Isolasi dan karakterisasi bakteri penghasil ahl-laktonase asal lahan pertanian luar Pulau Jawa

ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI PENGHASIL
AHL-LAKTONASE ASAL LAHAN PERTANIAN LUAR
PULAU JAWA

AIDATUN FITRIYAH

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011

ABSTRAK
AIDATUN FITRIYAH. Isolasi dan karakterisasi bakteri penghasil AHL-laktonase asal lahan
pertanian luar pulau Jawa. Dibimbing oleh IMAN RUSMANA dan ALINA AKHDIYA.
Quorum sensing (QS) adalah komunikasi antar sel bakteri yang dimediasi oleh autoinduser
(AI) untuk mengatur ekspresi gen-gen tertentu ketika populasi sel bakteri telah mencapai quorum.
AI bakteri Gram negatif adalah N-acyl homoserine lactone (AHL). Sistem QS bekerja pada gengen untuk perilaku populasi bakteri seperti pembentukan biofilm, virulensi pada inang,
bioluminescence, dan pembentukan antibiotik. Proses QS dapat dirusak oleh senyawa anti-QS.
AHL-laktonase merupakan salah satu senyawa anti-QS yang disandikan oleh gen aiiA. Penelitian
ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi bakteri penghasil AHL-laktonase asal 16

lahan pertanian luar pulau Jawa. Bioesai aktivitas degradasi AHL dilakukan menggunakan
Chromobacterium violaceum sebagai bioindikator. Gen aiiA dideteksi dengan menggunakan
primer spesifik aiiAF dan aiiAR, sedangkan identifikasi molekuler dilakukan berdasarkan sekuen
gen 16S rRNA. Sebanyak 58 isolat bakteri berhasil diisolasi dan enam diantaranya memiliki
aktivitas degradasi AHL (PAD1a, BAL2a, NTT3a, NTT3e, NTT6B6, dan NTT6B7). Di antara
enam isolat tersebut, hanya isolat NTT3a dan NTT3e yang menunjukkan amplikon berukuran 800
bp ketika diamplifikasi menggunakan primer aiiAF dan aiiAR. Analisis terhadap sekuen gen aiiA
pada isolat NTT3a dan NTT3e menunjukkan tingkat homologi 99% dengan gen AHL-laktonase
Bacillus sp. 91.
Kata kunci: quorum sensing, autoinduser, AHL-laktonase, gen aiiA.

ABSTRACT
AIDATUN FITRIYAH. Isolation and characterization of AHL-lactonase producing bacteria from
agricultural land outside Java. Under supervision of IMAN RUSMANA and ALINA AKHDIYA.
Quorum sensing (QS) is communication between bacterial cells mediated by autoinducer
(AI) to regulate the expression of specific genes in certain bacterial population quorum. AI of
Gram negative bacteria is N-acyl homoserine lactone (AHL). QS system controls behaviors of
bacterial population on biofilm formation, virulence, bioluminescence, and formation of
antibiotics. QS process can be inhibited by anti-QS compound. AHL-lactonase is one of anti-QS
compound encoded by aiiA gene. The aims of this study were to isolate and characterize bacteria

producing AHL-lactonase from agricultural land outside Java. Soil samples were taken from 16
locations of agricultural lands. Bioassay was performed by AHL degradation of Chromobacterium
violaceum. Detection of aiiA gene was conducted using specific primer aiiAF and aiiAR, while
molecular identification was conducted based on 16S rRNA gene sequence. It was found that from
58 isolates, six isolates had AHL degradation activity i.e. PAD1a, BAL2a, NTT3a, NTT3e,
NTT6B6, dan NTT6B7 isolates. Two isolates (i.e. NTT3a and NTT3e isolates) had aiiA gene. And
indicated by 800 bp product. They were 99% closely related to AHL-lactonase gene from Bacillus
sp 91.
Keywords: quorum sensing, autoinducer, AHL-lactonase, aiiA gene.

ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI PENGHASIL
AHL-LAKTONASE ASAL LAHAN PERTANIAN LUAR
PULAU JAWA

AIDATUN FITRIYAH

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011

Judul
Nama
NIM

: Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Penghasil AHL-laktonase Asal
Lahan Pertanian Luar Pulau Jawa
: Aidatun Fitriyah
: G34070072

Menyetujui,
Pembimbing I

Pembimbing II

Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si
NIP 196507201991031002

Alina Akhdiya, M.Si
NIP 196812082001122001

Mengetahui,
Ketua Departemen Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor

Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.S
NIP 196410021989031002

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga
karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak

bulan November 2010 hingga Mei 2011 ini ialah Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Penghasil AHLlaktonase Asal Lahan Pertanian Luar Pulau Jawa.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si dan Ibu Alina
Akhdiya, M.Si atas bimbingan, bantuan pendanaan, dan pengarahan yang diberikan selama
penelitian dan penyusunan skripsi ini. Terima kasih kepada Ibu Dr. Ir. Y. M. Diah Ratnadewi atas
saran dan masukan yang telah diberikan sehingga tulisan ini menjadi lebih baik. Ungkapan terima
kasih juga disampaikan kepada Ayah, Ibu, Ka Isma Haryanti, Ka Iyus Husniyati, Rizqy Rahman,
dan Dede Fina atas segala doa dan kasih sayangnya. Penulis juga mengucapkan terima kasih
kepada Fadhila Achmad S, Astri, Maulina, Yoshita, Syifa, Wika, Dina, Rizki, Ashna, Nisyful,
Komal, Henny, Fahmi, Rahmah, Rindi, Tira, Chintya, Ka Fina, Rani, teman-teman yang
melakukan penelitian di laboratorium Mikrobiologi, Yakub, Nia, Rina, Nita, Hokie, Debie, Susan,
Adian, Aya, Alma, Bang Jo, Ivan, Hana, Vita dan teman-teman yang telah membawakan sampel
tanah, Sepri, Made, Kokom, Adhi, serta seluruh teman-teman Biologi 44 atas segala doa,
dukungan, dan perhatiannya. Serta pihak-pihak yang secara tidak langsung telah membantu dalam
pengumpulan data karya ilmiah ini.
Semoga karya Ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Juli 2011

Aidatun Fitriyah

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Indramayu pada tanggal 12 Juli 1988 dari ayah Bahrudin dan Ibu
Suprihatin. Penulis merupakan anak ketiga dari empat bersaudara.
Tahun 2007 penulis lulus dari SMA Negeri 4 Cirebon dan pada tahun yang sama lulus
seleksi masuk IPB melalui Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis memilih program studi Biologi,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif menjadi anggota Divisi Pengembangan
Sumber Daya Manusia (PSDM) Himpunan Mahasiswa Biologi (Himabio) dan anggota Divisi
Kekeluargaan Ikatan Kekeluargaan Cirebon (IKC) pada tahun 2008-2009, Sekretaris Divisi PSDM
Himabio tahun 2009-2010, Ketua Panitia Grand Biodiversity Biologi IPB tahun 2010, Ketua
Divisi Hubungan Masyarakat Workshop dan Diskusi Artikel Ilmiah Populer Biologi tahun 2010,
dan Ketua Divisi Konsumsi Seminar dan Pelatihan PKM tahun 2009. Penulis menjadi asisten
praktikum mata kuliah Biologi Tingkat Persiapan Bersama pada tahun ajaran 2009/20102010/2011, mata kuliah Mikrobiologi Dasar pada tahun ajaran 2010/2011, dan mata kuliah Ilmu
Lingkungan pada tahun ajaran 2010/2011.
Penulis melakukan studi lapangan di Kawasan Wana Wisata Cangkuang Sukabumi dengan
judul makalah “Eksplorasi Begonia Sebagai Tanaman Obat di Wana Wisata Cangkuang,
Sukabumi”. Penulis juga melakukan Praktik Lapangan di PT PERTAMINA (PERSERO)
Refinery Unit VI Balongan pada bulan Juli tahun 2010, dengan judul makalah “Evaluasi
Pengolahan Air Limbah dengan Sistem Activated Sludge di PT PERTAMINA (PERSERO)
Refinery Unit VI Balongan Indramayu”. Penulis juga menerima beasiswa PERTAMINA
Foundation tahun 2009-2011.

