Visi Tinta Manik, 2013 Identifikasi Dan Filogenetika Bakteri Aeromonas Spp. Isolat Air Kolam Beberapa Kota Berdasarkan
Pada Sikuen Gen 16S rRNA Universitas Pendidikan Indonesia
| repository.upi.edu
| perpustakaan.upi.edu
Untuk primer act, ast, aopB, aerA, ascV, dan aexT, proses amplifikasi dengan total 45 siklus diawali dengan denaturasi awal pada suhu 94
o
C selama 5 menit, diikuti 17 siklus yang terdiri dari denaturasi pada suhu 94
o
C selama 30 detik, annealing pada suhu 62-54
o
C, elongasi pada suhu 72
o
C selama 1 menit, kemudian dilanjutkan dengan 28 siklus berikutnya yang terdiri dari proses denaturasi pada
suhu 94
o
C selama 30 detik, annealing pada suhu 53
o
C, elongasi pada suhu 72
o
C dan diakhiri dengan elongasi akhir pada suhu 72
o
C selama 10 menit. Program amplifikasi dapat dilihat pada gambar 3.3
Gambar 3.3. Program suhu PCR yang digunakan untuk amplifikasi Gen Virulen act, ast, aopB, aerA, ascV, dan aexT
Hasil PCR kemudian diamati dengan elektroforesis gel agaros 1.4 . Sebanyak 3 µl DNA amplikon dicampur dengan 1µl loading dye. Kemudian
sampel dimasukkan ke dalam sumur. DNA marker yang digunakan adalah FastRuler DNA Ladder Middle range ready-to-use. Sebanyak 2µl DNA marker
dicampur dengan deion 1µl. Elektroforesis dilakukan selama 20 menit pada tegangan 100 volt dengan buffer TBE 1x sebagai running buffer.Hasil
elektroforesis dilihat dengan alat sinar UV dan difoto dengan menggunakan kamera digital merk Cannon.
4 Pra sikuensing
a. Identifikasi Gen 16S rRNA Dengan Metode PCR
Proses amplifikasi gen 16S rRNA dilakukan dengan menggunakan alat PCR. Komposisi yang digunakan menurut protokol Gotaq Green Master Mix 2x KAPA
Fast Ready Mix yaitu dengan total volum 50µl, yang berisi KAPAGoTaq Master
Visi Tinta Manik, 2013 Identifikasi Dan Filogenetika Bakteri Aeromonas Spp. Isolat Air Kolam Beberapa Kota Berdasarkan
Pada Sikuen Gen 16S rRNA Universitas Pendidikan Indonesia
| repository.upi.edu
| perpustakaan.upi.edu
Mix sebanyak 25µl, Primer FR masing-masing 2µl, DNA templat 4µl, dan deion steril 19µl. Primer yang digunakan adalah 27F 5’ AGA GTT TGA TCC TGG
CTC AG 3’ dan 1492R 5’ GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3’.
Proses amplifikasi diawali dengan denaturasi awal pada suhu 95
o
C selama 5 menit, diikuti 28 kali siklus yang terdiri dari tahap denaturasi pada suhu 95
o
C selama 30 detik, proses annealing pada suhu 54
o
C selama 30 detik, proses elongasi pada suhu 72
o
C selama 90 detik, dan diakhiri proses elongasi akhir pada suhu 72
o
C selama 10 menit. Program suhu PCR dalam proses amplifikasi dapat dilihat pada Gambar 3.4.
Gambar 3.4 Program Suhu PCR yang Digunakan dalam Proses Amplifikasi Gen 16S rRNA
b. Purifikasi DNA amplikon 16S rRNA
Hasil amplifikasi gen 16S rRNA dipindahkan ke dalam tabung 1.5 ml, kemudian DF Buffer sebanyak 5x total volum hasil PCR ditambahkan ke dalam
tabung 1.5 ml. Kolom DF ditempatkan pada tabung 2ml Collection tabung, kemudian sampel dipindahkan kedalam Kolom DF lalu sampel disentrifugasi
pada 10.000 rpm selama 30 detik. Cairan pada tabung 2ml dibuang, kemudian Kolom DF ditempatkan kembali pada tabung 2ml. Selanjutnya sebanyak 600 µl
Wash buffer dimasukkan pada Kolom DF dengan cara diteteskan tepat pada tengah membrane Kolom DF dan dibiarkan selama 1 menit. Kemudian sampel
disentrifugasi pada 10.000 rpm selama 30 detik. Larutan pada tabung 2 ml dibuang, kemudian Kolom DF disentrifugasi kembali pada 10.000 rpm selama 3
10menit 72
o
C 90 detik
30 detik 54
o
C 30 detik
95
o
C 5 menit
95
o
C 72
o
C
28 siklus
Visi Tinta Manik, 2013 Identifikasi Dan Filogenetika Bakteri Aeromonas Spp. Isolat Air Kolam Beberapa Kota Berdasarkan
Pada Sikuen Gen 16S rRNA Universitas Pendidikan Indonesia
| repository.upi.edu
| perpustakaan.upi.edu
menit untuk mengeringkan kolom matriks. Selanjutnya Kolom DF dipindahkan pada tabung 1.5 ml yang baru. Setelah itu sebanyak 75 µl Buffer elusi
ditambahkan kedalam Kolom DF melalui kolom matriks pada bagian tengah dan didiamkan selama 7 menit agar buffer elusi dapat diserap oleh matriks dengan
sempurna. Setelah itu, sampel disentrifugasi selama 2 menit pada 10.000 rpm. DNA amplikon hasil purifikasi dianalisis dengan elektroforesis dalam gel
agaros 1,5. Sebanyak 3µl DNA dicampur dengan 1 µl loading dye. Kemudian sampel dimasukkan kedalam sumur yang terdapat dalam gel. DNA marker yang
digunakan adalah FastRuler DNA Ladder low range, ready-to-use sebanyak 2µl dicampur dengan deion 1 µl. Elektroforesis dilakukan selama 30 menit pada
tegangan 100 volt dengan buffer TBE 1x sebagai running buffer. Gel diwarnai dengan Ethium bromide selama 5 menit, kemudian gel dicuci dengan akuades
selama 7 menit. Hasil elektroforesis dilihat dengan alat sinar UV dan difoto dengan menggunakan kamera digital merk Cannon.
c. Mengukur konsentrasi DNA Amplikon Hasil Purifikasi
