20 lanjutan dengan menggunakan Uji Jarak Berganda Duncan UJGD pada taraf 5,
dengan menggunakan program SAS Release 6.12 SAS Inst. 2002 dan dilakukan uji keragaman fenotipik dari masing-masing perlakuan dosis iradiasi.
2. Kemampuan Regenerasi Tunas Mutan pada Tahap Multiplikasi dan
Pembesaran secara In Vitro
Percobaan ini dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan Pusat Kajian Buah-buahan Tropika PKBT Institut Pertanian Bogor selama 4 bulan.
Tunas-tunas yang telah mengalami pembesaran dalam media MS0 pada kegiatan sebalumnya, kemudian disubkultur kedalam media MS dengan
penambahan 1 mg L
-1
BAP Nursandi 2006 untuk pengujian kemampuan multiplikasi dari tunas-tunas mutan selama 8 MST. Tunas-tunas yang terbentuk
dalam media multiplikasi kemudian disubkultur kedalam media MS tanpa pemberian zat pengatur tumbuh untuk pemanjangan dan pembesaran tunas selama
8 MST. Parameter yang diamati terdiri dari : a jumlah tunas dan b jumlah daun. Rancangan percobaan yang digunakan adalan Rancangan Acak Lengkap.
Dosis iradiasi sinar gamma 0; 15; 25 dan 35 Gy digunakan sebagai perlakuan. Setiap unit percobaan diulang 10 kali. Model linier satu faktor dengan Rancangan
Acak Lengkap RAL menurut Mattjik dan Sumertajaya 2006. Perbedaan setiap perlakuan dianalisis dengan menggunakan uji F pada taraf
5, jika terdapat perbedaan nyata antar perlakuan maka dilakukan uji lanjutan dengan menggunakan Uji Jarak Dunnet pada taraf 5, dengan menggunakan
program SAS Release 6.12 SAS Inst. 2002. 3. Analisis Keragaman Genetik Mutan Berdasarkan Penanda
Morfologi dan Penanda Molekular ISSR
Percobaan ini dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan dan Laboratorium Molekular Pusat Kajian Buah-buahan Tropika PKBT Institut Pertanian Bogor
selama 4 bulan. Tunas-tunas yang telah mengalami pembesaran dalam media MS0 setelah
tahap multiplikasi, selanjutnya dilakukan subkultur setiap 4 minggu sebanyak dua kali pada MS0. Pengamatan dilakukan terhadap karakter morfologi jumlah daun,
bentuk daun, tinggi tunas, kedudukan daun, diameter tajuk, dan warna daun.
21 Analisis keragaman genetik mutan terseleksi dalam MS0 dengan
menggunakan penanda molekuler ISSR, dilakukan dengan menganalisis DNA dari mutan-mutan terseleksi yang memiliki penampilan karakter tertentu yang
mewakili populasi mutan. Percobaan dilaksanakan di Laboratorium Molekular Pusat Kajian Buah Tropika IPB selama dua bulan dengan tahapan sebagai berikut:
Pengambilan Sampel Daun. Sampel daun diambil dari setiap botol kultur
yang telah terseleksi unggul kalus embriogenik yang aktif berkembang dalam media.
Isolasi DNA Total.
Daun sebanyak 200 mg dimasukkan ke dalam mortar yang berisi 10 ml penyangga lisis 100 mM Tris-HCl pH 8.2 mv CTAB,
1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, dan 0.2 ß mercaptoethanol ditambahkan pada saat akan diisolasi dan 0.07 g pasir kuarsa, selanjutnya digerus sampai halus.
Cairanserbuk daun dipindahkan ke dalam tabung 15 ml dan diinkubasi pada suhu 65
o
C selama 30 menit. Suspensi DNA diambil dengan melakukan sentrifuse pada 11000 rpm selama 10 menit, dilanjutkan dengan ekstraksi 1 volume chloroform :
isoamil alkohol 24:1. DNA di dalam suspensi dipresipitasi dengan menambahkan 0.1 volume sodium asetat 3M pH 5.2 dan 0.8 volume isopropanol.
