Ketahanan Mutan Cronobacter Sakazakii Dan Mikroorganisme Lain Terhadap Ampisilin Untuk Pengembangan Media Sepsifik
KETAHANAN MUTAN Cronobacter sakazakii DAN
MIKROORGANISME LAIN TERHADAP AMPISILIN UNTUK
PENGEMBANGAN MEDIA SPESIFIK
RUTH THERESIA
DEPARTEMEN ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Ketahanan Mutan
Cronobacter sakazakii dan Mikroorganisme Lain terhadap Ampisilin untuk
Pengembangan Media Spesifik adalah benar karya saya dengan arahan dari
komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan
tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, September 2015
Ruth Theresia
NIM F24110056
ABSTRAK
RUTH THERESIA. Ketahanan Mutan Cronobacter sakazakii dan
Mikroorganisme Lain terhadap Ampisilin untuk Pengembangan Media Sepsifik.
Dibimbing oleh SITI NURJANAH.
C. sakazakii ditemukan sebagai kontaminan pada pangan kering. Metode
analisis mikrobiologi pangan konvensional masih sulit digunakan untuk
membedakan bakteri target dengan bakteri lainnya serta mikroorganisme lain.
Penggunaan isolat mutan yang dilabel dengan plasmid Green Flourescent Protein
(pGFP) dapat mempermudah analisis, tetapi masih diperlukan pengembangan
media spesifik untuk metode deteksi dan pengujian. Penelitian ini bertujuan untuk
mengetahui ketahanan hidup C. sakazakii mutan dan wild-type pada media yang
mengandung ampisilin, menentukan konsentrasi ampisilin optimum dan
mengetahui profil ketahanan mikroorganisme lain (bakteri asam laktat, khamir
dan kapang) dalam media ampisilin. Metode perhitungan yang digunakan adalah
Standar Plate Count. Isolat C. sakazakii FWHc3 wild-type dan YRt2a wild-type
tidak dapat tumbuh pada media TSA yang mengandung ampisilin sedangkan
isolat C. sakazakii mutan dapat bertahan pada media ampisilin. Konsentrasi
optimum untuk isolat FWHc3 mutan dan YRt2a mutan adalah konsentrasi 30
µg/ml berdasarkan perhitungan skor tertimbang, dimana FWHc3 mutan dan
YRt2a mutan memiliki nilai recovery number yang optimum masing-masing
sebesar 87.50 % dan 107.04 % serta adanya reduksi jumlah khamir sebesar 2 log
dan bakteri asam laktat sebesar 3.2log. Isolat C. sakazakii, kapang, khamir dan
bakteri asam laktat yang ditumbuhkan secara bersamaan pada konsentrasi
optimum menunjukan pertumbuhan mutan tidak terganggu atau tidak berbeda
dengan kontrol, tetapi kapang, khamir dan bakteri asam laktat menurun.
Kata kunci : C. sakazakii, Green Flourescent Protein, Bakteri asam laktat,
Ampisilin, Khamir
ABSTRACT
RUTH THERESIA. Resistance of Mutants C. sakazakii and other microorganisms
against Ampicilin for Development of a Spesific Enumeration Medium.
Supervised by SITI NURJANAH.
C. sakazakii was found as a contaminant in dried food. However,
microbiological analysis by conventional methods is difficult to distinguish the
target bacterian from other microorganisms. Use of mutant, example Cronobacter
sakazakii labeled with pGFP, could improve the detection rate, but it required
development a specific medium. This study aimed to determine: the survival of C.
sakazakii mutant and wild-type in media containing ampicillin, optimum
concentration of ampicillin and the resistance of other microorganisms against
ampicillin. The method of enumeration used was Standard Plate Count, Reduction
Amount and Number of Recovery Mutant. The results showed that isolates of C.
sakazakii FWHc3 and YRt2a wild-type did not grow on TSA medium containing
ampicillin whereas mutant isolates of C. sakazakii survived on ampicillin media.
Optimum concentration of mutant isolates FWHc3 and YRt2a mutant at a
concentration of 30 µg/ml against molds based on weighted scoring, yeasts and
latic acid bacterian because both of them had recovery number mutant optimum
(87.50 % for FWHc3 and 107.04 % for YRt2a), reduction amount of yeast (2 log)
and lactic acid bacterian (3.2 log). Observation of isolates mixture at the optimum
concentration, growth of mutant was not hampered but molds, yeasts and lactic
acid bacteria decreased.
Keywords : C. sakazakii, Green Flourescent Protein, Lactic acid bacterian,
Ampicilin, Mold
KETAHANAN MUTAN Cronobacter sakazakii DAN
MIKROORGANISME LAIN TERHADAP AMPISILIN UNTUK
PENGEMBANGAN MEDIA SPESIFIK
RUTH THERESIA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Teknologi Pertanian
pada
Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan
Fakultas Teknologi Pertanian
Institut Pertanian Bogor
DEPARTEMEN ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
Judul
: Ketahanan Mutan Cronobacter sakazakii dan Mikroorganisme Lain
Nama
: Ruth Theresia
NIM
: F24110056
terhadap Ampisilin untuk Pengembangan Media Spesiik
Disetujui oleh :
ｾ＠
Dr. Siti Nurjanah STP, MSi.
Dosen Pembimbing
Diketahu i oleh:
Tanggal Lulus:
f2
1 SEP 205
PRAKATA
Segala puji dan syukur dipanjatkan kepada Tuhan Yang Maha Kuasa, atas kasih
dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah dengan
judul “Ketahanan Mutan Cronobacter sakazakii dan Mikroorganisme Lain
terhadap Ampisilin untuk Pengembangan Media Spesifik”dapat diselesaikan.
Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada:
1. Bapak (Parlaungan Sihombing) dan Mama (Alm Dra. Dianna Siburian)
selaku orang tua yang telah mendoakan serta memberi semangat, nasehat dan
dukungannya. Tidak lupa terima kasih untuk kakak dan adik tercinta
Novriana Elizabeth ST dan Samuel Leonardo untuk dukungannya.
2. Dr. Siti Nurjanah STP, M.Si sebagai dosen pembimbing skripsi yang telah
banyak memberikan arahan dan bimbingan kepada penulis hingga
terselesaikannya skripsi ini.
3. Prof. Dr. Ir. Ratih Dewanti, MSc dan Dr. Ir. Budi Nurtama selaku dosen
penguji.
4. Brian Hoffni ST yang selalu memberi dukungan bantuan dan saran dalam
penulisan skripsi ini serta Aldila Setiawati dan Nuriska Rahma Dewanti.
5. Teman-teman mikrob atas kebersamaannya di laboratorium dan masukannya,
serta teman-teman ITP 48 yang telah mendukung dan membantu dalam
penulisan skripsi ini.
6. Para teknisi laboratorium Mbak Ari, Kak Tami dan Teh Asih yang membantu
penulis selama di laboratorium.
Penulis berharap penelitian ini dapat memberikan manfaat bagi semua pihak.
