R e a k si Ba l i k

© 2003 Digit ized by USU digit al library 9 dengan kegunaannya dalam analisa data kinetik dari enzim yang memerlukan lebih dari satu substrat. K CAT K M a da la h u k u r a n e fisie n si k a t a lit ik Suatu parameter kinetika enzim merupakan suatu ukuran dari efisiensi katalitiknya. Konstanta katalitik dari suatu enzim dapat didefenisikan sebagai: T max CAT ] E [ v K = [1.12] Jumlah kuantitas ini dikenal juga dengan angka turn over dari suatu enzim karena merupakan nilai proses reaksi turn over dimana tiap daerah aktif dapat mengkatalisis persatuan waktu. Angka turn over ini untuk enzim-enzim tertentu diberikan pada Tabel 1-1. Perhatikan bahwa kuantitas-kuantitas ini bervariasi hampir pada delapan bagian dari magnitudo tergantung pada identitas enzim dan juga substratnya. Persamaan ini [1.8] mengindikasikan bahwa untuk model Michaelis Menten, k CAT = k 2 . Untuk enzim-enzim dengan mekanisme yang lebih rumit, k CAT dapat berupa fungsi dari beberapa tingkat reaksi. Bila [S] K M, sangat sedikit [ES] dibentuk. Akibatnya [E] ≈ [E] T sehingga persamaan [13.22] berubah membentuk persamaan tingkat reaksi orde dua. V o ≈ ] S [ ] E [ K k ] S [ ] E [ K k M CAT T M 2         [1.13] K CAT K M adalah konstanta tingkat reaksi orde dua dari reaksi enzimatis, tingkat reaksi bervariasi secara langsung terhadap seberapa sering enzim dan substrat bergabung satu sama lain dalam larutan. Kuantitas k CAT K M untuk itu merupakan ukuran efisiensi katalistik enzim. Be be r a pa En z im M e m ilik i Ke se m pu r n a a n Ke r j a Ka t a lit ik Apakah ada batas teratas dari efisiensi katalitik enzim ? Dari persamaan [1.6] ditemukan 2 1 2 1 M 2 M CAT k k k k K k K k + = = [1.14] Ratio perbandingan ini adalah maksimal bila k 2 k -1 ; yaitu, ketika pembentukan produk dari Michaelis kompleks [ES] adalah lebih cepat daripada dekomposisi kembali menjadi substrat dan enzim. Maka k CAT K M = k 1 , konstanta kecepatan orde kedua untuk pembentukan ES. K 1 tentunya tidak boleh lebih besar daripada frekuensi dimana enzim dan substrat bertubrukan satu sama lain dalam larutan. Batas kontrol difusi ini berkisar dari 10 8 sampai 10 9 M -1 s -1 . Sehingga enzim-enzim dengan nilai-nilai seperti itu dari k CAT K M harus mengkatalisa suatu reaksi yang hampir setiap waktu enzim tersebut bergabung dengan molekul substrat.Tabel 1-1 mengindikasikan beberapa enzim seperti katalase, asetil kolinesterase, fumarase dan kemungkinan karbonik anhidrase telah mencapai kesempurnaan tingkat katalitik. Oleh karena daerah aktif suatu enzim secara umum hanya mengikat suatu fraksi kecil dari total permukaan daerah, bagaimana suatu enzim mengkatalisa suatu reaksi tiap waktu bila bergabung dengan molekul substrat?. Walaupun jawaban ini belum jelas, bukti struktural dan teoritical telah dikumpulkan untuk menduga bahwa pengaturan grup-grup bermuatan pada permukaan enzim berhubungan dengan petunjuk substrat polar secara elektrostatistik terhadap daerah-daerah aktif enzim..

