Hubungan Kekerabatan Beberapa isolat Lentinus Asal Tropis Berdasarkan Sifat Mikroskopik Kultur dan Molekular
HUBUNGAN KEKERABATAN BEBERAPA ISOLAT Lentinus ASAL
TROPIS BERDASARKAN SIFAT MIKROSKOPIK KULTUR DAN
MOLEKULAR
MOCHAMAD YADI NURJAYADI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
HUBUNGAN KEKERABATAN BEBERAPA ISOLAT Lentinus ASAL
TROPIS BERDASARKAN SIFAT MIKROSKOPIK KULTUR DAN
MOLEKULAR
MOCHAMAD YADI NURJAYADI
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains
Pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
ABSTRAK
MOCHAMAD YADI NURJAYADI. HUBUNGAN KEKERABATAN BEBERAPA ISOLAT
Lentinus ASAL TROPIS BERDASARKAN SIFAT MIKROSKOPIK KULTUR DAN
MOLEKULAR. Dibimbing oleh LISDAR A MANAF dan DEDY DURYADI S.
Jamur Lentinus merupakan jamur pelapuk kayu yang berpotensi sebagai obat yang tersebar
di berbagai kawasan daerah tropis dan subtropis. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui
hubungan kekerabatan jamur Lentinus isolat tropis berdasarkan sifat mikroskopik kultur dan sifat
molekular. Sampel yang digunakan ialah Lentinus isolat LU3, LU10 (L. torulosus), LC4, LC6 (L.
cladopus), LSC1, LSC7 (L. Sajor-caju), LP9 (L. quarrosulus), dan HS serta JTP (Pleurotus).
Media yang digunakan adalah agar ekstrak malt pepton (AEMP) dan agar ekstrak malt (AEM)
pada suhu 35°C untuk isolat Lentinus dan ±29°C untuk isolat HS dan JTP. Struktur mikroskopik
kultur setiap isolat diamati setelah isolat berumur 2 dan 4 minggu. Analisis molekular dilakukan
dengan mengamplifikasi DNA berdasarkan metode PCR-RAPD dengan menggunakan 2 primer
acak tunggal 10-mer, yaitu RP1 dan RP3. Sifat mikroskopik kultur dan molekular dinyatakan ke
dalam data biner dan diolah dengan program MEGA 4.1. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa
beberapa isolat Lentinus yang ditumbuhkan pada media AEMP memiliki penampakan koloni yang
berbeda dengan penampakan koloni pada media AEM. Berdasarkan pohon kekerabatan
mikroskopik kultur dan molekular, isolat Pleurotus (JTP) berada di luar kelompok A (kelompok
Lentinus dan HS) sebagai out group. Kelompok A terbagi menjadi dua cabang yaitu HS dan
kelompok Lentinus (B, C, D). Berdasarkan sifat molekular kelompok Lentinus terdiri dari
kelompok B dengan nilai konsistensi (NK) 57% yang terdiri dari LP9 dan LSC1 (NK=89%) dan
kelompok C dengan NK 20%. Kelompok C terdiri dari LSC7 dan LC6 (NK=65%) dan kelompok
D dengan NK=45%. Kelompok D terdiri dari isolat LU10 dan isolat LC4 dan LU3 (NK=46%).
Hubungan kekerabatan Lentinus berdasarkan molekular belum spesifik sehingga perlu dianalisis
kembali dengan penambahan primer lain.
ABSTRACT
MOCHAMAD YADI NURJAYADI. PHYLOGENY RELATIONSHIP OF SEVERAL
TROPICAL Lentinus BASED ON MICROSCOPIC AND MOLECULAR CHARACTERS.
Supervised by LISDAR A MANAF and DEDY DURYADI S.
Lentinus mushroom is a wood rot fungi used as medicine and distributed in tropic and
subtropic regions. The research aimed to know the phylogeny relationship of tropical Lentinus
mushroom isolates based on culture microscopic and molecular characters. Isolates of Lentinus
that were used are LU3, LU10 (L. torulosus), LC4, LC6 (L. cladopus), LSC1, LSC7 (L. sajorcaju), and LP9 (L. squarrosulus), HS, and JTP (Pleurotus). Culture media were malt extract
peptone agar (MEPA) and malt extract agar (MEA) at 35°C for Lentinus isolates and ±29°C for
HS and JTP isolates. The culture microscopic structure of each isolate was observed at 2 and 4
weeks old of cultures. Molecular analysis carried out amplification of DNA with PCR-RAPD
method using two 10-mer single random primers, RP1 and RP3. The culture microscopic and
molecular characters were converted into biner data and analysis using MEGA 4.1 program. The
observation showed that the colony appearances of some Lentinus isolates on MEPA media were
different from those of MEA. Based on phylogenic tree of culture microscopic and molecular
characters, Pleurotus isolate (JTP) was separated from A group (Lentinus and HS) as out group. A
group was devided to two branches, HS isolate and Lentinus group (B, C, D). Based on molecular
analysis, Lentinus group included B group(consistency value, CV=57%) which devided LP9 and
LSC1 isolates (CV=89%) and C group (CV=20%). C Group were devided into LSC7 and LC6
(CV=65%) and D group (CV=45%). D group included LU10 isolate and LC4 and LU3 isolates
(CV=46%). Molecular relationship of Lentinus based on molecular analysis was not yet specific so
need to analyze detailed with added another primer.
Judul Skripsi : Hubungan Kekerabatan Beberapa isolat Lentinus Asal Tropis
Berdasarkan Sifat Mikroskopik Kultur dan Molekular
Nama
: Mochamad Yadi Nurjayadi
NIM
: G34104080
Menyetujui,
Pembimbing I
Pembimbing II
Dr. Ir. Lisdar A. Manaf
Dr. Ir. Dedy Duryadi S, DEA
NIP 19591018 198403 2 001
NIP 19561102 198403 1 003
Mengetahui :
Ketua Departemen,
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M. Si
NIP 19641002 198903 1 002
Tanggal Lulus :
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT, karena atas rahmat dan hidayah-Nya
penulis dapat menyelesaikan skripsi hasil penelitian ini. Penelitian yang berlangsung dari bulan
Oktober 2008 hingga Juni 2009 ini berjudul Hubungan Kekerabatan Beberapa Isolat Lentinus Asal
Tropis Berdasarkan Sifat Mikroskopik dan Molekular.
Terima kasih penulis sampaikan kepada ibu Dr. Ir. Lisdar A Manaf dan bapak Dr. Ir. Dedy
Duryadi Solihin, DEA selaku pembimbing atas bimbingan, saran dan arahan selama proses
penelitian dan penyelesaian skripsi ini. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada Dr. Nunik Sri
Ariyanti M.Si. selaku dosen penguji atas semua masukan yang telah diberikan.
Terima kasih juga penulis sampaikan kepada bapak Iwa K selaku teknisi Laboratorium
Mikrobiologi dan Biokimia dan Bapak Heri selaku teknisi Laboratorium Biologi Molekular
PPSHB IPB, dan kepada seluruh staf Departemen Biologi atas fasilitas, saran, dan bantuannya.
Penulis menyampaikan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada kedua orang tua dan
kakak-kakak tersayang atas segala doa, dukungan, dan kasih sayang. Terima kasih juga penulis
sampaikan kepada teman-teman biologi angkatan 41 khususnya anak-anak ”8” (Uma, Moris,
Andik, Pams, Kushi, Muza, Budi), Deny K, Tina, Iffa, Disti, Achied, Melput, Idha, Forhuman
(Romzie, Rizal, Ajeng, Nurul, Winda) dan anak-anak Lamin Dentis (Zein, Farid, Okoy, Bogie,
Awang, Dede) atas semua kebersamaan dan hari-hari indah yang telah dijalani. Tidak lupa penulis
juga manyampaikan terima kasih kepada ibu-ibu, bapak-bapak, dan mba-mba yang ada di
Laboratorium Biologi Molekular khususnya Mba Andri, Bu Septi, Bu Rossa, Bu Suri, dan Mba
Handay atas dukungan, nasihat, dan kebersamaannya.
Penulis menyadari bahwa laporan ini masih jauh dari sempurna. Oleh karena itu, kritik dan
saran yang membangun sangat diharapkan. Semoga laporan ini dapat bermanfaat.
Bogor, Desember 2009
Mochamad Yadi Nurjayadi
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan tanggal 12 Nopember 1986 di Cirebon, Jawa Barat. Anak kelima dari lima
bersaudara pasangan Bapak Iing Sanjaya dan Ibu Dasih.
Tahun 2004 penulis lulus dari SMUN 3 Cirebon dan pada tahun yang sama diterima di
Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor
melalui jalur SPMB (Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru).
Selama masa perkuliahan, penulis aktif berorganisasi di dalam maupun di luar kampus. Selain
itu, penulis juga aktif mengikuti berbagai kegiatan yang bersifat kerohanian, kewirausahaan,
pelatihan motivasi, dan latihan kepemimpinan. Tahun 2006 - 2009 penulis aktif menjadi asisten
praktikum, yaitu mata kuliah Pendidikan Agama Islam, Fisiologi Tumbuhan, Biologi Cendawan,
dan Biologi Dasar.
Penulis melaksanakan Praktik Lapangan pada tahun 2007 di PT Adijaya Guna Satwata,
sebuah perusahaan yang bergerak dibidang pengolahan udang, dengan judul Pengolahan Udang
IQF (Individually Quick frozen) di PT Adijaya Guna Satwatama, Cirebon. Penulis juga aktif dalam
melaksanakan penyuluhan budidaya jamur tiram dan jamur merang pada tahun 2007 dan 2008.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ................................................................................................................ viii
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................................. viii
DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................................... viii
PENDAHULUAN
Latar Belakang .................................................................................................................. 1
Tujuan ............................................................................................................................. 1
Waktu dan Tempat ........................................................................................................... 1
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat.................................................................................................................. 2
Metode Penelitian ............................................................................................................. 2
Pengamatan Struktur Koloni dan Mikroskopik ............................................................ 2
Perbanyakan Biakan Isolat ......................................................................................... 2
Perbanyakan Koloni dan Isolasi DNA ........................................................................ 2
Analisis PCR-RAPD .................................................................................................. 3
Analisis Molekular ...................................................................................................... 3
HASIL
Penampakan Koloni dan Sifat Mikroskopik Kultur ........................................................... 3
Analisis PCR-RAPD ......................................................................................................... 5
PEMBAHASAN
Penampakan Koloni dan Sifat Mikroskopik Kultur ........................................................... 6
Hubungan kekerabatan ...................................................................................................... 7
SIMPULAN .......................................................................................................................... 9
SARAN ................................................................................................................................. 9
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................................ 9
LAMPIRAN ......................................................................................................................... 11
DAFTAR TABEL
Halaman
1.
2.
Penampakan koloni isolat Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1, LSC7, LP9), HS,
dan Pleurotus (JTP) di media AEMP dan AEM ............................................................ 4
Sifat mikroskopik kultur isolat Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1, LSC7, LP9),
HS, dan Pleurotus (JTP) di media AEMP dan AEM pada minggu ke-2 dan 4................ 5
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1.
2.
3.
4.
Pohon kekerabatan isolat Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1, LSC7, LP9),
HS, dan Pleurotus (JTP) berdasarkan sifat mikroskopik kultur........................................
Hasil amplifikasi DNA isolat Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1, LSC7, LP9),
HS, dan Pleurotus (JTP) dengan metode PCR-RAPD dengan menggunakan primer
RP1 (a) dan RP3 (b).......................................................................................................
Pohon kekerabatan isolat Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1, LSC7, LP9),
HS,dan Pleurotus (JTP) berdasarkan sifat molekular.. ....................................................
Struktur mikroskopik: (a) hifa terwarnai isolat LP9, (b) sambungan apit isolat HS,
(c) artrospora isolat LU3, (d) hifa berdinding tebal dan tipis isolat LU10, (e) sel
gembung isolat LSC1, (f) ujung hifa gembung isolat LC4, (g) klamidospora isolat
LSC1, (h) konidia dan konidiofor isolat HS, (i) kristal isolat LC4 ...................................
4
6
6
8
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1.
2.
3.
4.
Komposisi media dalam satu liter...................................................................................
Penampakan koloni isolat Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1, LSC7, LP9),
HS, dan Pleurotus (JTP) pada media AEMP dan AEM ..................................................
Istilah penampakan koloni .............................................................................................
Bilangan biner berdasarkan keberadaan pita dalam primer RP1 dan RP3
pada isolat Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1, LSC7, LP9), HS, dan
Pleurotus (JTP) .............................................................................................................
12
13
15
16
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Jamur Lentinus seperti halnya Ganoderma,
Trametes, Polyporus, dan Fomes merupakan
salah satu jamur pelapuk kayu yang tersebar
di berbagai kawasan tropis dan subtropis.
Jamur
Lentinus
termasuk
kelas
Basidiomycetes, ordo Polyporales dengan
famili Lentinaceae yang memiliki tubuh buah
makroskopik dengan struktur liat dan kokoh
serta tahan lama (Sudirman 1995). Pada
umumnya jamur ini memiliki ciri-ciri sebagai
berikut: berbentuk seperti payung; berukuran
sedang; warna beragam; permukaan tudung
(pileus) halus, berbulu atau bersisik dengan
bagian tengah melengkung ke bawah
(depressed), berlekuk ke dalam (umbilicate);
tangkai pada umumnya tidak di tengah atau
eksentrik,
kadang-kadang
membentuk
beberapa cabang sehingga terlihat seperti
tandan; lamela rapat dan turun mencapai
tangkai (decurrent); spora berwarna putih
(Pegler dan Young 1983).
Beberapa
jenis
Lentinus
dapat
menghasilkan senyawa aktif yang dapat
menghambat patogen penyakit (antimikrob,
antibakteri, antifungi) dan berkhasiat sebagai
antikolesterol dan antihipertensi selain dapat
sebagai bahan pangan. Diantara jenis
Lentinus asal tropis yang telah diteliti adalah
L. cladopus, L. sajor-caju, L. squarrosulus,
dan L. torulosus (Sudirman 2005).
