Karakterisasi Bakteri Penghasil Asil Homoserin Lakton Laktonase dan Asilase yang diisolasi dari Lahan Pertanian

KARAKTERISASI BAKTERI PENGHASIL
ASIL HOMOSERIN LAKTON LAKTONASE DAN ASILASE
YANG DIISOLASI DARI LAHAN PERTANIAN

DINA FITRIYAH

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Karakterisasi Bakteri
Penghasil Asil Homoserin Lakton Laktonase dan Asilase yang diisolasi dari
Lahan Pertanian adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing
dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun.
Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun
tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan
dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.
Bogor, Januari 2015
Dina Fitriyah
NIM G351120101

RINGKASAN
DINA FITRIYAH. Karakterisasi Bakteri Penghasil Asil Homoserin Lakton
Laktonase dan Asilase yang diisolasi dari Lahan Pertanian. Dibimbing oleh
IMAN RUSMANA dan ARIS TRI WAHYUDI.
Bakteri Gram negatif melakukan quorum sensing dengan menggunakan
sinyal Asil Homoserin Lakton (AHL) untuk meregulasi ekspresi gen tertentu
seperti gen untuk transfer plasmid, pembentukan nodul, biofilm, produksi
antibiotik, eksopolisakarida, serta produksi faktor virulen. Bakteri fitopatogen
menggunakan mekanisme quorum sensing untuk mengekspresikan gen-gen
virulennya. Sejauh ini, pengendalian bakteri fitopatogen dilakukan dengan
menggunakan senyawa antibiotik maupun pestisida. Penggunaan senyawa ini
secara terus menerus dapat menyebabkan resistensi bakteri terhadap senyawa
tersebut. Salah satu strategi pengendalian bakteri fitopatogen yang dapat
digunakan yaitu dengan degradasi molekul sinyal oleh enzim yaitu AHL laktonase
yang dikodekan oleh gen aiiA dan AHL asilase yang dikodekan oleh gen pvdQ.

Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi bakteri yang menghasilkan AHL
laktonase dan AHL asilase.
Isolasi bakteri dilakukan pada 11 sampel tanah rizosfer asal lahan pertanian
di Jawa. Isolasi bakteri dilakukan dengan metode cawan sebar pada media
Nutrient Agar (NA). Aktivitas degradasi AHL diuji menggunakan bioindikator
Chromobacterium violaceum. Isolat bakteri yang memiliki aktivitas degradasi
AHL diidentifikasi secara morfologi, fisiologi dan identifikasi berdasarkan gen
16S rRNA. Verifikasi keberadaan AHL laktonase dan AHL asilase dilakukan
dengan amplifikasi gen aiiA menggunakan primer BTFdan BTR, gen pvdQ
diamplifikasi menggunakan primer pvdQF dan pvdQR. Produk PCR disekuensing,
kemudian dianalisis menggunakan software MEGA 5.05.
Sebanyak 161 isolat bakteri berhasil diisolasi dari tanah rizosfer asal lahan
pertanian di Jawa, enam diantaranya memiliki aktivitas degradasi AHL yaitu
isolat BKS-1, BKS-8, BGR-7, CMS-4, JBR1-3 dan JBR2-16. Berdasarkan
identifikasi morfologi, satu isolat yaitu BKS-1 merupakan bakteri Gram negatif
berbentuk batang pendek, sedangkan lima isolat (BKS-8, BGR-7, CMS-4, JBR1-3
dan JBR2-16) merupakan bakteri Gram positif dengan sel berbentuk batang.
Identifikasi bakteri secara fisiologi berdasarkan kemampuan dalam
memetabolisme glukosa melalui uji oksidatif fermentatif menunjukkan bahwa
BKS-1 bersifat fermentatif yang ditandai dengan perubahan warna media dari

hijau menjadi kuning pada tabung yang dikondisikan aerob dan anaerob,
sedangkan isolat BKS-8, BGR-7, JBR1-3 dan JBR2-16 tidak menunjukkan
perubahan warna media. Analisis sekuen gen 16S rRNA berdasarkan BLAST-N
menunjukkan bahwa BKS-1 memiliki kemiripan dengan Serratia marcescens
By2Root2, BKS-8 dengan Bacillus aquimaris JB306, BGR-7 dengan
B. marisflavi GN28, CMS-4 dengan B. altitudinis NIOT-BARREN23, JBR-13
dengan B. aquimaris dengan JP44SK28 dan JBR2-16 dengan B. axarquiensis
CHMS1B6 dengan persentase kemiripan masing-masing 100%. Amplifikasi gen
aiiA menunjukkan bahwa semua isolat dapat diamplifikasi dan menghasilkan
produk berukuran ± 750 pb, sedangkan gen pvdQ tidak dapat teramplifikasi.
Analisis gen aiiA berdasarkan BLAST-X menunjukkan bahwa AHL laktonase

BKS-1 memiliki kedekatan dengan AHL laktonase kelompok B. cereus dengan
persentase kemiripan 99%, AHL laktonase BKS-8 dengan AHL laktonase
Bacillus sp. MBG09, BGR-7 dengan AHL laktonase Bacillus sp.MBG12, CMS-4
dan JBR1-3 dengan AHL laktonase B. cereus, JBR2-16 dengan AHL laktonase
B. firmus dengan persentase kesamaan masing-masing yaitu 92%, 97%, 94%,
98%, dan 99%. Keberadaan AHL laktonase pada B. aquimaris, B. marisflavi,
B. altitudinis dan B. axarquiensis belum pernah dilaporkan, sehingga penelitian
ini memberikan informasi baru bahwa bakteri tersebut dapat menghasilkan AHL

laktonase dan berpotensi sebagai agen biokontrol bakteri fitopatogen.
Kata Kunci: AHL-laktonase, Bacillus altitudinis, Bacillus aquimaris, Bacillus
axarquiensis, Bacillus marisflavi.

SUMMARY
DINA FITRIYAH. Characterization of Bacteria Producing Acyl Homoserine
Lactone Lactonase and Acylase Isolated from Agricultural Lands. Supervised by
IMAN RUSMANA and ARIS TRI WAHYUDI.
Gram negative bacteria perform quorum sensing by using
acylhomoserine lactone (AHL) signal to regulate specific gene expression such as,
plasmid transfer, formation of nodule and biofilm, production of antibiotic,
exopolysaccharide and virulence factor. Phytopathogenic bacteria use quorum
sensing mechanism to express virulence genes. So far, to control of
phytopathogenic bacteria has been done using antibiotics and pesticides. The use
of antibiotics continously can cause bacterial resistance to these compounds. One
of strategy to control phytopathogenic bacteria by degrading signal molecules
using enzymes i.e AHL lactonase encoded by aiiA gene and AHL acylase encoded
by pvdQ gene. The objective of this research was to characterize bacteria that
produce AHL lactonase and AHL acylase.
Isolation of bacteria was done on 11 samples of rhizosphere soils from

agricultural lands in Java, Indonesia. Bacterial isolation was carried out by
dilution method and inoculated on Nutrient Agar (NA) medium using spread plate
method. AHL degrading activities of bacterial isolates were tested using
Chromobacterium violaceum as a bioindicator. AHL degrading bacterial isolates
were identified based on morphology, physiology, and 16S rRNA gene.
Verification of AHL lactonase and AHL acylase existence was done by
amplification of aiiA gene (using BTF and BTR primers) and pvdQ gene (using
pvdQF and pvdQR primers). PCR product were sequenced, and analyzed by
MEGA 5.05 bioinformatics software.
A total of 161 bacterial isolates were isolated from rhizosphere, six of them
was able to degrade AHL (BKS-1, BKS-8, BGR-7, CMS-4, JBRI-3, and JBR216). Based on morphological characteristic of AHL degrading isolates, BKS-1
isolate was Gram negative bacteria with short rod shape, while the others five
isolates (BKS-8, BGR-7, CMS-4, JBR1-3 and JBR2-16) were Gram positive
bacteria with rod shape cells. Physiological characteristics of AHL degrading
bacteria based on the ability to metabolize glucose through oxidation fermentative
test showed that BKS-1 was fermentative bacteria indicated by color change of
medium from green to yellow in aerobic and anaerobic condition, whereas
bacterial isolates of BKS-8, BGR-7, JBR1-3 and JBR2-16 did not showed color
change on the medium. BLAST-N analysis of 16S rRNA gene sequences showed
that the isolates of BKS-1, BKS-8, BGR-7, CMS-4, JBR1-3 and JBR2-16 had