Bogor, September 2015
Ruth Theresia
vi
DAFTAR ISI
DAFTAR ISI
vi
DAFTAR TABEL
vii
DAFTARGAMBAR
vii
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
2
Manfaat Penelitian
2
METODE
2
Waktu dan Tempat Penelitian
2
Bahan dan Alat
2
Prosedur Penelitian
3
Pemupukan pada Media Ampisilin
5
Perhitungan Penurunan Jumlah Mikroba terhadap Konsentrasi Ampisilin
5
Penentuan Konsentrasi Ampisilin Optimum
6
Pengujian profil pertumbuhan C. sakazakii mutan dan
mikroorganisme lainnya pada konsentrasi optimum secara bersamaan
6
Analisis Statistik
6
HASIL DAN PEMBAHASAN
7
Ketahanan Hidup C. sakazakii Wild-type dan Mutan pada Media Ampisilin
7
Konsentrasi Ampisilin Optimum
8
Profil Pertumbuhan C. sakazakii Mutan, BAL, Khamir dan Kapang
pada Konsentrasi Ampisilin Optimum yang Ditumbuhkan secara Bersamaan 10
PENUTUP
11
Simpulan
11
Saran
12
DAFTAR PUSTAKA
13
Riwayat Hidup
15
15
DAFTAR TABEL
1 Jenis-jenis Isolat yang Digunakan dalam Penelitian
2 Skor tertimbang dari Recovery number mutan serta nilai reduksi
3 Jumlah koloni C. sakazakii mutan, kapang serta BAL dan khamir
3
10
11
DAFTAR GAMBAR
1 Diagram alir penelitian
2 Jumlah koloni C. sakazakii FWHc3 dan YRt2a dalam media ampisilin
3 Jumlah koloni C. sakazakii Mutan, BAL, Khamir dan Kapang yang
Ditumbuhkan pada Media Ampisilin
4 Pengamatan mikroorganisme campuran
4
7
10
12
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Cronobacter sakazakii (sebelumnya dikenal sebagai Enterobacter
sakazakii) adalah bakteri gram negatif, berbentuk batang, fakultatif anaerob dan
motil (Healy et al. 2010). C. sakazakii merupakan salah satu dari tujuh spesies
dalam genus Cronobacter spp. Perbedaan antara spesies ini adalah berdasarkan
reaksi biokimia, serologi dan molekuler teknik (Iversen et al 2008). C. sakazakii
termasuk salah satu bakteri patogen atau bakteri yang dapat menyebabkan
penyakit. Bakteri ini banyak terdapat di lingkungan sekitar kita bahkan bisa juga
ditemukan di dalam pencernaan manusia yang sehat (Tisnadjaja 2011).
Infeksi pada manusia yang disebabkan oleh C. sakazakii dapat terjadi pada
semua kalangan usia. Bayi paling berisiko untuk terinfeksi bakteri ini, terutama
pada bayi yang mengalami berat badan kurang, bayi lahir prematur, bayi yang
mempunyai penurunan sistem imun, bayi dari ibu yang menderita HIV
(FAO/WHO 2008). Adanya kasus meningitis yang disebabkan oleh infeksi C.
sakazakii dan telah diisolasi dari jaringan otak dan cairan cerebrospinal bayi yang
terserang meningitis di Osterhills Hospital, Inggris (Urmenyi AMC dan Franklin
AW 1961). Gitapratiwi (2011) telah mengisolasi C. sakazakii dari maizena (2
sampel dari 8 sampel). Kontaminasi C. sakazakii pada pati-patian juga ditemukan
oleh Hamdani (2012), yaitu 1 sampel pati singkong (tapioka) dari 3 sampel patipatian serta Senzani (2011) juga telah mengisolasi C. sakazakii dari sayuran, yaitu
kubis.
Metode analisis mikrobiologi pangan konvensional tidak dapat
membedakan bakteri target dengan mikroorganisme lainnya. Hal ini disebabkan
karena pada bahan pangan mengandung mikroorganisme dengan jumlah dan jenis
yang beragam. Selain itu metode konvensional memerlukan waktu yang lama dan
biaya yang besar. Teknik pelabelan menggunakan plasmid Green Flourescent
Protein (pGFP) menjadi salah satu alternatif penelusuran perilaku bakteri ini
tanpa melakukan dekontaminasi atau sterilisasi untuk menekan pertumbuhan
ataupun membunuh mikroba lainnya (Nurjanah 2014).
Teknik pelabelan dilakukan dengan cara menyisipkan plasmid GFP pada
isolat C. sakazakii. Selain itu pGFP juga tidak bersifat toksik sehingga uji biologis
dapat dilakukan secara in vivo dan pengambilan gambar bisa menggunakan sel
hidup (in vivo imaging) (Widyajayantie 2011). pGFPuv merupakan salah satu
varian plasmid Green Flourescent Protein (pGFP) yang memikilik intensitas
berflouresen 45 kali lipat di bawah sinar UV sehingga dapat dibedakan dengan
mikroorganisme lainnya dan dapat tumbuh pada media yang mengandung
ampisilin. Pada media yang mengandung ampisilin isolat mutan lebih stabil
berflouresen. Menurut Zahner dan Maas (1972), ampisilin dapat bersifat
bakterisidal terhadap bakteri gram negatif dan gram positif. Selain C. sakazakii
mutan dapat bertahan terhadap ampisilin tetapi ada beberapa mikroorganisme
lainya dapat tumbuh terutama kelompok khamir dan kapang.
Penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Sarah (2013) telah melakukan
penumbuhan mutan dalam media ampsilin dan membandingkannya dengan
mikroorganisme lainnya namun perhitungan yang dilakukan secara kualitatif.
Pertumbuhan mikroorganisme lain ini dapat mengganggu dalam perhitungan jika
2
jumlahnya lebih besar dari mutan. Oleh karena itu, penting dicari konsentrasi
ampisilin optimum yang ditambahkan dalam media perhitungan. Konsentrasi
optimum ini dipilih berdasarkan nilai recovery number mutan dan penurunan
bakteri asam laktat (BAL) sampai dengan tiga log sehingga tidak mengganggu
pengamatan mutan. Recovery number adalah persentase jumlah koloni mutan
yang hidup dalam media ampisilin dibandingkan dengan media tanpa ampisilin.
C. sakazakii yang digunakan pada penelitian ini adalah isolat wild-type
YRt2a (Meutia 2008) dan FWHc3 (Hamdani 2012) serta isolat mutan dari kedua
nya (Nurjanah 2014). Penelitian ini bertujuan mengetahui ketahanan C. sakazakii
baik wild-type ataupun mutan terhadap media ampisilin dan juga akan
dibandingkan dengan mikroorganisme lain seperti kapang (A. flavus, A. niger, F.
oxysporum), khamir (K. ohmeri, C. krusei, dan C. zeylanoides) dan kultur BAL
(Pediococcus sp., L. plantarum, dan L. Lactis) yang telah diisolasi oleh
Rahmawati et al (2012) dalam media ampisilin ditumbuhkan secara bersamaan
untuk menentukan konsentrasi ampisilin optimum.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan:
1. Mengetahui ketahanan hidup C. sakazakii wild-type dan mutan pada media
yang mengandung ampisilin.