Untuk
melihat
morfologi
dan
perkembangan tubuh beberapa spesies
Lentinus yang diisolasi dari alam telah dicoba
ditumbuhkan pada substrat serbuk gergaji.
Dari hasil penelitian tersebut terlihat adanya
keragaman morfologi pada tubuh buah
dewasa, walaupun pada tubuh buah yang
belum dewasa tidak menunjukkan perbedaan
bentuk dan warna (Sudirman 1995).
Telaah fisiologi dapat dilakukan dengan
membandingkan
pertumbuhan
kultur
miselium pada berbagai kondisi lingkungan
dan melakukan uji reaksi oksidasi pada media
agar dalam menumbuhkan kultur. Rosa (1996)
telah melakukan uji sifat fisiologi pada isolatisolat Lentinus yang telah dikulturkan dari
alam yang meliputi LPM, LSC, LPT, LP, LU,
LCEL, dan LC. Hasil penelitian yang
diperoleh adalah seluruh isolat mampu
tumbuh optimal pada beberapa kondisi
lingkungan dan memiliki reaksi positif pada
uji oksidasi di media agar asam galat (AAG)
dan agar asam tanat (AAT). Sedangkan uji
pada asam tirosin (AT) menghasilkan reaksi
negatif. Kesamaan sifat fisiologi tersebut
kemudian dibagi menjadi tiga kelompok.
Kelompok yang pertama meliputi LPM, LSC,
dan LPT. Bagian kelompok kedua mencakup
isolat LP. Untuk kelompok ketiga terdiri dari
LU, LCEL, dan LC.
Keanekaragaman spesies dapat disebabkan
karena telah terjadi perubahan susunan
nukleotida penyusun DNA. Perubahan ini
dapat
mempengaruhi
fenotipe
suatu
organisme atau mempengaruhi reaksi individu
terhadap lingkungan tertentu. Secara umum
keanekaragaman genetik dari suatu populasi
dapat terjadi karena adanya mutasi,
rekombinasi, atau migrasi gen dari satu tempat
ke tempat lain (Pereira et al. 2008). Tingkat
kekerabatan genus Lentinus dapat dilakukan
baik berdasarkan kesamaan sifat morfologi
tubuh buah, sifat fisiologi, sifat mikroskopik
di media kultur maupun berdasarkan sifat
molekular.
Metode PCR-RAPD merupakan teknik
penanda molekular yang digunakan untuk
mempelajari keragaman genetik spesies.
Dasar analisis RAPD adalah menggunakan
mesin PCR yang mampu mengamplifikasi
sekuen DNA secara in vitro. Teknik ini
menggunakan sepasang primer random yang
masing-masing
berukuran
10
basa.
Penggunaan penanda RAPD relatif sederhana
dan mudah dalam hal preparasi. Teknik
RAPD memberikan hasil yang lebih cepat
dibandingkan dengan teknik molekular
lainnya. Teknik ini juga mampu menghasilkan
jumlah karakter yang relatif tidak terbatas,
sehingga sangat membantu untuk keperluan
analisis keanekaragaman organisme yang
tidak diketahui latar belakang genomnya.
Teknik RAPD sering digunakan untuk
membedakan organisme tingkat tinggi
(eucaryote) (Saunders dan Helen 1999).
Penelitian tentang kekerabatan Lentinus
isolat
tropis
belum
banyak
yang
melakukannya.
Berdasarkan
penelitian
terdahulu, Noverita (2005) telah melakukan
pengelompokkan isolat Pleurotus liar dan
domestik melalui sifat molekular dengan
metode PCR-RAPD. Pada penelitian tersebut
digunakan isolat Lentinus sebagai out group.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui
hubungan kekerabatan jamur Lentinus isolat
tropis berdasarkan struktur sifat kultur
mikroskopik dan sifat molekular.
Waktu dan Tempat
Penelitian
ini
dilaksanakan
di
Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia dan
Laboratorium Biologi dan Molekular Pusat
Penelitan
Sumberdaya
Hayati
dan
Bioteknologi IPB (PPSHB-IPB) kampus IPB
Dramaga, Bogor mulai bulan Oktober 2008
sampai dengan Juni 2009.
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Sampel yang digunakan ialah isolat
koleksi Dr. Ir. Lisdar A Manaf meliputi isolat
Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1,
LSC7, LP9), isolat HS, dan isolat Pleurotus
(JTP), media agar ekstrak malt pepton
(AEMP), media agar ekstrak malt (AEM),
media agar sukrosa kentang (ASK), ekstrak
malt pepton cair (EMPC) (Lampiran 1),
larutan KOH, larutan eosin 1%, larutan
purifikasi cetyltrimethylammonium bromide
(CTAB) buffer, gel agarosa 1.2%, etidium
bromida, 2 primer acak tunggal (RP-1, RP-3),
akuabides, larutan amplifikasi (Tris-HCl pH8,
KCl,
ethylenediaminetetraacetic
acid
(EDTA), dithiothreitol (DTT), gliserol,
MgCl2, dNTP, enzim Taq polymerase.
Alat yang digunakan adalah: cawan Petri,
Erlenmeyer 250 ml, gelas ukur, cord borer,
scalpel, pipet pastur, lampu spirtus, autoclaf,
laminar air flow, incubator, kertas saring
Whatman no 1, tabung Eppendorf, mesin
PCR,
alat
elektroforesis,
sinar
UV
transiluminator.
Me tode Pe nelitian
Pengamatan Penampakan Koloni dan
Sifat Mikroskopik Kultur. Kultur masingmasing isolat diamati penampakan dan sifat
kulturnya
secara mikroskopik setelah
ditumbuhkan di media AEM dan AMP.
Penampakan koloni diamati setelah umur
isolat berumur 6 hingga 7 hari. Sedangkan
sifat mikroskopik kultur diamati pada saat
isolat berumur 2 dan 4 minggu. Pengamatan
dilakukan dengan cara mengambil miselium
dan struktur koloni yang kemudian diletakkan
di atas preparat yang telah diberi larutan KOH
(Kalium hidroksida) dan larutan pewarna
eosin 1%.
Keberadaan sifat mikroskopik kultur
kemudian divisualisasikan ke dalam bentuk
pohon kekerabatan melalui program MEGA
4.1. Penampakan yang dilihat meliputi
sambungan apit, klamidospora, konidia, oidia,
basidia, basidiospora, seta, sel veskikular,
cabang stag-horn, hifa terwarnai larutan eosin,
hifa tidak terwarnai larutan eosin, hifa
incrusted, kristal, sel gembung, ujung hifa
gembung, dan hifa besar berdinding tipis.
Metode yang dilakukan berdasarkan angka
bilangan biner, yaitu angka 1 menunjukkan
ada struktur mikroskopik dan angka 0 tidak
ada. Selanjutnya dimasukkan ke dalam
program MEGA 4.1 metode parsimoni
maksimum.
Pe rbanyakan Biakan Isolat. Koloni
masing-masing isolat Lentinus diinokulasi
pada media AMP dengan teknik aseptik. Isolat
yang telah diinokulasi kemudian diinkubasi
pada suhu 35oC selama 7 hari. Pada hari
terakhir miselium akan menutupi seluruh
permukaan media cawan (Rosa 1996).
Pe rbanyakan Koloni dan Isolasi DNA.
Kultur yang sudah berumur 7 hari pada
AEMP, dipotong dengan cord borer steril
yang berdiameter 7 mm dan diambil dengan
menggunakan scalpel steril. Kemudian satu
inokulum diinokulasikan pada permukaan
larutan 100 ml media EMPC steril dalam
Erlenmeyer 250 mlI sebanyak dua ulangan
dan diinkubasikan pada suhu 35oC dalam
keadaan statik (Rosa 1996). Bila permukaan
medium telah dipenuhi oleh miselium jamur
maka miselium jamur dipanen dan dipisahkan
dari medium cair dengan kertas saring
Whatman No.1.
Solichin (2004) melaporkan bahwa isolasi
DNA jamur dapat dilakukan dengan cara
mengambil miselium yang telah disaring
sebanyak 1 gram lalu digerus di dalam mortar
dengan ditambah larutan purifikasi CTAB
buffer (2% CTAB, 100 mM Tris HCl pH8,
1.4 M NaCl, 1% Polyvinilpirolidone, 0.2%
beta-mercaptoethanol) sebanyak 500 µl dalam
tabung Eppendorf dan diinkubasi pada suhu
65°C selama 3 jam. Kemudian sampel
ditambah 500 µl larutan fenol dan diayun
berputar secara rotasi selama 20 menit lalu
disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm
selama 3 menit. Setelah terbentuk endapan,
supernatan dipindahkan ke tabung Eppendorf
baru dan ditambah 500 µl larutan CIAA
(chloroform isoamil alcohol). Sampel diayun
berputar rotasi kembali selama 20 menit dan
disentrifugasi kembali dengan kecepatan
13000 rpm selama 3 menit. Di dalam tabung
akan terbentuk dua lapisan larutan. Bagian
atas merupakan lapisan CIAA dengan larutan
berwarna bening dan bagian bawah berwarna
agak keruh yang merupakan larutan yang
mengandung DNA. Bagian lapisan bawah
dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf baru
dan ditambah 100 µl sodium buffer. Sampel
diinkubasi pada suhu 65°C selama 15 menit.
Setelah itu, sampel ditambah 100 µl sodium
atau kalium asetat. Lalu sampel ditambah
HUBUNGAN KEKERABATAN BEBERAPA ISOLAT Lentinus ASAL
TROPIS BERDASARKAN SIFAT MIKROSKOPIK KULTUR DAN
MOLEKULAR
MOCHAMAD YADI NURJAYADI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
HUBUNGAN KEKERABATAN BEBERAPA ISOLAT Lentinus ASAL
TROPIS BERDASARKAN SIFAT MIKROSKOPIK KULTUR DAN
MOLEKULAR
MOCHAMAD YADI NURJAYADI
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains
Pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
ABSTRAK
MOCHAMAD YADI NURJAYADI. HUBUNGAN KEKERABATAN BEBERAPA ISOLAT
Lentinus ASAL TROPIS BERDASARKAN SIFAT MIKROSKOPIK KULTUR DAN
MOLEKULAR. Dibimbing oleh LISDAR A MANAF dan DEDY DURYADI S.
Jamur Lentinus merupakan jamur pelapuk kayu yang berpotensi sebagai obat yang tersebar
di berbagai kawasan daerah tropis dan subtropis. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui
hubungan kekerabatan jamur Lentinus isolat tropis berdasarkan sifat mikroskopik kultur dan sifat
molekular. Sampel yang digunakan ialah Lentinus isolat LU3, LU10 (L. torulosus), LC4, LC6 (L.
cladopus), LSC1, LSC7 (L. Sajor-caju), LP9 (L. quarrosulus), dan HS serta JTP (Pleurotus).
Media yang digunakan adalah agar ekstrak malt pepton (AEMP) dan agar ekstrak malt (AEM)
pada suhu 35°C untuk isolat Lentinus dan ±29°C untuk isolat HS dan JTP. Struktur mikroskopik
kultur setiap isolat diamati setelah isolat berumur 2 dan 4 minggu. Analisis molekular dilakukan
dengan mengamplifikasi DNA berdasarkan metode PCR-RAPD dengan menggunakan 2 primer
acak tunggal 10-mer, yaitu RP1 dan RP3. Sifat mikroskopik kultur dan molekular dinyatakan ke
dalam data biner dan diolah dengan program MEGA 4.1. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa
beberapa isolat Lentinus yang ditumbuhkan pada media AEMP memiliki penampakan koloni yang
berbeda dengan penampakan koloni pada media AEM. Berdasarkan pohon kekerabatan
mikroskopik kultur dan molekular, isolat Pleurotus (JTP) berada di luar kelompok A (kelompok
Lentinus dan HS) sebagai out group. Kelompok A terbagi menjadi dua cabang yaitu HS dan
kelompok Lentinus (B, C, D). Berdasarkan sifat molekular kelompok Lentinus terdiri dari
kelompok B dengan nilai konsistensi (NK) 57% yang terdiri dari LP9 dan LSC1 (NK=89%) dan
kelompok C dengan NK 20%. Kelompok C terdiri dari LSC7 dan LC6 (NK=65%) dan kelompok
D dengan NK=45%. Kelompok D terdiri dari isolat LU10 dan isolat LC4 dan LU3 (NK=46%).
Hubungan kekerabatan Lentinus berdasarkan molekular belum spesifik sehingga perlu dianalisis
kembali dengan penambahan primer lain.
ABSTRACT
MOCHAMAD YADI NURJAYADI. PHYLOGENY RELATIONSHIP OF SEVERAL
TROPICAL Lentinus BASED ON MICROSCOPIC AND MOLECULAR CHARACTERS.
Supervised by LISDAR A MANAF and DEDY DURYADI S.
Lentinus mushroom is a wood rot fungi used as medicine and distributed in tropic and
subtropic regions. The research aimed to know the phylogeny relationship of tropical Lentinus
mushroom isolates based on culture microscopic and molecular characters. Isolates of Lentinus
that were used are LU3, LU10 (L. torulosus), LC4, LC6 (L. cladopus), LSC1, LSC7 (L. sajorcaju), and LP9 (L. squarrosulus), HS, and JTP (Pleurotus). Culture media were malt extract
peptone agar (MEPA) and malt extract agar (MEA) at 35°C for Lentinus isolates and ±29°C for
HS and JTP isolates. The culture microscopic structure of each isolate was observed at 2 and 4
weeks old of cultures. Molecular analysis carried out amplification of DNA with PCR-RAPD
method using two 10-mer single random primers, RP1 and RP3. The culture microscopic and
molecular characters were converted into biner data and analysis using MEGA 4.1 program. The
observation showed that the colony appearances of some Lentinus isolates on MEPA media were
different from those of MEA. Based on phylogenic tree of culture microscopic and molecular
characters, Pleurotus isolate (JTP) was separated from A group (Lentinus and HS) as out group. A
group was devided to two branches, HS isolate and Lentinus group (B, C, D). Based on molecular
analysis, Lentinus group included B group(consistency value, CV=57%) which devided LP9 and
LSC1 isolates (CV=89%) and C group (CV=20%). C Group were devided into LSC7 and LC6
(CV=65%) and D group (CV=45%). D group included LU10 isolate and LC4 and LU3 isolates
(CV=46%). Molecular relationship of Lentinus based on molecular analysis was not yet specific so
need to analyze detailed with added another primer.