100% similarity with Serratia marcescens By2Root2, Bacillus aquimaris JB306,
B. marisflavi GN28, B. altitudinis NIOT-BARREN23, B. aquimaris JP44SK28
and B. axarquiensis CHMS1B6, respectively. The aiiA gene amplification showed
that all isolates were successfully amplified with PCR products of ±750 bp,
whereas pvdQ gene could not be amplified. BLAST-X analysis of aiiA gene
showed that AHL lactonase of BKS-1 was closely related with AHL lactonase of
B. cereus group with 99% similarity, AHL lactonase BKS-8 with AHL lactonase
from Bacillus sp. MBG09, AHL lactonase BGR-7 with AHL lactonase from

Bacillus sp.MBG12, AHL lactonase CMS-4 and JBR1-3 were closely related with
AHL lactonase from B. cereus, AHL lactonase JBR2-16 was closely related with
AHL lactonase from B. firmus with 92%, 97%, 94%, 98%, and 99% of maximum
identity, respectively. The existence of the AHL lactonase from B. aquimaris,
B. marisflavi, B. altitudinis and B. axarquiensis have not been reported yet, this
study provide the new information that they could produced AHL lactonase that
encode aiiA gene and might have potential as a biocontrol agents against
phytopathogen bacteria.
Key words: AHL-lactonase, Bacillus altitudinis, Bacillus aquimaris, Bacillus
axarquiensis, Bacillus marisflavi.

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

KARAKTERISASI BAKTERI PENGHASIL
ASIL HOMOSERIN LAKTON LAKTONASE DAN ASILASE
YANG DIISOLASI DARI LAHAN PERTANIAN

DINA FITRIYAH

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada

Program Studi Mikrobiologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Ir Abdjad Asih Nawangsih, MSi

PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah subhanahu wa ta’ala yang
telah melimpahkan rahmat dan karunia-Nya, sehingga penulis dapat
menyelesaikan penyusunan tesis yang berjudul “Karakterisasi Bakteri Penghasil
Asil Homoserin Lakton Laktonase dan Asilase yang diisolasi dari Lahan
Pertanian”. Tesis ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat untuk
menyelesaikan pendidikan strata dua (S2) Program Studi Mikrobiologi,
Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Pengetahuan Alam, Institut
Pertanian Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr Ir Iman Rusmana, MSi dan
Prof. Dr. Aris Tri Wahyudi, MSi selaku pembimbing yang telah memberikan

pengarahan, bimbingan, saran, motivasi, serta solusi dari setiap permasalahan
yang dihadapi penulis selama melaksanakan penelitian dan penyusunan karya
ilmiah ini. Selain itu penulis ucapkan terima kasih kepada penguji luar komisi
Dr Ir Abdjad Asih Nawangsih, MSi dan Prof. Dr. Anja Meryandini, MS selaku
Ketua Program Studi Mikrobiologi IPB, yang telah memberikan masukan pada
saat ujian sidang tesis untuk membuat karya ilmiah ini menjadi lebih baik. Ucapan
terima kasih kepada DIKTI melalui Beasiswa Unggulan 2012/2013 atas
kepercayaannya untuk memberikan beasiswa kuliah selama menempuh
pendidikan pascasarjana di IPB, sehingga penelitian yang penulis lakukan dapat
terlaksana dengan baik.
Penulis juga ingin menyampaikan terima kasih kepada Bapak Jaka dan Ibu
Heni selaku staf Laboratorium Mikrobiologi, Aar, Asril, Bang Risky, Kak Sipri,
Randi, Hendri, Anja, Lekta, Mbak Mona, Mbak Anik, Mbak Gege, Mbak Ayun,
Mb Rika, Eja, Vita, Antri, serta seluruh teman-teman di Laboratorium
Mikrobiologi IPB, atas bantuan dan motivasinya selama penelitian. Terima kasih
kepada teman-teman seperjuangan Pascasarjana Mikrobiologi IPB 2012 atas
kebersamaan dan persaudaraannya. Ungkapan terima kasih yang tak terhingga
juga penulis ucapkan kepada bapak, ibu, saudara Moh. Rosyadi Adnan dan Moh.
Ubaidillah serta seluruh keluarga besar tercinta, atas segala doa, semangat,
dukungan, motivasi dan kasih sayangnya selama ini. Semoga karya tulis ini

bermanfaat bagi kemajuan ilmu pengetahuan selanjutnya.

Bogor, Januari 2015
Dina Fitriyah

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

xi

DAFTAR GAMBAR

xi

DAFTAR LAMPIRAN

xi

PENDAHULUAN

1

Latar Belakang

1

Perumusan Masalah

2

Tujuan Penelitian

2

Manfaat Penelitian

2

Ruang Lingkup Penelitian

2

TINJAUAN PUSTAKA

3

Quorum Sensing

3

Acyl Homoserine Lactone (AHL)

3

Strategi Quorum Quenching dengan AHL laktonase dan AHL asilase

5

METODE PENELITIAN

7

Kerangka Penelitian

7

Waktu dan Tempat Penelitian

7

Isolasi Bakteri Asal Lahan Pertanian

7

Bioesei Aktivitas Degradasi AHL

8

Pewarnaan Gram

8

Uji Oksidasi Fermentasi Glukosa

8

Identifikasi Isolat dengan Menggunakan Gen Penyandi 16S rRNA

8

Amplifikasi Gen Penyandi AHL Laktonase dan AHL asilase

9

Analisis Sekuen Gen Penyandi AHL Laktonase dan Asilase

10

Konstruksi Pohon Filogeni

10

HASIL DAN PEMBAHASAN

10

Hasil

10

Pembahasan

16

SIMPULAN DAN SARAN

20

Simpulan

20

Saran

20

DAFTAR PUSTAKA

21

LAMPIRAN

26

RIWAYAT HIDUP

34

DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5
6

Isolat bakteri dari tanah rizosfer asal lahan pertanian di Jawa yang
mempunyai aktivitas degradasi AHL
Diameter zona degradasi AHL Chromobacterium violaceum oleh enam
isolat bakteri pendegradasi AHL
Karakter morfologi bakteri pendegradasi AHL
Konsentrasi dan kemurnian DNA genom bakteri pendegradasi AHL
Homologi sekuen gen 16S rRNA enam isolat bakteri pendegradasi AHL
dengan menggunakan program BLAST-N
Homologi sekuen gen aiiA enam isolat bakteri pendegradasi AHL
dengan menggunakan analisis BLAST-X

11
12
12
13
13
15

DAFTAR GAMBAR
Struktur Acyl Homoserine Lacton
Mekanisme quorum sensing pada bakteri gram negatif
Sisi degradasi enzimatik molekul AHL oleh AHL laktonase dan AHL
asilase
4 Mekanisme degradasi AHL oleh AHL laktonase
5 Mekanisme degradasi molekul AHL oleh AHL asilase
6 Tahapan kerja penelitian
7 Bioesei aktivitas degradasi AHL kultur Chromobacterium violaceum
oleh isolat bakteri asal tanah rizosfer
8 Hasil elektroforesis gel agarose 1% dari gen penyandi 16S rRNA
9 Pohon filogenetik gen penyandi 16S rRNA isolat bakteri pendegradasi
AHL
10 Hasil elektroforesis gel agarose 0.8% dari gen aiiA
11 Pohon filogenetik sekuen asam amino AHL laktonase (AiiA) isolat
bakteri pendegradasi AHL

