila dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti
jenis isolat atau galur dan kondisi kultur isolat (Basiacik dan Aksoz 2004).
Kondisi kultur isolat dipengaruhi antara lain: pH media pertumbuhan, suhu, waktu
inkubasi, dan kondisi inkubasi bergerak atau diam, dan periode gelap atau terang
(Bilkay et al. 2010). Mikrob penghasil giberelin (Tabel 1).
Peranan isolat rizobakteri penghasil giberelin perlu dilakukan optimasi
terhadap media pertumbuhannya. Informasi mengenai pengaruh pertumbuhan
yang berkaitan dengan pH media pertumbuhan sel, lama proses pertumbuhan sel
dan pengaruh cahaya terhadap produksi giberelin oleh isolat rizobakteri masih
terbatas, sehingga perlu dilakukan penelitian tentang pengaruh faktor lingkungan
terhadap pertumbuhan sel dan produksi giberelin.

6

Tabel 1 Mikrob penghasil giberelin pada berbagai kondisi lingkungan
Mikrob
Pseudomonas sp.

Media
NB

Fusarium
moniliforme
LPB 03

Ekstrak
citric pulp
(CP)
dengan
sukrosa
Vermani
cair

Azotobacter sp.
LKM6
Aspergilus niger

CzapekDox cair

Bacillus sp.

TSA

Kondisi Produksi
pH 7
suhu 30 °C
Tanpa Cahaya
pH 6
suhu 29 °C
kelembaban 75 80 %
Tanpa Cahaya
pH 7
suhu 30 °C
Tanpa Cahaya
pH 5
suhu 30 °C
Tanpa Cahaya
pH 7
suhu 27 °C
Tanpa Cahaya

Giberelin
285.06
mg L-1

Referensi
Karakoc dan
Aksoz (2006)

5.9 g/Kg

Rodrigues
et al. (2009)

18.7 mg
Kg-1

Hindersah dan
Sudirja (2010)

128.3 mg
L-1

Bilkay et al.
(2010)

0.75 µg
mL-1

Umamaheswari
et al. (2013)

7

3 METODE
Kerangka Penelitian
Kerangka penelitian meliputi: isolasi rizobakteri dari tanah rizosfer asal
Hutan Penelitian Carita, uji kemampuan isolat rizobakteri penghasil giberelin, uji
hipersensitivitas, identifikasi isolat terpilih, uji pengaruh faktor lingkungan yaitu:
suhu, pH, dan kondisi cahaya gelap terang terhadap pertumbuhan sel rizobakteri
dan produksi giberelin (Gambar 1).
Isolasi rizobakteri penghasil
giberelin asal tanah Hutan
Penelitian Carita

Analisis kandungan
giberelin dari isolat terpilih

Seleksi isolat terpilih
penghasil giberelin terbaik

Identifikasi rizobakteri
 Morfologi
 Fisiologi (KIT API)
 Uji kualitas DNA
 16S rRNA

Uji pengaruh faktor
lingkungan terhadap
media pertumbuhan isolat
terbaik rizobakteri
penghasil giberelin

Gambar 1 Kerangka penelitian

8

Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Maret sampai Desember 2014.
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium
Fisiologi Tumbuhan Departeman Biologi, FMIPA, IPB.
Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan pada penelitian ini ialah sampel tanah asal rizosfer
sekitar perakaran pohon keruing (Dipterocarpus sp.) di Hutan Penelitian Carita,
Pandeglang, Banten (0608’ – 06014’LS dan 105050 – 105055’BT).
Pengambilan Sampel Tanah
Sampel tanah diambil dengan menggunakan metode Composite sampling
(Hyde et al. 2009) dari 10 titik lokasi pengambilan sampel secara acak dengan
jarak ± 1 Km antar titik lokasi pengambilan sampel dan 3 – 5 meter dari batang
pohon keruing (Dipterocarpus sp.) di bawah tajuk pohon di kedalaman 15-20 cm
dari permukaan tanah yang menempel di perakaran. Pengambilan sampel tanah
dilakukan dengan menggunakan bor tanah dengan kondisi bersih dan steril
permukaan. Sterilisasi alat dilakukan dengan mencuci peralatan dengan air bersih
dan dibilas dengan kapas beralkohol dan dievaporasi dengan nyala api (Saraswati
et al. 2007). Tanah kemudian dikompositkan, diambil sebanyak 1 Kg tanah untuk
diisolasi rizobakteri penghasil giberelin.
Isolasi Sel Rizobakteri Penghasil Giberelin dari Tanah Hutan
Rizobakteri penghasil giberelin diisolasi dengan media seleksi: Tripticase
Soy Agar (TSA), King’s B, Nitrogen Free-Base (NFB), dan Lactose Glucose
Induce (LGI). Teknik isolasi rizobakteri dilakukan dengan metode Rao (1996)
sebagai berikut: sampel tanah diambil dari tanah yang dikompositkan, ditimbang
sebanyak 1 g tanah rizosfer dengan 3 kali ulangan, kemudian dilarutkan dalam
9 ml larutan fisiologis (NaCl 0.85%), lalu dihomogenisasi menggunakan vortex.
Larutan diencerkan secara berseri sampai pengenceran 10-6, dan dari pengenceran
10-3 sampai 10-5 diambil 100µL untuk ditumbuhkan dalam media seleksi dengan
metode cawan sebar. Selanjutnya suspensi diinkubasi pada suhu ruang ± 25 °C,
selama 1 – 2 minggu. Koloni yang tumbuh pada media seleksi disubkulturkan
pada media seleksi yang sama sampai diperoleh isolat murni. Jumlah koloni sel
rizobakteri dihitung dengan metode cawan hitung (plate count) (Lay 1994).

