Penapisan, Identifikasi, Uji Potensi Agens Hayati Bakteri Penghasil Ahl Laktonase Dan Ekspresinya Pada Escherichia Coli

PENAPISAN, IDENTIFIKASI, UJI POTENSI AGENS HAYATI
BAKTERI PENGHASIL AHL-LAKTONASE DAN
EKSPRESINYA PADA Escherichia coli

SYAIFUL KHOIRI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER
INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Penapisan, Identifikasi,
Uji Potensi Agens Hayati Bakteri Penghasil AHL-laktonase dan Ekspresinya pada
Escherichia coli adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing
dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi mana pun.
Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka di
bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.

Bogor, Juni 2016
Syaiful Khoiri
NIM A352130011

RINGKASAN
SYAIFUL KHOIRI. Penapisan, Identifikasi, Uji Potensi Agens Hayati Bakteri
Penghasil AHL-laktonase dan Ekspresinya pada Escherichia coli. Dibimbing oleh
GIYANTO dan TRI ASMIRA DAMAYANTI.
AHL-laktonase merupakan enzim pendegradasi N-acyl homoserine lactone
(AHL) dalam quorum sensing (QS). Degradasi AHL dapat mengacaukan
komunikasi antar sel bakteri patogen tumbuhan. Mekanisme ini disebut sebagai
quorum quenching (QQ). Mekanisme QQ dapat mencegah ekspresi faktor
virulensi bakteri patogen yang diekspresikan seperti enzim, toksin, dan
eksopolisakarida. AHL-laktonase dihasilkan oleh bakteri tertentu, namun di
Indonesia informasi tentang bakteri ini dan potensinya sebagai agens hayati belum
banyak dilaporkan. Sehingga penelitian ini bertujuan untuk menapis,
mengidentifikasi, mengkloning dan mengekspresikan gen aiiA penyandi AHLlaktonase pada Escherichia coli BL21 (DE3), serta menguji potensi agens hayati
bakteri penghasil AHL-laktonase sebagai anti-QS terhadap Chromobacterium

violaceum dan Dickeya dadantii.
Penapisan bakteri penghasil AHL-laktonase dilakukan dengan uji anti-QS,
antibiosis, dan deteksi gen aiiA dengan PCR menggunakan primer spesifik.
Identifikasi bakteri dilakukan dengan perunutan DNA gen 16S rRNA. Gen aiiA
dikloning pada plasmid pTZ57R/T dengan metode TA-kloning dan dirunut
sekuen nukleotidanya. Sekuen yang diperoleh dianalisis tingkat homologinya
terhadap gen aiiA yang ada di GenBank. Gen aiiA disubkloning ke dalam vektor
ekspresi pET-28a pada situs enzim restriksi BamHI dan SalI, kemudian
diekspresikan pada E. coli BL21 (DE3). Protein hasil ekspresi dianalisis dengan
sodium dedocyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Bobot
protein diperkirakan dengan perangkat lunak ExPaSy. Uji potensi agens hayati
bakteri penghasil AHL-laktonase dan E. coli BL21 (DE3) rekombinan gen aiiA
dilakukan terhadap bakteri penyebab penyakit busuk lunak D. dadantii.
Hasil penapisan diperoleh 21 dari 31 isolat bersifat anti-QS terhadap C.
violaceum, namun dua isolat bersifat antibiosis yakni isolat B13 dan EKK10.
Isolat yang bersifat anti-QS dan tidak bersifat antibiosis selanjutnya dideteksi
dengan primer spesifik gen aiiA penyandi AHL-laktonase. Hasil deteksi gen aiiA
diperoleh 4 dari 19 isolat tersebut memiliki gen aiiA. Keempat isolat bakteri
tersebut yaitu B37, GG3, GG6, dan BT2. Keempat isolat tersebut mampu
menekan virulensi D. dadantii dengan ditandai adanya penghambatan busuk lunak

pada anggrek dan kentang secara signifikan. Penghambatan tertinggi ditunjukkan
oleh isolat GG6 pada anggrek dengan tingkat hambatan relatif sebesar 55.2% dan
isolat BT2 pada kentang dengan tingkat hambatan relatif sebesar 36.7%.
Hasil perunutan DNA keempat isolat menunjukkan gen aiiA berukuran 753
pb. Analisis sekuen nukleotida gen aiiA dan asam amino AiiA menunjukkan
bahwa isolat B37 (aiiAB37/AiiAB37), GG3 (aiiAGG3/AiiAGG3), GG6
(aiiAGG6/AiiAGG6), dan BT2 (aiiABT2/AiiABT2) memiliki homologi yang tinggi
dengan sekuen gen aiiA dan AiiA yang telah terdeposit pada GenBank, serta
memiliki bagian asam amino terkonservasi yaitu 103SHLHFDH109 dan
166
TPGHSPGH173 yang merupakan ciri kelompok enzim metallo-beta-lactamase.

Struktur protein asam amino AiiA keempat isolat mempunyai kemiripan dengan
struktur protein tersier AHL-hidrolase. Bobot molekul protein keempat AiiA
berkisar 28.096-28.25 kDa. Analisis protein dengan SDS-PAGE menunjukkan
gen aiiA yang diekspresikan berukuran sekitar 32 kDa, yang terdiri dari fusi
protein berukuran 3.8 kDa dari plasmid pET-28a dan 28 kDa dari AiiA, namun
ekspresi proteinnya perlu dioptimasi lebih lanjut.
Gen aiiA yang diekspresikan pada E. coli BL21 (DE3) dengan IPTG 0.75
mM dan suhu inkubasi 37 oC terekspresi pada fraksi insoluble (pelet sel) dan tidak

terekspresi pada supernatan. E. coli BL21 (DE3) rekombinan aiiA mampu
menghambat QS yang lebih tinggi terhadap C. violaceum dengan diameter hambat
mencapai 34 mm dan mampu menekan virulensi D. dadantii pada kentang dengan
tingkat hambatan relatif yang lebih tinggi yakni mencapai 63.3%.
Hasil identifikasi berdasarkan sekuen gen 16S rRNA menunjukkan bahwa
isolat B37 mempunyai homologi tertinggi dengan Brevibacillus brevis strain
NBRC15304, isolat GG3 dan GG6 mempunyai homologi tertinggi dengan
Bacillus cereus ATCC14579, dan isolat BT2 mempunyai homologi tertinggi
dengan B. thuringiensis ATCC10792. B. brevis belum pernah dilaporkan
sebelumnya sebagai bakteri penghasil AHL-laktonase. Sekuen nukleotida dari
16S rRNA dan gen aiiA yang diperoleh dari penelitian ini telah didepositkan pada
DDJB/EMBL/GenBank database dengan nomor aksesi: LC055677, LC055679,
LC055680, LC055678, LC055758, LC05576, LC055761, dan LC055759.
Kemampuan bakteri penghasil AHL-laktonase dalam menekan virulensi D.
dadantii ini dapat menjadi infomasi tentang pemanfaatannya sebagai agens hayati.
Informasi tersebut menambah pengetahuan terkait mekanisme pengendalian
hayati selain antibiosis dan kompetisi. Hasil identifikasi bakteri-bakteri tersebut
dapat menambah informasi tentang keragaman isolat-isolat bakteri penghasil
AHL-laktonase. Selain itu, gen aiiA penyandi AHL-laktonase dapat digunakan
sebagai material genetik untuk produksi AHL-laktonase atau perakitan tanaman

yang tahan terhadap infeksi bakteri patogen tumbuhan.
Kata kunci: Bacillus, busuk lunak, gen aiiA, quorum quenching, quorum sensing