1
2
3

4
4
5
6
6
7
11
13
14
15
16

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5

Komposisi media
Gambar hasil pewarnaan Gram enam isolat pendegradasi AHL
Gambar hasil uji oksidatif fermentatif
Sekuen DNA penyandi 16S rRNA isolat pendegradasi AHL
Sekuen asam amino AHL laktonase (AiiA) isolat pendegradasi AHL

26
27
28
28
32

PENDAHULUAN

Latar Belakang
Quorum Sensing (QS) merupakan mekanisme komunikasi antara sel bakteri
sebagai suatu regulasi ekspresi gen tertentu dengan memproduksi dan
mengeluarkan molekul-molekul sinyal (autoinduser). Mekanisme ini tergantung
pada densitas atau jumlah populasi bakteri (Miller dan Bassler 2001). Bakteri
menggunakan mekanisme ini untuk sintesis antibiotik, produksi eksopolisakarida,
transfer plasmid, pembentukan nodul, bioluminisensi, pembentukan biofilm serta
produksi faktor virulen (de Kievit dan Iglewsky 2000).
Autoinduser merupakan senyawa-senyawa dengan berat molekul rendah
yang disekresikan, diakumulasikan dan diserap kembali selama proses QS.
Terdapat dua kelompok molekul sinyal dalam mekanisme QS yaitu molekul
peptida yang dihasilkan oleh bakteri Gram positif dan Asil Homoserin Lakton
(AHL) dihasilkan oleh bakteri Gram negatif (Fuqua dan Greenberg 1998).
Beberapa bakteri patogen mengekspresikan gen-gen virulen dengan
mekanisme QS. Sejauh ini pengendalian bakteri fitopatogen dilakukan dengan
antibiotik, maupun pestisida. Hal ini dapat menyebabkan timbulnya generasi
bakteri patogen yang lebih resisten terhadap senyawa-senyawa tersebut. Alternatif
pengendalian bakteri fitopatogen dapat dilakukan dengan mengganggu sistem QS
tanpa mempengaruhi pertumbuhan bakteri tersebut. Teknik ini meliputi
penghambatan biosintesis molekul sinyal melalui senyawa analog, aplikasi
senyawa antagonis QS misalnya furanon terhalogenasi, aplikasi agonis QS,
inaktivasi secara kimia terhadap sinyal QS, dan biodegradasi molekul sinyal oleh
enzim (Defoirdt et al. 2004).
Degradasi molekul sinyal AHL oleh enzim merupakan cara yang efektif
dalam menghambat proses QS. Beberapa enzim pendegradasi AHL yaitu AHL
laktonase dan AHL asilase. Enzim tersebut disandikan oleh gen yang berbedabeda pada masing-masing spesies. AHL laktonase dan AHL asilase dapat
dihasilkan oleh bakteri Gram positif maupun Gram negatif. AHL laktonase yang
pertama kali dikarakterisasi adalah Aiia240B1 yang merupakan produk dari gen aiiA
oleh Bacillus sp. strain 240B1 (Dong et al. 2000). AHL laktonase juga dihasilkan
oleh Agrobacterium tumefaciens, Arthrobacter sp., Rhodococcus erythropolis
berturut-turut disandikan oleh gen attM, ahlD, qsdA (Zhang et al. 2002; Park et
al. 2003; Uroz et al. 2008). AHL asilase dihasilkan oleh bakteri Ralstonia
eutropha yang disandikan oleh gen aiiD (Lin et al. 2003). Selain itu, bakteri
Pseudomonas aeruginosa juga menghasilkan AHL-asilase yang disandikan oleh
gen yang berbeda yaitu pvdQ (Huang et al. 2003) dan quiP (Huang et al. 2006).
Isolasi dan karakterisasi bakteri yang memiliki kemampuan dalam
mendegradasi AHL asal lahan pertanian di Jawa merupakan langkah awal untuk
memanfaatkan bakteri tersebut sebagai agen biokontrol. Informasi mengenai
bakteri penghasil enzim AHL laktonase dan asilase asal lahan pertanian
di Indonesia masih sangat sedikit, sehingga penelitian tersebut sangat diperlukan.

2
Perumusan Masalah
Pengendalian bakteri fitopatogen sejauh ini diatasi dengan menggunakan
berbagai senyawa antibiotik maupun pestisida. Penggunaan senyawa tersebut
dapat menyebabkan timbulnya tekanan seleksi yang dapat menghasilkan generasi
patogen yang resisten terhadap antibiotik, sehingga diperlukan suatu alternatif
pengendalian bakteri fitopatogen tanpa mempengaruhi pertumbuhannya dengan
cara degradasi molekul sinyal AHL oleh enzim, salah satunya AHL laktonase dan
AHL asilase. Bakteri penghasil enzim AHL laktonase dan AHL asilase asal lahan
pertanian di Indonesia khususnya di Jawa belum banyak dikaji dan dikarakterisasi.

Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan mengkarakterisasi bakteri penghasil AHL laktonase
dan AHL asilase yang diisolasi dari lahan pertanian di Jawa.

Manfaat Penelitian
Data yang diperoleh dapat memberikan informasi mengenai karakter bakteri
penghasil AHL laktonase dan asilase asal lahan pertanian di Indonesia khususnya
di Jawa yang merupakan langkah awal dalam pengendalian bakteri fitopatogen.
Hasil penelitian ini juga diharapkan memberikan informasi mengenai gen
penyandi AHL laktonase dan AHL asilase sehingga dapat ditelaah lebih lanjut
mengenai karakter dan fungsi enzim tersebut dalam mendegradasi molekul AHL
bakteri fitopatogen.

Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian ini meliputi isolasi dan purifikasi bakteri asal lahan pertanian di
Jawa, uji degradasi AHL, pewarnaan Gram, uji oksidasi fermentasi glukosa,
identifikasi isolat terpilih dengan DNA penyandi 16S rRNA, amplifikasi gen
penyandi AHL laktonase dan AHL asilase dan analisis sekuen gen penyandi AHL
laktonase dan AHL asilase.

3

TINJAUAN PUSTAKA

Quorum Sensing
Sel-sel mikroorganisme khususnya bakteri dapat saling berkomunikasi dan
dapat memberikan respon terhadap sinyal kimiawi dari lingkungan termasuk
produk yang dihasilkan oleh organisme lain. Sel-sel berkomunikasi dan
mengontrol berbagai kegiatan (melalui modulasi ekspresi gen) yang menghasilkan
perubahan fenotip dan penyesuaian yang lebih baik terhadap kondisi lingkungan
selama pertumbuhan. Sel bakteri dapat berkomunikasi dengan mengeluarkan
sinyal molekul (autoinduser) yang dapat berdifusi dengan sel dan dapat dikenali
oleh sel yang lain disebut dengan quorum sensing (QS). Molekul sinyal tersebut
mempunyai berat molekul yang rendah serta dapat terakumulasi di lingkungan
luar sel selama pertumbuhan (Fuqua et al. 1994).
QS merupakan regulasi ekspresi gen sebagai respon terhadap fluktuasi
kepadatan populasi sel. Mekanisme QS bakteri didasarkan pada dua kelompok
molekul sinyal yaitu AHL yang digunakan oleh Gram negatif dan molekul peptida
kecil digunakan oleh bakteri Gram positif. Mekanisme QS dapat memodulasi
berbagai proses fisiologis seperti bioluminisensi pada Vibrio fischeri dan
V. harveyi, motilitas, biosintesis antibiotik pada Erwinia carotovora, transfer
plasmid (konjugasi) pada Agrobacterium tumefaciens, produksi faktor virulensi
dan pembentukan biofilm pada Pseudomonas aeruginosa, sistem kompeten dan
sporulasi pada Bacillus subtilis (de Kievit dan Iglewsky 2000; Lazazzera 2000;
William et al. 2000; Miller dan Bassler 2001).