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ..............................................................................................................
viii
DAFTAR GAMBAR ..........................................................................................................

viii

DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................................................

viii

PENDAHULUAN ..............................................................................................................
Latar Belakang.............................................................................................................
Tujuan .........................................................................................................................
Waktu dan Tempat .......................................................................................................

1
1

1
1

BAHAN DAN METODE ...................................................................................................
Pengambilan Contoh Tanah..........................................................................................
Isolasi dan Penyimpanan Bakteri ..................................................................................
Bioesai Aktivitas Degradasi AHL.................................................................................
Isolasi Genom dan Amplifikasi Gen Penyandi AHL-laktonase ......................................
Identifikasi Isolat Pendegradasi AHL ...........................................................................

1
1
2
2
2
2

HASIL ...............................................................................................................................
Isolasi dan Penyimpanan Bakteri ..................................................................................
Bioesai Aktivitas Degradasi AHL.................................................................................

Amplifikasi Gen Penyandi AHL-laktonase ...................................................................
Identifikasi Isolat Pendegradasi AHL ...........................................................................
Analisis Filogenetik Gen Pendegradasi AHL ................................................................

3
3
3
3
4
4

PEMBAHASAN.................................................................................................................

5

SIMPULAN .......................................................................................................................

6

SARAN ..............................................................................................................................

6

DAFTAR PUSTAKA .........................................................................................................

6

LAMPIRAN .......................................................................................................................

8

DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5

Halaman
Sampel tanah bahan isolasi bakteri..............................................................................

2
Isolat bakteri yang diperoleh dari setiap sampel tanah .................................................
3
Diameter zona degradasi AHL enam isolat terpilih......................................................
3
Hasil analisis gen aiiA pada isolat NTT3a dan NTT3e.................................................
4
Hasil analisis gen 16S rRNA isolat-isolat pendegradasi AHL ......................................
4

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4

Halaman
Zona degradasi AHL oleh supernatan isolat PAD1a (A), BAL2a (B), NTT3e (C),
NTT3a (D), NTT6B6 (E), NTT6B7 (F), dan kontrol negatif (G) ..................................
3
Visualisasi pita DNA hasil amplifikasi gen aiiA pada isolat NTT3a dan NTT3e (kirikanan; ladder 1 kb, NTT3e, dan NTT3a) ....................................................................
4
Visualisasi pita DNA hasil amplifikasi gen 16S rRNA pada isolat pendegradasi AHL
(kiri-kanan; PAD1a, BAL2a, NTT6B6, NTT6B7, NTT3e, NTT3a, dan ladder 1 kb) ...
4
Pohon filogenetik gen aiiA NTT3e dan NTT3a dibandingkan dengan beberapa spesies
penghasil AHL-laktonase dan AHL-acylase menggunakan metode Neighbor Joining
(NJ) dengan boostrap 1000x .......................................................................................
5

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5

Halaman
Komposisi media pertumbuhan bakteri .......................................................................
9
Hasil pewarnaan Gram isolat-isolat pendegradasi AHL ...............................................
10
Hasil pewarnaan endospora isolat NTT6B7 ................................................................
11
Hasil sekuen gen aiiA, BLAST-N, dan BLAST-X isolat NTT3a dan NTT3e ...............
12
Hasil sekuen gen 16S rRNA dan BLAST-N isolat PAD1a, BAL2a, NTT3a, NTT3e,
NTT6B6, dan NTT6B7 .............................................................................................
15

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Quorum sensing (QS) adalah komunikasi
antar sel bakteri yang dimediasi oleh
autoinduser (AI) pada quorum populasi
tertentu untuk mengatur ekspresi gen-gen
tertentu (Rukayadi & Hwang 2009). AI adalah
senyawa berbobot molekul rendah yang
disekresikan bakteri dan diakumulasikan
sehingga AI dikenali sel bakteri lainnya
kemudian diserap kembali. AI bakteri Gram
negatif berbeda dengan Gram positif. Gram
negatif menggunakan N-acyl homoserine
lactone (AHL), sedangkan Gram positif
menggunakan
senyawa
peptida
yang
dihasilkan melalui jalur ATP Binding Cassette
(ABC) (Rukayadi & Hwang 2009). Sistem QS
bekerja pada gen-gen yang berhubungan
dengan perilaku populasi bakteri seperti
pembentukan biofilm, virulensi pada inang,
bioluminescence, dan pembentukan antibiotik
(Gera & Srivastava 2006).
Anti-quorum sensing (anti-QS) merupakan
salah satu alternatif pengendalian penyakit
tanpa mematikan bakteri patogen. Senyawa
anti-QS dapat memblok atau mengacau proses
QS. Senyawa anti-QS dapat dikelompokkan
menjadi tiga jenis, yaitu: (1) senyawa
pendegradasi (degradator) yaitu senyawa yang
dapat mendegradasi AI atau komponen
pengatur QS lainnya dan senyawa ini biasanya
berupa enzim, (2) senyawa antagonis, dan (3)
senyawa kompetitor yaitu senyawa yang dapat
berkompetisi
dengan
AI
membentuk
kompleks dengan protein reseptor (Rukayadi
& Hwang 2009). Proses QS juga dapat
dicegah oleh reaksi laktonolisis (terbukanya
cincin lakton) akibat peningkatan pH >7 di
sekitar sel target. Namun ketika pH kembali
turun (asam) cincin lakton kembali terbentuk
(Rasmussen & Givskov 2006). Degradasi
enzimatik molekul AHL merupakan cara yang
efektif dalam mengcegah proses QS. Ada dua
jenis enzim pendegradasi AHL, yaitu AHL–
acylase dan AHL-laktonase.
AHL-acylase adalah enzim penghidrolisis
ikatan peptida pada rantai acyl molekul AHL
dan menghasilkan asam lemak bebas serta
homoserine lacton. Produk degradasi tersebut
digunakan kembali untuk proses metabolisme
bakteri yaitu sebagai sumber energi, nitrogen,
dan karbon. Beberapa gen yang menyandikan
AHL-acylase telah ditemukan yaitu aiiD dari
Ralstonia eutropha, PvdQ dan QuiP dari
Pseudomonas, AhlM dari Streptomyces sp.,

dan aiiC dari Anabaena sp. PCC7120
(Czajkowski & Jafra 2009).
AHL-laktonase merusak proses QS
melalui hidrolisis enzimatis cincin lakton
molekul AHL. Salah satu gen penyandi AHLlaktonase adalah gen aiiA. Gen aiiA pertama
kali ditemukan pada Bacillus sp. strain 240B1
(Dong et al. 2000). AHL-laktonase terdiri dari
dua klaster yaitu klaster aiiA pada genus
Bacillus dan Attm pada Agrobacterium
tumefaciens, Arthrobacter sp., dan Klebsiella
pneumonia (Dong & Zhang 2005). Homologi
aiiA kemudian ditemukan pada beberapa
spesies Bacillus lainnya yaitu B. subtilis, B.
cereus, B. mycoides dan beberapa strain dari
B. thuringiensis (Dong et al. 2002).
Kemampuan
suatu
bakteri
dalam
mendegradasi AHL dapat diuji dengan
menggunakan Chromobacterium violaceum
sebagai
bioindikator.
Chromobacterium
violaceum menggunakan proses QS untuk
mengatur ekspresi gen Vio yang menyandikan
pigmen berwarna ungu yang disebut violacein
(August et al. 2000).
Penelitian mengenai QS memiliki potensi
dan manfaat yang sangat besar karena dapat
dijadikan alternatif pengendalian bakteri
patogen yang ramah lingkungan dan tidak
memicu resistensi. Isolasi dan karakterisasi
bakteri penghasil AHL-laktonase dari lahan
pertanian dapat dijadikan sebagai langkah
awal memanfaatkan mekanisme anti-QS
untuk mengendalikan bakteri patogen
terutama pada tanaman.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi
dan mengkarakterisasi bakteri penghasil
AHL-laktonase asal lahan pertanian di luar
Pulau Jawa.
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan
November 2010 sampai Mei 2011 di
Laboratorium Mikrobiologi, Departemen
Biologi, FMIPA, IPB.