2. Menentukan konsentrasi ampisilin optimum dalam media untuk mendukung
pertumbuhan C. sakazakii mutan.
3. Melihat profil pertumbuhan C. sakazakii mutan dan mikroorganisme lain
(Kapang, khamir dan BAL) pada konsentrasi ampisilin optimum yang
ditumbuhkan bersamaan.
Manfaat Penelitian
Manfaat yang diharapkan dari penelitian ini adalah diperolehnya informasi
tentang ketahanan C. sakazakii wild-type dan mutan serta mikroorganisme lain
(Kapang, khamir dan BAL) terhadap antibiotik ampisilin. Konsentrasi ampisilin
optimum direkomendasikan untuk digunakan dalam media.
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan selama bulan Februari - Agustus 2015. Penelitian
dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi SEAFAST Center IPB.
Bahan dan Alat
Bahan baku yang digunakan pada penelitian ini adalah ampisilin, air
destilata, alkohol 70%, spirtus, kapas, kertas tisu, plastik, aluminium foil, media
pertumbuhan TSA (Tryptone Soy Agar), DFIA (Druggan Forsythe Iversen Agar),
BHI (Brain Heart Infusion), BPW (Buffered Peptone Water), PDA (Potato
Dextrose Agar), MRSB (De Man Rogosa Sharp Broth), dan NB (Nutrient Broth).
3
Kultur bakteri yang digunakan adalah koleksi SEAFAST Center dapat dilihat
pada Tabel 1. Peralatan yang digunakan pada penelitian ini terdiri dari neraca,
inkubator suhu 37°C, inkubator suhu 55°C, autoklaf, oven, lampu UV (366 nm),
pipet mikro, tip pipet, tabung reaksi berulir, cawan petri, erlenmeyer, gelas piala,
gelas ukur, sudip, sendok, rak tabung reaksi, hocky stick, pipet Mohr, pipet tetes,
bulb, bunsen, kaca preparat, dan gelas objek.
Tabel 1 Jenis-jenis Isolat yang Digunakan dalam Penelitian
Kelompok
Spesies/ kode
Referensi
mikroorganisme
C. sakazakii
C. sakazakii FWHc3 mutan
Nurjanah 2014
C. sakazakii YRt2a mutan
BAL
Khamir
Kapang
C. sakazakii FWHc3 wild-type
Hamdani 2012
C. sakazakii YRt2a wild-type
Meutia 2008
Pediococcus sp.
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus lactis
Kodameae ohmeri
Candida krusei
Candida zeylanoides
Aspergillus flavus
Aspergillus niger
Fusarium oxysporum
Rahmawati 2012
Prosedur Penelitian
Penelitian ini terdiri dari dua tahap yaitu (1) penentuan konsentrasi
ampisilin optimum untuk media perhitungan C. sakazakii mutan, (2) profil
pertumbuhan mutan C. sakazakii dan mikroorganisme lainnya (BAL, khamir dan
kapang). Diagram alir penelitian dapat dilihat pada Gambar 1.
4
Tahap 1 Penentuan Konsentrasi Ampisilin Optimum
Kultur
Ampisilin
Persiapan Kultur
Pemupukan secara
terpisah
Pembuatan media
ampisilin dengan
konsentrasi
0, 10, 20, 30, 40, 50,
75, 100 μg/ml
Perhitungan Jumlah Koloni
(Standart Plate Count)
Perhitungan :
1. Recovery number mutan
2. Jumlah reduksi BAL, khamir dan kapang
Konsentrasi optimum
Pemupukan
secara bersamaan
Tahap 2 Profil Pertumbuhan
Profil pertumbuhan C. sakazakii
mutan, BAL, khamir dan kapang
Gambar 1 Diagram alir penelitian
5
Pemupukan pada Media Ampisilin
Persiapan Inokulum. Isolat FWHc3 dan YRt2a wild-type dan mutan
diinokulasikan masing-masing ke media BHI, lalu diinkubasi selama 1 hari pada
suhu 37°C. Kultur kapang (A. flavus, A. niger, F. oxysporum), khamir (K. ohmeri,
C. krusei, dan C. zeylanoides) dibuat dengan menginokulasikan 1 ose untuk
masing-masing isolat ke PDB, lalu diinkubasi pada suhu 30°C selama 1 hari.
Kultur BAL (Pediococcus sp., L. plantarum, dan L. lactis) dibuat dengan
menginokulasikan 1 ose untuk masing-masing isolat ke MRSB, lalu diinkubasi
pada suhu 37°C selama 1 hari. Kultur campuran dibuat dengan menginokulasikan
masing-masing isolat BAL, khamir dan kapang, YRt2a mutan, dan FWHc3 mutan
ke NB.
Pembuatan Stok Ampisilin. Satu tablet ampisilin yang mengandung 500
mg ampisilin dihaluskan menggunakan mortar, lalu dimasukkan ke dalam 100 ml
air steril sehingga diperoleh konsentrasi 5000 μg/ml. Kemudian larutan stok
ampisilin tersebut disterilisasi menggunakan microfilter dengan bantuan syringe
steril.
Pembuatan Media Pemupukan. Media tumbuh yang digunakan adalah
TSA yang ditambah ampisilin dengan konsentrasi 0 μg/ml (kontrol), 10μg/ml, 20
μg/ml, 30 μg/ml, 30 μg/ml, 50 μg/ml, 75 μg/ml dan 100 μg/ml. Jumlah media
TSA yang dibuat disesuaikan dengan konsentrasi ampisilin berdasarkan rumus
pengenceran, lalu disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit.
Sebelum media TSA digunakan, ampisilin dari stok ditambahkan sesuai
konsentrasi masing-masing.
Pemupukan. Inokulum diencerkan menggunakan BPW, lalu sebanyak 0.1
ml dipupukkan ke cawan petri steril dan sekitar 15 ml media TSA dengan
konsentrasi ampisilin tertentu dituang. Kemudian cawan diinkubasi pada suhu
37°C selama 2 hari dengan posisi terbalik.
Perhitungan Penurunan Jumlah Mikroba terhadap Konsentrasi Ampisilin
Setelah masa inkubasi, cawan diamati dan untuk isolat mutan dapat diamati
menggunakan UV dengan panjang gelombang 366 nm. Koloni yang teramati
dihitung dengan rumus Standar Plate Count sebagai berikut:
N=
Kemudian setelah mendapatkan jumlah mikroba yang sudah dalam bentuk log
maka dilakukan perhitungan penurunan jumlah log dengan rumus sebagai berikut:
S = log N0 log Nt
Setelah itu dilakukan perhitungan recovery number dengan rumus :
Recovery number =
6
Keterangan
N
C
n1
n2
d
S
N0
Nt
:
: Total mikroba per ml atau gram sampel
: Jumlah mikroba dari semua cawan yang masuk dalam batas perhitungan
: Jumlah cawan pada pengenceran pertama
: Jumlah cawan pada pengenceran kedua
: Tingkat pengenceran pertama saat mulai perhitungan
: Reduksi log mikroba
: Jumlah mikroba tanpa ampisilin
: Jumlah mikroba pada media ampisilin
Penentuan Konsentrasi Ampisilin Optimum
Konsentrasi ampisilin optimum ditentukan melalui perhitungan skor
tertimbang. Parameter yang digunakan untuk menghitung skor tertimbang
meliputi recovery number mutan dan jumlah reduksi dari BAL dan khamir.