C. R e a k si Ba l i k

Model Michaelis Menten secara implisit mengasumsikan bahwa reaksi balik enzimatik mungkin dapat diabaikan. Banyak reaksi enzimatik yang mempunyai daya reversibel dapat balik tinggi yang memiliki energi radiasi bebas yang kecil, dan oleh karena itu memiliki produk yang dapat bereaksi kembali membentuk substrat pada kecepatan yang tertentu. Dalam bagian © 2003 Digit ized by USU digit al library 10 ini dapat dilihat batasan Michaelis – Menten tanpa reaksi balik dan dengan demikian, akan menemukan beberapa hal yang menarik dan prinsip kinetik yang penting. M o d e l Sa t u P e r a n t a r a Modifikasi dari model Michaelis – Menten adalah memadukan hasil reaksi kembali seperti pada skema reaksi. E + S ES Disini ES adalah disebut EP karena model ini tidak menspesifikasikan sifat dari kompleks perantara. Persamaan yang menjelaskan perilaku kinetik dari model ini, dinyatakan sebagai : P M s M P M r max s M f max K ] P [ K ] S [ 1 K ] P [ V K ] S [ V v + + − = [ 1 . 1 5 ] dimana : T 2 f max ] E [ k V = T 1 r max ] E [ k V − = 2 2 1 P M k k k K − − + = dan [E] T = [E] + [ES] Ini merupakan persamaan Michaelis Menten yang sangat penting yang bekerja secara bolak balik. Dalam hal ini, pada [P] = 0, maka bila V = V o , persamaan ini menjadi persamaan Michaelis Menten. H u b u n g a n H a l d a n e Pada kesetimbangan, V = 0 sehingga persamaan [1.15] dapat diuraikan sehingga menghasilkan : s M r max P M f max eq K V K V ] S [ ] P [ K = = [ 1 . 1 6 ] yang dikenal sebagai hubungan Haldane. Hubungan ini menunjukkan bahwa p ar am et er k in et ik a d ar i r eak si b olak b alik y an g d ik at alisasik an secar a en zim at ik ad alah b u k an t id ak t er g an t u n g p ad a sat u sam a lain . Leb ih d ar i it u , in i salin g d ih u b u n g k an oleh k on st an t a k eset im b an g an u n t u k k eselu r u h an r eak si y an g t en t u saj a ad alah b er sif at in d ep en d en p ad a k eb er ad aan en zy m . D a t a Ki n e t i k T i d a k D a p a t M e n e n t u k a n M e k a n i sm e R e a k si Enzim yang membentuk senyawa reversibel dengan substratnya haruslah dalam hal ini, mempunyai mekanisme seperti : E + S ES Persamaan yang menjelaskan perilaku kinetik dari kedua model perantara ini, yang turunannya adalah analog terhadap apa yang diuraikan dalam Lampiran A untuk satu model perantara, yaitu memiliki bentuk yang identik dengan persamaan [1.15]. Namun, parameternya P M s M r f danK K V V , , , max max k 1 k- 1 K 2 k- 2 P + E k 1 k- 1 K 2 k- 2 EP k 3 k- 3 P + E © 2003 Digit ized by USU digit al library 11 didefinisikan dalam pengertian enam konstanta kinetika dari model dua perantara dari pada empat dari model satu perantara. Dalam kenyataan, persamaan kecepatan kondisi tunak untuk reaksi reversibel dengan tiga perantara atau lebih juga memiliki bentuk yang sama tetapi dengan definisi yang berbeda dari empat parameter. Nilai P M s M r max f max danK , K , V , V dalam pers [1.15] dapat ditentukan dengan manipulasi yang sesuai dari substrat awal dan konsentrasi produk di bawah kondisi tunak. Ini, tentu saja tidak menghasilkan nilai konstanta untuk model dua perantara karena terdapat enam konstanta dan hanya empat