Potensi Ekstrak Bakteri Laut yang Berasosiasi dengan Spons sebagai Antikanker dan Antioksidan

POTENSI EKSTRAK BAKTERI LAUT YANG BERASOSIASI
DENGAN SPONS SEBAGAI ANTIKANKER DAN
ANTIOKSIDAN

ANNISA WULAN AGUS UTAMI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

PERNYATAAN MENGENAI TESIS
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul Potensi Ekstrak
Bakteri Laut yang Berasosiasi dengan Spons sebagai Antikanker dan Antioksidan
adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2014
Annisa Wulan Agus Utami
NIM G351130326

RINGKASAN
ANNISA WULAN AGUS UTAMI. Potensi Ekstrak Bakteri Laut yang
Berasosiasi dengan Spons sebagai Antikanker dan Antioksidan. Dibimbing oleh
ARIS TRI WAHYUDI dan IRMANIDA BATUBARA.
Kanker merupakan penyakit paling mematikan kedua di dunia setelah
penyakit jantung. Kanker disebabkan oleh pertumbuhan sel yang tidak terkendali
sehingga dapat mengganggu bentuk dan fungsi jaringan sel lainnya. Salah satu
penyebab kanker ialah radikal bebas yang menyebabkan stres oksiidatif pada
tubuh manusia. Antioksidan berperan penting bagi tubuh manusia dalam
menetralisir radikal bebas yang mengakibatkan penyakit degeneratif termasuk
kanker. Jumlah penderita kanker di dunia terus meningkat, saat ini jumlahnya
meningkat sekitar 7 juta penderita kanker dari tahun sebelumnya. Menurut WHO,
di Indonesia terjadi sebanyak 165 kasus kanker dalam 100 000 penduduk. Kanker
leher rahim merupakan salah satu penyebab utama kematian wanita yang
berhubungan dengan kanker. Kanker leher rahim menyebabkan 270 000 kematian

setiap tahunnya. Sekitar 85% kasus kanker leher rahim terjadi di negara-negara
berkembang.
Produk bahan bioaktif yang berasal dari spons telah diteliti memiliki
potensi sebagai antikanker dan antioksidan. Namun, pemanfaatan spons sebagai
sumber bahan bioaktif tidak efektif karena memerlukan biomassa yang cukup
besar dan waktu budidaya yang lama. Isolasi bakteri yang bersimbiosis dengan
spons merupakan strategi yang dapat digunakan untuk memproduksi berbagai
bahan bioaktif dalam jumlah besar melalui produksi pengkulturan mikroba.
Mikroorganisme yang berpotensi menghasilkan bahan bioaktif dicirikan dengan
adanya gen penyandi enzim poliketid sintase (PKS) dan nonribosomal poliketid
sintase (NRPS) yang dapat dideteksi melalui analisis keberadaan fragmen DNA
penyandi domain ketosintase (KS) dan domain adenilase (A). Oleh karena itu,
penelitian ini bertujuan menentukan potensi ekstrak dari bakteri laut yang
berasosiasi dengan spons sebagai antikanker dan antioksidan serta mendeteksi
keberadaan gen penyandi senyawa bioaktif dari bakteri laut yang berasosiasi
dengan spons. Metode yang digunakan dalam penelitian ini yaitu dimulai dengan
ekstraksi bahan bioaktif, pengujian kandungan kimia, uji antikanker dengan
menggunakan metode MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide), uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH (2,2-difenil-1pikrilhidrazil) dan metode CUPRAC (Cupric Ion Reducing Antioxidant Capacity),
serta deteksi gen yang berperan dalam sintesis senyawa bioaktif dari bakteri yang

berasosiasi dengan spons dengan cara amplifikasi domain KS dan domain A
menggunakan teknik PCR. Bakteri yang berasosiasi dengan spons yang digunakan
dalam penelitian ini yaitu SAB E-31, SAB E-35, SAB E-38, SAB E-40, SAB E41, SAB E-57, HAL-08, dan HAL-20 yang merupakan bakteri yang berasosiasi
dengan spons Jaspis sp. dan Haliclona sp.
Ekstrak dari bakteri laut yang berasosiasi dengan spons memiliki potensi
sebagai antikanker dan antioksidan. Ekstraksi bahan bioaktif yang berasal dari
bakteri diekstrak menggunakan pelarut etil asetat. Rendemen ekstrak etil asetat
senyawa bioaktif yang berasal dari bakteri menghasilkan jumlah rendemen 0.01%
hingga 0.03%. Ekstrak bakteri yang berasosiasi dengan spons memiliki