SUMMARY
SYAIFUL KHOIRI. Screening, Identification, Bio-agents Potensial Assay of
AHL-lactonase Producing Bacteria, and Its Expression in Escherichia coli.
Supervised by GIYANTO dan TRI ASMIRA DAMAYANTI.
AHL-lactonase is N-acyl homoserine lactone (AHL) degradative enzyme in
quorum sensing (QS). Degradation of AHL can confuse intercell communication
of bacterial pathogen which is known as quorum quenching (QQ) mechanism. QQ
mechanism prevent the expression of bacterial pathogens virulence factors
controlled by QS such as enzymes, toxins, and exopolisaccharides. AHLlactonase is produced by some bacteria, however the information related AHLlactonase producing bacteria and its biocontrol potential is still unexploited yet in
Indonesia. Thus, the research aimed to screen, identify, cloning and expression of
aiiA gene(s) encoding AHL-lactonase in Escherichia coli BL21 (DE3), and also
to test their biocontrol potential ability of AHL-lactonase producing bacteria as
anti-QS on Chromobacterium violaceum and Dickeya dadantii.
The screening of AHL lactonase-producing bacteria was conducted using
the anti-QS assay, antibiosis activity, and detection of aiiA gene encoding AHLlactonase by PCR using specific primer aiiA. Identification of bacteria was
conducted by DNA sequencing of 16S rRNA gene. The aiiA gene was clone into
TA-cloning vector pTZ57R/T and sequenced. The homology of aiiA nucleotide

sequences were analyzed in compare with aiiA sequence on GenBank database.
The aiiA gene was subclone into expression vector pET-28a on BamHI and SalI
restriction site and expressed in E. coli BL21 (DE3). The expressed protein was
analyzed by sodium dedocyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDSPAGE). The protein was predicted by ExPaSy software. The biocontrol of either
AHL-lactonase producing bacteria or E. coli BL21 (DE3) aiiA recombinant was
tested against soft rot pathogen D. dadantii.
The screening result showed that 21 among 31 tested isolates showed antiQS activity on C. violaceum, however 2 isolates namely B13 and EKK10 showed
antibiosis activity. Further, isolates with anti-QS and non antibiosis characters
were detected by PCR using specific primer of AHL-lactonase gene. Four among
19 isolates was positively having aiiA gene. Those isolates (in succession code
B37, GG3, GG6, and BT2) were having ability to suppress the virulence of D.
dadantii either on orchids or potato slices. It is indicate the potential of those
bacteria as biocontrol agents by anti-QS mechanism. GG6 and BT2 isolates
showed highest relative inhibition level on orchid and potato up to 55.2% and
36.7%, respectively.
Nucleotide sequences of aiiA gene of four these isolates sized 753 bp. The
aiiA gene and AiiA amino acid sequences of B37 (aiiAB37/AiiAB37), GG3
(aiiAGG3/AiiAGG3), GG6 (aiiAGG6/AiiAGG6), and BT2 (aiiABT2/AiiABT2) has
highest homology with corresponding genes deposited in GenBank database. The
structure of AiiA amino acid showed similarity with AHL-hidrolase conformation

structure. The characteristic of all four AiiA sequences also had conserved amino
acid region 103SHLHFDH109 and 166TPGHSPGH173 as typical character of
metallo-beta-lactamase enzyme group. Prediction molecular weight of AiiAB37,

AiiAGG3, AiiAGG6, and AiiABT2 ranged from 28.096 kDa - 28.25 kDa. Protein
analysis using SDS-PAGE showed that the expressed protein sized approximately
32 kDa, consisting of protein fusion of 3.8 kDa from pET-28a and 28 kDa from
AiiA gene. However, the expression of AHL-lactonase protein needs further
optimation.
The aiiA gene in E. coli BL21 (DE3) recombinant cultured at temperature
37 oC with IPTG concentration 0.75 mM expressed in insoluble fraction (pellet)
and not expressed in soluble fraction. The expressed E. coli BL21 (DE3)
recombinant bacteria can inhibit quorum sensing of C. violaceum up to 34 mm in
diameter. The recombinant able to suppressed the virulence of D. dadantii on
potatoes up to 63.3%.
Based on nucleotide sequences of 16S ribosomal RNA isolates B37 had
highest homology with Brevibacillus brevis strain NBRC15304, GG3 and GG6
isolates as Bacillus cereus ATCC14579 and BT2 isolate as B. thuringiensis
ATCC10792. B. brevis is never been reported as AHL-lactonase producing
bacteria. All nucleotide sequences obtained from these researches were deposited

on DDJB/EMBL/GenBank databases with accession number(s): LC055677,
LC055679, LC055680, LC055678, LC055758, LC05576, LC055761, and
LC055759.
The ability of AHL-producing bacteria to suppress virulence of D. dadantii
will be used as information about their potential as a biological control. These
information gave knowledge on biological control mechanisms, other than
antibiosis and competition. The results of the identification of these bacteria added
information about the diversity of AHL-lactonase producing bacteria. In addition,
aiiA genes encoding AHL-lactonase can be used as material genetic for the
production of AHL-lactonase or genetic engineering of plants that are resistant
from plant pathogenic bacteria infection.
Key words: aiiA gene, Bacillus, quorum quenching, quorum sensing, soft rot

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan

IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

PENAPISAN, IDENTIFIKASI, UJI POTENSI AGENS HAYATI
BAKTERI PENGHASIL AHL-LAKTONASE DAN
EKSPRESINYA PADA Escherichia coli

SYAIFUL KHOIRI

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Fitopatologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Ir Kikin Hamzah Mutaqin, MSi

Judul Tesis : Penapisan, Identifikasi, Uji Potensi Agens Hayati Bakteri
Penghasil AHL-laktonase dan Ekspresinya pada Escherichia coli
Nama
: Syaiful Khoiri
NIM
: A352130011

Disetujui oleh

Komisi Pembimbing

Dr Ir Giyanto, MSi
Ketua

Dr Ir Tri Asmira Damayanti, MAgr
Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi Fitopatologi

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof Dr Ir Sri Hendrastuti Hidayat, MSc

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian: 13 April 2016

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah
melimpahkan rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan
tugas akhir dengan judul Penapisan, Identifikasi, Uji Potensi Agens Hayati
Bakteri Penghasil AHL-laktonase dan Ekspresinya pada Escherichia coli yang
dilaksanakan pada bulan Oktober 2014 sampai Maret 2016 di Laboratorium
Bakteriologi Tumbuhan dan Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen
Proteksi Tanaman, Institut Pertanian Bogor.
Penulis menyampaikan terima kasih kepada Direktorat Jenderal Pendidikan
Tinggi (DIKTI) yang telah memberikan beasiswa pendidikan pascasarjana dalam
negeri (BPPDN) tahun 2013. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr Ir
Giyanto, MSi dan Dr Ir Tri Asmira Damayanti, MAgr selaku komisi pembimbing,
Dr Ir Kikin Hamzah Mutaqin, MSi sebagai penguji luar komisi pada ujian tesis,
dan Prof Dr Ir Sri Hendrastuti Hidayat, MSc selaku ketua program studi
Fitopatologi yang telah memberikan bimbingan, arahan, kritik dan saran yang
sangat bermanfaat dalam penyusunan tesis ini. Penulis juga menyampaikan terima
kasih kepada istri dan anak tercinta: Dita Megasari dan Nayaka Amirul Khoiri,
kepada orang tua: Bapak Yusuf, Ibu Khuzaemah (alm.), Ibu Muslimah, Bapak
Suprijanto dan Ibu Dyah Wiyati, serta saudara Eny Laili dan Diyan Maharani
yang telah memberikan dukungan moral dan material sehingga penulis dapat
menyelesaikan tugas akhir ini. Ucapan terima kasih tidak lupa penulis sampaikan
kepada rekan-rekan Fitopatologi 2013, rekan-rekan Laboratorium Bakteriologi
Tumbuhan dan Laboratorium Virologi Tumbuhan, serta semua pihak yang telah
membantu dalam penelitian ini.
Semoga karya ilmiah ini dapat menambah informasi dalam ilmu
pengetahuan dan bermanfaat bagi masyarakat. Penulis menyadari masih banyak
kekurangan dalam penulisan karya ilmiah ini. Kritik dan saran sangat penulis
harapkan untuk perbaikan penelitian dan penyusunan karya ilmiah berikutnya.