Perhitungan dilakukan denan persamaan berikut :
Ȓ=
.................................... (1)
Xs = Rmin + ((X –Xmin) x Ȓ)................ (2)
Xt = 0.3 Xs(RN) + 0.2 Xs(r) ................ .. (3)
Keterangan:
Ȓ
: Selang
Rmax : Nilai maksimum pada selang
Rmin : Nilai minimum pada selang
Xmax : Nilai respon tertinggi
Xmin : Nilai respon terendah
X
: Nilai respon pada konsentrasi ampisilin
Xs
: Skor dalam selang
Xt
: Skor tertimbang
RN
: Recovery Number
r
: Jumlah reduksi
Pengujian profil pertumbuhan C. sakazakii mutan dan mikroorganisme
lainnya pada konsentrasi optimum secara bersamaan
Inokulum akan dicampur di dalam media NB setelah itu akan diencerkan
menggunakan BPW, lalu sebanyak 0.1 ml dipupukkan ke cawan petri steril dan
sekitar 15 ml media TSA dengan konsentrasi ampisilin optimum dan konsentrasi
0 µg/ml dijadikan sebagai kontrol. Kemudian cawan diinkubasi pada suhu 30°C
selama 2 hari dengan posisi terbalik. BAL dan khamir dihitung secara total karena
sulit dibedakan saat pengamatan.
Analisis Statistik
Data yang telah diperoleh diolah dengan menggunakan program komputer
Microsoft Excel, kemudian dilanjutkan uji ANOVA dengan uji lanjut Dunnett
untuk data jumlah koloni yang ditumbuhkan secara terpisah dan uji Independent-
7
Sampel T Test untuk data jumlah koloni yang ditumbuhkan secara bersamaan. Uji
ini menggunakan program komputer SPSS 22.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Ketahanan Hidup C. sakazakii Wild-type dan Mutan pada Media Ampisilin
Penelitian ini menggunakan isolat C. sakazakii wild-type YRt2a (Meutia
2008) yang berasal dari susu formula dan FWHc3 (Hamdani 2012) yang berasal
dari pati singkong serta mutan dari kedua isolat tersebut (Nurjanah 2014). Isolat
YRt2a merupakan isolat nontoksik, sedangkan FWHc3 merupakan isolat toksik
(Nurjanah 2014). Penggunaan isolat mutan C. sakazakii bertujuan sebagai
penanda atau mempermudah dalam membedakan C. sakazakii dengan isolat
lainnya saat ditumbuhkan di dalam media. Hal ini disebabkan karena isolat mutan
C. sakazakii memiliki kemampuan berflouresens dibawah lampu UV dan tahan
terhadap ampisilin. Mutan merupakan organisme atau sel yang telah mengalami
perubahan fenotip akibat dari proses mutasi sehingga berbeda dari wild-type atau
bentuk yang ditemukan di alam. Konsentrasi ampisilin yang digunakan adalah 0,
10, 20, 30, 40, 50, 75, dan 100 μg/ml dalam media TSA (Tryptone Soy Agar).
Koloni bakteri dihitung dengan rumus Standard Plate Count (BAM 2001) dan
dikonversi dalam satuan log. Pemupukan isolat C. sakazakii wild-type dan mutan
ke dalam media TSA yang sudah diberi ampisilin dalam berbagai konsentrasi
bertujuan dapat mengetahui ketahanannya.
FWHc3 wild-type dan YRt2a wild-type tidak dapat tumbuh pada media
TSA yang mengandung ampisilin seperti yang ditunjukan pada Gambar 2. Hasil
penelitian menunjukan pada konsentrasi ampisilin terendah yaitu 10 µg/ml tidak
ada sama sekali pertumbuhan. Mekanisme ampisilin yang bekerja menghambat
enzim transpeptidase yang berfungsi dalam pembentukan struktur ikatan silang
pada dinding sel bakteri. Pertumbuhan sel dengan keberadaan ampisilin akan
mengakibatkan pembentukan dinding sel yang lemah sehingga sel bakteri akan
pecah karena tekanan osmotik internal yang tinggi (Haddix et al. 2000).
FWHc3 wild-type FWHc3 mutan
YRt2a wild-type
YRt2a mutan
Gambar 2 Jumlah koloni C. sakazakii FWHc3 dan YRt2a dalam media ampisilin
8
Hal sebaliknya isolat C. sakazakii mutan dapat bertahan pada media TSA
yang diberi ampisilin. Jumlah FWHc3 mutan pada konsentrasi ampisilin 10 µg/ml
adalah 7.3 log CFU/ml dan pada konsentrasi 100 µg/ml adalah 3.6 log CFU/ml.
Hal yang serupa pada jumlah FWHc3 mutan di konsentrasi ampisilin 10 µg/ml
adalah 7.1 log CFU/ml dan pada konsentrasi 100 µg/ml adalah 6.2 log CFU/ml.
Hal ini juga dapat disimpulkan bahwa YRt2a mutan lebih resisten terhadap
ampisilin dibandingkan dengan FWHc3 mutan. Hasil penelitian menunjukan
semakin tinggi konsentrasi ampisilin jumlah FWHc3 mutan dan YRt2a mutan
semakin menurun namun masih dapat tumbuh pada konsentrasi ampisilin 100
µg/ml. Hal ini disebabkan pGFPuv yang disisipkan mengandung gen Ampr yang
menyandikan enzim β-lactamase. Enzim ini dapat menghidrolisis ampisilin
sehingga tidak mengganggu pembentukan ikatan silang pada dinding sel bakteri
(Haddix et al. 2000).
Konsentrasi Ampisilin Optimum
Jenis kultur lain yang digunakan adalah kultur BAL, khamir dan kapang.
Kultur tersebut diperoleh dari fermentasi spontan perendaman jagung (Rahmawati
2012). Ketiga kultur ini akan dibandingkan dengan isolat C. sakazakii untuk
mengetahui tingkat ketahanannya terhadap ampisilin dalam konsentrasi optimum.
Dalam tahap ini akan dihitung jumlah koloni dari isolat mutan, BAL, khamir dan
kapang yang ditumbuhkan secara terpisah.