kandungan flavonoid, alkaloid, dan triterpenoid. Selain itu ekstrak bakteri SAB
E-38 dan SAB E-41 juga memiliki kandungan steroid. Senyawa dari golongan
flavonoid, alkaloid, dan terpenoid telah diteliti memiliki aktivitas sebagai
antioksidan dan antikanker. Ekstrak yang memiliki aktivitas antikanker dengan
nilai IC50 terbaik dan yang memiliki nilai aktivitas tertinggi dalam meredam
radikal bebas DPPH yaitu ekstrak bakteri SAB E-40. Nilai IC50 ekstrak bakteri
SAB E-40 yaitu 234.59 µg mL-1 dengan aktivitas peredaman radikal bebas DPPH
pada konsentrasi 100 µg mL-1 dan 200 µg mL-1 yaitu 10.09% dan 19.34%. Ekstrak
yang memiliki nilai kapasitas antioksidan tertinggi adalah ekstrak bakteri HAL-08
sebesar 649.92 µmol troloks/g ekstrak. Isolat HAL-08 dan HAL-20 terdeteksi

memiliki DNA penyandi domain KS dan domain A dengan ukuran untuk domain
KS yaitu 700 pasang basa dan domain A yaitu 1000 pasang basa. Berdasarkan
analisis bioinformatika sekuen fragmen DNA penyandi domain ketosintase
menunjukkan isolat HAL-8 dan HAL-20 memiliki tingkat homologi masingmasing sebesar 91% dan 99% dengan sekuen hybrid PKS/NRPS dari kluster gen
PKS Bacillus subtilis. Tingkat homologi pada sekuen domain A isolat HAL-08
dan HAL-20 memiliki homologi masing-masing sebesar 51% dan 99% dengan
domain adenilase dari kluster gen NRPS Bacillus subtilis.

Kata kunci: antikanker, antioksidan, bakteri laut, KS dan A domain.

SUMMARY
ANNISA WULAN AGUS UTAMI. The Potency of Extract from Marine Bacteria
are Associated with Sponges as Anticancer and Antioxidant. Supervised by ARIS
TRI WAHYUDI and IRMANIDA BATUBARA.
Cancer is the second leading cause of mortality in the world after
cardiovascular diseases. This disease is caused by uncontrolled cell growth which
interfere the function of another cell. The uncontrolled cell growth happens due to
genes mutations that regulate the cell cycle. Apparently, most cancer cells are
under oxidative stress from free radicals which disrupt the DNA bases of genetic
information and continue to the formation of cancer cells. Antioxidants play an

important role for the human body in neutralizing free radicals that lead to
degenerative diseases including cancer. The number of cancer patients in the
world increase approximately 7 million compared than the previous year.
According to WHO, In Indonesia there were 165 cases of cancer in 100 000
population. Cervical cancer is one of the main cancer diseases that cause female
mortality. Cervical cancer causes 270 000 deaths annually. Approximately 85% of
cervical cancer cases occur in developing countries.
Bioactive from natural product such as sponges had potency as anticancer
and antioxidant; however, the utilization of sponges as bioactive compounds are
not effective because it requires a large number of biomass and need long time to
be cultured the sponge. Isolation of symbiotic bacterial with sponges is a strategy
that can be used to produce a wide range of bioactive compounds in large
quantities through the production of microbial culturing. Microorganisms which
have potency to produce bioactive compounds are characterized by gene that
encode the ketosynthase (KS) domain of polyketide synthase (PKS) and adenylase
(A) domain of non-ribosomal polyketide synthase (NRPS) which play role in the
synthesis of bioactive compounds. This study aimed to find anticancer and
antioxidant potency of extracts marine bacteria which associated with sponges and
correlated with the synthesis of bioactive compounds. The method used in this
study were extraction of bioactive, analysis of chemical content, analysis of