9

Analisis Kemampuan Produksi Giberelin
Analisis kandungan giberelin diukur secara kuantitatif dengan
menggunakan metode Unyayar et al. (1996) (Lampiran 1). Isolat sel rizobakteri
ditumbuhkan pada media cair Trypticase Soy Broth (TSB) selama 24 jam
inkubasi pada suhu ruang ± 25 °C dan dikocok dengan kecepatan 120 rpm.
Sampel kultur isolat bakteri ditimbang 5 g, ditambahkan dengan 100 mL larutan
pelarut campuran metanol:kloroform:2N amonium hidroksida (12:5:3 v/v/v).
Campuran pelarut ekstrak 100 mL ditambah dengan 22.4 mL air aquades,
didiamkan dalam corong pemisah selama 24 jam sampai terjadi pemisahan 2 fase
lapisan cairan. Lapisan cair kloroform dibuang, fase cair ekstrak diatur menjadi
pH 2.5 dengan menggunakan larutan 5N HCl atau 1N NaOH untuk menaikkan
pH. Hasil ekstraksi ditambahkan dengan 15 mL etil asetat sampai 3 kali,
didiamkan selama 15 menit sampai terjadi pemisahan 2 lapisan cairan ekstrak,
lapisan ekstrak yang mengandung etil asetat kemudian dievaporasi 3 kali masingmasing ditambahkan etil asetat 15mL dengan rotaroevaporator (Buchi
Instruments) pada suhu 65 oC. Ekstrak hasil evaporasi kemudian dilarutkan dalam
metanol 10 mL. Larutan sampel hasil ekstraksi, dianalisis kandungan giberelinnya
dengan menggunakan spektrofotometer (Shimadzu Pharmaspec 1700) pada
‫ ג‬263 nm.
Uji Hipersensitivitas pada Daun Tembakau
Uji hipersensitif dilakukan pada daun tembakau (Nicotiana tabacum L.)
dewasa umur 3 bulan (Vanneste et al. 1990). Isolat sel rizobakteri ditumbuhkan
pada media seleksi TSB, LGI dan King’s B cair (107 sel mL-1). Bakteri
Pseudomonas syringae digunakan sebagai kontrol positif, karena bersifat patogen
pada tanaman, dengan gejala nekrosis pada daun tembakau, sedangkan air dan
media kultur sebagai kontrol negatif. Sebanyak 200 µL dari kultur bakteri uji,
kontrol positif, dan kontrol negatif diambil menggunakan alat penyuntik steril
(tanpa jarum), kemudian disuntikkan ke permukaan bawah daun tembakau. Gejala
hipersensitif diamati setelah 48 jam penyuntikan.
Karakterisasi Isolat Rizobakteri
Isolat rizobakteri dikarakterisasi berdasarkan ciri-ciri morfologi dan
fisiologi mengikuti Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (Holt et al.
1994). Identifikasi bakteri berdasarkan ciri-ciri biokimia menggunakan kit API®
20NE (bioMeriux, Inc. Durham, USA).
Identifikasi Isolat Sel Rizobakteri Terseleksi Berdasarkan Gen 16S rRNA
Isolat rizobakteri terpilih dari hasil uji kandungan giberelin dan uji
hipersensitivitas dari rizosfer pohon keruing (Dipterocarpus sp.) ditumbuhkan
pada medium Tripticase Soy Broth (TSB) selama 24 jam. Ekstraksi DNA