Bogor, Juni 2016
Syaiful Khoiri

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
xvii
DAFTAR GAMBAR
xvii
DAFTAR LAMPIRAN
xviii
1 PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Rumusan Masalah
2
Ruang Lingkup Penelitian
3
Tujuan Penelitian
4
Manfaat Penelitian
4
Hipotesis
4
2 TINJAUAN PUSTAKA
5
Quorum Sensing pada Bakteri Patogen Tumbuhan
5
Virulensi Bakteri Patogen Tumbuhan Dikendalikan oleh QS
6
Dickeya dadantii sebagai Bakteri Patogen Tumbuhan
6
AHL-laktonase sebagai Anti-QS (quencher)
7
Identifikasi Bakteri berdasarkan Sekuen Gen 16S ribosomal RNA
8
Biologi Molekuler dalam Proteksi Tanaman: Kloning dan Ekspresi
Gen
10
3 BAHAN DAN METODE
12
Waktu dan Tempat Penelitian
12
Bahan dan Alat
12
Penapisan Bakteri Penghasil AHL-laktonase
12
Identifikasi Bakteri berdasarkan Analisis Kesejajaran Urutan
Nukleotida Gen 16S rRNA
13
Uji Keefektifan Bakteri Penghasil AHL-laktonase dalam Menghambat
Virulensi Bakteri D. dadantii
14
Kloning dan Analisis Sekuen Gen aiiA Penyandi AHL-laktonase
15
Sub-kloning dan Ekspresi Gen aiiA pada E. coli BL21 (DE3)
15
Analisis Protein AHL-laktonase dengan SDS-PAGE
17
Analisis fungsional E. coli BL21 (DE3) rekombinan pET-28a::aiiA
18
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
20
Penapisan Bakteri Penghasil AHL-laktonase
20
Identifikasi Bakteri Penghasil AHL-laktonase
21
Uji Virulensi D. dadantii pada Anggrek dan Kentang
23
Uji Potensi AHL-laktonase sebagai Penghambat Virulensi D. dadantii
secara In-vivo
23
Kloning dan Analisis gen aiiA
24
Sub-kloning dan Ekspresi Gen aiiA Penyandi AHL-laktonase pada E.
coli BL21 (DE3)
27
Analisis Protein dan Pendugaan Struktur Protein AHL-laktonase
(AiiA)
29
Aktivitas Enzim AHL-laktonase dan Potensinya dalam Menghambat
Virulensi D. dadantii
32

5 PEMBAHASAN UMUM
6 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
RIWAYAT HIDUP

35
37
37
37
38
45
68

DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5
6
7
8
9

Quorum sensing pada bakteri Gram negatif patogen tumbuhan
Beberapa bakteri penghasil AHL-laktonase dan gen penyandinya
Primer-primer yang dapat digunakan dalam amplifikasi gen 16S
rRNA
Komposisi bahan yang digunakan dalam SDS-PAGE
Homologi sekuen gen 16S rRNA isolat B37, GG3, GG6, dan BT2
dengan sekuen 16S rRNA pada GenBank
Analisis homologi sekuen gen aiiA
Analisis homologi sekuen asam amino AiiA
Diameter zona hambat ekspresi violacein C. violaceum oleh E. coli
BL21 (DE3) rekombinan gen aiiA
Tingkat hambatan relatif (THR) E. coli BL21 (DE3) rekombinan gen
aiiA terhadap perkembangan busuk lunak pada kentang yang
disebabkan D. dadantii

6
8
9
18
22
26
26
33

34

DAFTAR GAMBAR
1

2
3
4
5
6
7
8
9
10

11

12

13

Alur pelaksanaan penelitian “Penapisan, Identifikasi, Uji Potensi
Agens Hayati Bakteri Penghasil AHL-laktonase dan Ekspresinya
pada Escherichia coli”
Molekul AHL sebagai molekul sinyal utama dalam QS bakteri Gram
negatif
Mekanisme degradasi AHL oleh AHL-laktonase
Peta bagian terkonservasi (berwarna ungu) dan bagian bervariasi
(V1-V9) pada 16S rRNA
Peta plasmid pTZ57R/T yang digunakan sebagai vektor kloning
Peta plasmid pET-28a yang digunakan sebagai vektor ekspresi
Hasil uji anti-QS dan antibiosis bakteri uji terhadap C. violaceum
Visualisasi DNA hasil amplifikasi gen aiiA dari beberapa isolat yang
diduga menghasilkan AHL-laktonase
Gejala busuk lunak hasil uji virulensi D. dadantii pada anggrek (A)
dan kentang (B) 48 jam setelah inokulasi
Aktivitas penghambatan dan persentase penghambatan relatif busuk
lunak oleh bakteri penghasil AHL-laktonase pada anggrek (A) dan
kentang (B)
Seleksi biru-putih hasil TA-kloning pTZ57R/T::aiiA pada E. coli
DH5α pada media LB agar yang mengandung ampisilin, IPTG, dan
X-gal
Visualisasi pita DNA hasil PCR koloni E. coli DH5α rekombinan
yang telah ditransformasi dengan plasmid pTZ57R/T::aiiA hasil TAkloning
Penyejajaran dua bagian terkonservasi AiiA isolat yang diperoleh
(AiiAB37, AiiAGG3, AiiAGG6, AiiABT2) dibandingkan dengan AiiABS1
dari B. subtilis BS1 (DQ000640)

3
5
8
9
10
11
20
21
23

24

25

25

27

14

15
16

17

18
19

20

21
22

Visualisasi pita DNA hasil restriksi plasmid pET-28a dan
pTZ57R/T::aiiA yang dipotong menggunakan enzmim BamHI dan
SalI
Hasil transformasi plasmid vektor ekpresi pada E. coli BL21 (DE3)
Visualisasi pita DNA hasil PCR koloni E. coli BL21 (DE3)
rekombinan yang telah ditransformasi dengan plasmid pET-28a::aiiA
menggunakan primer aiiA1 dan aiiA2
Visualisasi pita DNA hasil PCR koloni E. coli BL21 (DE3) yang
telah ditransformasi dengan plasmid pET-28a::aiiA menggunakan
primer T7 promotor dan T7 terminator
Struktur protein tersier AHL-laktonase berdasarkan urutan asam
amino gen aiiA yang dibuat dengan perangkat lunak Swiss model
Ekspektasi fusi protein pET-28a ( ) dengan gen aiiA ( ) yang
terekspresi dari kodon start (ATG) pada pET-28a hingga kodon stop
pada gen aiiA (TAG) (A) dan hasil analisis translasi sekuen pET28a::aiiAB37 (B)
Hasil analisis protein AHL-laktonase dengan SDS-PAGE dari E. coli
BL21 (DE3) rekombinan gen aiiA dengan 0.75 µM IPTG pada suhu
37 oC
Pengujian ekspresi AHL-laktonase pada E. coli BL21 (DE3) terhadap
QS C. violaceum
Penekanan virulensi D. dadantii penyebab busuk lunak oleh E. coli
BL21 (DE3) rekombinan gen aiiA