Endapan DNA yang dihasilkan melalui sentrifuse 11000 rpm selama 10 menit, dicuci dengan etanol 70, dikeringkan, dan DNA disuspensi dalam
500 μl larutan TE 1X. Suspensi DNA diektraksi berturut-turut dengan fenol,
kemudian dengan 1 volume kloroform : isoamil alkohol 24:1. Tahapan berikut adalah presipitasi sampai tahap mensuspensi DNA yang prosedurnya sama dengan
langkah sebelumnya.
Amplifikasi ISSR dengan PCR . Untuk amplifikasi ISSR, total campuran
yang digunakan adalah sebanyak 12.5 μl terdiri dari 30 - 100 ng genomic DNA,
0.5 μl primer, 1x PCR buffer, 0,2 mM dNTPs, 1,5 mM MgCl2, and 0,5 Unit rTaq
polymerase. Diusahakan pencampuran larutan homogen dan kegiatan dilakukan pada kondisi dingin diatas es. Amplifikasi dilakukan menggunakan thermocycle
dengan tahapan program sebagai berikut: Denaturasi awal pada kondisi 94 ºC
selama 2 menit, dilanjutkan dengan 35 putaran yang terdiri dari denaturasi pada 94
ºC selama 30 detik, amplifikasi 52ºC selama 45 detik, dan extension pada 72ºC of 2 menit. Setelah selesai 35 putaran selanjutnya diakhiri dengan final extension
22 pada 72
ºC selama 7 menit. Hasil dari reaksi kemudian dielektroforesis pada agarose gel pada konsentrasi 1,5. Gel kemudian diwarnai dengan Ethidium
bromide dan diamati di bawah UV transiluminator untuk melihat pola pita yang
dihasilkan. Primer ISSR yang digunakan sebanyak 19 buah, kemudian diseleksi dan hanya 5 primer menunjukkan tingkat polimorfisme yang tinggi Tabel 1.
Tabel 1 Susunan nukleotida, kandungan GC dari 19 primer berulang ISSR yang digunakan untuk seleksi primer
No. Primer Susunan oligonukleotida 5’ ---------------3’
TM
o
C 1 PKBT
1 ACACACACACACACACTG
54 2 PKBT
2 ACACACACACACACACTT
53 3 PKBT
3 AGAGAGAGAGAGAGAGT
53 4 PKBT
4 AGAGAGAGAGAGAGAGAA
53 5 PKBT
5 AGAGAGAGAGAGAGAGTA
53 6 PKBT
6 AGAGAGAGAGAGAGAGTT
53 7 PKBT
7 GAGAGAGAGAGAGAGAGAA
53 8 PKBT
8 GAGAGAGAGAGAGAGAGAC
54 9 PKBT
9 GAGAGAGAGAGAGAGAGAT
54 10 PKBT
10 GTGTGTGTGTGTGTGTGTA
54 11 PKBT
11 GTGTGTGTGTGTGTGTGTC
54 12 PKBT
12 GTGTGTGTGTGTGTGTGTT
54 13 ISSRED
12 AGAC
AGACAGACAGAC 50
14 ISSRED 14
GACAGACAGACAGACA 50 15
ISSRED 15 GATA GATA GATA GATAG
44 16 ISSRED
17 GACGACGACGACGAC
55 17 ISSRED
18 GGATGGATGGATGGAT 50
18 ISSRED 19
GAA GAA GAA GAA GAA GAA 46
19 ISSRED 26
CACACACACACAAG 46
Keterangan : primer terseleksi
Analisis Data 1. Analisis Keragaman Genetik Regeneran Mutan Berdasarkan Penanda
Morfologi
Hasil pengamatan pada Percobaan II untuk karakter morfologi jumlah daun, bentuk daun, tinggi tunas, kedudukan daun, warna daun, dan diameter tajuk
dalam media pembesaran MS0, kemudian diubah menjadi data biner dengan skoring data berdasarkan kriteria-kriteria yang sudah ditetapkan pada setiap
variabel. Bila ada nilai pada kriteria tersebut diskor ”1” atau tidak ada nilai diskor ”0”. Berdasarkan pada keragaman morfolgi yang muncul, selanjutnya dihitung
23 matrik kesamaan antar galur mutan yang dihitung berdasarkan Dice algoritme
yang terdapat dalam paket program NTSYSpc Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System
versus 2.02 Rohlf 1998.
2. Analisis Keragaman Genetik Regeneran Mutan Berdasarkan Penanda Molekular ISSR