10

dilakukan dengan mengikuti prosedur PrestoTMMini gDNA Bakteri Kit (Geneaid).
Hasil ekstraksi DNA diukur kosentrasi dan kemurniannya dengan menggunakan
NanoDrop 2000 spektrofotometer (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA).
Amplifikasi gen 16S rRNA menggunakan mesin Polymerase Chain
Reaction (PCR) (EBSCO) dengan primer 67f (5’-CAG GCC TAA CAC ATG
CAA GTC-3’) dan 1387r (5’-GGG CGG WGT GTA CAA GGC-3’) (Marchesi
et al. 1998). Total volume untuk PCR yaitu 25 µL terdiri atas: 12.5 µL GoTag
Green Master Mix 2X (Promega, Madison, W1, USA), 2.5 µL primer 63f dan
1387r (10 pmol), 6.5 µL Nuclease Free Water dan 1 µL DNA template. Tahap
PCR yang dilakukan yaitu: pre-denaturation (95 °C, 5 menit), denaturation
(95 °C, 1 menit), annealing (55 °C, 1 menit), elongation (72 °C, 1.5 menit), dan
extension (72 °C, 5 menit) dengan total sebanyak 30 siklus. Produk hasil PCR
dielektroforesis dengan 1 % (w/v) gel agarosa dengan voltase 80 V selama
45 menit, hasil elektroforesis diamati dengan menggunakan UV transiluminator
GelDoc (Labquip) dengan pewarna Ethidium Bromida (EtBr). Penentuan urutan
nukleotida dilakukan di Laboratorium 1st Base PT Genetika Science, Singapura
dengan mengirimkan sampel DNA isolat BC2. Data sekuen DNA dari jasa
sekuensing selanjutnya dilakukan BLASTN (Basic Local Alignment Search Tool
Nucleotide) dengan data genom di GenBank kemudian disejajarkan menggunakan
program MEGA 5.05. (MegaSoftware, Inc, Arizona, USA). Konstruksi pohon
filogenetik dibuat dengan metode Neighbour Joining (NJ) (Altschul et al. 1997).
Kurva Pertumbuhan Sel dan Produksi Giberelin Isolat Terpilih
Kultur starter disiapkan dengan menginokulasikan 2 ose isolat rizobakteri
terpilih ke dalam 50 mL kultur media TSB cair, diinkubasi pada suhu ruang
± 27 °C dan kecepatan agitasi 120 rpm hingga kepadatan sel rizobakterinya
mencapai 108 CFU mL-1. Selanjutnya, sebanyak 1% inokulum dikultivasi ke
dalam media TSB cair produksi 200 mL pada pH 7 pada suhu ruang ± 27 °C dan
kecepatan agitasi 120 rpm. Kultur sel isolat terpilih diambil sebanyak 5 mL setiap
3 jam sekali selama 24 jam. Jumlah sel isolat rizobakteri diukur kerapatannya
pada ‫ ג‬590 nm. Hasil pengukuran nilai absorbansi dimasukkan ke dalam
persamaan kurva standar jumlah sel rizobakteri (Lampiran 4). Sebanyak 5 mL
kultur sel dipanen kemudian diukur produksi giberelin dengan menggunakan
metode Unyayar et al. (1996).
Pengaruh Faktor Lingkungan terhadap Pertumbuhan Sel Rizobakteri dan
Produksi Giberelin
Pengaruh faktor lingkungan terhadap pertumbuhan sel dan produksi
giberelin diukur secara berurutan dan bertahap selama 24 jam. Sebanyak 2 mL
kultur isolat rizobakteri terpilih pada produksi giberelin tinggi diinokulasikan ke
dalam 200 mL media TSB dengan kepadatan sel rizobakteri 108 CFU mL-1.
Parameter lingkungan yang diukur meliputi: (1) suhu inkubasi media
pertumbuhan sel isolat rizobakteri diatur pada suhu 25 oC, 30 oC, 35 oC, dan

11

40 oC, pada agitator, (2) pH media pertumbuhan sel untuk produksi giberelin
diatur dengan menggunakan bufer sitrat fosfat 0.2 M untuk pH 5 dan bufer fosfat
0.2 M untuk pH 6, 7, 8; dan (3) kondisi inkubasi cahaya gelap dan terang, kondisi
gelap dilakukan dengan penutup aluminium foil dan kondisi terang pada cahaya
ruang 400 cd M-2.
Analisis Data
Data hasil penelitian dianalisis dengan uji sidik ragam menggunakan
software SAS 9.1.3 (SAS Institut, Cary, NC, USA).