BAHAN DAN METODE
Pengambilan Contoh Tanah
Contoh tanah diambil dari lahan pertanian
di Nusa Tenggara Timur, Lampung, Papua
Barat, Sumatera Barat, Bali, dan Bangka
Belitung (Tabel 1).

2

Tabel 1 Sampel tanah bahan isolasi bakteri
No.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Provinsi
Bangka
Belitung
Bali
Bali
Sumatera
Barat
Papua Barat
Lampung
Nusa Tenggara
Timur

Desa/Kecamatan/Kabupaten
Kelubi, Manggar, Belitung
Timur
Tibubiyu, Kerambitan,
Tabanan
Beraban, Selemadeg, Tabanan
Ladang Darek, Kamang
Magek, Agam
Danaweria, Fak-Fak
Bandung Baru, Adiluwih,
Pringsewu
Lambanapu, Kambera, Sumba
Timur

Isolasi dan Penyimpanan Bakteri
Sebanyak 1 g tanah disuspensikan dengan
garam fisiologis 0.85% kemudian diencerkan
secara serial sampai pengenceran 10-6, 10-7,
dan 10-8. Masing-masing hasil pengenceran
diambil 100 µl dan disebarkan pada media
nutrient agar (NA) (Lampiran 1). Sisa hasil
pengenceran dipanaskan pada suhu 80º C
selama 10 menit lalu diambil sebanyak 100 µl
untuk disebarkan ke media NA yang baru.
Media NA yang telah diinokulasi kemudian
diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37º C.
Koloni tunggal yang tumbuh dimurnikan
dengan metode cawan gores pada media
dengan bahan komposisi yang sama. Setelah
didapatkan koloni murni, isolat dipindahkan
pada media NA miring kemudian disimpan
dalam lemari pendingin sampai saat
digunakan.
Bioesai Aktivitas Degradasi AHL
Sebanyak satu lup kultur bakteri
diinokulasikan ke dalam 3 ml media luria
broth (LB) (Lampiran 1) lalu diinkubasi pada
suhu ruang. Setelah 16-18 jam, kultur
disentrifugasi (12000 rpm, 10 menit) untuk
diambil supernatannya. Sebanyak 100 µL
supernatan diteteskan pada paper disc di atas
media luria agar (LA) semi-padat (Lampiran
1) yang telah diinokulasikan dengan 1%
kultur
Chromobacterium
violaceum.
Selanjutnya cawan LA tersebut diinkubasi
pada suhu ruang selama 24 jam. Paper disc
yang dikelilingi oleh zona berwarna tidak
ungu menunjukkan adanya aktivitas degradasi
AHL oleh enzim yang dieksresikan oleh isolat
bakteri yang diuji.

Jumlah
sampel

Kode sampel

1

BLT1

1

BAL1

1

BAL2

1

PAD1

2

PAP1, PAP2

2

LMP1, LMP2

8

NTT1, NTT2, NTT3, NTT4,
NTT5, NTT6, NTT7, NTT8

Isolasi Genom dan Amplifikasi Gen
Penyandi AHL-laktonase
DNA bakteri diisolasi menggunakan
metode Lazzo (Sambrook & Russell 2001).
DNA total yang diperoleh digunakan sebagai
template untuk amplifikasi gen penyandi
AHL-laktonase menggunakan primer aiiAF
(5’- ATC GGA TCC ATG ACA GTA AAG
AAG CTT TAT TTC G-3’) dan aiiAR (5’GTC GAA TTC CTC AAC AAG ATA CTC
CTA ATG ATG T-3’) (Dong et al. 2000).
Campuran reaksi PCR yang digunakan terdiri
dari 32 µl ddH2O, 5 µl 10x buffer, 3 µl 25
mM MgSO4, 5 µl dNTPS, 1,5 µl masingmasing primer, 1 µl template, dan 1 µl DNA
polymerase (KOD hot start). Amplifikasi
dilakukan selama 32 siklus dengan kondisi
pra-denaturasi (94ºC, 10 menit), denaturasi
(94ºC, 30 detik), annealing (52ºC, 30 detik),
elongasi (72ºC, 1 menit), dan post-elongasi
(72ºC, 5 menit) (Chan et al. 2007). Hasil PCR
kemudian dilarikan pada 1% gel elektroforesis
dan diwarnai dengan Ethidium Bromide
(EtBr).
Identifikasi Isolat Pendegradasi AHL
Isolat-isolat yang menunjukkan hasil
positif bioesei degradasi AHL dan amplifikasi
gen penyandi AHL-laktonase diidentifikasi
secara molekuler. Amplifikasi gen 16S rRNA
dilakukan menggunakan primer 63f (5’-CAG
GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3’) dan
1387r (5’-GGG CGG WGT GTA CAA GGC3’) (Marchesi et al. 1998). Amplifikasi
dilakukan selama 30 siklus dengan kondisi
pra-denaturasi (95ºC, 5 menit), denaturasi
(95ºC, 30 detik), annealing (55ºC, 1 menit),
elongasi (72ºC, 5 menit), dan post-elongasi
(72ºC, 5 menit). Hasil amplifikasi gen 16s
rRNA kemudian dikirim ke perusahaan
penyedia jasa sekuensing.

3

HASIL
Isolasi dan Penyimpanan Bakteri
Sebanyak 58 isolat berhasil diisolasi dan
enam di antaranya memiliki aktivitas
degradasi AHL (Tabel 2). Keenam isolat
tersebut merupakan bakteri Gram positif
berbentuk batang. Lima di antaranya
membentuk endospora (Tabel 3) (Lampiran 2
& 3).
Tabel 2 Isolat bakteri yang diperoleh dari
setiap sampel tanah
Isolat
Jumlah
Kode
No.
yang
isolat positif
sampel
diperoleh
bioesei
1.
BLT1
4
2.
BAL1
3
3.
BAL2
2
1
4.
PAD1
1
1
5.
PAP1
4
6.
PAP2
2
7.
LMP1
6
8.
LMP2
3
9.
NTT1
2
10.
NTT2
11.
NTT3
6
2
12.
NTT4
2
13.
NTT5
9
14.
NTT6
11
2
15.
NTT7
1
16.
NTT8
2
Total
58
6
Bioesai Aktivitas Degradasi AHL
Isolat PAD1a menunjukan diameter zona
degradasi AHL terbesar yaitu 0.9 cm.
Sedangkan isolat NTT3a, NTT3e, dan
NTT6B7 memiliki diameter zona degradasi
AHL yang paling kecil yaitu sebesar 0.3 cm
(Tabel 3) (Gambar 1).
Amplifikasi Gen Penyandi AHL-laktonase
Hasil amplifikasi gen aiiA menunjukkan
terdapat dua isolat yang mengandung gen
aiiA. Dua isolat tersebut adalah NTT3a dan
NTT3e. Ukuran amplikon 800 bp (Gambar 2).
Hasil analisis BLAST-N dan BLAST-X
menunjukkan gen aiiA isolat NTT3a dan
NTT3e homolog dengan AHL-laktonase
Bacillus sp. 91 (Lampiran 4) (Tabel 4).

Tabel 3 Diameter zona degradasi AHL enam
isolat terpilih
Diameter
zona
Kode
Morfologi sel
No.
degradasi
isolat
(cm)
1.
PAD1a
0.9
Gram positif,
batang, tidak
berendospora
2.
BAL2a
0.4
Gram positif,
batang,
berendospora
3.
NTT3e
0.3
Gram positif,
batang,
berendospora
4.
NTT3a
0.3
Gram positif,
batang,
berendospora
5.
NTT6B6
0.5
Gram positif,
batang,
berendospora
6.
NTT6B7
0.3
Gram positif,
batang,
berendospora

A

B

C

E

D

F

G
Gambar

1

Zona degradasi AHL oleh
supernatan isolat PAD1a (A),
BAL2a (B), NTT3e (C),
NTT3a (D), NTT6B6 (E),
NTT6B7 (F), dan kontrol
negatif (G).