Acyl Homoserine Lactone (AHL)
Setiap sel-sel bakteri Gram negatif dalam suatu populasi akan menghasilkan
dan mengeluarkan suatu molekul sinyal yaitu AHL. AHL memiliki struktur umum
yang terdiri dari cincin homoserin lakton dan rantai samping asil yang
dihubungkan oleh ikatan amida (Fuqua dan Greenberg 1998). AHL dihasilkan
oleh bakteri Gram negatif dengan bagian homoserin lakton yang sama, akan tetapi
berbeda pada gugus asilnya (Gambar 1).
AHL disintesis oleh enzim spesifik yaitu AHL sintase yang merupakan
anggota dari protein LuxI yang menggunakan asil-protein pembawa asil (asilACP) sebagai donor utama rantai asil, sedangkan S-adenosyl methionine (SAM)
sebagai donor bagian homoserin lakton (Fuqua dan Greenberg 1998). Ketika
densitas sel rendah, AHL ditransfer ke lingkungan dan akan kembali lagi ke sel
baik secara transport pasif (difusi) maupun transport aktif. Peningkatan densitas
sel menyebabkan akumulasi AHL diluar sel (di lingkungan). Ketika konsentrasi
AHL mencapai batas maksimum, AHL akan berinteraksi dengan protein regulator
(R/Lux R). Protein regulator ini berperan sebagai regulator positif. Komplek
protein R dan AHL akan terikat pada promoter gen target dan akan menginisiasi
ekspresi gen tersebut (Gambar 2) (Fuqua 1994).

4
Pengikatan AHL membutuhkan perubahan tiga dimensi pada protein regulator,
sehingga dapat berinteraksi dengan daerah spesifik pada DNA yang akan
mengaktivasi transkripsi pada gen target (Hanzelka dan Greenberg 1996).

)
a)

b)

c)

d)

e)
Gambar 1 Struktur Acyl Homoserine Lacton, a) Struktur utama AHL; beberapa
derivate AHL b) 3-hydroxybuthanoyl-L-homoserine lactone pada
V. harveyi; c) 3-oxododecanoyl-L-homoserine lactone pada
Pseudomonas aeruginosa; d) oxohexanoyl-L-homoserine lactone pada
Vibrio fischeri; e) 3-oxooctanoyl-L-homoserine lactone pada
Agrobacterium tumefaciens (Fuqua 1994)

Gambar 2 Mekanisme quorum sensing pada bakteri gram negatif
(de Kievit dan Iglewsky 2000, dengan modifikasi)

5
Strategi Quorum Quenching dengan AHL laktonase dan AHL asilase
AHL mempunyai peranan penting dalam regulasi faktor virulen pada bakteri
patogenik. Pengendalian bakteri patogen dapat dilakukan dengan menggunakan
antibiotik, akan tetapi penghambatan dengan antibiotik dapat menimbulkan
resistensi bakteri patogen (Defoirdt et al. 2004). Strategi pengendalian bakteri
patogen dapat dilakukan dengan pendekatan Quorum Quenching (QQ) yaitu
dengan cara mengganggu proses komunikasi sel bakteri melalui penghambatan
sinyal, sehingga dapat menghambat mekanisme regulasi faktor virulen.
Mekanisme penghambatan dapat dilakukan dengan berbagai cara yaitu dengan
penghambatan biosintesis molekul sinyal, aplikasi senyawa analog AHL,
biodegradasi molekul sinyal oleh enzim. Substansi alami dapat mengganggu
persepsi sinyal yaitu dengan menirukan struktur AHL. Analog AHL dapat
memblok protein regulator sehingga dapat mencegah aktivasi ekspresi gen target.
Senyawa mirip AHL yang dihasilkan oleh alga merah Delisea pulchra yaitu
furanon terhalogenasi dapat meghambat aktivitas AHL (Manafield et al. 1999).
Strategi lain yang dapat digunakan untuk menghambat mekanisme QS adalah
dengan enzim pendegradasi AHL. Pendekatan ini merupakan paling potensial
dalam menghambat QS.

Gambar 3 Sisi degradasi enzimatik molekul AHL oleh AHL laktonase (nomor 1)
dan AHL asilase (nomor 3) (Dong dan Zhang 2005)
Enzim pendegradasi AHL antara lain AHL laktonase, AHL asilase,
oksidoreduktase dan paraoksonase (Dong et al. 2000; Lin et al. 2003; Uroz et al.
2005; Yang et al. 2005). Enzim yang banyak dipelajari dalam degradasi molekul
AHL yaitu AHL-laktonase dan AHL-asilase. Degradasi enzimatik molekul AHL
oleh AHL laktonase dapat terjadi dengan cara nomor 1 (Gambar 3). AHLlaktonase dapat menghidrolisis cincin lakton pada bagian homoserin AHL tanpa
mempengaruhi struktur molekul sinyal (Dong et al. 2000) (Gambar 4). AHL
laktonase memiliki substrat yang bervariasi dan dapat mendegradasi substrat AHL
rantai panjang maupun rantai pendek (Wang et al. 2004). Hidrolisis cincin lakton
oleh AHL laktonase dipengaruhi oleh pH, AHL laktonase bekerja pada pH 6-8
(Wang et al. 2004). Degradasi AHL oleh AHL laktonase bersifat reversible yaitu
cincin lakton dapat terbentuk kembali jika terjadi asidifikasi. AHL laktonase
dikelompokkan menjadi 2 klaster yaitu klaster AiiA dan klaster AttM. Klaster
AiiA terdiri dari semua AHL laktonase dari spesies Bacillus yang dikodekan oleh
gen aiiA, dengan persentase kemiripan sekuen peptidanya lebih dari 90% (Dong et
al. 2002; Lee et al. 2002; Ulrich 2004). Klaster AttM terdiri dari enzim AHL
laktonase yang dihasilkan oleh A. tumefaciens yang dikodekan oleh gen attM dan
aiiB, Klebsiella pneumonia dikodekan oleh gen ahlK dan Arthrobacter sp.
disandikan oleh gen ahlD, enzim AHL laktonase pada klaster AttM memiliki
homologi sekuen peptidanya sekitar 30-58% (Zhang et al. 2002).

6

Gambar 4 Mekanisme degradasi AHL oleh AHL laktonase
(Czajkowski dan Jafra 2009)
AHL asilase merupakan enzim pendegradasi AHL yang bersifat irreversible
yaitu dengan menghidrolisis ikatan amida antara rantai asil dan homoserin lakton
pada molekul AHL sehingga dapat menghasilkan asam lemak bebas dan
homoserin lakton (Gambar 5) (Leadbetter dan Greenberg 2000). Produk degradasi
tersebut dapat dimetabolisasi dan digunakan oleh bakteri sebagai sumber karbon,
nitrogen dan energi.