persamaan yang menjelaskan hubungannya. Lebih lanjut pengukuran kinetik kondisi tunak tidak mampu untuk membedakan jumlah perantara dalam reaksi enzimatik reversibel karena bentuk pers [1.15] tidak berubah dengan jumlah perantara. Identitas fungsional dari persamaan ini menjelaskan skema reaksi yang mungkin dapat dipahami dalam pengertian analogi antara model reaksi reversibel n-perantara dan kotak hitam yang mengandung sistem pipa air dengan satu inlet dan satu drain : Pada kondisi tunak, yaitu setelah pipa terisi dengan air, seseorang dapat mengukur hubungan antara tekanan input dan aliran output. Namun, berbagai pemeriksaan tidak menghasilkan informasi menyangkut konstruksi yang lebih rinci dari plumbing yang menghubungkan inlet dengan drain. Ini memerlukan informasi tambahan seperti pembukaan kotak hitam dan penelusuran pipa. Dem ikian j uga pengukuran kinet ika kondisi t unak dapat m em berikan uraian fenom enologi dari perilaku enzim , t et api sifat alam iah dari perant ara ini m asih t et ap t idak dapat dit ent ukan. Lebih dari it u, int erm ediasi at au perant araan ini haruslah t erdet eksi dan dikarakt erisasi dengan cara independen sepert i analisis spekt roskopik. Pembahasan ini terus menyoroti prinsip utama dari analisis kinetika : Analisis kinetika kondisi tunak dari reaksi, tidak dapat menentukan dengan jelas mekanismenya. Ini karena permasalahan tidak sederhana, elegan atau rasional dari mekanisme salah satu postulat yang dihitung dari data kinetika, juga adanya jumlah tak terbatas dari mekanisme alternatif, yang barangkali rumit, janggal, dan terlihat irasional, yang dapat dihitung untuk data kinetika yang ada. Biasanya ini lebih sederhana dan mekanisme elegan yang akan menghasilkan kebenaran, tetapi ini tidak selalu menjadi kasus. Jika dat a kinet ika t idak sesuai dengan m ekanism e yang dihasilkan, m aka m ekanism e harus dit olak. Oleh karena itu, meskipun kinetika tidak dapat digunakan untuk mekanisme yang tidak jelas tanpa data yng sesuai, seperti percobaan fisika dari eksistensi perantara, analisis kinetika kondisi tunak mempunyai arti yang besar besar karena dapat digunakan untuk menghilangkan mekanisme yang diajukan. 3 . I N H I BI SI Banyak bahan mengubah aktivitas dari suatu enzim dengan menggabungkannya dalam suatu jalur yang mempengaruhi ikatan substrat danatau nilai “turn-over”- © 2003 Digit ized by USU digit al library 12 nya. Bahan bahan yang mereduksi aktivitas suatu enzim dengan cara ini dikenal sebagai in h ibit or . Banyak inhibitor berupa bahan –bahan yang secara struktural menyerupai substrat enzimnya tetapi salah satunya tidak bereaksi atau bereaksi dengan sangat lambat dibandingkan dengan substrat. Inhibitor-inhibitor seperti ini pada umumnya digunakan untuk menyelidiki sifat kimia dan sifat konformasi alami dari suatu daerah site ikatan substrat sebagai bagian dari suatu usaha untuk mengelusidasi mekanisme katalisis enzim tersebut. Sebagai tambahan, banyak inhibitor enzim efektif sebagai bahan kemoterapi karena suatu analog substrat “tidak alami” dapat menghalangi aksi dari suatu enzim spesifik. Sebagai contohnya, ‘methotrexate’ juga disebut amethopterin secara kimiawi menyerupai