27
28

29

29
30

31

32
33
34

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13

Daftar isolat bakteri yang digunakan dalam penapisan bakteri
penghasil AHL-laktonase
Aktivitas degradasi AHL pada C. violaceum ditandai adanya zona
hambat ungu
Pengujian antibiosis dalam penapisan bakteri penghasil AHLlaktonase
Sekuen gen 16S rRNA isolat B37 yang telah didepositkan di DDBJ
Sekuen gen 16S rRNA isolat GG3 yang telah didepositkan di DDBJ
Sekuen gen 16S rRNA isolat GG6 yang telah didepositkan di DDBJ
Sekuen gen 16S rRNA isolat BT2 yang telah didepositkan di DDBJ
Homologi sekuen 16S rRNA isolat B37 dengan Brevibacillus brevis
Homologi sekuen 16S rRNA isolat GG3 dengan Bacillus cereus
Homologi sekuen 16S rRNA isolat GG6 dengan B. cereus
Homologi sekuen 16S rRNA isolat BT2 dengan B. thuringiensis
Pengaruh perlakuan terhadap perkembangan gejala busuk lunak yang
disebabkan oleh D. dadantii pada kentang dan anggrek(1)
Sidik ragam data penekanan busuk lunak yang disebabkan D.
dadantii oleh bakteri penghasil AHL-laktonase pada anggrek dengan
α=5%

46
47
47
48
49
50
51
52
53
54
55
57

57

14

15

16

17
18
19
20
21
22
23
24
25

Sidik ragam data penghambatan relatif busuk lunak yang disebabkan
D. dadantii oleh bakteri penghasil AHL-laktonase pada anggrek
dengan α=5%
Sidik ragam data penekanan busuk lunak yang disebabkan D.
dadantii oleh bakteri penghasil AHL-laktonase pada kentang dengan
α=5%
Sidik ragam data penekanan busuk lunak yang disebabkan D.
dadantii oleh bakteri penghasil AHL-laktonase pada kentang dengan
α=5%
Sekuen gen aiiA dari isolat B37 yang telah didepositkan di DDBJ
Sekuen gen aiiA dari isolat GG3 yang telah didepositkan di DDBJ
Sekuen gen aiiA dari isolat GG6 yang telah didepositkan di DDBJ
Sekuen gen aiiA dari isolat BT2 yang telah didepositkan di DDBJ
Kesejajaran sekuen gen aiiA hasil sekuensing dari isolat B37, GG3,
GG6, dan BT2
Analisis homologi asam amino AiiA dari isolat B37, GG3, GG6, dan
BT2
Sidik ragam data diameter zona hambat violacein C. violaceum oleh
E. coli BL21 (DE3) rekombinan gen aiiA setelah 24 jam dan 48 jam
Sidik ragam diameter busuk lunak pada kentang oleh E. coli BL21
(DE3) rekombinan gen aiiA setelah 24 jam dan 48 jam
Sidik ragam tingkat hambatan relatif busuk lunak pada kentang oleh
E. coli BL21 (DE3) rekombinan gen aiiA setelah 24 jam dan 48 jam

57

58

58
59
60
61
62
63
64
65
66
67

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Bakteri patogen tumbuhan merupakan salah satu jenis patogen penting
penyebab penyakit pada tumbuhan. Bakteri patogen tumbuhan terdiri atas
mollicutes, bakteri Gram positif, dan bakteri Gram negatif. Bakteri Gram negatif
merupakan kelompok terbanyak penyebab penyakit tumbuhan, diantaranya genus
Ralstonia, Xanthomonas, Agrobacterium, Erwinia, Pantoea, Pseudomonas,
Bucholderia, Acidovorax, Xylophilus, Xylella, dan Rhizomonas (Schaad et al.
2001). Faktor virulensi bakteri patogen tumbuhan yaitu enzim, toksin, dan
eksopolisakarida (Prasannath 2013). Ekspresi faktor virulensi bakteri patogen
tumbuhan dikendalikan oleh mekanisme quorum sensing (QS).
QS merupakan mekanisme komunikasi antar sel bakteri Gram negatif pada
level populasi tertentu yang diinduksi oleh molekul sinyal N-acyl homoserine
lactone (AHL). AHL dengan konsentrasi yang tinggi dapat mengaktifkan
transkripsi atau meregulasi protein regulator untuk menginduksi atau menekan
ekspresi gen tertentu. QS terlibat dalam fungsi penting biologi, seperti
luminescens, produksi antibiotik, transfer plasmid, motilitas, pembentukan biofilm,
virulensi, dan regulasi ekspresi gen terkait patogenesis (De Kievit & Iglewski
2000). AHL telah diketahui berperan dalam aktivasi faktor virulensi bakteri
patogen tumbuhan melalui mekanisme QS. Beberapa contoh bakteri yang
mengekspresikan faktor virulensi melalui sistem QS diantaranya Xanthomonas
campestris, Ralstonia solanacearum, Pseudomonas aeruginosa, Pectobacterium
antrosepticum, Pantoea stewartii dan kelompok Erwinia (Von Bodman & Farrand
1995; Barber et al. 1997; Dong et al. 2000; Conway & Greenberg 2002; Burr et al.
2006).
Pengendalian hayati bakteri patogen tumbuhan meliputi beberapa
mekanisme diantaranya yaitu antibiosis, kompetisi, dan penghambatan mekanisme
virulensi. Penghambatan virulensi salah satunya dapat dilakukan dengan
mengganggu sistem QS. Terkait hal tersebut pada beberapa penelitian telah
melaporkan bahwa AHL dapat terdegradasi oleh enzim. Enzim pendegradasi AHL
telah diidentifikasi dari beberapa bakteri dan memiliki kemampuan sebagai antiQS, salah satunya yaitu acyl homoserine lactone-lactonase (AHL-laktonase) (Yin
et al. 2010). AHL-laktonase merupakan metallo-beta-lactamase (metalloenzyme)
yang menon-aktifkan AHL dengan mendegradasi cincin ester laktone pada AHL.
Degradasi cincin laktone tersebut dapat mencegah pengenalan oleh protein
regulator sehingga menghambat mekanisme QS. Proses penghambatan QS
dikenal dengan mekanisme quorum quenching (QQ) (Dong et al. 2001). Enzim
AHL-laktonase dikodekan oleh gen tertentu, seperti aiiA yang ditemukan pada
Bacillus spp., B. weihenstephanensis strain P65 (Dong et al. 2000; Sakr et al.
2013).
Potensi pemanfaatan AHL-laktonase sebagai salah satu alternatif
pengendalian bakteri patogen yang lebih aman dan tidak menimbulkan resistensi
dibandingkan dengan penggunaan antibiotik. Penggunaan antibiotik terus menerus
dapat menyebabkan munculnya generasi patogen yang lebih resisten terhadap
antibiotik karena adanya tekanan seleksi (White & Finan 2009). Beberapa
penelitian telah melaporkan keefektifan AHL-laktonase dalam menekan virulensi