4

Tabel 4 Hasil analisis gen aiiA pada isolat NTT3a dan NTT3e
Homologi bakteri Homologi protein (BLAST-X)
Kode isolat
(BLAST-N) (a)
(b)
NTT3a
Bacillus sp. 91 AHL-lactonase [Bacillus sp.
AHL-lactonase
91] Length= 250
gene Length= 753
NTT3e
Bacillus sp. 91 AHL-lactonase [Bacillus sp.
AHL-lactonase
91] Length= 250
gene Length= 753

Nilai identitas
724/725 (99%) (a),
239/240 (99%) (b)
724/725 (99%) (a),
239/240 (99%) (b)

Tabel 5 Hasil analisis gen 16S rRNA isolat-isolat pendegradasi AHL
Kode isolat
Homologi bakteri
Nilai identitas
(BLAST-N)
PAD1a
Microbacterium sp. Bg-7 Length=1383
1025/1039 (99%)
BAL2a
Uncultured bacterium clone ncd1261e03c1
609/683 (89%)
Length=1372
NTT3a
Bacillus sp. AF-777 Length=1522
455/471 (99%)
NTT3e
Bacillus sp. NIOT-3 Length=1445
807/814 (97%)
NTT6B6
Bacillus subtilis strain HU48 Length=1427
1147/1149 (99%)
NTT6B7
Bacillus subtilis strain GD1 Length=1452
1025/1028 (99%)

1500
1000
1000
750

750
500

500
250
250
Gambar 2 Visualisasi pita DNA hasil
amplifikasi gen aiiA pada isolat
NTT3a dan NTT3e (kiri-kanan;
ladder 1 kb, NTT3e, dan
NTT3a).
Identifikasi Isolat Pendegradasi AHL
Berdasarkan hasil bioesai dan deteksi
gen aiiA dilakukan identifikasi gen 16S
rRNA terhadap enam isolat yang memiliki
aktivitas degradasi AHL. Amplikon
berukuran 1300 bp (Gambar 3). Analisis gen
16S rRNA menunjukkan isolat NTT3a,
NTT3e, NTT6B6, dan NTT6B7 termasuk
kedalam genus Bacillus, isolat PAD1a mirip
dengan Microbacterium sp. Bg-7, dan isolat
BAL2a mirip dengan Uncultured bacterium
clone ncd1261e03c1 (Lampiran 5) (Tabel 5).

Gambar 3 Visualisasi pita DNA hasil
amplifikasi gen 16S rRNA
pada isolat pendegradasi AHL
(kiri-kanan; PAD1a, BAL2a,
NTT6B6, NTT6B7, NTT3a,
NTT3e, dan ladder 1 kb).
Analisis Filogenetik Gen Pendegradasi
AHL
Analisis filogenetik gen pendegradasi
AHL menggunakan metode Neighbor
Joining (NJ) (Tamura et al. 2007) dengan
boostrap 1000x menunjukkan bahwa isolat
NTT3e dan isolat NTT3a terletak dalam satu
klaster dengan bakteri penghasil AHLlaktonase Bacillus Sp. 91 dengan nilai
konsistensi boostrap hanya 47%.
Pohon
filogenetik tersebut membentuk dua klaster
besar yang terpisah yaitu klaster bakteri
yang menghasilkan AHL-laktonase dan
AHL-acylase (Gambar 4).

5

90
47
44
100
42

100

NTT3e
NTT3a
Bacillus sp. 91 (ABQ42910.1)
Bacillus thuringiensis (ABN11118.1)

AHLlaktonase

Bacillus sp. EGU18 (AEB20400.1)
Bacillus cereus (AEA48310.1)
Agrobacterium tumefaciens (AAL13075.1)

100

Pseudomonas sp. THA3 (AAP68798.1)
Pseudomonas sp. 130 (AAC34685.2)
Streptomyces sp. M664 (AAT68473.1)

100

AHLacylase

Ralstonia sp. XJ12B (AAO41113.1)
100

Ralstonia solanacearum GMI1000 (NP 52066)

0.1

Gambar 4 Pohon filogenetik gen aiiA NTT3e dan NTT3a dibandingkan dengan beberapa spesies
penghasil AHL-laktonase dan AHL-acylase menggunakan metode Neighbor Joining
(NJ) dengan boostrap 1000x.
NTT3a berdasarkan BLAST-N dan BLAST-X
masing-masing
menunjukkan
tingkat
PEMBAHASAN
homologi 99% dengan AHL-laktonase pada
Bacillus sp. 91. AHL-laktonase spesifik
Hasil bioesai menunjukkan dari 58 isolat
mendegradasi molekul AHL karena hanya
yang diperoleh, enam isolat di antaranya
menunjukkan aktivitas degradasi terhadap Lmemiliki aktivitas degradasi AHL. Hal ini
homoserine lacton dan tidak menunjukkan
ditunjukkan dengan hilangnya pigmen ungu
aktivitas degradasi pada non-cyclic ester.
pada kultur Chromobacterium violaceum
Enzim ini aktivitasnya stabil pada suhu di
setelah diinkubasi selama 24 jam (Gambar 1).
bawah 37ºC tetapi tidak stabil pada suhu yang
Isolat
PAD1a
menunjukkan
aktivitas
tinggi (Wang et al. 2004).
degradasi terbaik dengan diameter zona
Amplifikasi gen 16S rRNA isolat PAD1a,
degradasi 0.9 cm. Dibandingkan dengan
BAL2a, NTT3e, NTT3a, NTT6B6, dan
diameter zona degradasi AHL empat isolat
NTT6B7 menghasilkan amplikon berukuran
lainnya, diameter zona degradasi AHL isolat
1300 bp (Gambar 2). Analisis gen 16S rRNA
NTT3a dan NTT3e relatif lebih kecil.
isolat PAD1a menunjukkan kemiripan dengan
Walaupun demikian, dari enam isolat yang
Microbacterium sp. Bg-7 (nilai identitas
menunjukkan hasil positif pada bioesai
99%). Wang et al. (2010) juga melaporkan
degradasi AHL hanya isolat NTT3a dan
adanya aktivitas degradasi AHL pada
NTT3e yang berhasil diamplifikasi gen
Microbacterium testaceum StLB037 yang
aiiAnya. Isolat BAL2a, NTT6B6, PAD1a, dan
diisolasi dari daun kentang. Aktivitas
NTT6B7 merupakan isolat-isolat yang
degradasi AHL pada bakteri ini mirip dengan
memiliki aktivitas degradasi AHL namun
aktivitas degradasi AHL pada beberapa
tidak menunjukkan produk amplifikasi gen
bakteri yang memiliki AHL-laktonase seperti
aiiA. Hal ini dapat disebabkan oleh perbedaan
Bacillus sp., Arthrobacter sp., Agrobacterium
gen penyandi AHL-laktonase yang dimiliki
tumefaciens, dan Rhodococcus erythropolis.
oleh isolat-isolat tersebut.
Selain AHLAHL-laktonase
pada
Microbacterium
laktonase degradasi AHL juga dapat
testaceum StLB037 disandikan oleh gen aiiM.
disebabkan oleh aktivitas AHL-acylase.
Hasil analisis 16S rRNA menunjukkan isolat
Amplifikasi gen aiiA pada isolat NTT3a
BAL2a mirip dengan Uncultured bacterium
dan NTT3e menunjukkan amplikon yang
clone ncd1261e03c1 (nilai identitas 89%),
berukuran 800 bp (Gambar 2), hal ini sesuai
isolat NTT6B6 mirip dengan Bacillus subtilis
dengan penelitian Chan et al. (2007) yang
strain HU48 (nilai identitas 99%). Hasil
membuktikan bahwa amplikon hasil PCR gen
analisis 16S rRNA isolat NTT6B7 mirip
aiiA pada bakteri tanah sebesar 800 bp.
dengan Bacillus subtilis strain GD1 (nilai
Analisis sekuen gen aiiA isolat NTT3e dan