Judul Skripsi : Hubungan Kekerabatan Beberapa isolat Lentinus Asal Tropis
Berdasarkan Sifat Mikroskopik Kultur dan Molekular
Nama
: Mochamad Yadi Nurjayadi
NIM
: G34104080
Menyetujui,
Pembimbing I
Pembimbing II
Dr. Ir. Lisdar A. Manaf
Dr. Ir. Dedy Duryadi S, DEA
NIP 19591018 198403 2 001
NIP 19561102 198403 1 003
Mengetahui :
Ketua Departemen,
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M. Si
NIP 19641002 198903 1 002
Tanggal Lulus :
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT, karena atas rahmat dan hidayah-Nya
penulis dapat menyelesaikan skripsi hasil penelitian ini. Penelitian yang berlangsung dari bulan
Oktober 2008 hingga Juni 2009 ini berjudul Hubungan Kekerabatan Beberapa Isolat Lentinus Asal
Tropis Berdasarkan Sifat Mikroskopik dan Molekular.
Terima kasih penulis sampaikan kepada ibu Dr. Ir. Lisdar A Manaf dan bapak Dr. Ir. Dedy
Duryadi Solihin, DEA selaku pembimbing atas bimbingan, saran dan arahan selama proses
penelitian dan penyelesaian skripsi ini. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada Dr. Nunik Sri
Ariyanti M.Si. selaku dosen penguji atas semua masukan yang telah diberikan.
Terima kasih juga penulis sampaikan kepada bapak Iwa K selaku teknisi Laboratorium
Mikrobiologi dan Biokimia dan Bapak Heri selaku teknisi Laboratorium Biologi Molekular
PPSHB IPB, dan kepada seluruh staf Departemen Biologi atas fasilitas, saran, dan bantuannya.
Penulis menyampaikan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada kedua orang tua dan
kakak-kakak tersayang atas segala doa, dukungan, dan kasih sayang. Terima kasih juga penulis
sampaikan kepada teman-teman biologi angkatan 41 khususnya anak-anak ”8” (Uma, Moris,
Andik, Pams, Kushi, Muza, Budi), Deny K, Tina, Iffa, Disti, Achied, Melput, Idha, Forhuman
(Romzie, Rizal, Ajeng, Nurul, Winda) dan anak-anak Lamin Dentis (Zein, Farid, Okoy, Bogie,
Awang, Dede) atas semua kebersamaan dan hari-hari indah yang telah dijalani. Tidak lupa penulis
juga manyampaikan terima kasih kepada ibu-ibu, bapak-bapak, dan mba-mba yang ada di
Laboratorium Biologi Molekular khususnya Mba Andri, Bu Septi, Bu Rossa, Bu Suri, dan Mba
Handay atas dukungan, nasihat, dan kebersamaannya.
Penulis menyadari bahwa laporan ini masih jauh dari sempurna. Oleh karena itu, kritik dan
saran yang membangun sangat diharapkan. Semoga laporan ini dapat bermanfaat.
Bogor, Desember 2009
Mochamad Yadi Nurjayadi
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan tanggal 12 Nopember 1986 di Cirebon, Jawa Barat. Anak kelima dari lima
bersaudara pasangan Bapak Iing Sanjaya dan Ibu Dasih.
Tahun 2004 penulis lulus dari SMUN 3 Cirebon dan pada tahun yang sama diterima di
Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor
melalui jalur SPMB (Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru).
Selama masa perkuliahan, penulis aktif berorganisasi di dalam maupun di luar kampus. Selain
itu, penulis juga aktif mengikuti berbagai kegiatan yang bersifat kerohanian, kewirausahaan,
pelatihan motivasi, dan latihan kepemimpinan. Tahun 2006 - 2009 penulis aktif menjadi asisten
praktikum, yaitu mata kuliah Pendidikan Agama Islam, Fisiologi Tumbuhan, Biologi Cendawan,
dan Biologi Dasar.
Penulis melaksanakan Praktik Lapangan pada tahun 2007 di PT Adijaya Guna Satwata,
sebuah perusahaan yang bergerak dibidang pengolahan udang, dengan judul Pengolahan Udang
IQF (Individually Quick frozen) di PT Adijaya Guna Satwatama, Cirebon. Penulis juga aktif dalam
melaksanakan penyuluhan budidaya jamur tiram dan jamur merang pada tahun 2007 dan 2008.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ................................................................................................................ viii
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................................. viii
DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................................... viii
PENDAHULUAN
Latar Belakang .................................................................................................................. 1
Tujuan ............................................................................................................................. 1
Waktu dan Tempat ........................................................................................................... 1
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat.................................................................................................................. 2
Metode Penelitian ............................................................................................................. 2
Pengamatan Struktur Koloni dan Mikroskopik ............................................................ 2
Perbanyakan Biakan Isolat ......................................................................................... 2
Perbanyakan Koloni dan Isolasi DNA ........................................................................ 2
Analisis PCR-RAPD .................................................................................................. 3
Analisis Molekular ...................................................................................................... 3
HASIL
Penampakan Koloni dan Sifat Mikroskopik Kultur ........................................................... 3
Analisis PCR-RAPD ......................................................................................................... 5
PEMBAHASAN
Penampakan Koloni dan Sifat Mikroskopik Kultur ........................................................... 6
Hubungan kekerabatan ...................................................................................................... 7
SIMPULAN .......................................................................................................................... 9
SARAN ................................................................................................................................. 9
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................................ 9
LAMPIRAN ......................................................................................................................... 11
DAFTAR TABEL
Halaman
1.
2.
Penampakan koloni isolat Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1, LSC7, LP9), HS,
dan Pleurotus (JTP) di media AEMP dan AEM ............................................................ 4
Sifat mikroskopik kultur isolat Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1, LSC7, LP9),
HS, dan Pleurotus (JTP) di media AEMP dan AEM pada minggu ke-2 dan 4................ 5
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1.
2.
3.
4.
Pohon kekerabatan isolat Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1, LSC7, LP9),
HS, dan Pleurotus (JTP) berdasarkan sifat mikroskopik kultur........................................
Hasil amplifikasi DNA isolat Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1, LSC7, LP9),
HS, dan Pleurotus (JTP) dengan metode PCR-RAPD dengan menggunakan primer
RP1 (a) dan RP3 (b).......................................................................................................
Pohon kekerabatan isolat Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1, LSC7, LP9),
HS,dan Pleurotus (JTP) berdasarkan sifat molekular.. ....................................................
Struktur mikroskopik: (a) hifa terwarnai isolat LP9, (b) sambungan apit isolat HS,
(c) artrospora isolat LU3, (d) hifa berdinding tebal dan tipis isolat LU10, (e) sel
gembung isolat LSC1, (f) ujung hifa gembung isolat LC4, (g) klamidospora isolat
LSC1, (h) konidia dan konidiofor isolat HS, (i) kristal isolat LC4 ...................................
4
6
6
8
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1.
2.
3.
4.
Komposisi media dalam satu liter...................................................................................
Penampakan koloni isolat Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1, LSC7, LP9),
HS, dan Pleurotus (JTP) pada media AEMP dan AEM ..................................................
Istilah penampakan koloni .............................................................................................
Bilangan biner berdasarkan keberadaan pita dalam primer RP1 dan RP3
pada isolat Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1, LSC7, LP9), HS, dan
Pleurotus (JTP) .............................................................................................................
12
13
15
16
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Jamur Lentinus seperti halnya Ganoderma,
Trametes, Polyporus, dan Fomes merupakan
salah satu jamur pelapuk kayu yang tersebar
di berbagai kawasan tropis dan subtropis.
Jamur
Lentinus
termasuk
kelas
Basidiomycetes, ordo Polyporales dengan
famili Lentinaceae yang memiliki tubuh buah
makroskopik dengan struktur liat dan kokoh
serta tahan lama (Sudirman 1995). Pada
umumnya jamur ini memiliki ciri-ciri sebagai
berikut: berbentuk seperti payung; berukuran
sedang; warna beragam; permukaan tudung
(pileus) halus, berbulu atau bersisik dengan
bagian tengah melengkung ke bawah
(depressed), berlekuk ke dalam (umbilicate);
tangkai pada umumnya tidak di tengah atau
eksentrik,
kadang-kadang
membentuk
beberapa cabang sehingga terlihat seperti
tandan; lamela rapat dan turun mencapai
tangkai (decurrent); spora berwarna putih
(Pegler dan Young 1983).
Beberapa
jenis
Lentinus
dapat
menghasilkan senyawa aktif yang dapat
menghambat patogen penyakit (antimikrob,
antibakteri, antifungi) dan berkhasiat sebagai
antikolesterol dan antihipertensi selain dapat
sebagai bahan pangan. Diantara jenis
Lentinus asal tropis yang telah diteliti adalah
L. cladopus, L. sajor-caju, L. squarrosulus,
dan L. torulosus (Sudirman 2005).
Untuk
melihat
morfologi
dan
perkembangan tubuh beberapa spesies
Lentinus yang diisolasi dari alam telah dicoba
ditumbuhkan pada substrat serbuk gergaji.
Dari hasil penelitian tersebut terlihat adanya
keragaman morfologi pada tubuh buah
dewasa, walaupun pada tubuh buah yang
belum dewasa tidak menunjukkan perbedaan
bentuk dan warna (Sudirman 1995).
Telaah fisiologi dapat dilakukan dengan
membandingkan
pertumbuhan
kultur
miselium pada berbagai kondisi lingkungan
dan melakukan uji reaksi oksidasi pada media
agar dalam menumbuhkan kultur. Rosa (1996)
telah melakukan uji sifat fisiologi pada isolatisolat Lentinus yang telah dikulturkan dari
alam yang meliputi LPM, LSC, LPT, LP, LU,
LCEL, dan LC. Hasil penelitian yang
diperoleh adalah seluruh isolat mampu
tumbuh optimal pada beberapa kondisi
lingkungan dan memiliki reaksi positif pada
uji oksidasi di media agar asam galat (AAG)
dan agar asam tanat (AAT). Sedangkan uji
pada asam tirosin (AT) menghasilkan reaksi
negatif. Kesamaan sifat fisiologi tersebut
kemudian dibagi menjadi tiga kelompok.
Kelompok yang pertama meliputi LPM, LSC,
dan LPT. Bagian kelompok kedua mencakup
isolat LP. Untuk kelompok ketiga terdiri dari
LU, LCEL, dan LC.
Keanekaragaman spesies dapat disebabkan
karena telah terjadi perubahan susunan
nukleotida penyusun DNA. Perubahan ini
dapat
mempengaruhi
fenotipe
suatu
organisme atau mempengaruhi reaksi individu
terhadap lingkungan tertentu. Secara umum
keanekaragaman genetik dari suatu populasi
dapat terjadi karena adanya mutasi,
rekombinasi, atau migrasi gen dari satu tempat
ke tempat lain (Pereira et al. 2008). Tingkat
kekerabatan genus Lentinus dapat dilakukan
baik berdasarkan kesamaan sifat morfologi
tubuh buah, sifat fisiologi, sifat mikroskopik
di media kultur maupun berdasarkan sifat
molekular.
Metode PCR-RAPD merupakan teknik
penanda molekular yang digunakan untuk
mempelajari keragaman genetik spesies.
Dasar analisis RAPD adalah menggunakan
mesin PCR yang mampu mengamplifikasi
sekuen DNA secara in vitro. Teknik ini
menggunakan sepasang primer random yang
masing-masing
berukuran
10
basa.
Penggunaan penanda RAPD relatif sederhana
dan mudah dalam hal preparasi. Teknik
RAPD memberikan hasil yang lebih cepat
dibandingkan dengan teknik molekular
lainnya. Teknik ini juga mampu menghasilkan
jumlah karakter yang relatif tidak terbatas,
sehingga sangat membantu untuk keperluan
analisis keanekaragaman organisme yang
tidak diketahui latar belakang genomnya.
Teknik RAPD sering digunakan untuk
membedakan organisme tingkat tinggi
(eucaryote) (Saunders dan Helen 1999).
Penelitian tentang kekerabatan Lentinus
isolat
tropis
belum
banyak
yang
melakukannya.
Berdasarkan
penelitian
terdahulu, Noverita (2005) telah melakukan
pengelompokkan isolat Pleurotus liar dan
domestik melalui sifat molekular dengan
metode PCR-RAPD. Pada penelitian tersebut
digunakan isolat Lentinus sebagai out group.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui
hubungan kekerabatan jamur Lentinus isolat
tropis berdasarkan struktur sifat kultur
mikroskopik dan sifat molekular.
Waktu dan Tempat
Penelitian
ini
dilaksanakan
di
Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia dan
Laboratorium Biologi dan Molekular Pusat
Penelitan
Sumberdaya
Hayati
dan
Bioteknologi IPB (PPSHB-IPB) kampus IPB
Dramaga, Bogor mulai bulan Oktober 2008
sampai dengan Juni 2009.