12

4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Isolasi Rizobakteri Penghasil Giberelin
Media pertumbuhan isolat rizobakteri menggunakan media seleksi yaitu:
Media TSA, King’s B, LGI, dan media NFB. Media TSA digunakan untuk isolasi
Bacillus, King’s B untuk isolasi Pseudomonas, media LGI untuk isolasi
Azotobacter, dan media NFB untuk isolasi Azospirillum. Sebanyak 8 isolat
rizobakteri dapat tumbuh di media seleksi, yaitu: BC1, BC2, BC3 tumbuh di
media TSA, BC4, BC5, BC6 tumbuh di media LGI, BC7, dan BC8 tumbuh di
media King’s B. Isolat rizobakteri tidak ada yang tumbuh pada media NFB
(Tabel 2).
Tabel 2 Karakterisasi isolat rizobakteri asal tanah rizosfer pohon keruing
(Dipterocarpus sp.)
Media
seleksi

Karakterisasi
Morfologi koloni
Isolat

TSA

BC1
BC2
BC3
LGI
BC4
BC5
BC6
King’s BC7
B
BC8

Gram Bentuk sel

Bentuk

Tepi

Elevasi

Warna

tak teratur
bundar
bundar
konsentris
bundar
bundar
bundar
bundar

berombak
utuh
utuh
utuh
licin
utuh
licin
licin

rata
cembung
rata
cembung
cembung
cembung
cembung
cembung

putih
hijau
putih
hijau
+
kuning +
hijau
+
kuning hijau
-

batang
batang
batang
batang
batang
bundar
bundar
bundar

Analisis Kemampuan Produksi Giberelin
Semua isolat rizobakteri mempunyai kemampuan menghasilkan giberelin.
Isolat rizobakteri menghasilkan giberelin yang berbeda-beda. Hal ini ditunjukkan
dengan besarnya produksi giberelin yang dihasilkan oleh masing-masing isolat
rizobakteri (Gambar 2). Isolat rizobakteri BC4 menghasilkan giberelin terendah
sebesar 0.219 mg L-1, isolat rizobakteri BC7 menghasilkan giberelin tertinggi
sebesar 0.890 mg L-1.

13

Gambar 2 Kandungan giberelin yang dihasilkan isolat rizobakteri asal
tanah rizosfer pohon keruing (Dipterocarpus sp.)
Uji Hipersensitivitas pada Daun Tembakau
Uji hipersensitivitas dilakukan untuk mengetahui sifat patogen isolat
rizobakteri asal tanah rizosfer akar pohon keruing (Dipterocarpus sp.) terhadap
tanaman inang. Hasil uji hipersensitivitas menunjukkan bahwa daun tembakau
yang diinjeksi dengan Pseudomonas syringae (kontrol positif) mengalami gejala
hipersensitif, yang ditunjukkan dengan perubahan warna daun tembakau dari
warna hijau menjadi kuning atau nekrosis (Gambar 3), sedangkan kontrol negatif
menunjukkan hasil negatif ditandai dengan tidak terbentuknya perubahan warna
pada daun tembakau.
Hasil pengamatan 48 jam setelah diinjeksi, daun tembakau yang diinjeksi
perlakuan kultur isolat rizobakteri BC7 dan BC8 menunjukkan gejala
hipersensitif di permukaan atas daun tembakau pada daerah penyuntikan,
sedangkan 6 isolat rizobakteri lainnya tidak menunjukkan gejala hipersensitif di
permukaan atas daun tembakau (Tabel 3).
Tabel 3 Uji hipersensitivitas isolat rizobakteri pada daun tembakau
Isolat
hasil uji
rizobakteri hipersensitivitas
BC1
BC2
BC3
BC4
BC5
BC6
BC7
+
A
B
BC8
+
Gambar 3 Gejala hipersensitivitas isolat
Kontrol
+
rizobakteri BC7 pada daun tembakau
positif
(A) seperti pada Pseudomonas
Kontrol
syringae sebagai kontrol positif (B)
negatif

14

Identifikasi dan Karakterisasi Isolat Sel Rizobakteri BC2
Isolat rizobakteri BC2 dipilih untuk uji lebih lanjut karena tidak
menunjukkan gejala hipersensitif pada daun tembakau dan giberelin yang
dihasilkan lebih tinggi di antara isolat lainnya yang tidak menunjukkan gejala
hipersensitif. Morfologi isolat rizobakteri BC2 dengan pewarnaan Gram
menunjukkan bentuk koloni bundar, tepian utuh, bentuk sel batang, ukuran
panjang 3 μm, elevasi cembung, dan Gram negatif (Gambar 4). Identifikasi isolat
rizobakteri BC2 didasarkan pada karakter fisiologi dan reaksi biokimia yang
terjadi dalam metabolisme bakteri (Tabel 4).