Gambar 5 Mekanisme degradasi molekul AHL oleh AHL asilase
(Czajkowski dan Jafra 2009)
Leadbetter dan Greenberg (2000) telah mengisolasi Variovorax paradoxus
VAC-I yang ditumbuhkan dalam medium yang mengandung 500 mg/l
3-oksoheksanoil-L-homoserin lakton dan dapat menggunakan AHL tersebut
sebagai satu-satunya sumber karbon dan nitrogen. Degradasi AHL oleh strain
tersebut yaitu dengan menggunakan enzim AHL asilase yang menghasilkan
homoserin lakton di dalam medium dan asam lemak yang dapat digunakan untuk
menghasilkan energi. Beberapa macam kelompok AHL asilase yang telah
diidentifikasi yaitu AiiD yang dihasilkan oleh R. eutropha yang disandikan oleh
gen aiiD (Lin et al. 2003). P. aeruginosa menghasilkan AHL asilase PvdQ dan
QuiP. PvdQ merupakan AHL asilase yang disandikan oleh gen pvdQ (Huang et
al. 2003), sedangkan QuiP merupakan AHL asilase yang dikodekan oleh gen
quiP (Huang et al. 2006). Jenis AHL asilase yang lain yaitu AhlM dari
Streptomyces sp. yang disandikan oleh ahlM. AhlM menunjukkan aktivitas
deasilasi tinggi terhadap AHL dengan rantai asil panjang dari pada AHL dengan
rantai pendek. Penambahan AhlM dalam media pertumbuhan dapat mengurangi
akumulasi AHL dan dapat menurunkan produksi faktor virulensi, sehingga AhlM
secara efektif dapat diterapkan untuk kontrol patogenisitas (Park et al. 2005).
AHL asilase yang dihasilkan oleh Shewanella sp. strain MIB015 yaitu Aac yang
disandikan oleh gen aac. Aac dapat mendegradasi AHL dan mereduksi
pembentukan biofilm pada patogen ikan (Morohoshi et al. 2008).

7

METODE PENELITIAN

Kerangka Penelitian
Penelitian ini terdiri atas beberapa tahap. Tahapan kerja penelitian disajikan
pada Gambar 6.
Isolasi dan purifikasi bakteri dari tanah rizosfer asal lahan pertanian
Bioesei aktivitas degradasi AHL
Pewarnaan Gram
Uji oksidasi fermentasi
Identifikasi isolat terpilih dengan DNA penyandi 16S rRNA
Amplifikasi gen penyandi AHL laktonase dan asilase
Analisis sekuen gen penyandi AHL laktonase dan asilase
serta konstruksi pohon filogenetik
Gambar 6 Tahapan kerja penelitian

Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan mulai Oktober 2013 sampai Oktober 2014.
Pengambilan sampel tanah rizosfer dilakukan di beberapa lahan pertanian di Jawa
Timur, Jawa Tengah dan Jawa Barat. Isolasi bakteri sampai analisis sekuen gen
penyandi AHL laktonase dan asilase dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi,
Departemen Biologi FMIPA Institut Pertanian Bogor (IPB).

Isolasi Bakteri Asal Lahan Pertanian
Isolasi bakteri dilakukan pada 11 sampel tanah rizosfer asal lahan pertanian
di Jawa. Isolasi bakteri dilakukan dengan metode cawan sebar pada media Nutrien
Agar (NA). Sebanyak 1 g sampel tanah rizosfer disuspensikan dalam 9 ml larutan
NaCl 0.85%. Pengenceran sampel dilakukan secara serial dari pengenceran 10-1
hingga 10-6. Sebanyak 0.1 ml suspensi dari pengenceran 10-3 hingga 10-6
diinokulasikan dengan metode cawan sebar pada media NA, inkubasi pada suhu
ruang selama 48 jam. Koloni-koloni bakteri yang tumbuh dan menunjukkan ciri
morfologi yang berbeda dimurnikan dengan metode gores kuadran.

8
Bioesei Aktivitas Degradasi AHL
Isolat bakteri asal lahan pertanian yang telah murni ditumbuhkan dalam
media Luria Broth (LB) dan dishaker ± selama 18 jam (sampai nilai Optical
Denstity (OD) mencapai 0.8. Kultur yang memiliki OD 0.8 disentrifugasi dengan
kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Sebanyak 100 µl supernatan diteteskan
pada paper disk dan diletakkan pada permukaan media Luria Agar (LA) semi
solid yang mengandung 1% C. violaceum. Inkubasi dilakukan pada suhu ruang
selama 24 jam. Media LB steril digunakan sebagai kontrol. Aktivitas degradasi
AHL ditunjukkan dengan zona tidak berwarna ungu di sekitar paper disk.

Pewarnaan Gram
Isolat murni yang memiliki aktivitas degradasi AHL yang berumur 24 jam
dalam media LA miring diambil 1 ose dan dipindahkan ke permukaan kaca objek
yang telah ditetesi akuades, kemudian difiksasi diatas bunsen yang bertujuan agar
bakteri dapat melekat diatas kaca objek dan tidak ikut terbawa saat pencucian.
Pewarnaan Gram diawali dengan pemberian pewarna crystal violet sebanyak 1-2
tetes selama 2 menit dan dibilas dengan akuades, kemudian diteteskan iodin
selama 1 menit dan dilakukan pencucian. Tahap dekolorisasi dilakukan dengan
penambahan etanol 95%, dibiarkan selama 30 detik. Pewarna yang terakhir yaitu
safranin sebanyak 1-2 tetes selama 1 menit. Bakteri Gram positif akan
menunjukkan warna ungu dan bakteri Gram negatif akan menunjukkan warna
merah.

Uji Oksidasi-Fermentasi (OF) Glukosa
Isolat murni yang berumur 24 jam dalam media LA miring diinokulasikan
secara tusukan pada medium semisolid dengan glukosa sebagai sumber karbonnya
(Lampiran 1) dan bromotimol biru sebagai indikator keasaman pada tabung reaksi
dengan tutup ulir. Inkubasi dilakukan dalam kondisi anaerob dengan
menambahkan parafin oil steril yang menutupi seluruh permukaan media dan
dalam kondisi aerob tanpa penambahan parafin oil (Hugh dan Leifson 1953).
Inkubasi pada suhu ruang selama 1-5 hari. Uji positif ditunjukkan dengan
berubahnya warna medium dari hijau menjadi kuning.

Identifikasi Isolat Berdasarkan Gen Penyandi 16S rRNA
Tahap awal untuk proses identifikasi gen penyandi 16S rRNA adalah isolasi
DNA genom. Isolasi DNA genom dilakukan dengan metode Cetyl Trimethyl
Ammonium Bromida (CTAB) (Wilson 2001) dengan modifikasi. Tahap
pemanenan sel yaitu 1.5 ml kultur bakteri disentrifugasi dengan kecepatan 12.000
rpm selama 10 menit, pelet dicuci sebanyak 2 kali dengan 760 µl buffer TE.
Tahap lisis sel yaitu pelet ditambahkan 200 µl buffer TE dan 45 µl lisozim,