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Sampel yang digunakan ialah isolat
koleksi Dr. Ir. Lisdar A Manaf meliputi isolat
Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1,
LSC7, LP9), isolat HS, dan isolat Pleurotus
(JTP), media agar ekstrak malt pepton
(AEMP), media agar ekstrak malt (AEM),
media agar sukrosa kentang (ASK), ekstrak
malt pepton cair (EMPC) (Lampiran 1),
larutan KOH, larutan eosin 1%, larutan
purifikasi cetyltrimethylammonium bromide
(CTAB) buffer, gel agarosa 1.2%, etidium
bromida, 2 primer acak tunggal (RP-1, RP-3),
akuabides, larutan amplifikasi (Tris-HCl pH8,
KCl,
ethylenediaminetetraacetic
acid
(EDTA), dithiothreitol (DTT), gliserol,
MgCl2, dNTP, enzim Taq polymerase.
Alat yang digunakan adalah: cawan Petri,
Erlenmeyer 250 ml, gelas ukur, cord borer,
scalpel, pipet pastur, lampu spirtus, autoclaf,
laminar air flow, incubator, kertas saring
Whatman no 1, tabung Eppendorf, mesin
PCR,
alat
elektroforesis,
sinar
UV
transiluminator.
Me tode Pe nelitian
Pengamatan Penampakan Koloni dan
Sifat Mikroskopik Kultur. Kultur masingmasing isolat diamati penampakan dan sifat
kulturnya
secara mikroskopik setelah
ditumbuhkan di media AEM dan AMP.
Penampakan koloni diamati setelah umur
isolat berumur 6 hingga 7 hari. Sedangkan
sifat mikroskopik kultur diamati pada saat
isolat berumur 2 dan 4 minggu. Pengamatan
dilakukan dengan cara mengambil miselium
dan struktur koloni yang kemudian diletakkan
di atas preparat yang telah diberi larutan KOH
(Kalium hidroksida) dan larutan pewarna
eosin 1%.
Keberadaan sifat mikroskopik kultur
kemudian divisualisasikan ke dalam bentuk
pohon kekerabatan melalui program MEGA
4.1. Penampakan yang dilihat meliputi
sambungan apit, klamidospora, konidia, oidia,
basidia, basidiospora, seta, sel veskikular,
cabang stag-horn, hifa terwarnai larutan eosin,
hifa tidak terwarnai larutan eosin, hifa
incrusted, kristal, sel gembung, ujung hifa
gembung, dan hifa besar berdinding tipis.
Metode yang dilakukan berdasarkan angka
bilangan biner, yaitu angka 1 menunjukkan
ada struktur mikroskopik dan angka 0 tidak
ada. Selanjutnya dimasukkan ke dalam
program MEGA 4.1 metode parsimoni
maksimum.
Pe rbanyakan Biakan Isolat. Koloni
masing-masing isolat Lentinus diinokulasi
pada media AMP dengan teknik aseptik. Isolat
yang telah diinokulasi kemudian diinkubasi
pada suhu 35oC selama 7 hari. Pada hari
terakhir miselium akan menutupi seluruh
permukaan media cawan (Rosa 1996).
Pe rbanyakan Koloni dan Isolasi DNA.
Kultur yang sudah berumur 7 hari pada
AEMP, dipotong dengan cord borer steril
yang berdiameter 7 mm dan diambil dengan
menggunakan scalpel steril. Kemudian satu
inokulum diinokulasikan pada permukaan
larutan 100 ml media EMPC steril dalam
Erlenmeyer 250 mlI sebanyak dua ulangan
dan diinkubasikan pada suhu 35oC dalam
keadaan statik (Rosa 1996). Bila permukaan
medium telah dipenuhi oleh miselium jamur
maka miselium jamur dipanen dan dipisahkan
dari medium cair dengan kertas saring
Whatman No.1.
Solichin (2004) melaporkan bahwa isolasi
DNA jamur dapat dilakukan dengan cara
mengambil miselium yang telah disaring
sebanyak 1 gram lalu digerus di dalam mortar
dengan ditambah larutan purifikasi CTAB
buffer (2% CTAB, 100 mM Tris HCl pH8,
1.4 M NaCl, 1% Polyvinilpirolidone, 0.2%
beta-mercaptoethanol) sebanyak 500 µl dalam
tabung Eppendorf dan diinkubasi pada suhu
65°C selama 3 jam. Kemudian sampel
ditambah 500 µl larutan fenol dan diayun
berputar secara rotasi selama 20 menit lalu
disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm
selama 3 menit. Setelah terbentuk endapan,
supernatan dipindahkan ke tabung Eppendorf
baru dan ditambah 500 µl larutan CIAA
(chloroform isoamil alcohol). Sampel diayun
berputar rotasi kembali selama 20 menit dan
disentrifugasi kembali dengan kecepatan
13000 rpm selama 3 menit. Di dalam tabung
akan terbentuk dua lapisan larutan. Bagian
atas merupakan lapisan CIAA dengan larutan
berwarna bening dan bagian bawah berwarna
agak keruh yang merupakan larutan yang
mengandung DNA. Bagian lapisan bawah
dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf baru
dan ditambah 100 µl sodium buffer. Sampel
diinkubasi pada suhu 65°C selama 15 menit.
Setelah itu, sampel ditambah 100 µl sodium
atau kalium asetat. Lalu sampel ditambah
etanol absolut 2X volume dan disimpan di
dalam freezer selama 30 menit. Kemudian
sampel disentrifugasi dengan kecepatan 13000
rpm selama 5 menit. Larutan etanol absolut di
dalam tabung Eppendorf dibuang dan diganti
dengan larutan etanol 70% sebanyak 400 µl.
Sampel disentrifugasi kembali dengan
kecepatan 13000 rpm selama 3 menit dan
larutan etanol 70% dibuang. Setelah tahapan
ini akan terbentuk endapan putih yang
merupakan ekstrak DNA. Ekstrak DNA
kemudian dikeringanginkan selama 30 menit
hingga dinding bagian dalam Eppendorf
kering. Setelah itu, ekstrak DNA ditambah
larutan TE (tris-EDTA buffer) sebanyak 50100 µl dan diinkubasi pada suhu 37°C selama
15 menit. Sampel ekstrak DNA lalu di simpan
di dalam freezer.
Ekstrak DNA yang dihasilkan dari
masing-masing sampel diuji kemurnian dan
kualitasnya dengan menggunakan 1.2 % gel
agarosa elektroforesis pada voltase 85 Volt
selama 45 menit di dalam larutan penyangga 1
x TBE (Tris Boric EDTA) kemudian diamati
dan difoto dengan menggunakan alat UVtransiluminator.
Analisis PCR-RAPD. Analisis PCRRAPD mengikuti metode Williams et al.
(1990). Ekstrak DNA diamplifikasi dengan
menggunakan 2 primer acak tunggal 10-mer:
RP1 dan RP3 dengan bantuan mesin PCR
(Gene Amp PCR System 2400 Perkin-Elmer).
Volume campuran untuk amplifikasi adalah
sebanyak 50μ l dengan kandungan: 34.75μ l
akuabides, 5 μ l Buffer amplifikasi 10x (20mM
Tris-HCl pH8, 100mM KCl, 0.1 mM EDTA,
50% gliserol), 3 μ l (25mM) MgCl2, 1.0 μ l
dNTP, 4.0 μ l primer RP1 atau RP3, 0.25 μ l (1
unit/reaksi) Taq polymerase. Campuran dibuat
di dalam tabung Eppendorf 0.2 ml.
Amplifikasi DNA dengan mesin PCR
melalui tahapan-tahapan sebagai berikut:
tahap pertama, pra-amplifikasi selama 3 menit
pada temperatur 94oC; tahap kedua, yaitu
pemisahan utas DNA genom (denaturasi) pada
temperatur 94oC selama 45 detik yang
berlangsung sebanyak 35 siklus selanjutnya
penempelan
primer
(annealing)
pada
temperatur 37oC selama 1 menit, elongasi
pada temperatur 72oC selama 1.5 menit; dan
tahap ketiga pasca amplifikasi pada
temperatur 72oC selama 5 menit. Hasil
amplifikasi DNA akan dilanjutkan dengan
tahap elektroforesis pada gel agarose dengan
konsentrasi 1.2% pada voltase 85 Volt selama
45 menit di dalam larutan penyangga 1 x TBE
kemudian diamati dan difoto dengan
menggunakan alat UV-transiluminator.
Analisis Mo le kular. Data dianalisis
berdasarkan hasil pemotretan gel berupa pola
pita DNA, kemudian diterjemahkan ke dalam
bilangan biner. Setiap pita dianggap mewakili
satu karakter dan diberi nilai 1 bila pita ada
dan 0 bila pita tidak ada. Penentuan dilakukan
dengan mengambil garis lurus secara
horisontal dengan membandingkan masingmasing fragmen DNA hasil PCR. Bilangan
biner lalu dirubah menjadi urutan nukleotida.
Pengelompokkan data disusun berdasarkan
matrik kesamaan secara berpasangan (cluster
analysis) dan pembuatan pohon kekerabatan
dilakukan
dengan
metode
parsimoni
maksimum dengan program MEGA versi 4.1.
Konsistensi pohon kekerabatan diuji dengan
melakukan uji Bootstrap dengan 1000
ulangan.
HASIL
Pe nampakan Koloni dan Sifat
Mikroskopik Kultur
Berdasarkan
hasil
pengamatan
menunjukkan bahwa beberapa isolat Lentinus,
HS, dan Pleurotus yang ditumbuhkan pada
media AEMP memiliki penampakan koloni
yang berbeda dengan media AEM (Tabel 1).
Penampakan koloni pada media AEMP pada
umumnya membentuk struktur plumose dan
selebihnya membentuk pulverulent, silky, dan
concentric cottony. Pada media AEM,
penampakan kultur
masing-masing isolat
Lentinus berubah kecuali isolat LC6 dan
LSC7 yang memiliki penampakan sama,
plumose dan LSC1 yaitu pulverulent. Isolat
yang lain membentuk penampakan kultur
silky, woolly bagian pinggir, concentric silky,
appressed, dan plumose. Tampilan gambar
dan penjelasan istilah penampakan koloni
disajikan pada Lampiran 2 dan 3.
Tabel 1 Penampakan koloni isolat Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1, LSC7, LP9), HS, dan
Pleurotus (JTP) di media AEMP dan AEM
No
Isolat
1
2
3
4
5
6
7
LU3
LU10
LC4
LC6
LSC1
LSC7
LP9
8
HS
9
JTP
AEMP
Plumose
Plumose
Plumose
Plumose
Pulverulent
Plumose
Silky
Concentric
cottony
Concentric
cottony
Sifat mikroskopik kultur setiap isolat
Lentinus, HS, dan Pleurotus yang ditumbuhi
di media AEMP dan AEM pada minggu ke-2
dan ke-4 memiliki struktur yang sama (Tabel
2). Isolat Lentinus, HS, dan Pleurotus berubah
menjadi hifa yang terwarnai (staining hyphae)
setelah dilakukan pewarnaan larutan eosin.
Struktur sambungan apit (clamp connection)
ditemui hampir pada seluruh isolat Lentinus,
HS, dan Pleurotus kecuali isolat LC4 dan
LSC1. Sebagian besar isolat membentuk
modifikasi hifa berupa sel gembung (swollen
cell), ujung hifa gembung (swollen hyphal
tip), hifa besar dan berdinding tipis (large
thin-walled hyphae). Struktur klamidospora
hanya terbentuk pada isolat LC4 dan LSC1.
Sedangkan artrospora hanya dibentuk oleh
isolat LU3 dan LSC7. Isolat HS memiliki
Media
AEM
Silky
Lateral wolly
Concentric silky
Plumose
Pulverulent
Plumose
Appressed
Plumose
Plumose
struktur modifikasi hifa berupa konidiofor dan
konidia yang terletak diantara sambungan
apit. Seluruh isolat Lentinus, HS, dan
Pleurotus membentuk kristal (crystal) setelah
penambahan larutan KOH dan pewarnaan
eosin.
Hasil pohon kekerabatan berdasarkan
penampakan mikroskopik kultur menunjukkan
bahwa isolat JTP terpisah dari kelompok A.
Pada kelompok A terbagi menjadi dua cabang
yaitu isolat HS yang mengelompok sendiri
dari kelompok Lentinus dan kelompok B, C,
dan D (LP9, LSC1, LC4, LC6, LU10, LSC7,
LU3). Nilai Konsistensi terbesar berada pada
pangkal cabang kelompok B sebesar 94 %
sedangkan nilai terkecil terdapat pada pangkal
cabang kelompok D, yaitu 10 % (Gambar 1).
40
LSC7
10
D
69
C
LU10
20
LC6
LC4
94
B
A
LU3
68
LSC1
LP9
HS
JTP
Gambar 1 Pohon kekerabatan isolat Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1, LSC7, LP9), HS,
dan Pleurotus (JTP) berdasarkan sifat mikroskopik kultur. Angka pada setiap
kelompok merupakan nilai konsistensi (%) yang diuji dengan uji Bootstrap 1000
ulangan melalui metode parsimoni maksimum.
Tabel 2 Sifat mikroskopik kultur isolat Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1, LSC7, LP9), HS,
dan Pleurotus (JTP) di media AEMP dan AEM pada minggu ke-2 dan 4 (Davidson et al.