3µm

Gambar 4 Sel isolat rizobakteri BC2 dengan pewarnaan Gram
Tabel 4 Karakteristik fisiologi isolat rizobakteri BC2
Pengujian
Metil merah
Produksi H2S
Hidrolisis urea
Produksi indol
Reduksi nitrat
Pemanfaatan sitrat
Pemanfaatan glukosa
Dekarboksilase lisin
Dekarboksilase ornitin
Pemanfaatan Manitol
Produksi acetoin
Pemanfaatan malonat
Pemanfaatan inositol
Pemanfaatan sorbitol
Pemanfaatan rhamnosa
Pemanfaatan sukrosa
Pemanfaatan laktosa
Dehidrolase arginin

Hasil uji fisiologi
Negatif
Positif
Positif
Negatif
Positif
Negatif
Negatif
Positif
Negatif
Negatif
Positif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif

15

Hasil uji biokimia menggunakan kit API® 20NE menunjukkan isolat
rizobakteri BC2 merupakan Pseudomonas maltophilia dengan tingkat kesamaan
99 %. Hasil uji kualitas DNA isolat rizobakteri BC2 menunjukkan perbandingan ‫ג‬
260/280 senilai 2.02 (Lampiran 5). Hasil visualisasi amplifikasi gen 16S rRNA
pada gel agarosa 0.8 % dihasilkan produk pita DNA dengan ukuran ± 1300
pasang basa (Gambar 5).

Gambar 5 Pita gen 16S rRNA isolat BC2 berukuran ±1300 bp, M=Marker 1kb
Analisis sekuen gen 16S rRNA (Lampiran 6 ) dengan data pada GenBank
pada program BLAST-N menunjukkan bahwa isolat rizobakteri BC2 termasuk ke
dalam genus Stenotrophomonas dengan nilai kesamaan 98 % (Tabel 5).
Tabel 5 Analisis kesamaan sekuen gen 16S rRNA isolat BC2 menggunakan BLAST-N
Nama spesies
Stenotrophomonas sp. PMIK-2
Stenotrophomonas sp. I_37-G5PA9B
Stenotrophomonas maltophilia galur
KF973235
Stenotrophomonas maltophilia galur DZSG-6
Stenotrophomonas maltophilia galur
KC849451

Homologi
(%)
98
98

Nilai-harapan

No aksesi

0.0
0.0

KC514104.1
KM091643.1

98

0.0

KJ548880.1

98

0.0

KC4973235.1

98

0.0

KF839451.1

Konstruksi pohon filogenetik dilakukan untuk mengetahui kekerabatan
isolat rizobakteri BC2 dengan data pada GenBank. Hasil konstruksi pohon
filogenetik menunjukkan bahwa isolat rizobakteri BC2 berada dalam satu klad
dengan Stenotrophomonas maltophilia galur KC 849451 (Gambar 6).

16

Stenotrophomonas_maltophilia_KC136833
45 Xanthomonadaceae_bacteriumJ_N846918
31

Stenotrophomonas_maltophilia_KF973235

95

Bacillus_anthracis_KF973291
48

98

Xanthomonas_sp_GQ381284
hadi
Isolat

BC2

Stenotrophomonas_maltophilia_KC849451
0.002

Gambar 6 Konstruksi pohon filogenetik isolat rizobakteri BC 2
dengan metode Neighbour-Joining
Kurva Pertumbuhan Sel dan Produksi Giberelin Isolat Rizobakteri BC2
Kurva pertumbuhan isolat rizobakteri BC2 dibuat dengan menggunakan
media pertumbuhan TSB. Sebanyak 2 mL kultur isolat rizobakteri dengan
kepadatan sel rizobakteri 108 CFU mL-1 ditumbuhkan dalam 200 mL media
produksi TSB. Fase adaptasi sel rizobakteri BC2 dimulai pada tiga jam pertama,
fase logaritmik terjadi sejak 3 jam hingga 21 jam inkubasi, selanjutnya diikuti
dengan fase stasioner hingga 24 jam inkubasi. Giberelin mulai diproduksi pada
fase logaritmik, yaitu: pada jam ke-3 dan meningkat ketika memasuki fase
logaritmik pada jam ke-12 sebesar 0.899 mg L-1. Produksi giberelin tertinggi
dicapai pada jam ke-21 sebesar 3.211 mg L-1, dan selanjutnya produksi giberelin
mulai menurun hingga jam ke-24 sebesar 3.144 mg L-1(Gambar 7).

Gambar 7 Kurva pertumbuhan sel dan produksi giberelin isolat rizobakteri BC2 di
media pertumbuhan TSB pada suhu 27 °C

17

Pengaruh Suhu Media terhadap Pertumbuhan Sel dan Produksi Giberelin
Sebanyak 2 mL kultur isolat rizobakteri BC2 dengan kepadatan sel
rizobakteri 108 CFU mL-1 ditumbuhkan dalam 200 mL media produksi TSB.
Isolat rizobakteri BC2 diinkubasi selama 21 jam. Hasil perlakuan suhu terhadap
media pertumbuhan isolat sel rizobakteri BC2 menunjukkan bahwa pada suhu
25 °C, isolat rizobakteri BC2 mengalami pertumbuhan sel terendah dan dihasilkan
giberelin terendah sebesar 1.546 mg L-1, sedangkan pada suhu 30 °C pertumbuhan
sel isolat rizobakteri BC2 tertinggi dan dihasilkan giberelin tertinggi sebesar 3.428
mg L-1 (Gambar 8).