9
kemudian dihomogenkan dengan vorteks dan diinkubasi pada suhu 55C selama
60 menit. Campuran tersebut ditambahkan 100 µl SDS 10% dan 20 µl proteinaseK (2 mg/ml) dan dihomogenkan dengan vorteks. Inkubasi pada suhu 55C selama
60 menit. Campuran ditambah dengan 100 µl CTAB dan 100 µl NaCl 0.5 M dan
di homogenkan dengan vorteks, kemudian diinkubasi pada suhu 65C selama 30
menit. Tahap purifikasi dan pengendapan dilakukan dengan cara menambahkan
campuran dengan 600 µl Phenol Chloroform Isoamylalcohol (PCI) 25: 24: 1,
kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit dan akan
terbentuk 2 lapisan, lapisan atas dipindahkan pada tabung mikro steril, kemudian
ditambahkan CI (24:1) sebanyak 1x volume. Larutan tersebut disentrifugasi
dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit dan akan menghasilkan 2 lapisan.
Lapisan atas ditambah dengan etanol absolute sebanyak 0.6 x volume. Presipitasi
dilakukan dengan inkubasi pada suhu ruang selama overnight. Sentrifugasi larutan
dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit. Pelet ditambah dengan 1 ml
etanol dingin 70% dan disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10
menit. Pelet dikeringanginkan dan ditambahkan dengan 50 µl ddH2O dan 1 µl
RNAse 1%. Inkubasi dilakukan pada suhu 370C selama 15 menit. Konsentrasi dan
kemurnian DNA diukur dengan menggunakan spektrofotometer Nano drop 2000
(Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA).
Amplifikasi gen 16S rRNA dilakukan dengan menggunakan primer 63F
(5’-CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-γ’) dan 1γ87R (5’-GGG CGG WGT
GTA CAA GGC-γ’) (Marchesi et al. 1998). Reaksi PCR terdiri dari 25 µl GoTaq
Green Master Mix 1X, 5 µl masing-masing primer (10 pmol), 2 µl cetakan DNA
(~100 ng/µl) dan nuclease free water sampai mencapai volume 50 µl. Gradien
temperatur yang digunakan yaitu pre denaturasi (95oC,5 menit), 30 siklus proses
denaturasi (95oC, 1 menit), penempelan primer (55oC, 1 menit), proses
pemanjangan (72oC, 1.5 menit) dan pemanjangan akhir (72oC, 10 menit). Produk
Polymerase Chain Reaction (PCR) dapat dilihat melalui elektroforesis yaitu
dengan menambahkan 5 µl produk PCR pada 1% gel agarose. DNA ladder 1kb
digunkan sebagai marker. Elektroforesis dilakukan selama 45 menit pada 80 V
dengan buffer TAE 1X sebagai running buffer. Visualisasi gel diatas UV
transluminator dengan pewarnaan EtBr. Sekuensing dilakukan dengan
mengirimkan hasil amplifikasi ke perusahaan jasa sekuensing. Hasil sekuensing
dianalisis dengan menggunakan program Bioedit kemudian disejajarkan dengan
data base gen 16S rRNA menggunakan program BLAST-N. Basic Local
Alignment Search Tool (BLAST) merupakan program dan basis data yang
digunakan untuk pensejajaran sekuen. Analisis filogenetik dilakukan dengan
menggunakan program MEGA 5.05 dengan metode Neighbour Joining (NJ)
dengan bootstrap 1000x.

Amplifikasi Gen Penyandi AHL Laktonase dan AHL Asilase
Amplifikasi gen penyandi AHL laktonase (gen aiiA) menggunakan primer
BTF (5’-GCG ATG ACA GTA AAG AAG CTT TAT TTC G-γ’) dan BTR
(5’-ATA CTA TAT ATA CTC TGG GAA CAC-γ’) (Chen et al. 2010). Reaksi
PCR terdiri dari 5 µl 10X Dream Taq Buffer, 8 µl dNTP (2 mM), 2 µl masing-

10
masing primer (10 pmol), 5 µl cetakan DNA (~100 ng/µl), 1.25 U Dream Taq
DNA polymerase, nuclease free water sampai mencapai volume 50 µl.
Amplifikasi dilakukan sebanyak 35 siklus dengan gradien temperatur pre
denaturasi (95oC, 5 menit), denaturasi (95oC, 30 detik), penempelan primer (53oC,
30 detik), pemanjangan (72oC, 1 menit), pemanjangan akhir (72oC, 10 menit).
Amplifikasi gen penyandi AHL-asilase untuk gen pvdQ menggunakan
primer pvdQF (5’-AGG CCA AGC TTA TGG GGG ATG CGT ACC GTA
CTG-γ’) dan pvdQR (5’-GTT ATA TAG GGC CGC TAG GCA TTC G-γ’)
(Huang et al. 2003). Reaksi PCR terdiri dari 5 µl 10X Dream Taq Buffer, 8 µl
dNTP (2 mM), 2 µl masing-masing primer (10 pmol), 5 µl cetakan DNA (~100
ng/µl), 1.25 U Dream Taq DNA polymerase, nuclease free water sampai
mencapai volume 50 µl. Gradien temperatur yang digunakan yaitu pre
denaturation (94oC, 10 menit), denaturasi (94oC, 30 detik), penempelan primer
(57oC, 30 detik), pemanjangan (72oC, 1 menit) serta pemanjangan akhir (72oC, 5
menit). Proses ini dilakukan sebanyak 35 siklus.

Analisis Sekuen Gen Penyandi AHL Laktonase dan Asilase
Penentuan urutan gen dilakukan dengan mengirimkan DNA hasil
amplifikasi ke perusahaan penyedia jasa sekuensing. Software Bioedit digunakan
untuk analisis data kasar hasil sekuensing. Sekuen gen penyandi AHL laktonase
dan asilase disejajarkan dengan data base gen penyandi AHL laktonase dan
asilase di GeneBank menggunakan program BLAST-X online software melalui
website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).

Konstruksi Pohon Filogeni
Analisis filogenetik bakteri pendegradasi AHL dilakukan berdasarkan
pohon filogenetik menggunakan metode NJ dan metode maximum likelihood
menggunakan software MEGA 5.0 (Tamura et al. 2011). Topologi dari konstruksi
pohon filogenetik dievaluasi menggunakan analisis bootstrap dengan 1000x.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil
Bakteri Hasil Isolasi dan Bioesei Aktivitas Degradasi AHL
Bakteri yang berhasil diisolasi dari 11 sampel tanah rizosfer asal lahan
pertanian di Jawa berjumlah 161 isolat bakteri, enam diantaranya menunjukkan
aktivitas degradasi AHL (Tabel 1). Aktivitas degradasi AHL ditandai dengan
adanya zona tidak berwarna ungu di sekitar kertas cakram pada kultur

11
C. violaceum, sedangkan kontrol menunjukkan adanya zona ungu di sekitar kertas
cakram (Gambar 7). Aktivitas degradasi AHL oleh keenam bakteri tersebut
menghasilkan diameter zona degradasi yang berkisar antara 20 mm sampai
47 mm. Isolat JBR2-16 menunjukkan diameter zona degradasi AHL terbesar,
sedangkan isolat yang menunjukkan diameter terkecil adalah isolat BKS-8 dan
CMS-4 (Tabel 2).
Tabel 1 Isolat bakteri dari tanah rizosfer asal lahan pertanian di Jawa yang
mempunyai aktivitas degradasi Asil Homoserin Lakton (AHL)
Asal sampel
Jawa Barat
Bandung
Bekasi
Bogor
Ciamis
Sukabumi
Jawa Tengah
Cilacap
Klaten
Wonogiri
Jawa Timur
Bondowoso
Jember
Total

Jumlah
sampel

Kode
isolate

Jumlah
isolat

Jumlah isolat yang
memiliki aktivitas
degradasi AHL

1
1
1
1
1

BDG
BKS
BGR
CMS
SKB

16
12
31
10
9

0
2
1
1
0

1
1
1

CLC
KLN
WNG

17
5
7

0
0
0

1
2
11

BWS
JBR

18
46
161

0
2
6

Gambar 7 Bioesei aktivitas degradasi Asil Homoserin Lakton (AHL)
Chromobacterium violaceum oleh supernatan bakteri terpilih.
A: kontrol negatif, B: BKS-1, C: BKS-8, D: CMS-4, E: JBR1-3,
F: JBR2-16

12
Tabel

2

Diameter zona degradasi Asil Homoserin Lakton (AHL)
Chromobacterium violaceum oleh enam isolat bakteri yang diisolasi
dari lahan pertanian

Kode isolat

Diameter zona degradasi
AHL (mm)