2
bakteri patogen, diantaranya yaitu kemampuan menekan virulensi Erwinia
carotovora, Pseudomonas aureginosa, dan Aeromonas hydrophila (Bainton et al.
1992; Dong & Zhang 2005; Zhang et al. 2007; Chen et al. 2010).
Proses seleksi bakteri penghasil AHL-laktonase dapat dilakukan dengan
menggunakan Chromobacterium violaceum karena bakteri ini diketahui
menghasilkan violacein yang berwarna ungu melalui mekanisme QS (McClean et
al. 1997). Bakteri patogen tumbuhan yang digunakan sebagai bakteri uji adalah
Dickeya dadantii (syn. Erwinia chrysanthemi). D. dadantii merupakan salah satu
patogen pektinolitik penyebab penyakit busuk lunak. Kisaran inang sangat luas
seperti kentang, anggrek, wortel, bawang putih, ubi jalar, dan lain-lain
(Perombelon & Kelman 1980; Ma et al. 2007). Di Indonesia, penyebaran D.
dadantii masih terbatas, dan termasuk kelompok patogen karantina golongan A2
(Kementan 2011). Tahun 2012 D. dadantii dilaporkan menyebabkan penyakit
busuk lunak pada anggrek di Jakarta dan Jawa Barat dengan kejadian penyakit
mencapai 100% dan keparahan mencapai 95.15% (Muharam et al. 2012). Pada
tahun 2015, Kementan menggolongkan D. dadantii ke dalam OPTK A1
(Kementan 2015), karena hasil karakterisasi bakteri penyebab busuk lunak pada
kentang yang ada di Indonesia berbeda dengan D. dadantii (Haerani et al. 2015).
D. dadantii diketahui mengekspresikan pektat lyase sebagai faktor virulensi
melalui mekanisme QS dengan 3-oxo-C6HSL atau C6HSL sebagai sinyal yang
berinteraksi dengan ExpI/ExpR sebagai protein regulator (Nasser et al. 1998).
Dalam bidang proteksi tanaman, agens hayati yang digunakan umumnya
bersifat antibiosis dan kompetisi sedangkan penghambatan QS belum banyak
dilaporkan. Perlu dilakukan penelitian untuk menyeleksi, mengidentifikasi, dan
menguji kemampuan bakteri penghasil laktonase sebagai agens hayati dalam
menghambat ekspresi virulensi bakteri patogen tumbuhan D. dadantii, serta
kloning dan ekspresi gen penyandi AHL-laktonase.
Rumusan Masalah
Bakteri patogen tumbuhan kelompok Gram negatif umumnya memiliki
sistem QS dalam memantau kerapatan populasi dan mensintesis protein dari gen
tertentu termasuk faktor virulensi. QS diregulasi oleh molekul AHL. Beberapa
penelitian telah dilakukan dan diketahui mampu mendegradasi AHL, salah
satunya yaitu AHL-laktonase. Degradasi AHL dapat mengganggu proses transfer
sinyal QS sehingga dapat menyebabkan ekspresi gen virulensi bakteri patogen
tumbuhan tidak terjadi. Berdasarkan informasi tersebut, maka perlu adanya
penelitian tentang bakteri penghasil AHL-laktonase, isolasi, ekspresi, analisis
sekuen gen penyandi AHL-laktonase, dan pengaruh penekanan terhadap virulensi
bakteri patogen tumbuhan. Pengujian aktivitas AHL-laktonase terhadap degradasi
AHL menggunakan D. dadantii sebagai model karena telah diketahui bahwa
faktor virulensi berupa enzim pectat lyase dikendalikan oleh sistem QS.

3
Ruang Lingkup Penelitian
Lingkup penelitian ini meliputi penapisan dan identifikasi isolat-isolat
bakteri penghasil AHL-laktonase, isolasi dan karakterisasi gen penyandi AHLlaktonase, kloning dan ekspresi gen AHL-laktonase, analisis protein AHLlaktonase dengan SDS-PAGE, serta uji penekanan virulensi D. dadantii oleh
AHL-laktonase. Adapun alur penelitian ini tersaji pada Gambar 1.

Peremajaan isolat bakteri koleksi





Penapisan bakteri penghasil AHL-laktonase:
Bioassay anti-QS
Bioassay antibiosis
Deteksi gen aiiA

Identifikasi bakteri penghasil AHL-laktonase berdasarkan homologi
sekuen 16S rRNA

Uji potensi AHL-laktonase sebagai anti-QS

Ekstrak kasar AHL-laktonase
dari supernatan bakteri penghasil
AHL-laktonase






Protein AHL-laktonase dari
Kloning dan ekspresi gen aiiA
pada E. coli BL21 (DE3)

Diperoleh isolat bakteri penghasil AHL-laktonase
Diperoleh gen penyandi AHL-laktonase dan runutan sekuennya
Informasi potensi penghambatan virulensi oleh AHL-laktonase
Publikasi ilmiah
= persiapan

Gambar 1

= proses

= tujuan akhir

Alur pelaksanaan penelitian “Penapisan, Identifikasi, Uji Potensi
Agens Hayati Bakteri Penghasil AHL-laktonase dan Ekspresinya
pada Escherichia coli”

4
Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini yaitu:
1) Memperoleh isolat dan identitas bakteri penghasil AHL-laktonase.
2) Memperoleh gen penyandi AHL-laktonase dan hasil analisis sekuen
nukelotidanya.
3) Mengetahui tingkat penekanan AHL-laktonase terhadap virulensi D. dadantii.
Manfaat Penelitian
Manfaat penelitian ini diantaranya:
1) Diperoleh isolat-isolat bakteri penghasil AHL-laktonase.
2) Diperoleh gen dan hasil analisis sekuen nukleotida gen penyandi AHLlaktonase.
3) Diperoleh informasi tentang kemampuan penekanan virulensi bakteri patogen
tumbuhan oleh AHL-laktonase.
Hipotesis
1)
2)
3)
4)

Hipotesis penelitian ini yaitu:
Terdapat keanekaragaman bakteri-bakteri penghasil AHL-laktonase.
Gen penyandi AHL-laktonase dari isolat-isolat uji dapat diamplifikasi dan
dianalisis sekuen nukleotidanya.
Kloning dan ekpresi gen penyandi AHL-laktonase dapat dilakukan pada E. coli
AHL-laktonase dapat menghambat QS dan menekan virulensi D. dadantii
penyebab busuk lunak.

5

2 TINJAUAN PUSTAKA
Quorum Sensing pada Bakteri Patogen Tumbuhan
Quorum sensing (QS) merupakan komunikasi antar sel untuk meningkatkan
atau menekan ekspresi gen dalam merespon fluktuasi kerapatan populasi sel. QS
pada bakteri menghasilkan dan melepaskan molekul sinyal kimia yang disebut
autoinducer yang meningkat seiring peningkatan kerapatan populasi sel (Kaplan
& Greenberg 1985). Beberapa penelitian melaporkan bahwa terdapat ambang
batas minimal konsentrasi autoinducer yang dapat memicu ekspresi gen tertentu.
Bakteri Gram positif dan Gram negatif menggunakan QS untuk meregulasi
aktifitas fisiologi tertentu, diantaranya simbiosis, virulensi, kompetensi, konjugasi,
produksi antibiotik, motilitas, sporulasi, dan pembentukan biofilm. Umumnya
bakteri Gram negatif menggunakan N-acylated homoserine lactone (AHL)
sebagai autoinducer, sedangkan bakteri Gram positif menggunakan oligo-peptida.
Namun demikian secara alami sinyal kimia, mekanisme penyampaian sinyal, dan
gen target yang dikendalikan sistem QS berbeda untuk tiap spesies (Miller &
Bassler 2001).
Sistem QS yang menggunakan AHL sebagai autoinducer telah dipelajari
dari banyak bakteri Gram negatif, diantaranya yaitu pada genus Agrobacterium,
Aeromonas, Burkholderia, Chromobacterium, Citrobacter, Enterobacter, Erwinia,
Hafnia, Nitrosomonas, Obesumbacterium, Pantoea, Pseudomonas, Rahnella,
Ralstonia, Rhodobacter, Rhizobium, Serratia, Vibrio, Xenorhabdus, dan Yersinia.
Diantara bakteri Gram negatif tersebut, banyak studi sistem QS merupakan sistem
homologi LuxR-LuxI dan kesamaan sinyal molekulnya adalah N-acyl homoserine
lactone (AHL), dan pertama dipelajari pada bakteri Vibrio fischeri (Kempner &
Hanson 1968)
Mayoritas sistem QS pada bakteri Gram negatif memanfaatkan AHL
sebagai molekul sinyal. Saat konsentrasi cukup tingi, molekul AHL dapat
mengikat dan mengaktifkan aktivator transkripsi, atau R protein yang
menginduksi ekspresi gen target. Meskipun R protein sangat sensitif terhadap
kesesuaian AHL, namun sebagian R protein mampu merespon beberapa molekul
AHL atau AHL turunan dengan konsentrasi tinggi untuk aktivasi (De Kievit &
Iglewski 2000). Molekul AHL terdiri atas cincin laktone dan rantai R-acyl
(Gambar 2).