1945)
Isolat
No
Penampakan mikroskopik
LU3
LU10
LC4
LC6
LSC1
LSC7
LP9
HS
JTP
1
Sambungan apit
+
+
-
+
-
+
+
+
+
2
Klamidospora
-
-
+
-
+
-
-
-
-
3
Konidia dan konidiofor
-
-
-
-
-
-
-
+
-
4
Oidia
-
-
-
-
-
-
-
-
-
5
Basidia
-
-
-
-
-
-
-
-
-
6
Basidiospora
-
-
-
-
-
-
-
-
-
7
Seta
-
-
-
-
-
-
-
-
-
8
Sel veskikular
-
-
-
-
-
-
-
-
-
9
Cabang stag-horn
-
-
-
-
-
-
-
-
-
10
Hifa terwarnai eosin
+
+
+
+
+
+
+
+
+
11
Hifa tidak terwarnai eosin
-
-
-
-
-
-
-
-
-
12
TROPIS BERDASARKAN SIFAT MIKROSKOPIK KULTUR DAN
MOLEKULAR
MOCHAMAD YADI NURJAYADI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
HUBUNGAN KEKERABATAN BEBERAPA ISOLAT Lentinus ASAL
TROPIS BERDASARKAN SIFAT MIKROSKOPIK KULTUR DAN
MOLEKULAR
MOCHAMAD YADI NURJAYADI
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains
Pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
ABSTRAK
MOCHAMAD YADI NURJAYADI. HUBUNGAN KEKERABATAN BEBERAPA ISOLAT
Lentinus ASAL TROPIS BERDASARKAN SIFAT MIKROSKOPIK KULTUR DAN
MOLEKULAR. Dibimbing oleh LISDAR A MANAF dan DEDY DURYADI S.
Jamur Lentinus merupakan jamur pelapuk kayu yang berpotensi sebagai obat yang tersebar
di berbagai kawasan daerah tropis dan subtropis. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui
hubungan kekerabatan jamur Lentinus isolat tropis berdasarkan sifat mikroskopik kultur dan sifat
molekular. Sampel yang digunakan ialah Lentinus isolat LU3, LU10 (L. torulosus), LC4, LC6 (L.
cladopus), LSC1, LSC7 (L. Sajor-caju), LP9 (L. quarrosulus), dan HS serta JTP (Pleurotus).
Media yang digunakan adalah agar ekstrak malt pepton (AEMP) dan agar ekstrak malt (AEM)
pada suhu 35°C untuk isolat Lentinus dan ±29°C untuk isolat HS dan JTP. Struktur mikroskopik
kultur setiap isolat diamati setelah isolat berumur 2 dan 4 minggu. Analisis molekular dilakukan
dengan mengamplifikasi DNA berdasarkan metode PCR-RAPD dengan menggunakan 2 primer
acak tunggal 10-mer, yaitu RP1 dan RP3. Sifat mikroskopik kultur dan molekular dinyatakan ke
dalam data biner dan diolah dengan program MEGA 4.1. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa
beberapa isolat Lentinus yang ditumbuhkan pada media AEMP memiliki penampakan koloni yang
berbeda dengan penampakan koloni pada media AEM. Berdasarkan pohon kekerabatan
mikroskopik kultur dan molekular, isolat Pleurotus (JTP) berada di luar kelompok A (kelompok
Lentinus dan HS) sebagai out group. Kelompok A terbagi menjadi dua cabang yaitu HS dan
kelompok Lentinus (B, C, D). Berdasarkan sifat molekular kelompok Lentinus terdiri dari
kelompok B dengan nilai konsistensi (NK) 57% yang terdiri dari LP9 dan LSC1 (NK=89%) dan
kelompok C dengan NK 20%. Kelompok C terdiri dari LSC7 dan LC6 (NK=65%) dan kelompok
D dengan NK=45%. Kelompok D terdiri dari isolat LU10 dan isolat LC4 dan LU3 (NK=46%).
Hubungan kekerabatan Lentinus berdasarkan molekular belum spesifik sehingga perlu dianalisis
kembali dengan penambahan primer lain.
ABSTRACT
MOCHAMAD YADI NURJAYADI. PHYLOGENY RELATIONSHIP OF SEVERAL
TROPICAL Lentinus BASED ON MICROSCOPIC AND MOLECULAR CHARACTERS.
Supervised by LISDAR A MANAF and DEDY DURYADI S.
Lentinus mushroom is a wood rot fungi used as medicine and distributed in tropic and
subtropic regions. The research aimed to know the phylogeny relationship of tropical Lentinus
mushroom isolates based on culture microscopic and molecular characters. Isolates of Lentinus
that were used are LU3, LU10 (L. torulosus), LC4, LC6 (L. cladopus), LSC1, LSC7 (L. sajorcaju), and LP9 (L. squarrosulus), HS, and JTP (Pleurotus). Culture media were malt extract
peptone agar (MEPA) and malt extract agar (MEA) at 35°C for Lentinus isolates and ±29°C for
HS and JTP isolates. The culture microscopic structure of each isolate was observed at 2 and 4
weeks old of cultures. Molecular analysis carried out amplification of DNA with PCR-RAPD
method using two 10-mer single random primers, RP1 and RP3. The culture microscopic and
molecular characters were converted into biner data and analysis using MEGA 4.1 program. The
observation showed that the colony appearances of some Lentinus isolates on MEPA media were
different from those of MEA. Based on phylogenic tree of culture microscopic and molecular
characters, Pleurotus isolate (JTP) was separated from A group (Lentinus and HS) as out group. A
group was devided to two branches, HS isolate and Lentinus group (B, C, D). Based on molecular
analysis, Lentinus group included B group(consistency value, CV=57%) which devided LP9 and
LSC1 isolates (CV=89%) and C group (CV=20%). C Group were devided into LSC7 and LC6
(CV=65%) and D group (CV=45%). D group included LU10 isolate and LC4 and LU3 isolates
(CV=46%). Molecular relationship of Lentinus based on molecular analysis was not yet specific so
need to analyze detailed with added another primer.
Judul Skripsi : Hubungan Kekerabatan Beberapa isolat Lentinus Asal Tropis
Berdasarkan Sifat Mikroskopik Kultur dan Molekular
Nama
: Mochamad Yadi Nurjayadi
NIM
: G34104080
Menyetujui,
Pembimbing I
Pembimbing II
Dr. Ir. Lisdar A. Manaf
Dr. Ir. Dedy Duryadi S, DEA
NIP 19591018 198403 2 001
NIP 19561102 198403 1 003
Mengetahui :
Ketua Departemen,
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M. Si
NIP 19641002 198903 1 002
Tanggal Lulus :
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT, karena atas rahmat dan hidayah-Nya
penulis dapat menyelesaikan skripsi hasil penelitian ini. Penelitian yang berlangsung dari bulan
Oktober 2008 hingga Juni 2009 ini berjudul Hubungan Kekerabatan Beberapa Isolat Lentinus Asal
Tropis Berdasarkan Sifat Mikroskopik dan Molekular.
Terima kasih penulis sampaikan kepada ibu Dr. Ir. Lisdar A Manaf dan bapak Dr. Ir. Dedy
Duryadi Solihin, DEA selaku pembimbing atas bimbingan, saran dan arahan selama proses
penelitian dan penyelesaian skripsi ini. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada Dr. Nunik Sri
Ariyanti M.Si. selaku dosen penguji atas semua masukan yang telah diberikan.
Terima kasih juga penulis sampaikan kepada bapak Iwa K selaku teknisi Laboratorium
Mikrobiologi dan Biokimia dan Bapak Heri selaku teknisi Laboratorium Biologi Molekular
PPSHB IPB, dan kepada seluruh staf Departemen Biologi atas fasilitas, saran, dan bantuannya.
Penulis menyampaikan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada kedua orang tua dan
kakak-kakak tersayang atas segala doa, dukungan, dan kasih sayang. Terima kasih juga penulis
sampaikan kepada teman-teman biologi angkatan 41 khususnya anak-anak ”8” (Uma, Moris,
Andik, Pams, Kushi, Muza, Budi), Deny K, Tina, Iffa, Disti, Achied, Melput, Idha, Forhuman
(Romzie, Rizal, Ajeng, Nurul, Winda) dan anak-anak Lamin Dentis (Zein, Farid, Okoy, Bogie,
Awang, Dede) atas semua kebersamaan dan hari-hari indah yang telah dijalani. Tidak lupa penulis
juga manyampaikan terima kasih kepada ibu-ibu, bapak-bapak, dan mba-mba yang ada di
Laboratorium Biologi Molekular khususnya Mba Andri, Bu Septi, Bu Rossa, Bu Suri, dan Mba
Handay atas dukungan, nasihat, dan kebersamaannya.
Penulis menyadari bahwa laporan ini masih jauh dari sempurna. Oleh karena itu, kritik dan
saran yang membangun sangat diharapkan. Semoga laporan ini dapat bermanfaat.
Bogor, Desember 2009
Mochamad Yadi Nurjayadi
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan tanggal 12 Nopember 1986 di Cirebon, Jawa Barat. Anak kelima dari lima
bersaudara pasangan Bapak Iing Sanjaya dan Ibu Dasih.
Tahun 2004 penulis lulus dari SMUN 3 Cirebon dan pada tahun yang sama diterima di
Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor
melalui jalur SPMB (Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru).
Selama masa perkuliahan, penulis aktif berorganisasi di dalam maupun di luar kampus. Selain
itu, penulis juga aktif mengikuti berbagai kegiatan yang bersifat kerohanian, kewirausahaan,
pelatihan motivasi, dan latihan kepemimpinan. Tahun 2006 - 2009 penulis aktif menjadi asisten
praktikum, yaitu mata kuliah Pendidikan Agama Islam, Fisiologi Tumbuhan, Biologi Cendawan,
dan Biologi Dasar.
Penulis melaksanakan Praktik Lapangan pada tahun 2007 di PT Adijaya Guna Satwata,
sebuah perusahaan yang bergerak dibidang pengolahan udang, dengan judul Pengolahan Udang
IQF (Individually Quick frozen) di PT Adijaya Guna Satwatama, Cirebon. Penulis juga aktif dalam
melaksanakan penyuluhan budidaya jamur tiram dan jamur merang pada tahun 2007 dan 2008.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ................................................................................................................ viii
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................................. viii
DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................................... viii
PENDAHULUAN
Latar Belakang .................................................................................................................. 1
Tujuan ............................................................................................................................. 1
Waktu dan Tempat ........................................................................................................... 1
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat.................................................................................................................. 2
Metode Penelitian ............................................................................................................. 2
Pengamatan Struktur Koloni dan Mikroskopik ............................................................ 2
Perbanyakan Biakan Isolat ......................................................................................... 2
Perbanyakan Koloni dan Isolasi DNA ........................................................................ 2
Analisis PCR-RAPD .................................................................................................. 3
Analisis Molekular ...................................................................................................... 3
HASIL
Penampakan Koloni dan Sifat Mikroskopik Kultur ........................................................... 3
Analisis PCR-RAPD ......................................................................................................... 5
PEMBAHASAN
Penampakan Koloni dan Sifat Mikroskopik Kultur ........................................................... 6
Hubungan kekerabatan ...................................................................................................... 7
SIMPULAN .......................................................................................................................... 9
SARAN ................................................................................................................................. 9
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................................ 9
LAMPIRAN ......................................................................................................................... 11
DAFTAR TABEL
Halaman
1.
2.
Penampakan koloni isolat Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1, LSC7, LP9), HS,
dan Pleurotus (JTP) di media AEMP dan AEM ............................................................ 4
Sifat mikroskopik kultur isolat Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1, LSC7, LP9),
HS, dan Pleurotus (JTP) di media AEMP dan AEM pada minggu ke-2 dan 4................ 5
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1.
2.
3.
4.
Pohon kekerabatan isolat Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1, LSC7, LP9),
HS, dan Pleurotus (JTP) berdasarkan sifat mikroskopik kultur........................................
Hasil amplifikasi DNA isolat Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1, LSC7, LP9),
HS, dan Pleurotus (JTP) dengan metode PCR-RAPD dengan menggunakan primer
RP1 (a) dan RP3 (b).......................................................................................................
Pohon kekerabatan isolat Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1, LSC7, LP9),
HS,dan Pleurotus (JTP) berdasarkan sifat molekular.. ....................................................
Struktur mikroskopik: (a) hifa terwarnai isolat LP9, (b) sambungan apit isolat HS,
(c) artrospora isolat LU3, (d) hifa berdinding tebal dan tipis isolat LU10, (e) sel
gembung isolat LSC1, (f) ujung hifa gembung isolat LC4, (g) klamidospora isolat
LSC1, (h) konidia dan konidiofor isolat HS, (i) kristal isolat LC4 ...................................
4
6
6
8
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1.
2.
3.
4.
Komposisi media dalam satu liter...................................................................................
Penampakan koloni isolat Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1, LSC7, LP9),
HS, dan Pleurotus (JTP) pada media AEMP dan AEM ..................................................
Istilah penampakan koloni .............................................................................................
Bilangan biner berdasarkan keberadaan pita dalam primer RP1 dan RP3
pada isolat Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1, LSC7, LP9), HS, dan
Pleurotus (JTP) .............................................................................................................
12
13
15
16
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Jamur Lentinus seperti halnya Ganoderma,
Trametes, Polyporus, dan Fomes merupakan
salah satu jamur pelapuk kayu yang tersebar
di berbagai kawasan tropis dan subtropis.
Jamur
Lentinus
termasuk
kelas
Basidiomycetes, ordo Polyporales dengan
famili Lentinaceae yang memiliki tubuh buah
makroskopik dengan struktur liat dan kokoh
serta tahan lama (Sudirman 1995). Pada
umumnya jamur ini memiliki ciri-ciri sebagai
berikut: berbentuk seperti payung; berukuran
sedang; warna beragam; permukaan tudung
(pileus) halus, berbulu atau bersisik dengan
bagian tengah melengkung ke bawah
(depressed), berlekuk ke dalam (umbilicate);
tangkai pada umumnya tidak di tengah atau
eksentrik,
kadang-kadang
membentuk
beberapa cabang sehingga terlihat seperti
tandan; lamela rapat dan turun mencapai
tangkai (decurrent); spora berwarna putih
(Pegler dan Young 1983).
Beberapa
jenis
Lentinus
dapat
menghasilkan senyawa aktif yang dapat
menghambat patogen penyakit (antimikrob,
antibakteri, antifungi) dan berkhasiat sebagai
antikolesterol dan antihipertensi selain dapat
sebagai bahan pangan. Diantara jenis
Lentinus asal tropis yang telah diteliti adalah
L. cladopus, L. sajor-caju, L. squarrosulus,
dan L. torulosus (Sudirman 2005).