Gambar 8 Pertumbuhan sel dan produksi giberelin isolat
rizobakteri BC2 pada berbagai suhu, dengan kondisi
pH netral, dan cahaya terang
Pengaruh pH Media Pertumbuhan terhadap Pertumbuhan Sel Rizobakteri
dan Produksi Giberelin Isolat BC2
Sebanyak 2 mL kultur isolat rizobakteri BC2 dengan kepadatan sel
rizobakteri 108 CFU mL-1 ditumbuhkan dalam 200 mL media produksi TSB.
Isolat rizobakteri BC2 diinkubasi selama 21 jam. Perlakuan pengaruh pH media
pertumbuhan terhadap pertumbuhan sel menunjukkan bahwa pada media
pertumbuhan pH 5 pertumbuhan sel isolat BC2 terendah. Pada media
pertumbuhan pH 5 dihasilkan giberelin terendah sebesar 0.455 mg L-1. Pada

18

media pertumbuhan pH 7 dihasilkan giberelin tertinggi sebesar 0.815 mg L-1
(Gambar 9). Pertumbuhan sel isolat rizobakteri BC2 terjadi peningkatan jumlah
sel dan produksi giberelin sampai pada pH 7, kemudian mengalami penurunan
jumlah sel dan produksi giberelin sampai pada pH 8.

Gambar 9 Pertumbuhan sel dan produksi giberelin isolat BC2 pada berbagai pH
dengan suhu 27 °C

Pengaruh Kondisi Cahaya terhadap Pertumbuhan Sel dan Produksi
Giberelin
Sebanyak 2 mL kultur isolat rizobakteri BC2 dengan kepadatan sel
rizobakteri 108 CFU mL-1 ditumbuhkan dalam 200 mL media produksi TSB.
Isolat rizobakteri BC2 diinkubasi selama 21 jam. Hasil perlakuan pengaruh
kondisi cahaya pada suhu 30 °C dan pH 7 terhadap pertumbuhan sel dan produksi
giberelin menunjukkan bahwa pada kondisi cahaya gelap pertumbuhan sel lebih
tinggi dibandingkan dengan kondisi cahaya terang. Giberelin yang dihasilkan
isolat BC2 pada kondisi gelap sebesar 1.848 mg L-1 lebih tinggi dibandingkan
dengan kondisi terang sebesar 1.248 mg L-1 (Tabel 6).

19

Tabel 6 Pertumbuhan sel dan produksi giberelin isolat rizobakteri BC2 pada
suhu 30 °C, pH 7, dan kondisi cahaya terang dan tanpa cahaya
Kondisi inkubasi

Log sel

Terang
Gelap

9.550
9.809 *

Giberelin (mg L-1)