dihidrofolat. Methotrexate berikatan kuat dengan enzim dihydrofolate reduktase, sehingga dengan demikian mencegahnya dari fungsi normalnya, reduksi dari dehidrofolat menjadi tetrahidrofolat, suatu kofaktor esensial dalam biosintesis dari prekursor DNA a sa m t h ym idylic . Dihydrofolate reductase C – NHCHCH 2 CH 2 COO - O COO - CH 2 – NH H H N H N HN O H 2 N Dihydrofolate © 2003 Digit ized by USU digit al library 13 Pembelahan sel-sel yang cepat seperti sel kanker, yang mana secara aktif berkaitan dengan sintesis DNA adalah jauh lebih rentan terhadap methotrexate daripada pertumbuhan sel-sel yang lambat seperti halnya kebanyakan jaringan sel normal mamalia. Untuk itu, methotrexate, bila diatur dalam dosis yang sesuai, akan membunuh sel-sel kanker tanpa secara fatal meracuni tubuh pemiliknya. Ada berbagai mekanisme dimana inhibitor enzim dapat bekerja. Dalam bahagian ini, akan dibicarakan beberapa mekanisme serupa yang paling sederhana dan efeknya pada perilaku kinetik enzim yang mengikuti model Michaelis – Menten. Inhibisi Kompetitif Suatu bahan yang berkompetisi secara langsung dengan suatu substrat normal untuk suatu daerah site ikatan enzim dikenal dengan suatu in h ibit or k om pe t it if . Inhibitor seperti ini biasanya menyerupai substrat dimana secara spesifik mengikat daerah aktif tetapi bila berbeda darinya sehingga menjadi tidak reaktif. Untuk itu, methotrexate merupakan suatu inhibitor kompetitif dari dihidrofolat reduktase. Sama seperti suksinat dehidrogenase, suatu enzim siklus asam sitrat, yang berfungsi untuk mengubah suksinat menjadi fumarat, secara kompetitif di inhibisi oleh malonat, dimana secara strukturnya menyerupai suksinat tetapi tidak dapat terdehidrogenasi. COO - CH 2 CH 2 COO - Su ccin a t e Fu m a r a t e COO - CH 2 NO REACTION COO - Efektivitas malonat dalam menginhibisi kompetitif suksinat dehidrogenase secara kuat menyatakan bahwa daerah site ikatan substrat enzim diatur untuk mengikat kedua grup substrat karboksilat, barang kali melalui pengaruh kira kira tempat dua muatan positif residu. Model umum untuk inhibisi kompetitif diberikan pada skema reaksi di bawah ini : E + S ES + I EI + S NO REACTION Diasumsikan bahwa I, inhibitor akan berikatan secara reversibel kepada enzim dan dicapai kesetimbangan dengan cepat sehingga : succinate dehydrogenase C C H COO - H - OOC succinate dehydrogenase k 1 k- 1 K 2 P + E © 2003 Digit ized by USU digit al library 14 ] EI [ ] I [ ] E [ K I = [1.17] dan EI, kompleks enzim inhibitor, secara katalitik tidak aktif. Suat u inhibit or kom pet it if unt uk it u bekerj a dengan m ereduksi konsent rasi enzim bebas yang t ersedia unt uk m engikat subst rat . Tujuan sebelumnya adalah untuk mengekspresikan V o dalam ukuran kuantitas; dalam hal [E] T , [S] dan [I]. Dimulai dalam kondisi konservatif dari turunan persamaan Michaelis Menten, yang mana sekarang harus dihitung dengan adanya EI. [E] T = [E] + [EI] + [ES] [1.18] Konsentrasi enzim dapat dinyatakan sebagai [ES] dengan mengatur kembali persamaan [1.2] di bawah kondisi tunak steady-state. ] S [ ] ES [ K ] E [ M = [1.19] Kompleks enzim – inhibitor diperoleh dengan mengatur kembali persamaan [1.17] dan mensubstitusi