6

identitas 99%), isolat NTT3e mirip dengan
Bacillus sp. NIOT-3 (nilai identitas 99%), dan
isolat NTT3a mirip dengan Bacillus sp. AF777 (nilai identitas 97%). Menurut Dong et al.
(2002), genus Bacillus sebagian besar
memiliki gen aiiA yang menyandikan AHLlaktonase. Chan et al. (2007) juga melaporkan
bahwa sebanyak 12 isolat dari 50 isolat
Bacillus yang diisolasi dari tanah tropis
memiliki gen yang homolog dengan gen aiiA.
Analisis filogenetik gen pendegradasi AHL
menggunakan metode Neighbor Joining (NJ)
dengan boostrap 1000x menunjukkan bahwa
isolat NTT3a dan isolat NTT3e terletak dalam
satu klaster dengan bakteri penghasil AHLlaktonase Bacillus Sp. 91 (Gambar 4). Nilai
konsistensi boostrap antara NTT3a dan
NTT3e mencapai 90% yang menunjukkan
bahwa gen aiiA pada kedua isolat ini sangat
mirip. Pohon filogenetik tersebut membentuk
dua klaster besar yang terpisah yaitu klaster
bakteri yang menghasilkan AHL-laktonase
dan AHL-acylase. Sekuen enzim AHLlaktonase terdistribusi luas pada beberapa
organisme meliputi Actinobacteria, Acidobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi, Deinococcus-Thermus, Firmicutes, α-Proteobacteria, β-Proteobacteria, γ-Proteobacteria, δProteobacteria, Euryarchaeota, Crenarchaeota,
Sphingobacteria, Spirochaetales, Nitrospirales, and Planctomycetes. Namun hanya dua
kelompok yaitu Firmicutes (12 genus dan 22
spp.) dan α-Proteobacteria (18 genus dan 22
spp.) yang memiliki aktivitas AHL-laktonase.
Distribusi sekuen AHL-acylase lebih sempit
dibandingkan
sekuen
AHL-laktonase.
Distribusi sekuen enzim AHL-acylase
meliputi Actinobacteria, Cyanobacteria, Bacteroidetes, Deinococcus-Thermus, Firmicutes,
α-Proteobacteria, β-Proteobacteria, γ-Proteobacteria, δ-Proteobacteria, Euryarchaeota dan
Crenarchaeota. Distribusi sekuen AHLacylase sangat berbeda dengan sekuen AHLlaktonase.
γ-Proteobacteria
merupakan
kelompok terbesar yang mengandung aktivitas
AHL-acylase (20 genus dan 31 spp.) (Kalia et
al. 2011).

SIMPULAN
Isolat NTT3e dan NTT3a memiliki gen
aiiA yang homolog dengan AHL-laktonase
pada Bacillus sp. 91. Gen 16S rRNA isolat
NTT3e mirip dengan Bacillus sp. NIOT-3
(nilai identitas: 99%). Sedangkan isolat
NTT3a mirip dengan Bacillus sp. AF-777
(nilai identitas: 97%). Isolat PAD1a, BAL2a,
NTT6B6, dan NTT6B7 memiliki aktivitas

degradasi AHL namun tidak berhasil
diamplifikasi gen aiiAnya. Berdasarkan
analisis gen 16S rRNA, isolat PAD1a mirip
dengan Microbacterium sp. Bg-7, BAL2a
mirip dengan Uncultured bacterium clone
ncd1261e03c1, NTT6B6 mirip dengan
Bacillus subtilis strain HU48, dan NTT6B7
mirip dengan Bacillus subtilis strain GD1.

SARAN
Perlu dilakukan karakterisasi molekuler
gen pendegradasi AHL pada isolat yang
memiliki aktivitas degaradasi AHL namun
tidak berhasil diamplifikasi gen aiiAnya
menggunakan primer aiiAF dan aiiAR.

DAFTAR PUSTAKA
August PR, Grossman TH, Minor C, Draper
MP, MacNeil IA, Pemberton JM, Call
KM, Holt D, Osburne S. 2000. Sequence
analysis and functional characterization of
the violacein biosynthetic pathway from
Chromobacterium violaceum. J Mol
Microbiol Biotechnol 2: 513-519.
Chan KG, Tiew SZ. Ng CC. 2007. Rapid
isolation method of soil bacilli and
screening of their quorum quenching
activity. Asia Pacific J Mol Biol and
Biotechnol 15: 153-156.
Czajkowski R, Jafra S. 2009. Quenching of
acyl-homoserine
lactone-dependent
quorum sensing by enzymatic disruption
of signal molecules. Acta Biochim
Polonica 56: 1-16.
Dong YH, Xu JL, Li XC, Zang LH. 2000.
aiiA, a novel enzyme inactivates acyl
homoserine-lactone quorum-sensing signal
and attenuates the virulence of Erwinia
carotovora. Proc Natl Acad Sci 97:3526–
3531.
Dong YH, Gusti AR, Zhang Q, Xu JL, Zhang
LH. 2002. Identification of quorumquenching N-acyl homoserine lactonases
from Bacillus species. Appl Environ
Microbiol 68:1754–1759.
Dong YH, Zhang LH. 2005. Quorum sensing
and quorum-quenching enzymes. J
Microbiol 43: 101-109.
Gera C, Srivastava S. 2006. Quorum sensing:
the
phenomenon
of
microbial
communication. Current Sci 90: 666-675.
Kalia VC, Raju SC, Purohit HJ. 2011.
Genomic analysis reveals versatile
organisms
for
quorum
quenching

7

enzymes: acyl-homoserine lactone-acylase
and –lactonase. Open Microbiol J 5: 1-13.
Marchesi JR, Sato T, Weightman AJ, Martin
TA, Fry JC, Hiom SJ, Wade WG. 1998.
Design and evaluation of useful
bacterium-specific PCR primer that
amplify genes coding for bacterial 16S
rRNA. Appl Environ Microbiol 64: 795799.
Rasmussen TB, Givskov M. 2006. Quorum
sensing inhibitors: a bargain of effects.
Microbiology 152: 895-904.
Rukayadi Y, Hwang JK. 2009. Pencegahan
quorum sensing: suatu pendekatan baru
dalam
mengatasi
infeksi
bakteri.
Medicinus 22: 22-27.
Sambrook J, Russell DW. 2001. Molecular
Cloning: a Laboratory Manual Third
Edition. New York: Cold Spring Harbor
Laboratory Pr.

Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. 2007.
MEGA4: molecular evolutionary genetics
analysis (MEGA) software version 4.0.
Mol Biol Evol 24: 1596-1599.
Wang LH, Weng LX, Dong YH, Zhang LH.
2004. Specifity and enzyme kinetics of the
quorum-quenching N-acyl homoserine
lactone lactonase (AHL-lactonase). J Biol
Chem 279: 13645-13651.
Wang WZ, Morohoshi T, Ikenoya M, Someya
N, Ikeda T. 2010. AiiM, a novel class of
N-acylhomoserine lactonase from the leafassociated bacterium Microbacterium
testaceum. Appl and Environ Microbiol
76: 2524-2530.

LAMPIRAN

9

Lampiran 1 Komposisi media pertumbuhan bakteri
1. Nutrient Agar (NA)
 0.8 g nutrient broth (NB)
 1.5 g agar
 100 ml akuades
2. Luria Broth (LB)
 1 g Trypton
 1 g NaCl
 0.5 g yeast extract
 100 ml akuades
3. Luria Agar (LA) untuk pertumbuhan Chromobacterium violaceum
 1 g Trypton
 1 g NaCl
 0.5 g yeast extract
 0.1 g CaCO3
 1.5 g agar
 100 ml akuades
4. Luria Agar (LA) semi padat
 1 g Trypton
 1 g NaCl
 0.5 g yeast extract
 0.1 g CaCO3
 1 g agar
 100 ml akuades

10

Lampiran 2 Hasil pewarnaan Gram isolat-isolat pendegradasi AHL

PAD1a
(perbesaran 100 x 10)

BAL2a
(perbesaran 100 x 10)

NTT6B7
(perbesaran 100 x 10)

NTT6B6
(perbesaran 100 x 10)

NTT3a
(perbesaran 100 x 10)

NTT3e
(perbesaran 100 x 10)

11

Lampiran 3 Hasil pewarnaan endospora isolat NTT6B7

Keterangan: bagian yang ditunjuk panah adalah endospora (gelap dan berbentuk bulat di ujung sel)
sedangkan sel vegetatifnya berwarna merah muda (perbesaran 100 x 10).