anticancer activity by MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide) assay, analysis of antioxidant activity by DPPH (2,2-difenil-1pikrilhidrazil) and CUPRAC (Cupric Ion Reducing Antioxidant Capacity) assay,
and the detection of genes that play role in the synthesis of bioactive compounds
from bacteria associated with the sponges by PCR amplification of KS domain
and A domain. Bacteria associated with sponges used in this study were the
isolates of SAB E-31, SAB E-35, SAB E-38, SAB E-40, SAB E-41, SAB E-57,
HAL-08 and HAL-20 from sponges Jaspis sp. and Haliclona sp.
Bioactive extracts from marine bacteria associated with sponges have
potency as anticancer and antioxidant. The bioactive extraction from bacteria was
performed by ethyl acetate solvent. The yield of ethyl acetate extracts product was
ranged from 0.01% to 0.03%. All of extracts from marine bacterial associated
with sponges in this research consisted of flavonoid, alkaloid, and triterpenoid but
only the extract of marine bacterial isolate of SAB E-38 and SAB E-41 consisted
of steroid. Flavonoid, alkaloid, and triterpenoid were reported had potency as
anticancer and antioxidant. The best anticancer activity due to the IC50 values and

the highest reduced of DPPH free radicals was achieved by the extract of SAB E40. The IC50 values of SAB E-40 was 234.59 µg mL-1 and the activity value of
reducing DPPH free radicals in the concentration of 100 µg mL-1 and 200 µg mL1
were 10.09% and 19.34% respectively. The highest antioxidant activity was
gained by HAL-08 extract with antioxidant capacity was up to 641.38 μmol

troloks/g extract. The isolates of HAL-08 and HAL-20 were detected having the
KS and A domain-coding DNA with the size of 700 bp and 1000 bp respectively.
Sequencing analysis of DNA fragment encodes KS domain using BlastX program
indicated that the isolates of HAL-08 and HAL-20 showed 91% and 99% of
similarity level to the sequence of the hybrid PKS/NRPS gene cluster of PKS
from Bacillus subtilis. The sequence homology level in A domain from the
isolates of HAL-08 and HAL-20 showed 51% and 99% of similarity level
respectively with the peptide synthase domain of NRPS gene cluster from
Bacillus subtilis.
Keywords: anticancer, antioxidant, KS and A domain, marine bacteria.

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

POTENSI EKSTRAK BAKTERI LAUT YANG BERASOSIASI
DENGAN SPONS SEBAGAI ANTIKANKER DAN
ANTIOKSIDAN

ANNISA WULAN AGUS UTAMI

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Mikrobiologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

Penguji luar komisi pada ujian tesis : Dr Ir Akhmad Endang Zainal Hasan, MSi

Judul Tesis : Potensi Ekstrak Bakteri Laut yang Berasosiasi dengan Spons
sebagai Antikanker dan Antioksidan
Nama
: Annisa Wulan Agus Utami
NIM
: G351130326

Disetujui oleh
Komisi Pembimbing

Prof Dr Aris Tri Wahyudi, MSi
Ketua

Dr Irmanida Batubara, MSi
Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi
Mikrobiologi

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof Dr Anja Meryandini, MS

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian: 22 Agustus 2014

Tanggal Lulus: 12 September 2014

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Desember 2013 hingga
Juni 2014 ini ialah Potensi Ekstrak Bakteri Laut yang Berasosiasi dengan Spons
sebagai Antikanker dan Antioksidan.
Selama menjalani perkuliahan hingga terselesaikannya tesis ini, penulis
banyak mendapatkan bantuan moral maupun material dari berbagai pihak. Terima
kasih penulis ucapkan kepada Prof Dr Aris Tri Wahyudi, MSi dan Dr Irmanida

Batubara, MSi selaku komisi pembimbing atas kesabarannya dalam memberikan
saran, bimbingan, dukungan dalam pelaksanaan penelitian dan penyusunan karya
ilmiah ini. Penulis berterima kasih atas sebagian dana penelitian yang didanai oleh
Proyek Unggulan Perguruan Tinggi 2012 kepada Prof Dr Aris Tri Wahyudi, MSi.
Penulis juga berterimakasih atas beasiswa pendidikan pascasarjana freshgraduate
yang diperoleh dari Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi (DIKTI) pada tahun
2013. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada Dr Ir Akhmad Endang Zainal
Hasan, MSi atas kesediaannya sebagai penguji luar komisi yang telah memberikan
saran dan bimbingan dalam penyempurnaan tesis ini. Terima kasih juga penulis
sampaikan kepada Prof Dr Anja Meryandini MS atas kesediaannya sebagai
penguji mutu lulusan program studi Mikrobiologi Pascasarjana IPB.
Disamping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Ibu Silmi dari Pusat
Studi Satwa Primata, Ibu Salina, Ibu Ninuk dan Bapak Endi dari Pusat Studi
Biofarmaka LPPM IPB, laboran Mikrobiologi dan laboran Kimia Analitik yang
telah membantu selama penelitian. Penulis berterimakasih kepada teman-teman
seperjuangan FAST TRACK, teman-teman di laboratorium Mikrobiologi, Biologi
angkatan 46, Mikrobiologi angkatan 2012, dan Mikrobiologi angkatan 2013.
Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada Ayahanda dan Ibunda tercinta,
Umi, Aisyah, Aulia, Falah, dan Nandang Permana serta seluruh keluarga, atas
dukungan, doa, dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Agustus 2014