persamaan [1.19] ke dalamnya. I M I K ] S [ ] I [ ] ES [ K K ] I [ ] E [ ] EI [ = = [1.20] Dengan mensubstitusi kedua hasil sebelumnya dalam persamaan [1.18] diperoleh :       +     + = 1 K ] I [ 1 ] S [ K ] Es [ ] E [ I M T dimana dapat diperoleh [ES] dengan mengatur kembali persamaan tersebut ] S [ K ] I [ 1 K ] S [ ] E [ ] ES [ I M T +     + = maka, menurut persamaan [1.7], kecepatan awal dinyatakan dengan : ] S [ K ] I [ 1 K ] S [ ] E [ k ] ES [ k V I M T 2 2 o +     + = = [1.19] Lalu mengingat bahwa :     + = I K ] I [ 1 α [1.20] dan V max = k 2 [E] T seperti persamaan [13.23] ] S [ K ] S [ V V M max o + = α [1.21] © 2003 Digit ized by USU digit al library 15 Ga m ba r 5 . Su a t u plot k e ce pa t a n V o da r i r e a k si M ich a e lis M e n t e n se de r h a n a v e r su s k on se n t r a si su bst r a t [ S] de n ga n a da n ya pe r be da a n k on se n t r a si da r i in h ibit or k om pe t it if. Ini adalah persamaan Michaelis – Menten dengan K M dimodulasikan dengan α , suatu fungsi konsentrasi inhibitor yang menurut persamaan [1.20], harus bernilai ≥ 1. Nilai dari [S] pada V o = V max 2 adalah α K M . Gambar 5 menunjukkan plot hiperbola persamaan [1.21] untuk variasi nilai α . Perhatikan bahwa pada [S] ∞ , V o V max untuk setiap nilai α Semakin besar nilai α , semakin besar pula [S] harus mencapai nilai V max . Untuk itu, inhibitor tidak mempengaruhi nilai “turn-over” dari enzim. Hal ini lebih kepada keberadaan I memiliki pengaruh mengakibatkan [S] menjadi lebih encer daripada kenyataannya, atau secara alternatif membuat K M menjadi lebih besar daripada kenyataannya. Sebaliknya peningkatan [S] mengubah kesetimbangan ikatan substrat terhadap ES. Dengan demikian, terdapat kompetisi sebenarnya antara I dan S untuk daerah site ikatan enzim substrat; ikatannya adalah mutually exclusive. Dengan merujuk pada persamaan [1.21] dalam bentuk resiprok ganda diperoleh persamaan : max max M o V 1 ] S [ 1 V K V I +     = α [1.22] Suatu plot dari persamaan ini linier dan memiliki slope α K M V max , intersep dari 1[S] adalah -1 α K M , dan intersep dari 1V o adalah 1V max Gambar 6. Plot resiprok ganda unt uk inhibit or kom pet it if pada v ariasi konsent rasi I berpot ongan pada 1 V m ax dalam aksis 1 V o ; ini diagnose unt uk inhibisi kom pet it if unt uk m em bandingkan dengan t ipe- t ipe inhibisi lain. Dengan m enent ukan nilai- nilai α pada berbagai konsent rasi inhibit or y ang berbeda- beda, nilai K i dapat dibentuk dari persamaan [1.20]. Dengan cara ini, inhibitor-inhibitor kompetitif dapat digunakan untuk menyelidiki struktur alamiah dari suatu daerah site aktif. Sebagai contoh untuk menunjukkan pentingnya berbagai segmen dari suatu molekul ATP untuk berikatan dengan daerah site aktif dari enzim ATP yang diperlukan, salah satu dapat menentukan K I , seperti , untuk ADP, AM adenosan monofosfat, ribosa, trifosfat dan lain-lain. Oleh karena banyak komponen ATP ini secara katalitik tidak aktif, penelitian tentang inhibisi adalah bagian yang paling sesuai untuk memonitor ikatannya terhadap enzim. © 2003 Digit ized by USU digit al library 16 Apabila inhibitor mengikat enzim secara irreversibel, inhibitor tersebut digolongkan