Gambar 2 Molekul AHL sebagai molekul sinyal utama dalam QS bakteri Gram
negatif

6
Virulensi Bakteri Patogen Tumbuhan Dikendalikan oleh QS
Beberapa virulensi bakteri patogen tumbuhan telah diketahui melibatkan
sistem QS. Beberapa contoh yaitu Ralstonia solanacearum penyebab penyakit
layu menghasilkan 3-hydroxy-palmitic acid methyl ester sebagai molekul sinyal
yang bersamaan dengan AHL digunakan untuk meregulasi faktor virulensi
(Flavier et al. 1997a). Xanthomonas campestris sebagai patogen pada kubis
menghasilkan faktor ekstraseluler yang bersifat dapat berdifusi, namun senyawa
tersebut belum terkarakterisasi (Barber et al. 1997).
von Bodman et al. (2003) mengkaji mekanisme komplek dari QS pada
bakteri patogen tumbuhan yang mengontrol gen patogenisitas dan kolonisasi pada
permukaan inang. Regulasi oleh QS meliputi produksi ekstraseluler polisakarida,
enzim pendegradasi, antibiotik, siderofor, pigmen, protein Hrp, transfer Tiplasmid, motilitas, pembentukan biofilm, dan kemampuan epifit. Sejak diketahui
sistem regulasi QS dibutuhkan dalam patogenesis, gangguan pada sinyal QS
menjadi peluang dalam mengendalikan penyakit yang disebabkan oleh bakteri.
Beberapa bakteri penting patogen tumbuhan yang dikaji yaitu: A. tumefaciens, P.
stewartii, E. carotovora, R. solanacearum, P. syringae, P. aeruginosa, dan X.
campestris.
Beberapa contoh bakteri patogen tumbuhan kelompok Gram negatif yang
telah dilaporkan menghasilkan molekul AHL sebagai sinyal QS untuk meregulasi
faktor virulensi tersaji dalam Tabel 1.
Tabel 1 Quorum sensing pada bakteri Gram negatif patogen tumbuhan
Organisme

Molekul
Sinyal Utama

Protein
Regulator

A. tumefaciens

3-Oxo-C8-HSL TraI/TraR

E. carotovora
subsp. carotovora

3-Oxo-C6-HSL ExpI/ExpR
CarI/CarR

E. chrysanthemi

Pectat lyase

E. stewartii

3-Oxo-C6-HSL ExpI/ExpR
C6-HSL
3-Oxo-C6-HSL EsaI/EsaR

R. solanacearum

C8-HSL

Belum diketahui

P. antrosepticum

3-Oxo-C6-HSL ExpI/ExpR

SolI/SolR

Fenotip

Referensi

Konjugasi Tiplasmid
Eksoenzim
Carbapenem
Antibiotik

Piper et al.
(1993)
Bainton et al.
(1992);
Chhabra et
al. (1993)
Nasser et al.
(1998)
Von Bodman
& Farrand
(1995)
Flavier et al.
(1997b)
Burr et al.
(2006)

Eksopolisakarida
Faktor virulensi

Eksoenzim
Faktor virulensi

Dickeya dadantii sebagai Bakteri Patogen Tumbuhan
Dickea dadantii (syn. Erwinia chrysanthemi) merupakan kelompok bakteri
Gram negatif, berbentuk batang, dan termasuk ke dalam famili Enterobacteriaceae.
Secara taksonomi, D. dadantii sebelumnya merupakan kelompok genus Erwinia.
Erwinia dipisahkan kedalam beberapa kelompok yaitu pektinolitik “carotovora”,
berpigmen kuning “herbicola”, non-pektinolitik penyebab layu “amylovora”, dan

7
“atypical” Erwinia (Dye 1968; 1969). Berdasarkan kesamaan sekuen 16S rRNA,
Erwinia dibagi kedalam empat genus yaitu Pectobacterium, Pantoea, Erwinia,
dan Brenneria (Hauben et al. 1998). Menurut Schaad et al. (2001) taksonomi
Erwinia masih dapat berubah dan deskripsi tiap genus masih terbatas. Samson et
al. (2005) mengklasifikasi ulang E. chrysanthemi menjadi genus Dickeya. D.
dadantii berasal dari E. chrysanthemi biovar 3 (Elphinstone & Toth 2007). Secara
umum D. dadantii bersifat anaerob fakultatif, menghasilkan nitrat reduktase, motil,
sel berukuran 0.8-3.2x0.5-0.8 m dan mempunyai flagel tipe peritrichus. Di alam,
D. dadantii menyebabkan penyakit pada tumbuhan dengan gejala yang
ditimbulkan berupa nekrosis, hawar, atau busuk lunak yang ditandai dengan
maserasi jaringan. D. dadantii mengandung banyak pektinase yang mampu
melunakkan dan memecah material dinding sel. Bagian tumbuhan yang terpapar
enzim pektinolitik melepaskan nutrisi yang dimanfaatkan untuk pertumbuhan
bakteri. Beberapa tumbuhan yang terinfeksi diantaranya umbi kentang, buahbuahan, tanaman hias (Van Vaerenbergh et al. 2012) dan busuk hati pada nanas
(Kaneshiro et al. 2008).
D. dadantii menyebabkan penyakit busuk lunak pada banyak inang
termasuk beberapa tanaman penting secara ekonomi. D. dadantii lebih dikenal
dengan penyakit busuk lunak, busuk coklat, atau busuk hitam. Patogen ini berhasil
masuk ke dalam jaringan inang karena banyaknya pektinase yang digunakan
untuk mendegradasi dinding sel. Degradasi dinding sel menyebabkan kerusakan
struktur jaringan dan maserasi jaringan yang menunjukkan gejala seperti tersiram
air panas atau water soaked (Grenier et al. 2006).
Kemampuan ekspresi pektinase pada D. dadantii melibatkan sistem QS
yang melibatkan AHL. D. dadantii strain 3937 membuat tiga AHL yang berbeda
yaitu 3-oxo C6HL, C6HL, dan C10HL yang mengikat regulator gen expI dan expR.
Perusakan expI atau expR hanya mempunyai efek sangat sedikit dalam produksi
enzim pektolitik secara invitro, dibandingkan dengan tanpa adanya AHL. AHL
berperan sebagai sinyal dalam sistem QS untuk regulasi sintesis pektinase sebagai
faktor virulensi. Oleh karena itu, D. dadantii dijadikan model dalam mempelajari
sistem quorum sensing misalnya untuk pengujian senyawa atau enzim
pendegradasi AHL (Nasser et al. 1998).
AHL-laktonase sebagai Anti-QS (quencher)
Potensi degradasi sinyal QS dalam mikrobiologi penting dipelajari karena
beberapa alasan. Sejak AHL diketahui sebagai sinyal dalam mekanisme QS pada
banyak bakteri patogen tumbuhan, studi pengendalian dengan target AHL menjadi
bagian yang menarik dipelajari (Studier et al. 1990). Bakteri lain yang hidup pada
habitat yang sama dengan bakteri penghasil AHL akan mampu berkompetisi
dengan cara mendegradasai molekul sinyal AHL bakteri lain. Enzim yang
mendegradasi AHL dapat digunakan untuk memanipulasi sistem sinyal antar sel.
AHL diketahui stabil pada kondisi asam namun tidak stabil pada kondisi basa
(Yates et al. 2002). Sejak diketahui AHL stabil pada kondisi asam, degradasi
AHL mempunyai peranan penting pada lingkungan, seperti tanah. Dua tipe enzim
pendegradasi AHL telah dilaporkan, yaitu AHL-laktonase (Dong et al. 2001) dan
AHL-acylase (Lin et al. 2003). Senyawa penghambat QS disebut quencher.