Annisa Wulan Agus Utami

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

vi

DAFTAR GAMBAR

vi

DAFTAR LAMPIRAN

vi

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian

1
1
2
2
2
3

TINJAUAN PUSTAKA

3

METODE
Bahan
Alat
Metode Penelitian

8
9
9
9

HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Pembahasan

12
12
19

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran

23
23
23

DAFTAR PUSTAKA

24

LAMPIRAN

24

RIWAYAT HIDUP

47

DAFTAR TABEL
1 Aktivitas senyawa bioaktif dari mikroorganisme yang berasosiasi
dengan spons
2 Kandungan kimia ekstrak bakteri yang berasosiasi dengan spons
3 Aktivitas antikanker ekstrak bakteri yang berasosiasi dengan spons
terhadap sel kanker HeLa
4 Aktivitas peredaman radikal bebas DPPH ekstrak bakteri yang
berasosiasi dengan spons menggunakan metode DPPH
5 Kapasitas antioksidan ekstrak bakteri yang berasosiasi dengan spons
6 Hasil analisis bioinformatika sekuen fragmen DNA penyandi domain
ketosintase menggunakan program BLASTX
7 Hasil analisis bioinformatika sekuen fragmen DNA penyandi domain
adenilase menggunakan program BLASTX

4
13
14
16
16
18
18

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4

Struktur troloks
Tahapan kerja penelitian
Rendemen ekstrak bakteri yang berasosiasi dengan spons
Sel HeLa pada uji antikanker ekstrak dari bakteri SAB E-40 pada
berbagai konsentrasi
5 Elektroforesis pada gel agarose 1% DNA penyandi domain KS yang
berukuran 700 bp dan domain A yang berukuran 1000 bp dari bakteri
laut yang berasosiasi dengan spons
6 Pohon filogenetik berdasarkan sekuen asam amino domain KS
(ketosintase) yang dikonstruksi dengan metode Neighbor-Joining
dengan nilai ulangan bootstrap 1000
7 Pohon filogenetik berdasarkan sekuen asam amino domain A
(adenilation) yang dikonstruksi dengan metode Neighbor-Joining
dengan nilai ulangan bootstrap 1000

7
8
12
15

17

18

19

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8

Komposisi medium sea water complete (SWC)
Ekstrak bakteri yang berasosisi dengan spons
Rendemen ekstrak bakteri yang berasosiasi dengan spons
Contoh perhitungan rendemen ekstrak bakteri yang berasosiasi dengan
spons
Kandungan kimia ekstrak bakteri yang berasosiasi dengan spons
Aktivitas antikanker ekstrak bakteri yang berasosiasi dengan spons
terhadap sel HeLa dengan menggunakan metode MTT
Contoh perhitungan nilai IC50 ekstrak bakteri yang berasosiasi dengan
spons
Aktivitas antioksidan ekstrak bakteri yang berasosiasi dengan spons
menggunakan metode DPPH

28
28
28
29
30
31
32
33

9 Contoh perhitungan aktivitas penghambatan radikal bebas DPPH
10 Absorbansi dan kurva standar troloks
11 Kapasitas antioksidan ekstrak bakteri yang beraasosiasi dengan spons
menggunakan metode CUPRAC
12 Sekuen parsial domain KS dan A
13 Publikasi jurnal dari sebagian hasil penelitian di International Journal
of Pharma and Bioscience (IJPBS)