Hasil penelitian menunjukan bahwa kultur FWHc3 mutan, YRt2a mutan,
BAL, khamir dan kapang masih dapat tumbuh pada media ampisilin konsentrasi
100 µg/ml. Berdasarkan uji Dunnett FWHc3 mutan berbeda nyata penurunannya
pada konsentrasi 10 sampai 100 µg/ml dengan kontrol sedangkan untuk YRt2a
berbeda nyata penurunannya pada konsentrasi 30 sampai 100 µg/ml dengan
kontrol. Berdasarkan uji Dunnett untuk isolat khamir dan BAL memperlihatkan
bahwa pemberian ampisilin pada media TSA mempengaruhi penurunan jumlah
secara signifikan (p
MIKROORGANISME LAIN TERHADAP AMPISILIN UNTUK
PENGEMBANGAN MEDIA SPESIFIK
RUTH THERESIA
DEPARTEMEN ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Ketahanan Mutan
Cronobacter sakazakii dan Mikroorganisme Lain terhadap Ampisilin untuk
Pengembangan Media Spesifik adalah benar karya saya dengan arahan dari
komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan
tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, September 2015
Ruth Theresia
NIM F24110056
ABSTRAK
RUTH THERESIA. Ketahanan Mutan Cronobacter sakazakii dan
Mikroorganisme Lain terhadap Ampisilin untuk Pengembangan Media Sepsifik.
Dibimbing oleh SITI NURJANAH.
C. sakazakii ditemukan sebagai kontaminan pada pangan kering. Metode
analisis mikrobiologi pangan konvensional masih sulit digunakan untuk
membedakan bakteri target dengan bakteri lainnya serta mikroorganisme lain.
Penggunaan isolat mutan yang dilabel dengan plasmid Green Flourescent Protein
(pGFP) dapat mempermudah analisis, tetapi masih diperlukan pengembangan
media spesifik untuk metode deteksi dan pengujian. Penelitian ini bertujuan untuk
mengetahui ketahanan hidup C. sakazakii mutan dan wild-type pada media yang
mengandung ampisilin, menentukan konsentrasi ampisilin optimum dan
mengetahui profil ketahanan mikroorganisme lain (bakteri asam laktat, khamir
dan kapang) dalam media ampisilin. Metode perhitungan yang digunakan adalah
Standar Plate Count. Isolat C. sakazakii FWHc3 wild-type dan YRt2a wild-type
tidak dapat tumbuh pada media TSA yang mengandung ampisilin sedangkan
isolat C. sakazakii mutan dapat bertahan pada media ampisilin. Konsentrasi
optimum untuk isolat FWHc3 mutan dan YRt2a mutan adalah konsentrasi 30
µg/ml berdasarkan perhitungan skor tertimbang, dimana FWHc3 mutan dan
YRt2a mutan memiliki nilai recovery number yang optimum masing-masing
sebesar 87.50 % dan 107.04 % serta adanya reduksi jumlah khamir sebesar 2 log
dan bakteri asam laktat sebesar 3.2log. Isolat C. sakazakii, kapang, khamir dan
bakteri asam laktat yang ditumbuhkan secara bersamaan pada konsentrasi
optimum menunjukan pertumbuhan mutan tidak terganggu atau tidak berbeda
dengan kontrol, tetapi kapang, khamir dan bakteri asam laktat menurun.
Kata kunci : C. sakazakii, Green Flourescent Protein, Bakteri asam laktat,
Ampisilin, Khamir
ABSTRACT
RUTH THERESIA. Resistance of Mutants C. sakazakii and other microorganisms
against Ampicilin for Development of a Spesific Enumeration Medium.
Supervised by SITI NURJANAH.
C. sakazakii was found as a contaminant in dried food. However,
microbiological analysis by conventional methods is difficult to distinguish the
target bacterian from other microorganisms. Use of mutant, example Cronobacter
sakazakii labeled with pGFP, could improve the detection rate, but it required
development a specific medium. This study aimed to determine: the survival of C.
sakazakii mutant and wild-type in media containing ampicillin, optimum
concentration of ampicillin and the resistance of other microorganisms against
ampicillin. The method of enumeration used was Standard Plate Count, Reduction
Amount and Number of Recovery Mutant. The results showed that isolates of C.
sakazakii FWHc3 and YRt2a wild-type did not grow on TSA medium containing
ampicillin whereas mutant isolates of C. sakazakii survived on ampicillin media.
Optimum concentration of mutant isolates FWHc3 and YRt2a mutant at a
concentration of 30 µg/ml against molds based on weighted scoring, yeasts and
latic acid bacterian because both of them had recovery number mutant optimum
(87.50 % for FWHc3 and 107.04 % for YRt2a), reduction amount of yeast (2 log)
and lactic acid bacterian (3.2 log). Observation of isolates mixture at the optimum
concentration, growth of mutant was not hampered but molds, yeasts and lactic
acid bacteria decreased.
Keywords : C. sakazakii, Green Flourescent Protein, Lactic acid bacterian,
Ampicilin, Mold
KETAHANAN MUTAN Cronobacter sakazakii DAN
MIKROORGANISME LAIN TERHADAP AMPISILIN UNTUK
PENGEMBANGAN MEDIA SPESIFIK
RUTH THERESIA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Teknologi Pertanian
pada
Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan
Fakultas Teknologi Pertanian
Institut Pertanian Bogor
DEPARTEMEN ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
Judul
: Ketahanan Mutan Cronobacter sakazakii dan Mikroorganisme Lain
Nama
: Ruth Theresia
NIM
: F24110056
terhadap Ampisilin untuk Pengembangan Media Spesiik
Disetujui oleh :
ｾ＠
Dr. Siti Nurjanah STP, MSi.
Dosen Pembimbing
Diketahu i oleh:
Tanggal Lulus:
f2
1 SEP 205
PRAKATA
Segala puji dan syukur dipanjatkan kepada Tuhan Yang Maha Kuasa, atas kasih
dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah dengan
judul “Ketahanan Mutan Cronobacter sakazakii dan Mikroorganisme Lain
terhadap Ampisilin untuk Pengembangan Media Spesifik”dapat diselesaikan.
Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada:
1. Bapak (Parlaungan Sihombing) dan Mama (Alm Dra. Dianna Siburian)
selaku orang tua yang telah mendoakan serta memberi semangat, nasehat dan
dukungannya. Tidak lupa terima kasih untuk kakak dan adik tercinta
Novriana Elizabeth ST dan Samuel Leonardo untuk dukungannya.
2. Dr. Siti Nurjanah STP, M.Si sebagai dosen pembimbing skripsi yang telah
banyak memberikan arahan dan bimbingan kepada penulis hingga
terselesaikannya skripsi ini.
3. Prof. Dr. Ir. Ratih Dewanti, MSc dan Dr. Ir. Budi Nurtama selaku dosen
penguji.
4. Brian Hoffni ST yang selalu memberi dukungan bantuan dan saran dalam
penulisan skripsi ini serta Aldila Setiawati dan Nuriska Rahma Dewanti.
5. Teman-teman mikrob atas kebersamaannya di laboratorium dan masukannya,
serta teman-teman ITP 48 yang telah mendukung dan membantu dalam
penulisan skripsi ini.
6. Para teknisi laboratorium Mbak Ari, Kak Tami dan Teh Asih yang membantu
penulis selama di laboratorium.
Penulis berharap penelitian ini dapat memberikan manfaat bagi semua pihak.