8
Beberapa bakteri penghasil enzim pendegradasi AHL telah dilaporkan, seperti
tersaji pada Tabel 2 (Dong & Zhang 2005).
Tabel 2 Beberapa bakteri penghasil AHL-laktonase dan gen penyandinya
Spesies

Gen

Enzim

Bacillus sp. 240B1
B. thuringiensis
B. cereus
B. mycoides
B. antrachis
A.tumefaciens
Arthobacter sp. IBN110
Kleibsiella pneumonia
Variovorax paradoxus VAI-C
Ralstonia strain XJ12B
Pseudomonas strain PAI-A,
P. aureginosa PAO1

aiiA
aiiA
aiiA
aiiA
aiiA
aiiA
attM, aiiB
ahlD
ahlK
ND
aiiD

AHL-laktonase
AHL-laktonase
AHL-laktonase
AHL-laktonase
AHL-laktonase
AHL-laktonase
AHL-laktonase
AHL-laktonase
AHL-acylase
AHL-acylase
AHL-acylase

AHL-laktonase merupakan metallo-beta-lactamase (metalloenzim) yang
menginaktivasi AHL. Metalloenzim merupakan salah satu senyawa yang
mempunyai kofaktor besi. Mekanisme degradasi AHL oleh enzim AHL-laktonase
yaitu dengan memecah cincin ester pada ikatan cincin laktone dari AHL (Dong et
al. 2000; Leadbetter 2001; Czajkowski & Jafra 2009) (Gambar 3).
Salah satu contoh AHL-laktonase yang telah dideskripsikan dan
dikarakterisasi dengan baik adalah AiiA24B1 yang merupakan produk dari aiiA gen
dari Bacillus sp 24B1 (Dong et al. 2000). Pan et al. (2008) melaporkan AHLlaktonase yang diproduksi oleh Bacillus thuringiensis, B. cereus and B. anthracis,
spesifik menghidrolisis AHL yang disekresikan bakteri Gram negatif dan dapat
berpengaruh terhadap perkembangan penyakit yang disebabkan oleh bakteri
patogen.

Gambar 3 Mekanisme degradasi AHL oleh AHL-laktonase
Identifikasi Bakteri berdasarkan Sekuen Gen 16S ribosomal RNA
Ribosom merupakan organel sel yang digunakan untuk translasi protein.
Ribosom terdiri atas dua bagian utama, yaitu subunit ribosom besar (large subunit ribosome) dan sub-unit ribosom kecil (small sub-unit ribosome), yang
berikatan dengan asam amino. Masing-masing sub-unit terdiri atas satu atau lebih
molekul ribosomal RNA (rRNA) dan protein yang berbeda (Jones et al. 2003).

9
Prokariot (bakteria dan archaea) memiliki 70S ribosom, yang terdiri atas
subunit kecil 30S dan subunit besar 50S. Sub-unit kecil dikodekan oleh gen 16S
rRNA (1540 nukleotida). Gen 16S rRNA saat ini digunakan sebagai cara untuk
mengidentifikasi bakteri dengan beberapa alasan, diantaranya: (1) analisis
berdasarkan DNA organisme lebih terpercaya dibandingkan identifkasi
berdasarkan fenotip, (2) 16S rRNA spesifik untuk prokariot, (3) 16S rRNA
relative pendek sekitar 1.5 kb sehingga cepat dan dan murah dibandingkan dengan
gen lain, (4) gen 16S rRNA mempunyai bagian terkonservasi, daerah variasi, dan
tidak mudah mengalami perubahan, dan (5) banyak informasi sekuen gen 16S
rRNA yang telah didepositkan pada database untuk memudahkan pembandingan
(Smit et al. 2007; Mizrahi-Man et al. 2013; LBL 2016).
Perunutan nukleotida 16S rRNA sebagai metode identifikasi telah dilakukan
cukup lama, salah satunya oleh Woese (1987) untuk mempelajari evolusi bakteri.
Saat ini 16S rRNA digunakan sebagai penanda molekuler untuk prokariot. Gen
16S rRNA berukuran sekitar 1 500 pb. Meskipun semua prokariot mempunyai
gen 16S rRNA, namun gen 16S rRNA memiliki 9 bagian dengan urutan
nukleotida yang bervariasi (Gambar 4). Hal ini dapat digunakan sebagai dasar
pembeda antar spesies (Mitchell 2014).
5’

3’

Gambar 4 Peta bagian terkonservasi (berwarna ungu) dan bagian bervariasi
(V1-V9) pada 16S rRNA
Secara umum, pemanfaatan sekuen 16S rRNA dalam identifikasi spesies
menunjukkan hasil yang lebih tinggi dibandingkan identifikasi secara
konvensional. Keberhasilan identifikasi menggunakan sekuen 16S rRNA
dilaporkan dapat mengidentifikasi bakteri ingga 92% (Woo et al. 2008). Sekuen
16S rRNA mampu mengidentifikasi bakteri yang sulit diidentifikasi dengan
metode konvensional yakni mencapai >90% mampu mengidentifikasi hingga
genus dan 68-83% hingga spesies (Drancourt et al. 2000; Mignard & Flandrois
2006).
Amplifikasi gen 16S rRNA mudah dilakukan dengan sepasang primer dapat
mengamplifikasi secara penuh dari berbagai jenis bakteri (Weisburg et al. 1991).
Telah tersedia banyak primer yang dapat mengamplifikasi gen 16S rRNA.
Beberapa pasang primer tersaji pada Tabel 3.
Tabel 3 Primer-primer yang dapat digunakan dalam amplifikasi gen 16S rRNA
No. Primer

Urutan Nukleotida (5’-3’)

Referensi

1

AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG
AAG GAG GTG ATC CAG CC
AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG
GGT TAC CTT GTT ACG ACT T
TAA AAC TYA AAK GAA TTG ACG GG
ACT GCT GCS YCC CGT AGG AGT CT
AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG
GGT TAC CTT GTT ACG ACT T

Weisburg et al. (1991)

2
3
4

fD1
rD1
8F
U1492R
928F
336R
27F
1492R

Eden et al. (1991)
Weidner et al. (1996)
Jiang et al. (2006)