33
34
35
36
38

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kanker merupakan penyakit yang disebabkan oleh pertumbuhan sel yang
tidak terkendali atau abnormal sehingga dapat mengganggu jaringan sel lainnya.
Pertumbuhan sel yang abnormal disebabkan mutasi pada gen yang meregulasi
siklus sel. Faktor yang menyebabkan mutasi tersebut diantaranya faktor
lingkungan yang meliputi nutrisi, agen infektor, gaya hidup dan faktor keturunan
atau bawaan genetik (McKelvery & Evans 2003; Nowell et al. 2004). Senyawa
radikal bebas juga dapat menyebabkan stres oksidatif yang berpotensi merusak
basa DNA sehingga mengacaukan sistem informasi genetik, dan berlanjut pada
pembentukan sel kanker (Fiaschi & Chiarugi 2012). Antioksidan berperan penting
bagi tubuh manusia dalam menetralisir radikal bebas yang mengakibatkan
penyakit degeneratif termasuk kanker (Halliwell & Gutteridge 1999). Jumlah
penderita kanker di dunia terus meningkat, saat ini jumlahnya meningkat sekitar 7
juta penderita kanker dari tahun sebelumnya. Menurut WHO, di Indonesia terjadi
sebanyak 165 kasus kanker dalam 100.000 penduduk. Kanker leher rahim (servic)
merupakan salah satu penyebab utama kematian wanita yang berhubungan dengan
kanker. Kanker leher rahim menyebabkan 270.000 kematian setiap tahunnya.
Sekitar 85% kasus kanker leher rahim terjadi di negara berkembang (WHO 2013).
Senyawa bioaktif yang berasal dari spons memiliki potensi sebagai
antibakteri, anticendawan, antikanker, antioksidan, dan anti-inflamasi (Sipkema et
al. 2005; Thakur et al. 2005; Taylor et al. 2007). Namun pengembangan senyawa
bioaktif tersebut mengalami hambatan karena memerlukan biomassa spons yang
besar untuk mengekstraksi senyawa bioaktif dalam aplikasinya di bidang medis
(Proksch et al. 2002). Spons telah diteliti membentuk asosiasi yang erat dengan
berbagai mikroba dan menjadi sumber berbagai senyawa bioaktif yang secara
umum dapat mencapai 50-60% dari volume jaringan spons (Wang 2006).
Komunitas mikroba yang beragam dan berjumlah besar pada hewan spons diduga
merupakan sumber dari berbagai senyawa bioaktif tersebut. Isolasi bakteri yang
bersimbiosis dengan spons merupakan strategi yang dapat digunakan untuk
memproduksi berbagai bahan bioaktif dalam jumlah besar melalui produksi
pengkulturan mikroba.
Keragaman metabolit sekunder yang bersifat bioaktif dari bakteri yang
berasosiasi dengan spons dapat dianalisis melalui pendekatan biologi molekuler
dan analisis bioinformatika. Bakteri yang menghasilkan senyawa bioaktif
umumnya memiliki kluster gen penyandi kompleks enzim poliketid sintase (PKS)
dan nonribosomal poliketid sintase (NRPS) yang menyandikan pembentukan
senyawa bioaktif (Zhang et al. 2005; Taylor et al. 2007). Bakteri yang berasosiasi
dengan spons yang digunakan dalam penelitian ini yaitu SAB E-31, SAB E-35,
SAB E-38, SAB E-40, SAB E-41, SAB E-57, HAL-08, dan HAL-20. Beberapa
isolat bakteri yang berasosiasi dengan spons yaitu isolat bakteri dengan kode SAB
E-31, SAB E-35, SAB E-38, SAB E-40, SAB E-41, dan SAB E-57 memiliki
kluster gen penyandi kompleks enzim poliketid sintase (PKS) dan nonribosomal
peptide sintase (NRPS) (Effendi 2012; Fadhillah 2014). Namun, data mengenai
keberadaan gen penyandi senyawa bioaktif dari isolat bakteri dengan kode HAL08 dan HAL-20 hingga saat ini belum diteliti sehingga diperlukan penelitian