12

Lampiran 4 Hasil sekuen gen aiiA, BLAST-N, dan BLAST-X isolat NTT3a dan NTT3e
A) Urutan nukleotida gen aiiA isolat NTT3a
TTTTCAGCAGGTCGTTGTATGTTAGATCATTCTTCTGTTAATAGTACACTCGCGCCGGGGAATTTATTGAA
CTTACCTGTATGGTGTTATCTTTTGGAGACAGAAGAGGGGCCTATTTTAGTAGATACAGGTATGCCAGAA
AGTGCAGTTAATAATGAAGGGCTTTTTAACGGTACATTTGTTGAAGGACAGATTTTACCGAAAATGACTG
AAGAAGATAGAATCGTGAATATATTAAAACGTGTAGGGTATGAGCCGGACGACCTTTTATATATTATTAG
TTCTCACTTACATTTTGATCATGCAGGAGGAAACGGTGCTTTTACAAATACACCGATTATTGTGCAACGA
ACGGAATATGAGGCAGCACTTCATAGAGAAGAATATATGAAAGAATGTATATTACCGCATTTGAACTAC
AAAATTATTGAAGGGGATTATGAAGTGGTACTAGGTGTGCAATTATTGTATACGCCAGGCCATTCTCCAG
GCCATCAGTCGCTATTAATTGAGACAGAAAAATCCGGTCCTGTATTATTAACGATTGATGCATCTTATAC
GAAAGAAAATTTTGAAGATGAAGTGCCGTTCGCGGGATTTGATTCGGAATTAGCTTTATCTTCCATTAAA
CGTTTAAAAGAAGTTGTGGCGAAAGAGAAACCAATTATTTTCTTTGGTCATGATATAGAGCAGGAAAAG
GGTTGTAAAGTGTTCCCGGAATATATATAGTGCAAAAAGTCATGAGCTTACGTGCTCATGACTTTTTCGT
TTAAATAATTTTTTTGAATAAGTTATAAACCTTTTTTGAGCTATCTTCATTTAATTGATAGTACTTGAGGTT
TACATCATTAGGAGTATCTTGTTGAGAAAATTCGACAAAANNNAAAAAAGAA

B) Hasil BLAST-N sekuen gen aiiA isolat NTT3a dengan data Genbank
|EF537015.1| Bacillus sp. 91 AHL-lactonase gene, complete cds
Length = 753; Score = 1334 bits (722); Expect = 0.0; Identities = 724/725 (99%); Gaps = 0/725
(0%); Strand = Plus/Plus
Query 6 CAGCAGGTCGTTGTATGTTAGATCATTCTTCTGTTAATAGTACACTCGCGCCGGGGAATT 65
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 29 CAGCAGGTCGTTGTATGTTAGATCATTCTTCTGTTAATAGTACACTCGCGCCGGGGAATT 88
Query 66 TATTGAACTTACCTGTATGGTGTTATCTTTTGGAGACAGAAGAGGGGCCTATTTTAGTAG 125
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 89 TATTGAACTTACCTGTATGGTGTTATCTTTTGGAGACAGAAGAGGGGCCTATTTTAGTAG 148
Query 126 ATACAGGTATGCCAGAAAGTGCAGTTAATAATGAAGGGCTTTTTAACGGTACATTTGTTG 185
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 149 ATACAGGTATGCCAGAAAGTGCAGTTAATAATGAAGGGCTTTTTAACGGTACATTTGTTG 208
Query 186 AAGGACAGATTTTACCGAAAATGACTGAAGAAGATAGAATCGTGAATATATTAAAACGTG 245
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 209 AAGGACAGATTTTACCGAAAATGACTGAAGAAGATAGAATCGTGAATATATTAAAACGTG 268
Query 246 TAGGGTATGAGCCGGACGACCTTTTATATATTATTAGTTCTCACTTACATTTTGATCATG 305
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 269 TAGGGTATGAGCCGGACGACCTTTTATATATTATTAGTTCTCACTTACATTTTGATCATG 328
Query 306 CAGGAGGAAACGGTGCTTTTACAAATACACCGATTATTGTGCAACGAACGGAATATGAGG 365
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 329 CAGGAGGAAACGGTGCTTTTACAAATACACCGATTATTGTGCAACGAACGGAATATGAGG 388
Query 366 CAGCACTTCATAGAGAAGAATATATGAAAGAATGTATATTACCGCATTTGAACTACAAAA 425
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 389 CAGCACTTCATAGAGAAGAATATATGAAAGAATGTATATTACCGCATTTGAACTACAAAA 448
Query 426 TTATTGAAGGGGATTATGAAGTGGTACTAGGTGTGCAATTATTGTATACGCCAGGCCATT 485
||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 449 TTATTGAAGGGGATTATGAAGTGGTACCAGGTGTGCAATTATTGTATACGCCAGGCCATT 508
Query 486 CTCCAGGCCATCAGTCGCTATTAATTGAGACAGAAAAATCCGGTCCTGTATTATTAACGA 545
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 509 CTCCAGGCCATCAGTCGCTATTAATTGAGACAGAAAAATCCGGTCCTGTATTATTAACGA 568
Query 546 TTGATGCATCTTATACGAAAGAAAATTTTGAAGATGAAGTGCCGTTCGCGGGATTTGATT 605
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 569 TTGATGCATCTTATACGAAAGAAAATTTTGAAGATGAAGTGCCGTTCGCGGGATTTGATT 628
Query 606 CGGAATTAGCTTTATCTTCCATTAAACGTTTAAAAGAAGTTGTGGCGAAAGAGAAACCAA 665
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 629 CGGAATTAGCTTTATCTTCCATTAAACGTTTAAAAGAAGTTGTGGCGAAAGAGAAACCAA 688
Query 666 TTATTTTCTTTGGTCATGATATAGAGCAGGAAAAGGGTTGTAAAGTGTTCCCGGAATATA 725
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

13

Sbjct 689 TTATTTTCTTTGGTCATGATATAGAGCAGGAAAAGGGTTGTAAAGTGTTCCCGGAATATA 748
Query 726 TATAG 730
|||||
Sbjct 749 TATAG 753

C) Hasil BLAST-X sekuen gen aiiA isolat NTT3a dengan data Genbank
|ABQ42910.1| AHL-lactonase [Bacillus sp. 91]
Length = 250; Score = 488 bits (1256); Expect = 5e-136; Identities = 239/240 (99%); Positives
= 239/240 (99%); Gaps = 0/240 (0%); Frame = +1
Query 8

AGRCMLDHSSVNSTLAPGNLLNLPVWCYLLETEEGPILVDTGMPESAVNNEGLFNGTFVE 187
AGRCMLDHSSVNSTLAPGNLLNLPVWCYLLETEEGPILVDTGMPESAVNNEGLFNGTFVE
Sbjct 11 AGRCMLDHSSVNSTLAPGNLLNLPVWCYLLETEEGPILVDTGMPESAVNNEGLFNGTFVE 70
Query 188 GQILPKMTEEDRIVNILKRVGYEPDDLLYIISSHLHFDHAGGNGAFTNTPIIVQRTEYEA 367
GQILPKMTEEDRIVNILKRVGYEPDDLLYIISSHLHFDHAGGNGAFTNTPIIVQRTEYEA
Sbjct 71 GQILPKMTEEDRIVNILKRVGYEPDDLLYIISSHLHFDHAGGNGAFTNTPIIVQRTEYEA 130
Query 368 ALHREEYMKECILPHLNYKIIEGDYEVVLGVQLLYTPGHSPGHQSLLIETEKSGPVLLTI 547
ALHREEYMKECILPHLNYKIIEGDYEVV GVQLLYTPGHSPGHQSLLIETEKSGPVLLTI
Sbjct 131 ALHREEYMKECILPHLNYKIIEGDYEVVPGVQLLYTPGHSPGHQSLLIETEKSGPVLLTI 190
Query 548 DASYTKENFEDEVPFAGFDSELALSSIKRLKEVVAKEKPIIFFGHDIEQEKGCKVFPEYI 727
DASYTKENFEDEVPFAGFDSELALSSIKRLKEVVAKEKPIIFFGHDIEQEKGCKVFPEYI
Sbjct 191 DASYTKENFEDEVPFAGFDSELALSSIKRLKEVVAKEKPIIFFGHDIEQEKGCKVFPEYI 250