10
Biologi Molekuler dalam Proteksi Tanaman: Kloning dan Ekspresi Gen
Perkembangan teknologi rekayasa genetika dapat menjadi salah satu
pengembangan teknologi pengendalian penyakit tumbuhan. Rekayasa genetik
tanaman telah memberikan manfaat yang besar antara lain dengan dihasilkannya
varietas-varietas unggul tahan terhadap OPT melalui transfer gen atau tanaman
transgenik yang dikenal sebagai genetically modified organism (GMO),
contohnya GMO dengan menggunakan gen cryI mampu meningkatkan ketahanan
tanaman terhadap hama (Romeis et al. 2006), gen kitinase mampu meningkatkan
ketahanan tanaman terhadap cendawan (Neuhaus et al. 1991), dan komplemen
gen coat protein virus dengan teknologi RNAi mampu meningkatkan ketahanan
tanaman terhadap infeksi virus (Tenllado & Llave 2004).
Proses rekayasa genetik secara umum meliputi isolasi DNA, karakterisasi
DNA, penyambungan pada vektor pembawa, karakterisasi protein hasil ekspresi
gen, transformasi pada organisme sasaran, dan evaluasi ekspresi gen. Adapun
dasar-dasar pengetahuan tentang gen telah dijabarkan oleh banyak peneliti, salah
satunya Lewin (1983). Informasi tentang rekayasa genetik, meliputi teknik isolasi
DNA, isolasi plasmid, pemilihan vektor kloning, pemilihan vektor ekspresi,
pemilihan enzim restriksi, teknik ligase, dan transformasi gen mengacu pada
Sambrook & Russell (2001).
Saat ini perkembangan kit kloning sangat beragam, salah satunya adalah
pZT57R/T InsTAclone PCR Cloning Kit (Thermo Scientific). Plasmid pTZ57R/T
sebagai vektor kloning mempunyai kemampuan dalam ligasi dengan mekanisme
TA-cloning dengan cara plasmid pTZ57R/T meligasi 3’-ddT pada 3’-ddA
overhang di kedua sisi produk PCR. Seleksi hasil kloning E. coli rekombinan
dapat dilakukan dengan seleksi biru-putih pada media LB yang mengandung
isopropyl-β–D-thiogalactopyranoside (IPTG) dan 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-βD-galactopyranoside (X-gal) karena plasmid pTZ57R/T memiliki gen lacZ yang
dapat digunakan sebagai seleksi, serta dapat dikonfirmasi dengan PCR
menggunakan primer M13/pUC forward dan M13/pUC reverse (Gambar 5).

Gambar 5 Peta plasmid pTZ57R/T yang digunakan sebagai vektor kloning

11
Vektor ekspresi yang dipilih adalah plasmid pET-28a. pET-28a dipilih
karena mempunyai promotor T7, lac operator, thrombin site, ribosomal binding
site (rbs) dan banyak situs pemotongan enzim restriksi diantara situs kloning
(multiple cloning site/MCS), mempunyai gen resistensi kanamisin untuk seleksi,
dan kemampuan ekspresi yang tinggi dengan diinduksi IPTG (Gambar 6).
Promotor merupakan situs untuk mengawali transkripsi (the site for initiating
transcription) Lewin (1983).
Ekpresi gen pada plasmid pET-28a dilakukan dengan menggunakan E. coli
BL21 (DE3) (BioDynamic laboratory Inc.). E. coli BL21 (DE3) mempunyai
kemampuan ekspresi yang tinggi, diinduksi dengan IPTG. Di dalam genom E. coli
BL21 (DE3) terdapat non-native RNA polymerase (RNAP) yang dapat
mengontrol transkripsi DNA eksogenus. IPTG yang ditambahkan pada media
dalam ekspresi mengikat lac repressor. Contoh penggunaan pTZ57R/T dan E.
coli BL21 (DE3) berhasil dilakukan oleh Halami & Chandrashekar (2007) untuk
kloning dan ekspresi pediocin 6XHis-Xpress-PedA, sedangkan contoh
keberhasilan kloning dan ekspresi gen aiiA telah berhasil dilakukan dengan
menggunakan plasmid pPIC9 pada Pichia pastoris (Chen et al. 2010) dan
menggunakan plasmid pGEX pada E. coli BL21 (Pan et al. 2008).

Gambar 6 Peta plasmid pET-28a yang digunakan sebagai vektor ekspresi

12

3 BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan mulai Oktober 2014 hingga Maret 2016. Penelitian
ini dilakukan di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan dan Laboratorium Virologi
Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian
Bogor.
Bahan dan Alat
Bakteri yang digunakan dalam penelitian ini yaitu D. dadantii, C. violaceum,
Escherichia coli DH5α, E. coli BL21 (DE3) dan 31 isolat bakteri Gram positif
koleksi Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman,
Institut Pertanian Bogor, Indonesia (Lampiran 1). Plasmid yang digunakan yaitu
plasmid pTZ57R/T (InsTAclone Thermo Scientific), plasmid pET-28a (Novagen),
enzim restriksi BamHI dan SalI (Thermo Scientific), HiYield Gel/PCR fragment
extraction kit (Real Biotech corp.). Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen
laktonase yaitu primer forward aiiA1 5'-ATG ACA GTA AAR AAR CTT TAT
TTC-3' dan primer reverse aiiA2 5'-TCA CTA TAT ATA YTC MGG GAA CTC3 (Pan et al. 2008). Primer yang telah ditambah dengan enzim restriksi yaitu aiiAF1 5’-CGC GGA TCC ATG ACA GTA AAR AAR CTT TAT TTC-3 (nukleotida
yang digarisbawahi merupakan situs restriksi enzim BamHI) dan aiiA-R1, 5-AGC
GGT CGA CTC ACT ATA TAT AYT CMG GGA ACT C-3 (nukleotida yang
digarisbawahi merupakan situs restriksi enzim SalI). PCR koloni untuk
memperoleh sekuen gen aiiA lengkap digunakan primer forward M13 5’-GTA
AAA CGA CGG CCA GT-3’ dan primer reverse M13 5’-CAG GAA ACA GCT
ATG AC-3’. Identifikasi bakteri berdasarkan gen 16S rRNA. Amplifikasi gen 16S
rRNA menggunakan dua primer yaitu primer forward 27F 5′-AGA GTT TGA
TCC TGG CTC AG-3′ dan primer reverse 14λ2R 5’-GGT TAC CTT GTT ACG
ACT T-3’ (Jiang et al. 2006).
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu mesin PCR Thermocycle
(Applied Biosystem), spektrofotometer Spectronic 20D+ (Thermo Spectronic),
mesin sentrifugasi Micro 200R (Hettich Zentrifugen), mesin gel electrophoresis
(MyRun.NC), SDS-PAGE Electrophoresis (Biorad), dan UV-transilluminator
(Ultra.Lum).
Penapisan Bakteri Penghasil AHL-laktonase
Bio-assay aktivitas anti-QS terhadap C. violaceum
Pengujian ini dilakukan untuk melihat penghambatan ekspresi violacein dari
bakteri C. violaceum yang diinduksi oleh AHL. Pengujian dilakukan dengan
metode disc diffusion assay dengan teknik double layer culture plate sesuai Song
et al. (2012) dengan modifikasi. Media LB agar (1.5%) dituang pada cawan petri
steril dan didiamkan hingga mengeras, kemudian diatasnya dituang media LB
agar (0.5%) yang telah diinokulasi dengan C. violaceum 1% (v/v). Selanjutnya
kertas saring steril (diameter 6 mm) direndam dalam supernatan bakteri uji selama

13
20 detik kemudian diletakkan di permukaan agar. Supernatan bakteri uji diperoleh
dengan cara disentrifugasi 1.5 ml biakan bakteri pada kecepatan 12 000 rpm
selama 10 menit dan disaring menggunakan milipore 0.2 µm (Minisart, Sartorius
Stediem Biotech, Germany). Selanjutnya perlakuan diinkubasi pada suhu ruang
selama semalam. Penghambatan QS ditandai dengan adanya zona penghambatan
produksi violacein disekitar kertas saring. Zona penghambatan produksi violacein
ditunjukkan dengan tidak adanya warna ungu. Penghambatan QS terhadap C.
violaceum diukur berdasarkan diameter zona penghambatan produksi violacein
yang terbentuk.
Bio-assay aktivitas antibiosis terhadap C. violaceum
Pengujian antibiosis bertujuan untuk memastikan bahwa zona
penghambatan produksi violacein yang terbentuk pada pengujian anti-QS
terhad