1.248
1.848*

Keterangan: tanda * menunjukkan angka beda nyata pada α =5%

Pembahasan
Isolat rizobakteri dapat tumbuh di sekitar rizosfer perakaran tumbuhan.
Namun di laboratorium, hanya isolat rizobakteri yang dapat dikulturkan yang
dapat tumbuh dan berhasil diisolasi. Pada penelitian ini tidak didapatkan isolat
rizobakteri yang tumbuh pada media Nitrogen Free-Base (NFB) yang diduga
dipengaruhi oleh ketersediaan sumber nutrisi yang berbeda dengan media
Tripticase Soy Agar (TSA), Lactose Glucose Induce (LGI) dan King’s B.
Jumlah populasi sel rizobakteri menunjukkan jumlah populasi yang berbeda
pada setiap sampel tanah rizosfer (Lampiran 2). Isolat BC1 jumlah sel/g tanah
paling tinggi (4.9 x 106 sel/g tanah) sedangkan isolat BC7 jumlah sel rizobakteri
paling rendah (2.5 x 105 sel/g tanah). Keragaman jumlah spesies ditunjukkan
dengan adanya isolat-isolat yang dapat tumbuh pada media seleksi. Di alam,
eksudat perakaran yang merupakan sumber nutrisi berperan sebagai penghambat
dan stimulator terhadap keragaman populasi rizobakteri (Lebuhn et al. 1997)
menjadi pembeda, penentu keragaman, dan jumlah populasi di rizosfer tanaman
(Broekling et al. 2008; Piromyou et al. 2011; Gunes et al. 2014).
Populasi isolat rizobakteri juga dipengaruhi oleh faktor abiotik seperti pH
tanah, suhu, dan kelembapan (Bardgett 2005; Arruda et al. 2013). Semakin
banyak keragaman dan jumlah populasi sel rizobakteri semakin menguntungkan
tanaman karena dapat menjadi sumber rizobakteri tanaman lainnya (Agustian
et al. 2010; Bratkova et al. 2012; Ahemad dan Kibret 2014).
Sebanyak delapan isolat rizobakteri yang diisolasi dari tanah rizosfer pohon
keruing (Dipterocarpus sp.) menghasilkan giberelin (Gambar 2) dengan
kemampuan yang berbeda dalam menghasilkan giberelin. Rizobakteri diketahui
menghasilkan giberelin (Bomke dan Tudzynski 2009). Giberelin merupakan
metabolit sekunder yang dihasilkan dalam metabolisme sel sebagai molekul sinyal
untuk mengenal inang tumbuhan (Bottini et al. 2004; Ahemad dan Kibret 2014;
Puga-Freitas dan Blouin 2014). Kemampuan isolat rizobakteri dalam
menghasilkan giberelin tidak sama (Capellari et al. 2013). Hal ini dipengaruhi
oleh karakteristik biokimia dan faktor lingkungan (Ahmad et al. 2008; Kumar
et al. 2014).
Isolat rizobakteri BC7 dan BC8 menunjukkan reaksi hipersensitif positif
ditandai dengan kemampuannya menyebabkan daun tembakau berubah warna
menjadi kekuningan atau nekrosis. Isolat rizobakteri BC2 menunjukkan hasil
reaksi hipersensitif negatif, ditandai dengan tidak terbentuknya gejala perubahan

20

warna kekuningan atau nekrosis pada daun tembakau. Hipersensitif merupakan
reaksi inang terhadap adanya serangan patogen. Reaksi ini biasanya menyebabkan
kematian sebagian sel inang yang bertujuan untuk menghambat pertumbuhan
patogen (Lindsay et al. 1993; Arwiyanto et al. 2007).
Analisis kualitas DNA isolat rizobakteri BC2 menunjukkan nilai 2.02
(Lampiran 5). Kualitas DNA yang baik dihitung dengan membandingkan nilai
serapan cahaya oleh molekul DNA dengan konsentrasi yang sama (50 mg/ml) ‫ג‬
260/280 dengan kisaran nilai 1.8-2.0 (Yuwono 2005). Hal ini menunjukkan
bahwa kualitas DNA isolat rizobakteri BC2 adalah baik.
Analisis filogenetik menunjukkan bahwa isolat rizobakteri BC2
kekerabatannya dekat dengan Stenotrophomonas maltophilia dengan tingkat
kesamaaan 98 % (Gambar 6). Stenotrophomonas maltophilia adalah nama baru
dari Pseudomonas maltophilia, bakteri bentuk batang, aerob, Gram negatif,
nonpatogen pada tanaman (Palleroni dan Bradbury 1993; Urszula et al. 2009).
Stenotrophomonas maltophilia bersifat katalase dan oksidase positif,
mengakumulasi β-polihidroksi butirat sebagai sumber karbon, kemoorganotrof
(Deswhal et al. 2013) dan memiliki kandungan GC tinggi berkisar 58-68 %
(Broun-Howland et al. 1992) ditemukan juga pada rizosfer tanaman tebu (Mehnaz
et al. 2010), jagung (Arruda et al. 2013), dan kacang tanah (Sholichatun et al.
2013).
Stenotrophomonas maltophilia termasuk dalam rizobakteri ekstraseluler
yang dapat memacu pertumbuhan tanaman dengan menghasilkan fitohormon
(Liba et al. 2006), yaitu hormon giberelin (Owen et al. 2015), mampu
menginduksi ketahanan bawang merah terhadap hawar daun bakteri (Dunne et al.
1997; Ernita et al. 2010), secara in vitro efektif menekan pertumbuhan Fusarium
culmorum (Kamil et al. 2007).
Jumlah sel isolat rizobakteri dapat dihitung dengan menggunakan rapat optis
(Optical density atau OD) kemudian dibuat kurva standar jumlah sel
(Lampiran 4). Pertumbuhan sel dan produksi giberelin isolat rizobakteri BC2
dipengaruhi oleh suhu inkubasi media pertumbuhan sel. Pada suhu 25 °C
pertumbuhan sel rizobakteri BC2 terendah dan produksi giberelin terendah,
sedangkan pada suhu 30 °C pertumbuhan sel rizobakteri BC2 tertinggi dan
produksi giberelin tertinggi. Hal ini ditunjukkan dengan peningkatan jumlah sel
isolat rizobakteri BC2 dan produksi giberelin pada media pertumbuhan sel.
Jumlah sel isolat rizobakteri BC2 dan produksi giberelin pada suhu 35 °C lebih
kecil dibandingkan pada suhu 25 °C. Jumlah sel rizobakteri BC2 dan produksi
giberelin menunjukkan penurunan pada suhu di atas 30 °C. Bakteri dapat tumbuh
baik di kisaran suhu 25 °C – 30 °C (Gambar 8).
Jumlah sel isolat rizobakteri BC2 mencapai 9.85 pada suhu 30 °C, pada
suhu ini bakteri dapat melangsungkan proses metabolisme dengan baik. Glick
(2012) menyatakan bahwa, bakteri peka terhadap suhu lingkungan. Kecepatan
reaksi hampir semua metabolisme dapat meningkat dua kali lebih cepat pada
setiap kenaikan suhu 10 °C (Murray et al. 2009). Pertumbuhan sel dan produksi
giberelin isolat Pseudomonas sp. optimum pada suhu 30 0C (Karakoc dan Aksoz
2006; Shruti et al. 2013).
Pertumbuhan sel dan produksi giberelin isolat rizobakteri BC2 dipengaruhi
oleh pH media dengan pH optimumnya 7. Perlakuan pH media 5 menyebabkan
pertumbuhan sel dan produksi giberelin isolat rizobakteri BC2 terendah,