Bogor, September 2015
Ruth Theresia
vi
DAFTAR ISI
DAFTAR ISI
vi
DAFTAR TABEL
vii
DAFTARGAMBAR
vii
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
2
Manfaat Penelitian
2
METODE
2
Waktu dan Tempat Penelitian
2
Bahan dan Alat
2
Prosedur Penelitian
3
Pemupukan pada Media Ampisilin
5
Perhitungan Penurunan Jumlah Mikroba terhadap Konsentrasi Ampisilin
5
Penentuan Konsentrasi Ampisilin Optimum
6
Pengujian profil pertumbuhan C. sakazakii mutan dan
mikroorganisme lainnya pada konsentrasi optimum secara bersamaan
6
Analisis Statistik
6
HASIL DAN PEMBAHASAN
7
Ketahanan Hidup C. sakazakii Wild-type dan Mutan pada Media Ampisilin
7
Konsentrasi Ampisilin Optimum
8
Profil Pertumbuhan C. sakazakii Mutan, BAL, Khamir dan Kapang
pada Konsentrasi Ampisilin Optimum yang Ditumbuhkan secara Bersamaan 10
PENUTUP
11
Simpulan
11
Saran
12
DAFTAR PUSTAKA
13
Riwayat Hidup
15
15
DAFTAR TABEL
1 Jenis-jenis Isolat yang Digunakan dalam Penelitian
2 Skor tertimbang dari Recovery number mutan serta nilai reduksi
3 Jumlah koloni C. sakazakii mutan, kapang serta BAL dan khamir
3
10
11
DAFTAR GAMBAR
1 Diagram alir penelitian
2 Jumlah koloni C. sakazakii FWHc3 dan YRt2a dalam media ampisilin
3 Jumlah koloni C. sakazakii Mutan, BAL, Khamir dan Kapang yang
Ditumbuhkan pada Media Ampisilin
4 Pengamatan mikroorganisme campuran
4
7
10
12
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Cronobacter sakazakii (sebelumnya dikenal sebagai Enterobacter
sakazakii) adalah bakteri gram negatif, berbentuk batang, fakultatif anaerob dan
motil (Healy et al. 2010). C. sakazakii merupakan salah satu dari tujuh spesies
dalam genus Cronobacter spp. Perbedaan antara spesies ini adalah berdasarkan
reaksi biokimia, serologi dan molekuler teknik (Iversen et al 2008). C. sakazakii
termasuk salah satu bakteri patogen atau bakteri yang dapat menyebabkan
penyakit. Bakteri ini banyak terdapat di lingkungan sekitar kita bahkan bisa juga
ditemukan di dalam pencernaan manusia yang sehat (Tisnadjaja 2011).
Infeksi pada manusia yang disebabkan oleh C. sakazakii dapat terjadi pada
semua kalangan usia. Bayi paling berisiko untuk terinfeksi bakteri ini, terutama
pada bayi yang mengalami berat badan kurang, bayi lahir prematur, bayi yang
mempunyai penurunan sistem imun, bayi dari ibu yang menderita HIV
(FAO/WHO 2008). Adanya kasus meningitis yang disebabkan oleh infeksi C.
sakazakii dan telah diisolasi dari jaringan otak dan cairan cerebrospinal bayi yang
terserang meningitis di Osterhills Hospital, Inggris (Urmenyi AMC dan Franklin
AW 1961). Gitapratiwi (2011) telah mengisolasi C. sakazakii dari maizena (2
sampel dari 8 sampel). Kontaminasi C. sakazakii pada pati-patian juga ditemukan
oleh Hamdani (2012), yaitu 1 sampel pati singkong (tapioka) dari 3 sampel patipatian serta Senzani (2011) juga telah mengisolasi C. sakazakii dari sayuran, yaitu
kubis.
Metode analisis mikrobiologi pangan konvensional tidak dapat
membedakan bakteri target dengan mikroorganisme lainnya. Hal ini disebabkan
karena pada bahan pangan mengandung mikroorganisme dengan jumlah dan jenis
yang beragam. Selain itu metode konvensional memerlukan waktu yang lama dan
biaya yang besar. Teknik pelabelan menggunakan plasmid Green Flourescent
Protein (pGFP) menjadi salah satu alternatif penelusuran perilaku bakteri ini
tanpa melakukan dekontaminasi atau sterilisasi untuk menekan pertumbuhan
ataupun membunuh mikroba lainnya (Nurjanah 2014).
Teknik pelabelan dilakukan dengan cara menyisipkan plasmid GFP pada
isolat C. sakazakii. Selain itu pGFP juga tidak bersifat toksik sehingga uji biologis
dapat dilakukan secara in vivo dan pengambilan gambar bisa menggunakan sel
hidup (in vivo imaging) (Widyajayantie 2011). pGFPuv merupakan salah satu
varian plasmid Green Flourescent Protein (pGFP) yang memikilik intensitas
berflouresen 45 kali lipat di bawah sinar UV sehingga dapat dibedakan dengan
mikroorganisme lainnya dan dapat tumbuh pada media yang mengandung
ampisilin. Pada media yang mengandung ampisilin isolat mutan lebih stabil
berflouresen. Menurut Zahner dan Maas (1972), ampisilin dapat bersifat
bakterisidal terhadap bakteri gram negatif dan gram positif. Selain C. sakazakii
mutan dapat bertahan terhadap ampisilin tetapi ada beberapa mikroorganisme
lainya dapat tumbuh terutama kelompok khamir dan kapang.
Penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Sarah (2013) telah melakukan
penumbuhan mutan dalam media ampsilin dan membandingkannya dengan
mikroorganisme lainnya namun perhitungan yang dilakukan secara kualitatif.
Pertumbuhan mikroorganisme lain ini dapat mengganggu dalam perhitungan jika
2
jumlahnya lebih besar dari mutan. Oleh karena itu, penting dicari konsentrasi
ampisilin optimum yang ditambahkan dalam media perhitungan. Konsentrasi
optimum ini dipilih berdasarkan nilai recovery number mutan dan penurunan
bakteri asam laktat (BAL) sampai dengan tiga log sehingga tidak mengganggu
pengamatan mutan. Recovery number adalah persentase jumlah koloni mutan
yang hidup dalam media ampisilin dibandingkan dengan media tanpa ampisilin.
C. sakazakii yang digunakan pada penelitian ini adalah isolat wild-type
YRt2a (Meutia 2008) dan FWHc3 (Hamdani 2012) serta isolat mutan dari kedua
nya (Nurjanah 2014). Penelitian ini bertujuan mengetahui ketahanan C. sakazakii
baik wild-type ataupun mutan terhadap media ampisilin dan juga akan
dibandingkan dengan mikroorganisme lain seperti kapang (A. flavus, A. niger, F.
oxysporum), khamir (K. ohmeri, C. krusei, dan C. zeylanoides) dan kultur BAL
(Pediococcus sp., L. plantarum, dan L. Lactis) yang telah diisolasi oleh
Rahmawati et al (2012) dalam media ampisilin ditumbuhkan secara bersamaan
untuk menentukan konsentrasi ampisilin optimum.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan:
1. Mengetahui ketahanan hidup C. sakazakii wild-type dan mutan pada media
yang mengandung ampisilin.
2. Menentukan konsentrasi ampisilin optimum dalam media untuk mendukung
pertumbuhan C. sakazakii mutan.