Indeks degradasi AHL

BKS-1
BKS-8
BGR-7
CMS-4
JBR1-3
JBR2-16

21
20
22
20
22
47

0.615
0.53
0.69
0.53
0.69
2.61

Karakteristik dan Identitas Molekuler Isolat Bakteri Pendegradasi AHL
Karakteristik morfologi isolat bakteri yang memiliki aktivitas degradasi
AHL menunjukkan bahwa lima isolat bakteri termasuk Gram positif berbentuk
batang dan satu isolat bakteri termasuk Gram negatif berbentuk batang pendek
(Tabel 3) dan (Lampiran 2). Karakteristik isolat bakteri pendegradasi AHL
berdasarkan kemampuan dalam memetabolisme glukosa melalui uji OF
menunjukkan bahwa isolat BKS-1 bersifat fermentatif yang ditandai dengan
perubahan warna media dari hijau menjadi kuning pada tabung yang dikondisikan
aerob dan anaerob, sedangkan isolat BKS-8, BGR-7, JBR1-3 dan JBR2-16 tidak
menunjukkan perubahan warna media (Lampiran 3).
Tabel 3 Karakter morfologi bakteri pendegradasi Asil Homoserin Lakton (AHL)
pada media Nutrien Agar (NA) dengan waktu inkubasi 24 jam
Kode
isolat Bentuk

Morfologi koloni
Warna

BKS-1 Bundar Putih susu

Elevasi

Tepi

Cembung Licin

Krem
Tidak
Cembung
kekuningan
beraturan
Krem
Tidak
BGR-7 Bundar
Cembung
kekuningan
beraturan
Tidak
CMS-4 Bundar Putih keruh Timbul
beraturan
Seperti
Tidak
JBR1-3 Bundar Krem
tombol
beraturan
JBR2BerbukitKeriput Putih susu
Licin
16
bukit
BKS-8 Bundar

Bentuk Pewarnaan
sel
Gram

Densitas

Diameter
(mm)

Translusen

1-2

Batang
pendek

Negatif

Keruh

1-4

Batang

Positif

Keruh

1-4

Batang

Positif

Keruh

0.5-2

Batang

Positif

Keruh

1-4

Batang

Positif

Keruh

3-5

Batang

Positif

Hasil pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA genom menunjukkan
bahwa konsentrasi DNA genom bakteri yang diperoleh berkisar 58.3- 261.7 ng/µl,
sedangkan kemurniannya berkisar 1.46-1.93 (Tabel 4). DNA genom tersebut
dapat dijadikan DNA cetakan pada proses PCR gen penyandi 16S rRNA, AHL
laktonase dan AHL asilase. Visualisasi hasil amplifikasi gen 16S rRNA pada
enam isolat bakteri pendegradasi AHL memperlihatkan pita berukuran ± 1300 pb
(Gambar 8). Kemiripan sekuen gen 16S rRNA dengan data di GenBank melalui

13
program BLAST-N menunjukkan bahwa lima isolat termasuk dalam genus
Bacillus dan satu isolat termasuk Serratia marcescens (Tabel 5). Analisis
filogenetik gen 16S rRNA keenam isolat bakteri tersebut dibandingkan dengan
spesies bakteri pada GeneBank menunjukkan bahwa terdapat dua klaster yaitu
klaster pertama adalah golongan Gram positif dan klaster kedua adalah Gram
negatif (Gambar 9).
Tabel 4 Konsentrasi dan kemurnian DNA genom bakteri pendegradasi Asil
Homoserin Lakton (AHL)
Kode isolate
BKS-1
BKS-8
BGR-7
CMS-4
JBR1-3
JBR2-16

Konsentrasi DNA (ng/µl)
170.7
100.0
58.3
261.7
166.9
130.0

A260/A280
1.93
1.87
1.90
1.46
1.57
1.89

Gambar 8 Hasil elektroforesis gel agarose 1% dari gen penyandi 16S rRNA.
M: Marker 1 kb, sumur 1: BKS-1, 2: BKS-8, 3: BGR-7, 4: CMS-4,
5: JBR1-3, 6: JBR2-16 dan 7: kontrol negatif
Tabel 5 Homologi sekuen gen 16S rRNA enam isolat bakteri pendegradasi Asil
Homoserin Lakton (AHL) dengan menggunakan program BLAST-N
Kode
isolate

Bakteri pembanding
(Database GeneBank)
Serratia marcescens strain
BKS-1
By2Root2
BKS-8
Bacillus aquimaris strain JB306
BGR-7 B. marisflavi strain GN28
B. altitudinis strain NIOTCMS-4
BARREN23
JBR1-3 B. aquimaris strain JP44SK28
B. axarquiensis strain
JBR2-16
CHMS1B6

Identity (%)

ENomor akses
value

100 (1221/1221)

0.0

KM099141.1

100 (1231/1231)
100 (1232/1232)

0.0
0.0

KJ920932.1
KJ719344.1

100 (1209/1209)

0.0

KM047502.1

100 (1226/1226)

0.0

JX144718.1

100 (1216/1216)

0.0

KJ787122.1

14

Gambar 9 Pohon filogenetik gen 16S rRNA isolat bakteri pendegradasi Asil
Homoserin Lakton (AHL) yang dibandingkan dengan sekuen gen 16S
rRNA beberapa spesies bakteri di GeneBank menggunakan metode NJ
dengan boostrap 1000x

Gen Penyandi AHL Laktonase dan AHL Asilase
Amplifikasi gen penyandi AHL laktonase (gen aiiA) pada isolat bakteri
pendegradasi AHL menunjukkan bahwa keenam isolat bakteri tersebut berhasil
teramplifikasi, hal ini ditunjukkan dengan adanya pita DNA berukuran ± 750 pb
(Gambar 10). Sedangkan amplifikasi gen penyandi AHL asilase (gen pvdQ) pada
enam isolat pendegradasi AHL tidak teramplifikasi. Hal ini dapat diduga bahwa
keenam isolat tersebut tidak dapat menghasilkan AHL asilase.
Analisis sekuen gen aiiA isolat bakteri terpilih yang disejajarkan dengan gen
aiiA pada GeneBank menggunakan program BLAST-X menunjukkan bahwa
protein yang dikodekan oleh gen aiiA isolat BKS-1 memiliki kemiripan 99%
dengan protein N-asil homoserin laktonase kelompok B. cereus, BKS-8 homolog
dengan AHL-laktonase Bacillus sp. MBG09 dengan persentase kemiripan 92%,
BGR-7 memiliki homologi 97% dengan N-asil homoserin laktonase Bacillus
sp.MBG12, CMS-4 memiliki kemiripan 94% dengan N-asil homoserin laktonase
B. cereus, JBR1-3 memiliki kemiripan 98% dengan AHL laktonase B. cereus dan
JBR2-16 homolog dengan AHL laktonase B. firmus dengan persentase kemiripan
99% (Tabel 6).

15

Gambar 10 Hasil elektroforesis gel agarose 0.8% dari gen aiiA. M: marker 1 kb,
sumur 1: JBR1-3, 2: BKS-8, 3: BKS-1, 4: BGR-7, 5: CMS-4 dan 6:
JBR2-16
Tabel 6 Homologi sekuen gen aiiA enam isolat bakteri pendegradasi Asil
Homoserin Lakton (AHL) dengan menggunakan analisis BLAST-X
Kode
isolate

Bakteri pembanding
(Database GeneBank)
MULTISPECIES: N-acyl
BKS-1 homoserine lactonase
[Bacillus cereus group]
AHL-lactonase, partial
BKS-8
[Bacillus sp. MBG09]
AHL lactonase, partial
BGR-7
[Bacillus sp.MBG12]
N-acyl homoserine lactonase
CMS-4
[Bacillus cereus]
AHL lactonase, partial
JBR1-3
[Bacillus cereus]
JBR2- AHL lactonase
16
[Bacillus firmus]

Identity (%) E-value
99 (248/249)

0.0

Nomor akses
WP000216605.1

92 (203/220) 1e-144 AEA48311.1
97 (225/233) 1e-162 AEA48281.1
94 (206/220) 2e-146 WP000216590.1
98 (211/216) 4e-152 AEA48283.1
99 (223/226) 2e-161 AHA91695.2

Analisis pohon filogenetik sekuen asam amino AHL laktonase AiiA pada
keenam bakteri pendegradasi AHL menunjukkan bahwa secara keseluruhan AHL
laktonase keenam isolat bakteri memiliki kekerabatan yang dekat dengan AHL
laktonase bakteri pembandingnya seperti AHL laktonase dari golongan B. cereus,
B. weihenstephanensis, B. firmus, B. thuringiensis serovar kim dan B. subtilis.
AHL laktonase keenam isolat tersebut memiliki cabang yang terpisah dengan
AHL laktonase Enterobacter asburiae, tetapi masih dalam satu klaster yang sama
yaitu klaster AiiA. Keenam isolat bakteri pendegradasi AHL membentuk
kelompok terpisah dengan AHL laktonase klaster AttM (Gambar 11).