21

sedangkan pada pH media 7, pertumbuhan sel dan produksi giberelin tertinggi
(Gambar 9). Pseudomonas sp. menghasilkan giberelin sebesar 285,06 mg L-1 pada
suhu 30 °C, pH 7, dan 72 jam inkubasi (Karakoc dan Aksoz 2006). Azotobacter
sp. LKM6 menghasilkan giberelin sebesar 18,7 mg Kg-1 pada suhu 30 °C, pH 7,
dan 48 jam inkubasi (Hindersah dan Sudirja 2010).
Pada saat pH 7 mulai terjadi penurunan
pertumbuhan sel dan produksi giberelin. Hal ini ditunjukkan dengan turunnya
jumlah sel isolat BC2 dan produksir giberelin yang dihasilkan lebih kecil
dibandingkan saat pH 7 (Gambar 9). Karakoc dan Aksoz (2006) menyatakan
bahwa pertumbuhan sel dan produksi giberelin Pseudomonas sp. optimum pada
media pertumbuhan dengan pH, suhu 30 °C, dan kondisi gelap.
Kondisi pH yang asam atau basa dapat menyebabkan perubahan aktivitas
metabolisme sel. Perubahan pada pH dapat mengubah penyebaran muatan ion
sehingga aktivitas enzim akan mengubah metabolisme dalam sel. Bufer fosfat
berfungsi untuk menjaga agar konsentrasi ion H+ pada media kultur cair tidak
berubah. Selain itu, K2HPO4 dan MgSO4.7H20 juga berperan sebagai sumber
fosfor dan magnesium (Sukmadi 2012).
Pertumbuhan sel dan produksi giberelin isolat rizobakteri BC2 pada suhu
inkubasi 30 oC, pH 7, dan kondisi cahaya gelap menghasilkan pertumbuhan sel
dan produksi giberelin yang lebih tinggi dibandingkan dengan kondisi cahaya
terang (Tabel 5). Hal ini ditunjukkan dengan jumlah sel dan produksi giberelin
pada kondisi cahaya gelap lebih tinggi dibandingkan dengan kondisi cahaya
terang. Lugterberg dan Kamilova (2009) dan Glick (2012) menyatakan bahwa
rizobakteri peka terhadap intensitas cahaya. Cahaya dapat menghambat biosintesis
giberelin (Karakoc dan Aksoz 2006; Bomke dan Tudzynki 2009; Kang et al.
2014), termasuk lama penyinaran menghambat biosintesis giberelin (Strik et al.
2014). Pengaturan cahaya dalam biosintesis giberelin melalui gen-gen
dioksigenase (Hedden dan Phillip 2000).
Prospek aplikasi giberelin di bidang pertanian diharapkan dapat
meningkatkan ketahanan tanaman, menyeragamkan waktu tanaman berbunga atau
berbuah, memperbesar ukuran hasil panen, dan meningkatkan kualitas produk
tanaman. Pemakaian giberelin diharapkan dapat dikurangi dengan rekayasa
metabolisme melalui jalur biosintesis giberelin.

22

5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Dari sampel tanah rizosfer akar pohon keruing (Dipterocarpus sp.) di
Hutan Penelitian Carita, Kabupaten Pandeglang, Banten diperoleh 8 isolat
rizobakteri penghasil giberelin. Isolat rizobakteri BC2 menghasilkan giberelin
tertinggi (0.756 m