3. Melihat profil pertumbuhan C. sakazakii mutan dan mikroorganisme lain
(Kapang, khamir dan BAL) pada konsentrasi ampisilin optimum yang
ditumbuhkan bersamaan.
Manfaat Penelitian
Manfaat yang diharapkan dari penelitian ini adalah diperolehnya informasi
tentang ketahanan C. sakazakii wild-type dan mutan serta mikroorganisme lain
(Kapang, khamir dan BAL) terhadap antibiotik ampisilin. Konsentrasi ampisilin
optimum direkomendasikan untuk digunakan dalam media.
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan selama bulan Februari - Agustus 2015. Penelitian
dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi SEAFAST Center IPB.
Bahan dan Alat
Bahan baku yang digunakan pada penelitian ini adalah ampisilin, air
destilata, alkohol 70%, spirtus, kapas, kertas tisu, plastik, aluminium foil, media
pertumbuhan TSA (Tryptone Soy Agar), DFIA (Druggan Forsythe Iversen Agar),
BHI (Brain Heart Infusion), BPW (Buffered Peptone Water), PDA (Potato
Dextrose Agar), MRSB (De Man Rogosa Sharp Broth), dan NB (Nutrient Broth).
3
Kultur bakteri yang digunakan adalah koleksi SEAFAST Center dapat dilihat
pada Tabel 1. Peralatan yang digunakan pada penelitian ini terdiri dari neraca,
inkubator suhu 37°C, inkubator suhu 55°C, autoklaf, oven, lampu UV (366 nm),
pipet mikro, tip pipet, tabung reaksi berulir, cawan petri, erlenmeyer, gelas piala,
gelas ukur, sudip, sendok, rak tabung reaksi, hocky stick, pipet Mohr, pipet tetes,
bulb, bunsen, kaca preparat, dan gelas objek.
Tabel 1 Jenis-jenis Isolat yang Digunakan dalam Penelitian
Kelompok
Spesies/ kode
Referensi
mikroorganisme
C. sakazakii
C. sakazakii FWHc3 mutan
Nurjanah 2014
C. sakazakii YRt2a mutan
BAL
Khamir
Kapang
C. sakazakii FWHc3 wild-type
Hamdani 2012
C. sakazakii YRt2a wild-type
Meutia 2008
Pediococcus sp.
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus lactis
Kodameae ohmeri
Candida krusei
Candida zeylanoides
Aspergillus flavus
Aspergillus niger
Fusarium oxysporum
Rahmawati 2012
Prosedur Penelitian
Penelitian ini terdiri dari dua tahap yaitu (1) penentuan konsentrasi
ampisilin optimum untuk media perhitungan C. sakazakii mutan, (2) profil
pertumbuhan mutan C. sakazakii dan mikroorganisme lainnya (BAL, khamir dan
kapang). Diagram alir penelitian dapat dilihat pada Gambar 1.
4
Tahap 1 Penentuan Konsentrasi Ampisilin Optimum
Kultur
Ampisilin
Persiapan Kultur
Pemupukan secara
terpisah
Pembuatan media
ampisilin dengan
konsentrasi
0, 10, 20, 30, 40, 50,
75, 100 μg/ml
Perhitungan Jumlah Koloni
(Standart Plate Count)
Perhitungan :
1. Recovery number mutan
2. Jumlah reduksi BAL, khamir dan kapang
Konsentrasi optimum
Pemupukan
secara bersamaan
Tahap 2 Profil Pertumbuhan
Profil pertumbuhan C. sakazakii
mutan, BAL, khamir dan kapang
Gambar 1 Diagram alir penelitian
5
Pemupukan pada Media Ampisilin
Persiapan Inokulum. Isolat FWHc3 dan YRt2a wild-type dan mutan
diinokulasikan masing-masing ke media BHI, lalu diinkubasi selama 1 hari pada
suhu 37°C. Kultur kapang (A. flavus, A. niger, F. oxysporum), khamir (K. ohmeri,
C. krusei, dan C. zeylanoides) dibuat dengan menginokulasikan 1 ose untuk
masing-masing isolat ke PDB, lalu diinkubasi pada suhu 30°C selama 1 hari.
Kultur BAL (Pediococcus sp., L. plantarum, dan L. lactis) dibuat dengan
menginokulasikan 1 ose untuk masing-masing isolat ke MRSB, lalu diinkubasi
pada suhu 37°C selama 1 hari. Kultur campuran dibuat dengan menginokulasikan
masing-masing isolat BAL, khamir dan kapang, YRt2a mutan, dan FWHc3 mutan
ke NB.
Pembuatan Stok Ampisilin. Satu tablet ampisilin yang mengandung 500
mg ampisilin dihaluskan menggunakan mortar, lalu dimasukkan ke dalam 100 ml
air steril sehingga diperoleh konsentrasi 5000 μg/ml. Kemudian larutan stok
ampisilin tersebut disterilisasi menggunakan microfilter dengan bantuan syringe
steril.
Pembuatan Media Pemupukan. Media tumbuh yang digunakan adalah
TSA yang ditambah ampisilin dengan konsentrasi 0 μg/ml (kontrol), 10μg/ml, 20
μg/ml, 30 μg/ml, 30 μg/ml, 50 μg/ml, 75 μg/ml dan 100 μg/ml. Jumlah media
TSA yang dibuat disesuaikan dengan konsentrasi ampisilin berdasarkan rumus
pengenceran, lalu disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit.
Sebelum media TSA digunakan, ampisilin dari stok ditambahkan sesuai
konsentrasi masing-masing.
Pemupukan. Inokulum diencerkan menggunakan BPW, lalu sebanyak 0.1
ml dipupukkan ke cawan petri steril dan sekitar 15 ml media TSA dengan
konsentrasi ampisilin tertentu dituang. Kemudian cawan diinkubasi pada suhu
37°C selama 2 hari dengan posisi terbalik.
Perhitungan Penurunan Jumlah Mikroba terhadap Konsentrasi Ampisilin
Setelah masa inkubasi, cawan diamati dan untuk isolat mutan dapat diamati
menggunakan UV dengan panjang gelombang 366 nm. Koloni yang teramati
dihitung dengan rumus Standar Plate Count sebagai berikut:
N=
Kemudian setelah mendapatkan jumlah mikroba yang sudah dalam bentuk log
maka dilakukan perhitungan penurunan jumlah log dengan rumus sebagai berikut:
S = log N0 log Nt
Setelah itu dilakukan perhitungan recovery number dengan rumus :
Recovery number =
6
Keterangan
N
C
n1
n2
d
S
N0
Nt
:
: Total mikroba per ml atau gram sampel
: Jumlah mikroba dari semua cawan yang masuk dalam batas perhitungan
: Jumlah cawan pada pengenceran pertama
: Jumlah cawan pada pengenceran kedua
: Tingkat pengenceran pertama saat mulai perhitungan
: Reduksi log mikroba
: Jumlah mikroba tanpa ampisilin
: Jumlah mikroba pada media ampisilin
Penentuan Konsentrasi Ampisilin Optimum
Konsentrasi ampisilin optimum ditentukan melalui perhitungan skor
tertimbang. Parameter yang digunakan untuk menghitung skor tertimbang
meliputi recovery number mutan dan jumlah reduksi dari BAL dan khamir.