D) Urutan nukleotida gen aiiA isolat NTT3e
TTTCAGCAGGTCGTTGTATGTTAGATCATTCTTCTGTTAATAGTACACTCGCGCCGGGGAATTTATTGAAC
TTACCTGTATGGTGTTATCTTTTGGAGACAGAAGAGGGGCCTATTTTAGTAGATACAGGTATGCCAGAAA
GTGCAGTTAATAATGAAGGGCTTTTTAACGGTACATTTGTTGAAGGACAGATTTTACCGAAAATGACTGA
AGAAGATAGAATCGTGAATATATTAAAACGTGTAGGGTATGAGCCGGACGACCTTTTATATATTATTAGT
TCTCACTTACATTTTGATCATGCAGGAGGAAACGGTGCTTTTACAAATACACCGATTATTGTGCAACGAA
CGGAATATGAGGCAGCACTTCATAGAGAAGAATATATGAAAGAATGTATATTACCGCATTTGAACTACA
AAATTATTGAAGGGGATTATGAAGTGGTACTAGGTGTGCAATTATTGTATACGCCAGGCCATTCTCCAGG
CCATCAGTCGCTATTAATTGAGACAGAAAAATCCGGTCCTGTATTATTAACGATTGATGCATCTTATACG
AAAGAAAATTTTGAAGATGAAGTGCCGTTCGCGGGATTTGATTCGGAATTAGCTTTATCTTCCATTAAAC
GTTTAAAAGAAGTTGTGGCGAAAGAGAAACCAATTATTTTCTTTGGTCATGATATAGAGCAGGAAAAGG
GTTGTAAAGTGTTCCCGGAATATATATAGTGCAAAAAGTCATGAGCTTACGTGCTCATGACTTTTTCGTTT
AAATAATTTTTTTGAATAAGTTATAAACCTTTTTTGAGCTATCTTCATTTAATTGATAGTACTTGAGGTTT
ACATCATTAGGAGTATCTTGTTGAGGAATTCAACAAAAAAAATATGCGNTAGATGTTAGCGTTCTGGTTG
GAAATCCGCATCAATAGTCGGTACATCTTCACCGACTAGNACGTGTAGC

E) Hasil BLAST-N sekuen gen aiiA isolat NTT3e dengan data Genbank
|EF537015.1| Bacillus sp. 91 AHL-lactonase gene, complete cds
Length = 753; Score = 1334 bits (722); Expect = 0.0; Identities = 724/725 (99%); Gaps = 0/725
(0%); Strand=Plus/Plus
Query 4 CAGCAGGTCGTTGTATGTTAGATCATTCTTCTGTTAATAGTACACTCGCGCCGGGGAATT 63
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 29 CAGCAGGTCGTTGTATGTTAGATCATTCTTCTGTTAATAGTACACTCGCGCCGGGGAATT 88
Query 64 TATTGAACTTACCTGTATGGTGTTATCTTTTGGAGACAGAAGAGGGGCCTATTTTAGTAG 123
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 89 TATTGAACTTACCTGTATGGTGTTATCTTTTGGAGACAGAAGAGGGGCCTATTTTAGTAG 148
Query 124 ATACAGGTATGCCAGAAAGTGCAGTTAATAATGAAGGGCTTTTTAACGGTACATTTGTTG 183
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 149 ATACAGGTATGCCAGAAAGTGCAGTTAATAATGAAGGGCTTTTTAACGGTACATTTGTTG 208
Query 184 AAGGACAGATTTTACCGAAAATGACTGAAGAAGATAGAATCGTGAATATATTAAAACGTG 243
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 209 AAGGACAGATTTTACCGAAAATGACTGAAGAAGATAGAATCGTGAATATATTAAAACGTG 268
Query 244 TAGGGTATGAGCCGGACGACCTTTTATATATTATTAGTTCTCACTTACATTTTGATCATG 303
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

14

Sbjct 269 TAGGGTATGAGCCGGACGACCTTTTATATATTATTAGTTCTCACTTACATTTTGATCATG 328
Query 304 CAGGAGGAAACGGTGCTTTTACAAATACACCGATTATTGTGCAACGAACGGAATATGAGG 363
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 329 CAGGAGGAAACGGTGCTTTTACAAATACACCGATTATTGTGCAACGAACGGAATATGAGG 388
Query 364 CAGCACTTCATAGAGAAGAATATATGAAAGAATGTATATTACCGCATTTGAACTACAAAA 423
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 389 CAGCACTTCATAGAGAAGAATATATGAAAGAATGTATATTACCGCATTTGAACTACAAAA 448
Query 424 TTATTGAAGGGGATTATGAAGTGGTACTAGGTGTGCAATTATTGTATACGCCAGGCCATT 483
||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 449 TTATTGAAGGGGATTATGAAGTGGTACCAGGTGTGCAATTATTGTATACGCCAGGCCATT 508
Query 484 CTCCAGGCCATCAGTCGCTATTAATTGAGACAGAAAAATCCGGTCCTGTATTATTAACGA 543
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 509 CTCCAGGCCATCAGTCGCTATTAATTGAGACAGAAAAATCCGGTCCTGTATTATTAACGA 568
Query 544 TTGATGCATCTTATACGAAAGAAAATTTTGAAGATGAAGTGCCGTTCGCGGGATTTGATT 603
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 569 TTGATGCATCTTATACGAAAGAAAATTTTGAAGATGAAGTGCCGTTCGCGGGATTTGATT 628
Query 604 CGGAATTAGCTTTATCTTCCATTAAACGTTTAAAAGAAGTTGTGGCGAAAGAGAAACCAA 663
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 629 CGGAATTAGCTTTATCTTCCATTAAACGTTTAAAAGAAGTTGTGGCGAAAGAGAAACCAA 688
Query 664 TTATTTTCTTTGGTCATGATATAGAGCAGGAAAAGGGTTGTAAAGTGTTCCCGGAATATA 723
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 689 TTATTTTCTTTGGTCATGATATAGAGCAGGAAAAGGGTTGTAAAGTGTTCCCGGAATATA 748
Query 724 TATAG 728
|||||
Sbjct 749 TATAG 753

F) Hasil BLAST-X sekuen gen aiiA isolat NTT3e dengan data Genbank
|ABQ42910.1| AHL-lactonase [Bacillus sp. 91]
Length = 250; Score = 488 bits (1256); Expect = 6e-136; Identities = 239/240 (99%); Positives
= 239/240 (99%); Gaps = 0/240 (0%); Frame = +3
Query 6

AGRCMLDHSSVNSTLAPGNLLNLPVWCYLLETEEGPILVDTGMPESAVNNEGLFNGTFVE 185
AGRCMLDHSSVNSTLAPGNLLNLPVWCYLLETEEGPILVDTGMPESAVNNEGLFNGTFVE
Sbjct 11 AGRCMLDHSSVNSTLAPGNLLNLPVWCYLLETEEGPILVDTGMPESAVNNEGLFNGTFVE 70
Query 186 GQILPKMTEEDRIVNILKRVGYEPDDLLYIISSHLHFDHAGGNGAFTNTPIIVQRTEYEA 365
GQILPKMTEEDRIVNILKRVGYEPDDLLYIISSHLHFDHAGGNGAFTNTPIIVQRTEYEA
Sbjct 71 GQILPKMTEEDRIVNILKRVGYEPDDLLYIISSHLHFDHAGGNGAFTNTPIIVQRTEYEA 130
Query 366 ALHREEYMKECILPHLNYKIIEGDYEVVLGVQLLYTPGHSPGHQSLLIETEKSGPVLLTI 545
ALHREEYMKECILPHLNYKIIEGDYEVV GVQLLYTPGHSPGHQSLLIETEKSGPVLLTI
Sbjct 131 ALHREEYMKECILPHLNYKIIEGDYEVVPGVQLLYTPGHSPGHQSLLIETEKSGPVLLTI 190
Query 546 DASYTKENFEDEVPFAGFDSELALSSIKRLKEVVAKEKPIIFFGHDIEQEKGCKVFPEYI 725
DASYTKENFEDEVPFAGFDSELALSSIKRLKEVVAKEKPIIFFGHDIEQEKGCKVFPEYI
Sbjct 191 DASYTKENFEDEVPFAGFDSELALSSIKRLKEVVAKEKPIIFFGHDIEQEKGCKVFPEYI 250