Untuk
melihat
morfologi
dan
perkembangan tubuh beberapa spesies
Lentinus yang diisolasi dari alam telah dicoba
ditumbuhkan pada substrat serbuk gergaji.
Dari hasil penelitian tersebut terlihat adanya
keragaman morfologi pada tubuh buah
dewasa, walaupun pada tubuh buah yang
belum dewasa tidak menunjukkan perbedaan
bentuk dan warna (Sudirman 1995).
Telaah fisiologi dapat dilakukan dengan
membandingkan
pertumbuhan
kultur
miselium pada berbagai kondisi lingkungan
dan melakukan uji reaksi oksidasi pada media
agar dalam menumbuhkan kultur. Rosa (1996)
telah melakukan uji sifat fisiologi pada isolatisolat Lentinus yang telah dikulturkan dari
alam yang meliputi LPM, LSC, LPT, LP, LU,
LCEL, dan LC. Hasil penelitian yang
diperoleh adalah seluruh isolat mampu
tumbuh optimal pada beberapa kondisi
lingkungan dan memiliki reaksi positif pada
uji oksidasi di media agar asam galat (AAG)
dan agar asam tanat (AAT). Sedangkan uji
pada asam tirosin (AT) menghasilkan reaksi
negatif. Kesamaan sifat fisiologi tersebut
kemudian dibagi menjadi tiga kelompok.
Kelompok yang pertama meliputi LPM, LSC,
dan LPT. Bagian kelompok kedua mencakup
isolat LP. Untuk kelompok ketiga terdiri dari
LU, LCEL, dan LC.
Keanekaragaman spesies dapat disebabkan
karena telah terjadi perubahan susunan
nukleotida penyusun DNA. Perubahan ini
dapat
mempengaruhi
fenotipe
suatu
organisme atau mempengaruhi reaksi individu
terhadap lingkungan tertentu. Secara umum
keanekaragaman genetik dari suatu populasi
dapat terjadi karena adanya mutasi,
rekombinasi, atau migrasi gen dari satu tempat
ke tempat lain (Pereira et al. 2008). Tingkat
kekerabatan genus Lentinus dapat dilakukan
baik berdasarkan kesamaan sifat morfologi
tubuh buah, sifat fisiologi, sifat mikroskopik
di media kultur maupun berdasarkan sifat
molekular.
Metode PCR-RAPD merupakan teknik
penanda molekular yang digunakan untuk
mempelajari keragaman genetik spesies.
Dasar analisis RAPD adalah menggunakan
mesin PCR yang mampu mengamplifikasi
sekuen DNA secara in vitro. Teknik ini
menggunakan sepasang primer random yang
masing-masing
berukuran
10
basa.
Penggunaan penanda RAPD relatif sederhana
dan mudah dalam hal preparasi. Teknik
RAPD memberikan hasil yang lebih cepat
dibandingkan dengan teknik molekular
lainnya. Teknik ini juga mampu menghasilkan
jumlah karakter yang relatif tidak terbatas,
sehingga sangat membantu untuk keperluan
analisis keanekaragaman organisme yang
tidak diketahui latar belakang genomnya.
Teknik RAPD sering digunakan untuk
membedakan organisme tingkat tinggi
(eucaryote) (Saunders dan Helen 1999).
Penelitian tentang kekerabatan Lentinus
isolat
tropis
belum
banyak
yang
melakukannya.
Berdasarkan
penelitian
terdahulu, Noverita (2005) telah melakukan
pengelompokkan isolat Pleurotus liar dan
domestik melalui sifat molekular dengan
metode PCR-RAPD. Pada penelitian tersebut
digunakan isolat Lentinus sebagai out group.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui
hubungan kekerabatan jamur Lentinus isolat
tropis berdasarkan struktur sifat kultur
mikroskopik dan sifat molekular.
Waktu dan Tempat
Penelitian
ini
dilaksanakan
di
Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia dan
Laboratorium Biologi dan Molekular Pusat
Penelitan
Sumberdaya
Hayati
dan
Bioteknologi IPB (PPSHB-IPB) kampus IPB
Dramaga, Bogor mulai bulan Oktober 2008
sampai dengan Juni 2009.
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Sampel yang digunakan ialah isolat
koleksi Dr. Ir. Lisdar A Manaf meliputi isolat
Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1,
LSC7, LP9), isolat HS, dan isolat Pleurotus
(JTP), media agar ekstrak malt pepton
(AEMP), media agar ekstrak malt (AEM),
media agar sukrosa kentang (ASK), ekstrak
malt pepton cair (EMPC) (Lampiran 1),
larutan KOH, larutan eosin 1%, larutan
purifikasi cetyltrimethylammonium bromide
(CTAB) buffer, gel agarosa 1.2%, etidium
bromida, 2 primer acak tunggal (RP-1, RP-3),
akuabides, larutan amplifikasi (Tris-HCl pH8,
KCl,
ethylenediaminetetraacetic
acid
(EDTA), dithiothreitol (DTT), gliserol,
MgCl2, dNTP, enzim Taq polymerase.
Alat yang digunakan adalah: cawan Petri,
Erlenmeyer 250 ml, gelas ukur, cord borer,
scalpel, pipet pastur, lampu spirtus, autoclaf,
laminar air flow, incubator, kertas saring
Whatman no 1, tabung Eppendorf, mesin
PCR,
alat
elektroforesis,
sinar
UV
transiluminator.
Me tode Pe nelitian
Pengamatan Penampakan Koloni dan
Sifat Mikroskopik Kultur. Kultur masingmasing isolat diamati penampakan dan sifat
kulturnya
secara mikroskopik setelah
ditumbuhkan di media AEM dan AMP.
Penampakan koloni diamati setelah umur
isolat berumur 6 hingga 7 hari. Sedangkan
sifat mikroskopik kultur diamati pada saat
isolat berumur 2 dan 4 minggu. Pengamatan
dilakukan dengan cara mengambil miselium
dan struktur koloni yang kemudian diletakkan
di atas preparat yang telah diberi larutan KOH
(Kalium hidroksida) dan larutan pewarna
eosin 1%.
Keberadaan sifat mikroskopik kultur
kemudian divisualisasikan ke dalam bentuk
pohon kekerabatan melalui program MEGA
4.1. Penampakan yang dilihat meliputi
sambungan apit, klamidospora, konidia, oidia,
basidia, basidiospora, seta, sel veskikular,
cabang stag-horn, hifa terwarnai larutan eosin,
hifa tidak terwarnai larutan eosin, hifa
incrusted, kristal, sel gembung, ujung hifa
gembung, dan hifa besar berdinding tipis.
Metode yang dilakukan berdasarkan angka
bilangan biner, yaitu angka 1 menunjukkan
ada struktur mikroskopik dan angka 0 tidak
ada. Selanjutnya dimasukkan ke dalam
program MEGA 4.1 metode parsimoni
maksimum.
Pe rbanyakan Biakan Isolat. Koloni
masing-masing isolat Lentinus diinokulasi
pada media AMP dengan teknik aseptik. Isolat
yang telah diinokulasi kemudian diinkubasi
pada suhu 35oC selama 7 hari. Pada hari
terakhir miselium akan menutupi seluruh
permukaan media cawan (Rosa 1996).
Pe rbanyakan Koloni dan Isolasi DNA.
Kultur yang sudah berumur 7 hari pada
AEMP, dipotong dengan cord borer steril
yang berdiameter 7 mm dan diambil dengan
menggunakan scalpel steril. Kemudian satu
inokulum diinokulasikan pada permukaan
larutan 100 ml media EMPC steril dalam
Erlenmeyer 250 mlI sebanyak dua ulangan
dan diinkubasikan pada suhu 35oC dalam
keadaan statik (Rosa 1996). Bila permukaan
medium telah dipenuhi oleh miselium jamur
maka miselium jamur dipanen dan dipisahkan
dari medium cair dengan kertas saring
Whatman No.1.
Solichin (2004) melaporkan bahwa isolasi
DNA jamur dapat dilakukan dengan cara
mengambil miselium yang telah disaring
sebanyak 1 gram lalu digerus di dalam mortar
dengan ditambah larutan purifikasi CTAB
buffer (2% CTAB, 100 mM Tris HCl pH8,
1.4 M NaCl, 1% Polyvinilpirolidone, 0.2%
beta-mercaptoethanol) sebanyak 500 µl dalam
tabung Eppendorf dan diinkubasi pada suhu
65°C selama 3 jam. Kemudian sampel
ditambah 500 µl larutan fenol dan diayun
berputar secara rotasi selama 20 menit lalu
disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm
selama 3 menit. Setelah terbentuk endapan,
supernatan dipindahkan ke tabung Eppendorf
baru dan ditambah 500 µl larutan CIAA
(chloroform isoamil alcohol). Sampel diayun
berputar rotasi kembali selama 20 menit dan
disentrifugasi kembali dengan kecepatan
13000 rpm selama 3 menit. Di dalam tabung
akan terbentuk dua lapisan larutan. Bagian
atas merupakan lapisan CIAA dengan larutan
berwarna bening dan bagian bawah berwarna
agak keruh yang merupakan larutan yang
mengandung DNA. Bagian lapisan bawah
dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf baru
dan ditambah 100 µl sodium buffer. Sampel
diinkubasi pada suhu 65°C selama 15 menit.
Setelah itu, sampel ditambah 100 µl sodium
atau kalium asetat. Lalu sampel ditambah
HUBUNGAN KEKERABATAN BEBERAPA ISOLAT Lentinus ASAL
TROPIS BERDASARKAN SIFAT MIKROSKOPIK KULTUR DAN
MOLEKULAR
MOCHAMAD YADI NURJAYADI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
HUBUNGAN KEKERABATAN BEBERAPA ISOLAT Lentinus ASAL
TROPIS BERDASARKAN SIFAT MIKROSKOPIK KULTUR DAN
MOLEKULAR
MOCHAMAD YADI NURJAYADI
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains
Pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
ABSTRAK
MOCHAMAD YADI NURJAYADI. HUBUNGAN KEKERABATAN BEBERAPA ISOLAT
Lentinus ASAL TROPIS BERDASARKAN SIFAT MIKROSKOPIK KULTUR DAN
MOLEKULAR. Dibimbing oleh LISDAR A MANAF dan DEDY DURYADI S.
Jamur Lentinus merupakan jamur pelapuk kayu yang berpotensi sebagai obat yang tersebar
di berbagai kawasan daerah tropis dan subtropis. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui
hubungan kekerabatan jamur Lentinus isolat tropis berdasarkan sifat mikroskopik kultur dan sifat
molekular. Sampel yang digunakan ialah Lentinus isolat LU3, LU10 (L. torulosus), LC4, LC6 (L.
cladopus), LSC1, LSC7 (L. Sajor-caju), LP9 (L. quarrosulus), dan HS serta JTP (Pleurotus).
Media yang digunakan adalah agar ekstrak malt pepton (AEMP) dan agar ekstrak malt (AEM)
pada suhu 35°C untuk isolat Lentinus dan ±29°C untuk isolat HS dan JTP. Struktur mikroskopik
kultur setiap isolat diamati setelah isolat berumur 2 dan 4 minggu. Analisis molekular dilakukan
dengan mengamplifikasi DNA berdasarkan metode PCR-RAPD dengan menggunakan 2 primer
acak tunggal 10-mer, yaitu RP1 dan RP3. Sifat mikroskopik kultur dan molekular dinyatakan ke
dalam data biner dan diolah dengan program MEGA 4.1. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa
beberapa isolat Lentinus yang ditumbuhkan pada media AEMP memiliki penampakan koloni yang
berbeda dengan penampakan koloni pada media AEM. Berdasarkan pohon kekerabatan
mikroskopik kultur dan molekular, isolat Pleurotus (JTP) berada di luar kelompok A (kelompok
Lentinus dan HS) sebagai out group. Kelompok A terbagi menjadi dua cabang yaitu HS dan
kelompok Lentinus (B, C, D). Berdasarkan sifat molekular kelompok Lentinus terdiri dari
kelompok B dengan nilai konsistensi (NK) 57% yang terdiri dari LP9 dan LSC1 (NK=89%) dan
kelompok C dengan NK 20%. Kelompok C terdiri dari LSC7 dan LC6 (NK=65%) dan kelompok
D dengan NK=45%. Kelompok D terdiri dari isolat LU10 dan isolat LC4 dan LU3 (NK=46%).
Hubungan kekerabatan Lentinus berdasarkan molekular belum spesifik sehingga perlu dianalisis
kembali dengan penambahan primer lain.
ABSTRACT
MOCHAMAD YADI NURJAYADI. PHYLOGENY RELATIONSHIP OF SEVERAL
TROPICAL Lentinus BASED ON MICROSCOPIC AND MOLECULAR CHARACTERS.
Supervised by LISDAR A MANAF and DEDY DURYADI S.
Lentinus mushroom is a wood rot fungi used as medicine and distributed in tropic and
subtropic regions. The research aimed to know the phylogeny relationship of tropical Lentinus
mushroom isolates based on culture microscopic and molecular characters. Isolates of Lentinus
that were used are LU3, LU10 (L. torulosus), LC4, LC6 (L. cladopus), LSC1, LSC7 (L. sajorcaju), and LP9 (L. squarrosulus), HS, and JTP (Pleurotus). Culture media were malt extract
peptone agar (MEPA) and malt extract agar (MEA) at 35°C for Lentinus isolates and ±29°C for
HS and JTP isolates. The culture microscopic structure of each isolate was observed at 2 and 4
weeks old of cultures. Molecular analysis carried out amplification of DNA with PCR-RAPD
method using two 10-mer single random primers, RP1 and RP3. The culture microscopic and
molecular characters were converted into biner data and analysis using MEGA 4.1 program. The
observation showed that the colony appearances of some Lentinus isolates on MEPA media were
different from those of MEA. Based on phylogenic tree of culture microscopic and molecular
characters, Pleurotus isolate (JTP) was separated from A group (Lentinus and HS) as out group. A
group was devided to two branches, HS isolate and Lentinus group (B, C, D). Based on molecular
analysis, Lentinus group included B group(consistency value, CV=57%) which devided LP9 and
LSC1 isolates (CV=89%) and C group (CV=20%). C Group were devided into LSC7 and LC6
(CV=65%) and D group (CV=45%). D group included LU10 isolate and LC4 and LU3 isolates
(CV=46%). Molecular relationship of Lentinus based on molecular analysis was not yet specific so
need to analyze detailed with added another primer.