16

AiiA Cluster

AttM
Cluster

Gambar 11 Pohon filogenetik sekuen asam amino AHL laktonase (AiiA) isolat
bakteri pendegradasi AHL menggunakan metode maximum likelihood
dengan boostrap 1000x

Pembahasan
Bakteri Gram negatif patogen menggunakan sistem QS untuk
mengekspresikan gen virulennya dengan cara mengeluarkan molekul sinyal AHL.
Degradasi molekul AHL dapat dilakukan untuk menekan virulensi patogen dan
mengurangi gejala penyakit (Dong et al. 2000). Salah satu strategi untuk
mendegradasi molekul sinyal AHL adalah dengan enzim, antara lain AHL
laktonase, AHL asilase, oksidoreduktase dan paraoksonase (Dong et al. 2000; Lin
et al. 2003; Uroz et al. 2005; Yang et al. 2005). Enzim ini berperan sebagai
senyawa anti QS (senyawa Quorum Quenching (QQ)). Enzim utama yang banyak
dikaji adalah AHL laktonase dan AHL asilase. AHL laktonase bekerja dengan
cara menghidrolisis cincin lakton AHL serta memiliki substrat yang bervariasi
(Wang et al. 2004). Enzim ini stabil pada suhu 28-50oC dan pH 6-9 (Sakr et al.
2013). Hidrolisis cincin lakton dipengaruhi oleh pH medium dan dapat terbentuk
kembali jika terjadi asidifikasi. Hal ini berbeda dengan AHL asilase yang bersifat
irreversible dalam menghidrolisis ikatan amida antara rantai asil dan homoserin
lakton. Proses hidrolisis ini menghasilkan homoserin lakton dan asam lemak

17
bebas yang dapat dimetabolisasi dan digunakan oleh bakteri sebagai sumber
karbon, nitrogen maupun energi (Leadbetter dan Greenberg 2000).
Beberapa bakteri yang dapat menghasilkan enzim pendegradasi AHL dapat
ditemukan pada habitat yang sama dengan bakteri yang ber-quorum sensing
(Chan et al. 2007). Pada penelitian ini, eksplorasi bakteri dari 11 sampel tanah
rizosfer asal lahan pertanian di Jawa menghasilkan 6 isolat bakteri yang memiliki
aktivitas degradasi AHL. Bioindikator yang digunakan dalam uji aktivitas AHL
yaitu C. violaceum. Bakteri tersebut merupakan bakteri Gram negatif yang dapat
menghasilkan pigmen ungu (violacein) melalui mekanisme QS yang
menggunakan sinyal AHL berupa N-hexanoyl homoserine lactone (HHL)
(McClean et al. 1997). McLean et al. (2004) menggunakan C. violaceum ATTC12472 sebagai indikator pada uji aktivitas degradasi AHL, karena lebih mudah
diamati fenotipnya tanpa membutuhkan penambahan substrat, selain itu
C. violaceum memberikan pigmentasi yang lebih gelap sehingga lebih mudah
diamati dari pada Pseudomonas aureofaciens yang menghasilkan pigmen oranye.
Aktivitas degradasi AHL oleh keenam bakteri asal lahan pertanian di Jawa
menghasilkan diameter zona degradasi yang bervariasi. Hal ini menunjukkan
bahwa kemampuan senyawa yang dihasilkan oleh bakteri dalam mendegradasi
AHL C. violaceum berbeda-beda. Chong et al. (2012) melaporkan bahwa terdapat
9 isolat bakteri yang diisolasi dari tanah rizosfer hutan montane Malaysia
menunjukkan aktivitas degradasi HHL yang berbeda, enam diantaranya
menunjukkan degradasi yang signifikan.
Mikroorganisme yang memiliki aktivitas QQ telah banyak diidentifikasi
baik dari bakteri Gram negatif maupun Gram positif (Chen et al. 2013).
Berdasarkan identifikasi secara morfologi dan gen penyandi 16S rRNA terhadap
keenam isolat bakteri pendegradasi AHL menunjukkan bahwa bakteri yang
banyak ditemukan dalam penelitian ini adalah genus Bacillus yang merupakan
kelompok bakteri Gram positif. Hal ini sejalan dengan penelitian d’Angelo-Picard
et al. (2005) bahwa bakteri pendegradasi AHL yang diisolasi dari sampel tanah
dan rizosfer tanaman tembakau, umumnya adalah kelompok Bacillus. Ma et al.
(2013) juga mengemukakan bahwa bakteri pendegradasi AHL yang diisolasi dari
sampel filosfer daun tembakau sekitar 75% merupakan kelompok firmicutes yang
umumnya adalah Bacillus. Dong et al. (2002) telah mengisolasi bakteri
penginaktivasi AHL dari tanah dan tanaman, sebanyak 8 isolat memiliki aktivitas
yang kuat dalam menginaktivasi AHL, isolat tersebut memiliki homologi dengan
B. thuringiensis. Spesies bakteri yang pertama kali ditemukan dapat mendegradasi
AHL adalah Bacillus sp. 240B1 (Dong et al. 2000). Beberapa spesies lain dari
genus Bacillus yang telah diidentifikasi memiliki aktivitas degradasi AHL adalah
B. thuringiensis, B. cereus, B. mycoides, B. subtilis, B. amyloliquefaciens,
B. weihenstephanensis (Dong et al. 2002; Pan et al. 2008; Yin et al. 2010;
Sakr et al. 2013).
Aktivitas degradasi AHL oleh spesies B. aquimaris, B. marisflavi,
B. altitudinis dan B. axarquensis belum pernah dilaporkan. Sejauh ini, bakteribakteri tersebut telah dilaporkan memiliki peran sebagai bakteri Plant Growth
Promoting Rhizobacteria (PGPR), biokontrol, pemfiksasi nitrogen serta penghasil
biosurfaktan. B. aquimaris yang diisolasi dari rizosfer tanaman dilaporkan sebagai
bakteri pemacu pertumbuhan tanaman (Plant Growth Promoting Rhizobacteria
(PGPR)) pada tanaman mentimun (Kim et al. 2011). B. aquimaris juga berperan

18
sebagai biokontrol terhadap Botrytis cinerea dengan dihasilkan enzim
ekstraseluler berupa kitinase dan glukanase (Berrada et al. 2012). B. aquimaris
dan B. marisflavi yang telah diisolasi dari air laut diajukan sebagai spesies baru
oleh Yoon et al. (2003). Ding et al. (2005) telah mengisolasi B. marisflavi dari
rizosfer tanaman gandum dan jagung, bakteri tersebut memiliki gen nifH dan
dapat memfiksasi nitrogen. Potensi B. altitudinis yang diisolasi rizosfer tanaman
labu siam di bukit Darjeeling, India adalah sebagai bakteri PGPR yang telah diuji
secara invitro dapat memproduksi siderofor, hidrogen sianida, asam indol asetat,
kitinase, protease, pelarut fosfat dan juga dapat menghambat fitopatogen (Sunar
et al. 2013). Sedangkan Bhute dan Chandekar (2014) telah mengisolasi bakteri
B. axarquiensis dari Basi