Perhitungan dilakukan denan persamaan berikut :
Ȓ=
.................................... (1)
Xs = Rmin + ((X –Xmin) x Ȓ)................ (2)
Xt = 0.3 Xs(RN) + 0.2 Xs(r) ................ .. (3)
Keterangan:
Ȓ
: Selang
Rmax : Nilai maksimum pada selang
Rmin : Nilai minimum pada selang
Xmax : Nilai respon tertinggi
Xmin : Nilai respon terendah
X
: Nilai respon pada konsentrasi ampisilin
Xs
: Skor dalam selang
Xt
: Skor tertimbang
RN
: Recovery Number
r
: Jumlah reduksi
Pengujian profil pertumbuhan C. sakazakii mutan dan mikroorganisme
lainnya pada konsentrasi optimum secara bersamaan
Inokulum akan dicampur di dalam media NB setelah itu akan diencerkan
menggunakan BPW, lalu sebanyak 0.1 ml dipupukkan ke cawan petri steril dan
sekitar 15 ml media TSA dengan konsentrasi ampisilin optimum dan konsentrasi
0 µg/ml dijadikan sebagai kontrol. Kemudian cawan diinkubasi pada suhu 30°C
selama 2 hari dengan posisi terbalik. BAL dan khamir dihitung secara total karena
sulit dibedakan saat pengamatan.
Analisis Statistik
Data yang telah diperoleh diolah dengan menggunakan program komputer
Microsoft Excel, kemudian dilanjutkan uji ANOVA dengan uji lanjut Dunnett
untuk data jumlah koloni yang ditumbuhkan secara terpisah dan uji Independent-
7
Sampel T Test untuk data jumlah koloni yang ditumbuhkan secara bersamaan. Uji
ini menggunakan program komputer SPSS 22.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Ketahanan Hidup C. sakazakii Wild-type dan Mutan pada Media Ampisilin
Penelitian ini menggunakan isolat C. sakazakii wild-type YRt2a (Meutia
2008) yang berasal dari susu formula dan FWHc3 (Hamdani 2012) yang berasal
dari pati singkong serta mutan dari kedua isolat tersebut (Nurjanah 2014). Isolat
YRt2a merupakan isolat nontoksik, sedangkan FWHc3 merupakan isolat toksik
(Nurjanah 2014). Penggunaan isolat mutan C. sakazakii bertujuan sebagai
penanda atau mempermudah dalam membedakan C. sakazakii dengan isolat
lainnya saat ditumbuhkan di dalam media. Hal ini disebabkan karena isolat mutan
C. sakazakii memiliki kemampuan berflouresens dibawah lampu UV dan tahan
terhadap ampisilin. Mutan merupakan organisme atau sel yang telah mengalami
perubahan fenotip akibat dari proses mutasi sehingga berbeda dari wild-type atau
bentuk yang ditemukan di alam. Konsentrasi ampisilin yang digunakan adalah 0,
10, 20, 30, 40, 50, 75, dan 100 μg/ml dalam media TSA (Tryptone Soy Agar).
Koloni bakteri dihitung dengan rumus Standard Plate Count (BAM 2001) dan
dikonversi dalam satuan log. Pemupukan isolat C. sakazakii wild-type dan mutan
ke dalam media TSA yang sudah diberi ampisilin dalam berbagai konsentrasi
bertujuan dapat mengetahui ketahanannya.
FWHc3 wild-type dan YRt2a wild-type tidak dapat tumbuh pada media
TSA yang mengandung ampisilin seperti yang ditunjukan pada Gambar 2. Hasil
penelitian menunjukan pada konsentrasi ampisilin terendah yaitu 10 µg/ml tidak
ada sama sekali pertumbuhan. Mekanisme ampisilin yang bekerja menghambat
enzim transpeptidase yang berfungsi dalam pembentukan struktur ikatan silang
pada dinding sel bakteri. Pertumbuhan sel dengan keberadaan ampisilin akan
mengakibatkan pembentukan dinding sel yang lemah sehingga sel bakteri akan
pecah karena tekanan osmotik internal yang tinggi (Haddix et al. 2000).
FWHc3 wild-type FWHc3 mutan
YRt2a wild-type
YRt2a mutan
Gambar 2 Jumlah koloni C. sakazakii FWHc3 dan YRt2a dalam media ampisilin
8
Hal sebaliknya isolat C. sakazakii mutan dapat bertahan pada media TSA
yang diberi ampisilin. Jumlah FWHc3 mutan pada konsentrasi ampisilin 10 µg/ml
adalah 7.3 log CFU/ml dan pada konsentrasi 100 µg/ml adalah 3.6 log CFU/ml.
Hal yang serupa pada jumlah FWHc3 mutan di konsentrasi ampisilin 10 µg/ml
adalah 7.1 log CFU/ml dan pada konsentrasi 100 µg/ml adalah 6.2 log CFU/ml.
Hal ini juga dapat disimpulkan bahwa YRt2a mutan lebih resisten terhadap
ampisilin dibandingkan dengan FWHc3 mutan. Hasil penelitian menunjukan
semakin tinggi konsentrasi ampisilin jumlah FWHc3 mutan dan YRt2a mutan
semakin menurun namun masih dapat tumbuh pada konsentrasi ampisilin 100
µg/ml. Hal ini disebabkan pGFPuv yang disisipkan mengandung gen Ampr yang
menyandikan enzim β-lactamase. Enzim ini dapat menghidrolisis ampisilin
sehingga tidak mengganggu pembentukan ikatan silang pada dinding sel bakteri
(Haddix et al. 2000).
Konsentrasi Ampisilin Optimum
Jenis kultur lain yang digunakan adalah kultur BAL, khamir dan kapang.
Kultur tersebut diperoleh dari fermentasi spontan perendaman jagung (Rahmawati
2012). Ketiga kultur ini akan dibandingkan dengan isolat C. sakazakii untuk
mengetahui tingkat ketahanannya terhadap ampisilin dalam konsentrasi optimum.
Dalam tahap ini akan dihitung jumlah koloni dari isolat mutan, BAL, khamir dan
kapang yang ditumbuhkan secara terpisah.
Hasil penelitian menunjukan bahwa kultur FWHc3 mutan, YRt2a mutan,
BAL, khamir dan kapang masih dapat tumbuh pada media ampisilin konsentrasi
100 µg/ml. Berdasarkan uji Dunnett FWHc3 mutan berbeda nyata penurunannya
pada konsentrasi 10 sampai 100 µg/ml dengan kontrol sedangkan untuk YRt2a
berbeda nyata penurunannya pada konsentrasi 30 sampai 100 µg/ml dengan
kontrol. Berdasarkan uji Dunnett untuk isolat khamir dan BAL memperlihatkan
bahwa pemberian ampisilin pada media TSA mempengaruhi penurunan jumlah
secara signifikan (p