Judul Skripsi : Hubungan Kekerabatan Beberapa isolat Lentinus Asal Tropis
Berdasarkan Sifat Mikroskopik Kultur dan Molekular
Nama
: Mochamad Yadi Nurjayadi
NIM
: G34104080
Menyetujui,
Pembimbing I
Pembimbing II
Dr. Ir. Lisdar A. Manaf
Dr. Ir. Dedy Duryadi S, DEA
NIP 19591018 198403 2 001
NIP 19561102 198403 1 003
Mengetahui :
Ketua Departemen,
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M. Si
NIP 19641002 198903 1 002
Tanggal Lulus :
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT, karena atas rahmat dan hidayah-Nya
penulis dapat menyelesaikan skripsi hasil penelitian ini. Penelitian yang berlangsung dari bulan
Oktober 2008 hingga Juni 2009 ini berjudul Hubungan Kekerabatan Beberapa Isolat Lentinus Asal
Tropis Berdasarkan Sifat Mikroskopik dan Molekular.
Terima kasih penulis sampaikan kepada ibu Dr. Ir. Lisdar A Manaf dan bapak Dr. Ir. Dedy
Duryadi Solihin, DEA selaku pembimbing atas bimbingan, saran dan arahan selama proses
penelitian dan penyelesaian skripsi ini. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada Dr. Nunik Sri
Ariyanti M.Si. selaku dosen penguji atas semua masukan yang telah diberikan.
Terima kasih juga penulis sampaikan kepada bapak Iwa K selaku teknisi Laboratorium
Mikrobiologi dan Biokimia dan Bapak Heri selaku teknisi Laboratorium Biologi Molekular
PPSHB IPB, dan kepada seluruh staf Departemen Biologi atas fasilitas, saran, dan bantuannya.
Penulis menyampaikan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada kedua orang tua dan
kakak-kakak tersayang atas segala doa, dukungan, dan kasih sayang. Terima kasih juga penulis
sampaikan kepada teman-teman biologi angkatan 41 khususnya anak-anak ”8” (Uma, Moris,
Andik, Pams, Kushi, Muza, Budi), Deny K, Tina, Iffa, Disti, Achied, Melput, Idha, Forhuman
(Romzie, Rizal, Ajeng, Nurul, Winda) dan anak-anak Lamin Dentis (Zein, Farid, Okoy, Bogie,
Awang, Dede) atas semua kebersamaan dan hari-hari indah yang telah dijalani. Tidak lupa penulis
juga manyampaikan terima kasih kepada ibu-ibu, bapak-bapak, dan mba-mba yang ada di
Laboratorium Biologi Molekular khususnya Mba Andri, Bu Septi, Bu Rossa, Bu Suri, dan Mba
Handay atas dukungan, nasihat, dan kebersamaannya.
Penulis menyadari bahwa laporan ini masih jauh dari sempurna. Oleh karena itu, kritik dan
saran yang membangun sangat diharapkan. Semoga laporan ini dapat bermanfaat.
Bogor, Desember 2009
Mochamad Yadi Nurjayadi
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan tanggal 12 Nopember 1986 di Cirebon, Jawa Barat. Anak kelima dari lima
bersaudara pasangan Bapak Iing Sanjaya dan Ibu Dasih.
Tahun 2004 penulis lulus dari SMUN 3 Cirebon dan pada tahun yang sama diterima di
Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor
melalui jalur SPMB (Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru).
Selama masa perkuliahan, penulis aktif berorganisasi di dalam maupun di luar kampus. Selain
itu, penulis juga aktif mengikuti berbagai kegiatan yang bersifat kerohanian, kewirausahaan,
pelatihan motivasi, dan latihan kepemimpinan. Tahun 2006 - 2009 penulis aktif menjadi asisten
praktikum, yaitu mata kuliah Pendidikan Agama Islam, Fisiologi Tumbuhan, Biologi Cendawan,
dan Biologi Dasar.
Penulis melaksanakan Praktik Lapangan pada tahun 2007 di PT Adijaya Guna Satwata,
sebuah perusahaan yang bergerak dibidang pengolahan udang, dengan judul Pengolahan Udang
IQF (Individually Quick frozen) di PT Adijaya Guna Satwatama, Cirebon. Penulis juga aktif dalam
melaksanakan penyuluhan budidaya jamur tiram dan jamur merang pada tahun 2007 dan 2008.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ................................................................................................................ viii
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................................. viii
DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................................... viii
PENDAHULUAN
Latar Belakang .................................................................................................................. 1
Tujuan ............................................................................................................................. 1
Waktu dan Tempat ........................................................................................................... 1
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat.................................................................................................................. 2
Metode Penelitian ............................................................................................................. 2
Pengamatan Struktur Koloni dan Mikroskopik ............................................................ 2
Perbanyakan Biakan Isolat ......................................................................................... 2
Perbanyakan Koloni dan Isolasi DNA ........................................................................ 2
Analisis PCR-RAPD .................................................................................................. 3
Analisis Molekular ...................................................................................................... 3
HASIL
Penampakan Koloni dan Sifat Mikroskopik Kultur ........................................................... 3
Analisis PCR-RAPD ......................................................................................................... 5
PEMBAHASAN
Penampakan Koloni dan Sifat Mikroskopik Kultur ........................................................... 6
Hubungan kekerabatan ...................................................................................................... 7
SIMPULAN .......................................................................................................................... 9
SARAN ................................................................................................................................. 9
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................................ 9
LAMPIRAN ......................................................................................................................... 11
DAFTAR TABEL
Halaman
1.
2.
Penampakan koloni isolat Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1, LSC7, LP9), HS,
dan Pleurotus (JTP) di media AEMP dan AEM ............................................................ 4
Sifat mikroskopik kultur isolat Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1, LSC7, LP9),
HS, dan Pleurotus (JTP) di media AEMP dan AEM pada minggu ke-2 dan 4................ 5
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1.
2.
3.
4.
Pohon kekerabatan isolat Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1, LSC7, LP9),
HS, dan Pleurotus (JTP) berdasarkan sifat mikroskopik kultur........................................
Hasil amplifikasi DNA isolat Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1, LSC7, LP9),
HS, dan Pleurotus (JTP) dengan metode PCR-RAPD dengan menggunakan primer
RP1 (a) dan RP3 (b).......................................................................................................
Pohon kekerabatan isolat Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1, LSC7, LP9),
HS,dan Pleurotus (JTP) berdasarkan sifat molekular.. ....................................................
Struktur mikroskopik: (a) hifa terwarnai isolat LP9, (b) sambungan apit isolat HS,
(c) artrospora isolat LU3, (d) hifa berdinding tebal dan tipis isolat LU10, (e) sel
gembung isolat LSC1, (f) ujung hifa gembung isolat LC4, (g) klamidospora isolat
LSC1, (h) konidia dan konidiofor isolat HS, (i) kristal isolat LC4 ...................................
4
6
6
8
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1.
2.
3.
4.
Komposisi media dalam satu liter...................................................................................
Penampakan koloni isolat Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1, LSC7, LP9),
HS, dan Pleurotus (JTP) pada media AEMP dan AEM ..................................................
Istilah penampakan koloni .............................................................................................
Bilangan biner berdasarkan keberadaan pita dalam primer RP1 dan RP3
pada isolat Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1, LSC7, LP9), HS, dan
Pleurotus (JTP) .............................................................................................................
12
13
15
16
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Jamur Lentinus seperti halnya Ganoderma,
Trametes, Polyporus, dan Fomes merupakan
salah satu jamur pelapuk kayu yang tersebar
di berbagai kawasan tropis dan subtropis.
Jamur
Lentinus
termasuk
kelas
Basidiomycetes, ordo Polyporales dengan
famili Lentinaceae yang memiliki tubuh buah
makroskopik dengan struktur liat dan kokoh
serta tahan lama (Sudirman 1995). Pada
umumnya jamur ini memiliki ciri-ciri sebagai
berikut: berbentuk seperti payung; berukuran
sedang; warna beragam; permukaan tudung
(pileus) halus, berbulu atau bersisik dengan
bagian tengah melengkung ke bawah
(depressed), berlekuk ke dalam (umbilicate);
tangkai pada umumnya tidak di tengah atau
eksentrik,
kadang-kadang
membentuk
beberapa cabang sehingga terlihat seperti
tandan; lamela rapat dan turun mencapai
tangkai (decurrent); spora berwarna putih
(Pegler dan Young 1983).
Beberapa
jenis
Lentinus
dapat
menghasilkan senyawa aktif yang dapat
menghambat patogen penyakit (antimikrob,
antibakteri, antifungi) dan berkhasiat sebagai
antikolesterol dan antihipertensi selain dapat
sebagai bahan pangan. Diantara jenis
Lentinus asal tropis yang telah diteliti adalah
L. cladopus, L. sajor-caju, L. squarrosulus,
dan L. torulosus (Sudirman 2005).
Untuk
melihat
morfologi
dan
perkembangan tubuh beberapa spesies
Lentinus yang diisolasi dari alam telah dicoba
ditumbuhkan pada substrat serbuk gergaji.
Dari hasil penelitian tersebut terlihat adanya
keragaman morfologi pada tubuh buah
dewasa, walaupun pada tubuh buah yang
belum dewasa tidak menunjukkan perbedaan
bentuk dan warna (Sudirman 1995).
Telaah fisiologi dapat dilakukan dengan
membandingkan
pertumbuhan
kultur
miselium pada berbagai kondisi lingkungan
dan melakukan uji reaksi oksidasi pada media
agar dalam menumbuhkan kultur. Rosa (1996)
telah melakukan uji sifat fisiologi pada isolatisolat Lentinus yang telah dikulturkan dari
alam yang meliputi LPM, LSC, LPT, LP, LU,
LCEL, dan LC. Hasil penelitian yang
diperoleh adalah seluruh isolat mampu
tumbuh optimal pada beberapa kondisi
lingkungan dan memiliki reaksi positif pada
uji oksidasi di media agar asam galat (AAG)
dan agar asam tanat (AAT). Sedangkan uji
pada asam tirosin (AT) menghasilkan reaksi
negatif. Kesamaan sifat fisiologi tersebut
kemudian dibagi menjadi tiga kelompok.
Kelompok yang pertama meliputi LPM, LSC,
dan LPT. Bagian kelompok kedua mencakup
isolat LP. Untuk kelompok ketiga terdiri dari
LU, LCEL, dan LC.
Keanekaragaman spesies dapat disebabkan
karena telah terjadi perubahan susunan
nukleotida penyusun DNA. Perubahan ini
dapat
mempengaruhi
fenotipe
suatu
organisme atau mempengaruhi reaksi individu
terhadap lingkungan tertentu. Secara umum
keanekaragaman genetik dari suatu populasi
dapat terjadi karena adanya mutasi,
rekombinasi, atau migrasi gen dari satu tempat
ke tempat lain (Pereira et al. 2008). Tingkat
kekerabatan genus Lentinus dapat dilakukan
baik berdasarkan kesamaan sifat morfologi
tubuh buah, sifat fisiologi, sifat mikroskopik
di media kultur maupun berdasarkan sifat
molekular.
Metode PCR-RAPD merupakan teknik
penanda molekular yang digunakan untuk
mempelajari keragaman genetik spesies.
Dasar analisis RAPD adalah menggunakan
mesin PCR yang mampu mengamplifikasi
sekuen DNA secara in vitro. Teknik ini
menggunakan sepasang primer random yang
masing-masing
berukuran
10
basa.
Penggunaan penanda RAPD relatif sederhana
dan mudah dalam hal preparasi. Teknik
RAPD memberikan hasil yang lebih cepat
dibandingkan dengan teknik molekular
lainnya. Teknik ini juga mampu menghasilkan
jumlah karakter yang relatif tidak terbatas,
sehingga sangat membantu untuk keperluan
analisis keanekaragaman organisme yang
tidak diketahui latar belakang genomnya.
Teknik RAPD sering digunakan untuk
membedakan organisme tingkat tinggi
(eucaryote) (Saunders dan Helen 1999).
Penelitian tentang kekerabatan Lentinus
isolat
tropis
belum
banyak
yang
melakukannya.
Berdasarkan
penelitian
terdahulu, Noverita (2005) telah melakukan
pengelompokkan isolat Pleurotus liar dan
domestik melalui sifat molekular dengan
metode PCR-RAPD. Pada penelitian tersebut
digunakan isolat Lentinus sebagai out group.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui
hubungan kekerabatan jamur Lentinus isolat
tropis berdasarkan struktur sifat kultur
mikroskopik dan sifat molekular.
Waktu dan Tempat
Penelitian
ini
dilaksanakan
di
Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia dan
Laboratorium Biologi dan Molekular Pusat
Penelitan
Sumberdaya
Hayati
dan
Bioteknologi IPB (PPSHB-IPB) kampus IPB
Dramaga, Bogor mulai bulan Oktober 2008
sampai dengan Juni 2009.