sebagai suatu in a k t iv a t or seperti bahan apapun yang pada dasarnya mengnon-aktifkan enzim. Inaktivator benar benar mereduksi level efektif [E] T pada semua nilai [S]. Ga m ba r 6 . Su a t u plot Lin e w e a v e r – Bu r k da r i in h ibisi M ich a e lis – M e n t e n se ca r a k om pe t it if e n z im da la m Ga m ba r 5 . Pe r h a t ik a n se m u a ga r is be r pot on ga n pa da I V o a k sis pa da I V m a x I n h ibisi N on - Kom pe t it if Dalam inhibisi non-kompetitif, inhibitor mengikat secara langsung ke kompleks enzim-substrat tetapi tidak ke enzim bebas. Tingkat peningkatan inhibitor, yang mana memiliki konstanta disosiasi , [ES] [I] K I = [1.23] [ESI] diasumsikan pada tingkat kesetimbangan. Ikatan inhibitor non-kompetitif, yang mana tidak perlu menyerupai substrat, bayangkan mengakibatkan distorsi struktural dari daerah aktif, sehingga mengakibatkan enzim secara katalitik tidak aktif. Apabila inhibitor berikatan dengan enzim sendiri, inhibitor tersebut juga bertindak seperti itu tanpa mempengaruhi affinitasnya terhadap substrat. © 2003 Digit ized by USU digit al library 17 Ga m ba r 7 . Su a t u plot Lin e w e a v e r – Bu r k da r i su a t u e n z im M ich a e lis – M e n t e n se de r h a n a de n ga n k e h a dir a n in h ibit or n on - k om pe t it if. Pe r h a t ik a n ba h w a se m u a ga r is m e m ilik i slope ide n t ik K M V m a x . Persamaan Michaelis – Menten untuk inhibisi non-kompetitif yang diturunkan, adalah : ] S [ K ] S [ V V M max o α α + = [1.24] dimana, I K ] I [ 1 + = α [1.25] Penyelidikan terhadap persamaan ini menunjukkan bahwa p ad a n ilai [ S] y an g t in g g i, V o ad alah m en d ek at i V m a x α ’ secar a asim p t om at ik seh in g g a b er b ed a d en g an in h ib it or k om p et it if , ef ek d ar i in h ib isi y an g t id ak k om p et it if p ad a V m a x ad alah t id ak d ap at b alik oleh p en in g k at an k on sen t r asi su b st r at . Namun, pada konsentrasi substrat yang rendah, dalam hal ini, bila [S] K M , maka pengaruh inhibisi yang tidak kompetitif menjadi dapat diabaikan, juga perilaku sifat yang berlawanan dari inhibisi kompetitif. Bila dibentuk dalam persamaan resiprok ganda, persamaan [1.24] menjadi : max max M o V ] S [ I V K V I α +     = [ 1 . 2 6 ] Plot Lineweaver-Burk untuk inhibisi hambatan yang tidak kompetitif adalah liner dengan kemiringan atau slope K M V max seperti di dalam reaksi yang tidak terhambat, dan dengan yang memotong 1V o dan 1[S] berupa α ’V max dan - α ’K M . Serangkaian plotLineweaver-Burk pada berbagai konsentrasi inhibitor yang tidak kompetitif terdiri dari serangkaian garis parallel gbr.7. Ini adalah dignosa untuk inhibisi yang tidak kompetitif. Inhibisi yang tidak kompetitif menyatakan bahwa inhibitor ini akan mempengaruhi fungsi enzym tetapi tidak terhadap ikatan dengan substrat. Untuk enzim dengan substrat tunggal, sangat sulit untuk mengemukakan bagaimana hal ini terjadi dengan pengecualian terhadap inhibitor kecil © 2003 Digit ized by USU digit al library 18 seperti proton atau ion logam. Sebagaimana diketahui bahwa, inhibisi yang tidak kompetitif adalah sangat penting bagi enzim dengan multisubstrat.

C. I n h i b i si Ca m p u r a n