15

Lampiran 5 Hasil sekuen gen 16S rRNA dan BLAST-N isolat PAD1a, BAL2a, NTT3a, NTT3e,
NTT6B6, dan NTT6B7
A) Urutan nukleotida gen 16S rRNA isolat PAD1a
TTTGGAAAGATTTTTCGGTTGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCA
AGGCGTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCC
TACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGAGGG
ATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAAAA
GCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGG
CGTAAAGAGCTCGTACGCGGTTTGTCGCGTCTGCTGTGAAATCCCGAGGCTCAACCTCAGGCCTGCAGTG
AGTACGGGCAGACTAGAGTGCGGTAGGGGAGATTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATAT
CAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGATCTCTGGGCCGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGGGTGGG
GAGCAAACAGGCTTAGATACCCTGGTAGTCCACCCCGTAAACGTTGGGAACTAGTTGTGGGGTCCATTCC
ACGGATTCCGTGACGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTC
AAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACC
TTACCAAGGCTTGACATATACGAGAACGGGCCAGAAATGGTCAACTCTTTGGACACTCGTAAACAGGTG
GTGCATGGTTGTCATCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGAGCAACCCTCGTTC
TATGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGGAACTCATGGGATACTGCCCGGGTCCACTTCGAAGGAAGGTGGG
GATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTAAGGTCTTGGGCTTCAAGCATGCTACAATGGCCAGGTACAAAGG
GC

B) Hasil BLAST-N sekuen gen 16S rRNA isolat PAD1a dengan data Genbank
|HQ916747.1| Microbacterium sp. Bg-7 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
Length = 1383; Score = 1838 bits (995); Expect = 0.0; Identities = 1025/1039 (99%); Gaps =
4/1039 (0%); Strand = Plus/Plus
Query 1 TTTGGAAAGATTTTTCGGTTGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAA 60
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 145 TTTGGAAAGATTTTTCGGTTGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAA 204
Query 61 TGGCTCACCAAGGCGTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACT 120
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 205 TGGCTCACCAAGGCGTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACT 264
Query 121 GAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAA 180
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 265 GAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAA 324
Query 181 GCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTAGC 240
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 325 GCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTAGC 384
Query 241 AGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAAAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCA 300
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 385 AGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAAAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCA 444
Query 301 GCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTA 360
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 445 GCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTA 504
Query 361 CGCGGTTTGTCGCGTCTGCTGTGAAATCCCGAGGCTCAACCTCAGGCCTGCAGTGAGTAC 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||| ||||
Sbjct 505 GGCGGTTTGTCGCGTCTGCTGTGAAATCCCGAGGCTCAACCTCGGGCCTGCAGTGGGTAC 564
Query 421 GGGCAGACTAGAGTGCGGTAGGGGAGATTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAG 480
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 565 GGGCAGACTAGAGTGCGGTAGGGGAGATTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAG 624
Query 481 ATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGATCTCTGGGCCGTAACTGACGCTGAGGAG 540
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 625 ATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGATCTCTGGGCCGTAACTGACGCTGAGGAG 684
Query 541 CGAAAGGGTGGGGAGCAAACAGGCTTAGATACCCTGGTAGTCCACCCCGTAAACGTTGGG 600
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 685 CGAAAGGGTGGGGAGCAAACAGGCTTAGATACCCTGGTAGTCCACCCCGTAAACGTTGGG 744

16

Query 601 AACTAGTTGTGGGGTCCATTCCACGGATTCCGTGACGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCG 660
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 745 AACTAGTTGTGGGGTCCATTCCACGGATTCCGTGACGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCG 804
Query 661 CCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCG 720
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 805 CCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCG 864
Query 721 GCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATAC 780
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 865 GCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATAC 924
Query 781 GAGAACGGGCCAGAAATGGTCAACTCTTTGGACACTCGTAAACAGGTGGTGCATGGTTGT 840
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 925 GAGAACGGGCCAGAAATGGTCAACTCTTTGGACACTCGTAAACAGGTGGTGCATGGTTGT 984
Query 841 CATCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGAGCAACCCTCGTTCTA 900
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||
Sbjct 985 CGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTA 1044
Query 901 TGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGGAACTCATGGGATACTGCCCGGGTCCACTTCGAAGGA 960
||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||| ||||| ||| || ||||
Sbjct 1045 TGTTGCCAGCACGTAATGGTGGG-AACTCATGGGATACTGCCGGGGTCAACT-CGGAGGA 1102
Query 961 AGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTAAGGTCTTGGGCTTCAAGCATGCTACA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||| | |||||||||||| ||||||||||
Sbjct 1103 AGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATG-TCTTGGGCTTCACGCATGCTACA 1161
Query 1021 ATGGCCAGGTACAAAGGGC 1039
|||||| ||||||||||||
Sbjct 1162 ATGGCC-GGTACAAAGGGC 1179

C) Urutan nukleotida gen 16S rRNA isolat BAL2a
GCNCNGTGANTTAGCGGCGGACGGGAGAGTCACACGTGGGTCACCTACCTATNAGACTGGTATCACTCC
GGGAAACCGGGGCTAATGCCGGATAACATTTAGAACCGCGTGGTTCTCAAGTGAAGGATGGTTTTGCTAT
CACTTATAGATGGACCCGCGCCGTATTAGCTAGTGGGGAGGGTAACGGCTTACCAAGGCAACGATACGT
ACCCGACCTGAAAGGGGGATCGGCCCCCCGGGAACGGAAACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGC
ATTAGGGAATCTTCCGCAAGGGGCAAAAGCCTGACGGANCACCGCCCCGGGGGTGATGAAGGTCTTCGA
ATCGAAAAATTTTGTTATTAGGGAAAAACAAATGTGTAAGTAACTGGGCGCGTCTTGACGGTACCTAATC
AGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTA
TTGGGCGTAAGGGCGCGTAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAGCCCCGGCTCANNGGNGAGGTCATT
GGAACTGGAACTTGAGTGCAGANAGAAGTGNATTCNTGTGTAGCGTGAATGCGCAGAGATATGAGNNCA
CNGTGCGAAGCGANTTCTGTCTGTACTGACGCTGATGNGCGAAGCGTNNNNCNNCAGNTAGATACNTGT
AGTCACGCNTAANGATGAGTGCTAGTGTAGGNNNNCNNNNTAGTGCTGCAGCTANGCATTAGCA

D) Hasil BLAST-N sekuen gen 16S rRNA isolat BAL2a dengan data Genbank
|JF072163.1| Uncultured bacterium clone ncd1261e03c1 16S ribosomal RNA gene, partial
sequence
Length = 1372; Score = 854 bits (462); Expect = 0.0; Identities = 609/683 (89%); Gaps =
24/683 (4%); Strand = Plus/Plus
Query 11 TTAGCGGCGGACGGGAGAGTCACACGTGGGTCACCTACCTATNAGACTGGTATCACTCCG 70
||||||||||||||| |||| |||||||||| |||||||||| ||||||| || ||||||
Sbjct 70 TTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTACCTATAAGACTGGAATAACTCCG 129
Query 71 GGAAACCGGGGCTAATGCCGGATAACATTTAGAACCGCGTGGTTCTCAAGTGAAGGATGG 130
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||| ||||||| |||||
Sbjct 130 GGAAACCGGGGCTAATGCCGGATAACATTTAGAACCGCATGGTTCTAAAGTGAAAGATGG 189
Query 131 TTTTGCTATCACTTATAGATGGACCCGCGCCGTATTAGCTAGTGGGGAGGG