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Sampel yang digunakan ialah isolat
koleksi Dr. Ir. Lisdar A Manaf meliputi isolat
Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1,
LSC7, LP9), isolat HS, dan isolat Pleurotus
(JTP), media agar ekstrak malt pepton
(AEMP), media agar ekstrak malt (AEM),
media agar sukrosa kentang (ASK), ekstrak
malt pepton cair (EMPC) (Lampiran 1),
larutan KOH, larutan eosin 1%, larutan
purifikasi cetyltrimethylammonium bromide
(CTAB) buffer, gel agarosa 1.2%, etidium
bromida, 2 primer acak tunggal (RP-1, RP-3),
akuabides, larutan amplifikasi (Tris-HCl pH8,
KCl,
ethylenediaminetetraacetic
acid
(EDTA), dithiothreitol (DTT), gliserol,
MgCl2, dNTP, enzim Taq polymerase.
Alat yang digunakan adalah: cawan Petri,
Erlenmeyer 250 ml, gelas ukur, cord borer,
scalpel, pipet pastur, lampu spirtus, autoclaf,
laminar air flow, incubator, kertas saring
Whatman no 1, tabung Eppendorf, mesin
PCR,
alat
elektroforesis,
sinar
UV
transiluminator.
Me tode Pe nelitian
Pengamatan Penampakan Koloni dan
Sifat Mikroskopik Kultur. Kultur masingmasing isolat diamati penampakan dan sifat
kulturnya
secara mikroskopik setelah
ditumbuhkan di media AEM dan AMP.
Penampakan koloni diamati setelah umur
isolat berumur 6 hingga 7 hari. Sedangkan
sifat mikroskopik kultur diamati pada saat
isolat berumur 2 dan 4 minggu. Pengamatan
dilakukan dengan cara mengambil miselium
dan struktur koloni yang kemudian diletakkan
di atas preparat yang telah diberi larutan KOH
(Kalium hidroksida) dan larutan pewarna
eosin 1%.
Keberadaan sifat mikroskopik kultur
kemudian divisualisasikan ke dalam bentuk
pohon kekerabatan melalui program MEGA
4.1. Penampakan yang dilihat meliputi
sambungan apit, klamidospora, konidia, oidia,
basidia, basidiospora, seta, sel veskikular,
cabang stag-horn, hifa terwarnai larutan eosin,
hifa tidak terwarnai larutan eosin, hifa
incrusted, kristal, sel gembung, ujung hifa
gembung, dan hifa besar berdinding tipis.
Metode yang dilakukan berdasarkan angka
bilangan biner, yaitu angka 1 menunjukkan
ada struktur mikroskopik dan angka 0 tidak
ada. Selanjutnya dimasukkan ke dalam
program MEGA 4.1 metode parsimoni
maksimum.
Pe rbanyakan Biakan Isolat. Koloni
masing-masing isolat Lentinus diinokulasi
pada media AMP dengan teknik aseptik. Isolat
yang telah diinokulasi kemudian diinkubasi
pada suhu 35oC selama 7 hari. Pada hari
terakhir miselium akan menutupi seluruh
permukaan media cawan (Rosa 1996).
Pe rbanyakan Koloni dan Isolasi DNA.
Kultur yang sudah berumur 7 hari pada
AEMP, dipotong dengan cord borer steril
yang berdiameter 7 mm dan diambil dengan
menggunakan scalpel steril. Kemudian satu
inokulum diinokulasikan pada permukaan
larutan 100 ml media EMPC steril dalam
Erlenmeyer 250 mlI sebanyak dua ulangan
dan diinkubasikan pada suhu 35oC dalam
keadaan statik (Rosa 1996). Bila permukaan
medium telah dipenuhi oleh miselium jamur
maka miselium jamur dipanen dan dipisahkan
dari medium cair dengan kertas saring
Whatman No.1.
Solichin (2004) melaporkan bahwa isolasi
DNA jamur dapat dilakukan dengan cara
mengambil miselium yang telah disaring
sebanyak 1 gram lalu digerus di dalam mortar
dengan ditambah larutan purifikasi CTAB
buffer (2% CTAB, 100 mM Tris HCl pH8,
1.4 M NaCl, 1% Polyvinilpirolidone, 0.2%
beta-mercaptoethanol) sebanyak 500 µl dalam
tabung Eppendorf dan diinkubasi pada suhu
65°C selama 3 jam. Kemudian sampel
ditambah 500 µl larutan fenol dan diayun
berputar secara rotasi selama 20 menit lalu
disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm
selama 3 menit. Setelah terbentuk endapan,
supernatan dipindahkan ke tabung Eppendorf
baru dan ditambah 500 µl larutan CIAA
(chloroform isoamil alcohol). Sampel diayun
berputar rotasi kembali selama 20 menit dan
disentrifugasi kembali dengan kecepatan
13000 rpm selama 3 menit. Di dalam tabung
akan terbentuk dua lapisan larutan. Bagian
atas merupakan lapisan CIAA dengan larutan
berwarna bening dan bagian bawah berwarna
agak keruh yang merupakan larutan yang
mengandung DNA. Bagian lapisan bawah
dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf baru
dan ditambah 100 µl sodium buffer. Sampel
diinkubasi pada suhu 65°C selama 15 menit.
Setelah itu, sampel ditambah 100 µl sodium
atau kalium asetat. Lalu sampel ditambah
etanol absolut 2X volume dan disimpan di
dalam freezer selama 30 menit. Kemudian
sampel disentrifugasi dengan kecepatan 13000
rpm selama 5 menit. Larutan etanol absolut di
dalam tabung Eppendorf dibuang dan diganti
dengan larutan etanol 70% sebanyak 400 µl.
Sampel disentrifugasi kembali dengan
kecepatan 13000 rpm selama 3 menit dan
larutan etanol 70% dibuang. Setelah tahapan
ini akan terbentuk endapan putih yang
merupakan ekstrak DNA. Ekstrak DNA
kemudian dikeringanginkan selama 30 menit
hingga dinding bagian dalam Eppendorf
kering. Setelah itu, ekstrak DNA ditambah
larutan TE (tris-EDTA buffer) sebanyak 50100 µl dan diinkubasi pada suhu 37°C selama
15 menit. Sampel ekstrak DNA lalu di simpan
di dalam freezer.
Ekstrak DNA yang dihasilkan dari
masing-masing sampel diuji kemurnian dan
kualitasnya dengan menggunakan 1.2 % gel
agarosa elektroforesis pada voltase 85 Volt
selama 45 menit di dalam larutan penyangga 1
x TBE (Tris Boric EDTA) kemudian diamati
dan difoto dengan menggunakan alat UVtransiluminator.
Analisis PCR-RAPD. Analisis PCRRAPD mengikuti metode Williams et al.
(1990). Ekstrak DNA diamplifikasi dengan
menggunakan 2 primer acak tunggal 10-mer:
RP1 dan RP3 dengan bantuan mesin PCR
(Gene Amp PCR System 2400 Perkin-Elmer).
Volume campuran untuk amplifikasi adalah
sebanyak 50μ l dengan kandungan: 34.75μ l
akuabides, 5 μ l Buffer amplifikasi 10x (20mM
Tris-HCl pH8, 100mM KCl, 0.1 mM EDTA,
50% gliserol), 3 μ l (25mM) MgCl2, 1.0 μ l
dNTP, 4.0 μ l primer RP1 atau RP3, 0.25 μ l (1
unit/reaksi) Taq polymerase. Campuran dibuat
di dalam tabung Eppendorf 0.2 ml.
Amplifikasi DNA dengan mesin PCR
melalui tahapan-tahapan sebagai berikut:
tahap pertama, pra-amplifikasi selama 3 menit
pada temperatur 94oC; tahap kedua, yaitu
pemisahan utas DNA genom (denaturasi) pada
temperatur 94oC selama 45 detik yang
berlangsung sebanyak 35 siklus selanjutnya
penempelan
primer
(annealing)
pada
temperatur 37oC selama 1 menit, elongasi
pada temperatur 72oC selama 1.5 menit; dan
tahap ketiga pasca amplifikasi pada
temperatur 72oC selama 5 menit. Hasil
amplifikasi DNA akan dilanjutkan dengan
tahap elektroforesis pada gel agarose dengan
konsentrasi 1.2% pada voltase 85 Volt selama
45 menit di dalam larutan penyangga 1 x TBE
kemudian diamati dan difoto dengan
menggunakan alat UV-transiluminator.
Analisis Mo le kular. Data dianalisis
berdasarkan hasil pemotretan gel berupa pola
pita DNA, kemudian diterjemahkan ke dalam
bilangan biner. Setiap pita dianggap mewakili
satu karakter dan diberi nilai 1 bila pita ada
dan 0 bila pita tidak ada. Penentuan dilakukan
dengan mengambil garis lurus secara
horisontal dengan membandingkan masingmasing fragmen DNA hasil PCR. Bilangan
biner lalu dirubah menjadi urutan nukleotida.
Pengelompokkan data disusun berdasarkan
matrik kesamaan secara berpasangan (cluster
analysis) dan pembuatan pohon kekerabatan
dilakukan
dengan
metode
parsimoni
maksimum dengan program MEGA versi 4.1.
Konsistensi pohon kekerabatan diuji dengan
melakukan uji Bootstrap dengan 1000
ulangan.
HASIL
Pe nampakan Koloni dan Sifat
Mikroskopik Kultur
Berdasarkan
hasil
pengamatan
menunjukkan bahwa beberapa isolat Lentinus,
HS, dan Pleurotus yang ditumbuhkan pada
media AEMP memiliki penampakan koloni
yang berbeda dengan media AEM (Tabel 1).
Penampakan koloni pada media AEMP pada
umumnya membentuk struktur plumose dan
selebihnya membentuk pulverulent, silky, dan
concentric cottony. Pada media AEM,
penampakan kultur
masing-masing isolat
Lentinus berubah kecuali isolat LC6 dan
LSC7 yang memiliki penampakan sama,
plumose dan LSC1 yaitu pulverulent. Isolat
yang lain membentuk penampakan kultur
silky, woolly bagian pinggir, concentric silky,
appressed, dan plumose. Tampilan gambar
dan penjelasan istilah penampakan koloni
disajikan pada Lampiran 2 dan 3.
Tabel 1 Penampakan koloni isolat Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1, LSC7, LP9), HS, dan
Pleurotus (JTP) di media AEMP dan AEM
No
Isolat
1
2
3
4
5
6
7
LU3
LU10
LC4
LC6
LSC1
LSC7
LP9
8
HS
9
JTP
AEMP
Plumose
Plumose
Plumose
Plumose
Pulverulent
Plumose
Silky
Concentric
cottony
Concentric
cottony
Sifat mikroskopik kultur setiap isolat
Lentinus, HS, dan Pleurotus yang ditumbuhi
di media AEMP dan AEM pada minggu ke-2
dan ke-4 memiliki struktur yang sama (Tabel
2). Isolat Lentinus, HS, dan Pleurotus berubah
menjadi hifa yang terwarnai (staining hyphae)
setelah dilakukan pewarnaan larutan eosin.
Struktur sambungan apit (clamp connection)
ditemui hampir pada seluruh isolat Lentinus,
HS, dan Pleurotus kecuali isolat LC4 dan
LSC1. Sebagian besar isolat membentuk
modifikasi hifa berupa sel gembung (swollen
cell), ujung hifa gembung (swollen hyphal
tip), hifa besar dan berdinding tipis (large
thin-walled hyphae). Struktur klamidospora
hanya terbentuk pada isolat LC4 dan LSC1.
Sedangkan artrospora hanya dibentuk oleh
isolat LU3 dan LSC7. Isolat HS memiliki
Media
AEM
Silky
Lateral wolly
Concentric silky
Plumose
Pulverulent
Plumose
Appressed
Plumose
Plumose
struktur modifikasi hifa berupa konidiofor dan
konidia yang terletak diantara sambungan
apit. Seluruh isolat Lentinus, HS, dan
Pleurotus membentuk kristal (crystal) setelah
penambahan larutan KOH dan pewarnaan
eosin.
Hasil pohon kekerabatan berdasarkan
penampakan mikroskopik kultur menunjukkan
bahwa isolat JTP terpisah dari kelompok A.
Pada kelompok A terbagi menjadi dua cabang
yaitu isolat HS yang mengelompok sendiri
dari kelompok Lentinus dan kelompok B, C,
dan D (LP9, LSC1, LC4, LC6, LU10, LSC7,
LU3). Nilai Konsistensi terbesar berada pada
pangkal cabang kelompok B sebesar 94 %
sedangkan nilai terkecil terdapat pada pangkal
cabang kelompok D, yaitu 10 % (Gambar 1).
40
LSC7
10
D
69
C
LU10
20
LC6
LC4
94
B
A
LU3
68
LSC1
LP9
HS
JTP
Gambar 1 Pohon kekerabatan isolat Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1, LSC7, LP9), HS,
dan Pleurotus (JTP) berdasarkan sifat mikroskopik kultur. Angka pada setiap
kelompok merupakan nilai konsistensi (%) yang diuji dengan uji Bootstrap 1000
ulangan melalui metode parsimoni maksimum.
Tabel 2 Sifat mikroskopik kultur isolat Lentinus (LU3, LU10, LC4, LC6, LSC1, LSC7, LP9), HS,
dan Pleurotus (JTP) di media AEMP dan AEM pada minggu ke-2 dan 4 (Davidson et al.
1945)
Isolat
No
Penampakan mikroskopik
LU3
LU10
LC4
LC6
LSC1
LSC7
LP9
HS
JTP
1
Sambungan apit
+
+
-
+
-
+
+
+
+
2
Klamidospora
-
-
+
-
+
-
-
-
-
3
Konidia dan konidiofor
-
-
-
-
-
-
-
+
-
4
Oidia
-
-
-
-
-
-
-
-
-
5
Basidia
-
-
-
-
-
-
-
-
-
6
Basidiospora
-
-
-
-
-
-
-
-
-
7
Seta
-
-
-
-
-
-
-
-
-
8
Sel veskikular
-
-
-
-
-
-
-
-
-
9
Cabang stag-horn
-
-
-
-
-
-
-
-
-
10
Hifa terwarnai eosin
+
+
+
+
+
+
+
+
+
11
Hifa tidak terwarnai eosin
-
-
-
-
-
-
-
-
-
12