2
tentang deteksi gen penyandi senyawa bioaktif untuk memastikan bahwa bakteri
tersebut menghasilkan senyawa bioaktif dan dari data tersebut dapat diketahui
keragaman senyawa bioaktif yang dihasilkan. Penelitian yang mengkaji potensi
senyawa bioaktif dari bakteri yang berasosiasi dengan spons Jaspis sp. dan
Haliclona sp yang diisolasi oleh Tokasaya (2010) dan Abubakar et al. (2011)
sebagai antikanker dan antioksidan sampai saat ini belum dilakukan serta
keragaman kandungan senyawa metabolit sekunder yang bersifat bioaktif yang
dihasilkan oleh bakteri tersebut belum diketahui, oleh karena itu tujuan penelitian
ini adalah menentukan potensi ekstrak dari bakteri yang berasosiasi dengan spons
sebagai antikanker dan antioksidan serta mendeteksi keberadaan gen penyandi
senyawa bioaktif dari isolat bakteri tersebut.
Perumusan Masalah
Salah satu manfaat penting yang dihasilkan spons yaitu kemampuannya
dalam menghasilkan senyawa metabolit sekunder yang bersifat bioaktif.
Pemanfaatan spons laut saat ini untuk produk komersial senyawa bioaktif
umumnya dilakukan dengan cara mengambil langsung di alam. Apabila hal
tersebut dilakukan secara berkelanjutan dapat mengakibatkan penurunan populasi
secara signifikan. Oleh karena itu dibutuhkan metode produksi senyawa bioaktif
yang tetap mempertahankan kelestarian sumber daya alam secara
berkesinambungan salah satunya dengan mengekstraksi senyawa bioaktif dari
mikrob yang berasosiasi dengan spons. Ekstrak bioaktif yang dihasilkan
diharapkan memiliki potensi sebagai antioksidan dan antikanker.
Antioksidan berperan penting bagi tubuh manusia dalam menetralisir
radikal bebas, menghalangi terjadinya stres oksidatif, kerusakan jaringan dan
timbulnya penyakit degeneratif dan kanker. Penggunaan bahan bioaktif hasil
isolasi dari bahan alam terus dikembangkan karena sifatnya yang mudah
teruraikan, dan dapat dikeluarkan dari dalam tubuh, sedangkan bahan sintetis
dapat menyisakan residu yang berbahaya bagi tubuh. Oleh karena itu pelacakan
bahan bioaktif dari bahan alam banyak dilakukan, untuk mendapatkan bahan
bioaktif yang berpotensi sebagai antikanker dan antioksidan baru.
Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah menentukan potensi ekstrak dari bakteri yang
berasosiasi dengan spons sebagai antioksidan dan antikanker serta deteksi gen
yang berperan dalam sintesis senyawa bioaktif.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan mendapatkan ekstrak yang bersifat bioaktif dari
bakteri yang berpotensi sebagai antikanker dan antioksidan serta memberi
informasi adanya gen yang berperan dalam sintesis senyawa bioaktif tersebut.

3
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian ini mencakup ekstraksi bahan bioaktif dari bakteri laut yang
berasosiasi dengan spons , uji kandungan kimia, uji antikanker, uji antioksidan,
dan deteksi gen yang berperan dalam sintesis senyawa bioaktif.

TINJAUAN PUSTAKA
Bakteri Laut yang Berasosiasi dengan Spons
Spons merupakan hewan metazoa dari filum porifera yang memperoleh
makanan dari lingkungannya secara pasif. Spons hidup menempel pada substrat
di dasar perairan laut atau tawar. Spons tidak memiliki jaringan yang sebenarnya,
tetapi memiliki tipe sel berbeda dengan pembagian fungsi yang jelas. Pinacoderm
merupakan lapisan sel yang paling luar dibentuk oleh sel-sel pinacocyte. Pori-pori
pada permukaan spons disebut ostia yang merupakan saluran atau kanal.
Choanocyte merupakan sel berflagel yang berfungsi untuk menyaring partikel
makanan. Partikel makanan akan ditransfer ke mesohyl. Mikroorganisme yang
berasosiasi dengan spons umumnya terjadi pada jaringan mesohyl (Taylor et al.
2007).
Interaksi mikroorganisme dengan spons yaitu sebagai makanan, patogen,
parasit atau sebagai organisme yang bersimbiosis secara mutualistik.
Mikroorganisme yang telah diketahui bersimbiosis dengan spons dikategorikan ke
dalam 14 filum bakteri, dua kelompok utama arkea, dan organisme eukariotik
berukuran mikroskopik. Berdasarkan analisis sekuen gen 16S rRNA dan
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) yang dilakukan oleh Taylor et
al. (2007) kelompok bakteri yang diketahui bersimbiosis dengan spons antara lain
Acidobacteria, Actinobacteria, Bacteroides, Chloroflexi, Cyanobacteria,
Deinococcus-Thermus,
Firmicutes,
Gemmatimonadetes,
Nitrospira,
Planctomycetes,
Poribacteria,
Proteobacteria,
Sphirochaetes
dan
Verrucomicrobia. Interaksi spons dan mikroorganisme simbionnya yang memiliki
hubungan yang bersifat simbiosis mutualisme yaitu spons bertahan dari gangguan
organisme lainnya yaitu dengan mengandalkan berbagai metabolit sekunder yang
bersifat bioaktif yang dihasilkan mikroorganisme simbionnya sedangkan
mikroorganisme yang bersimbiosis dengan spons mendapatkan pasokan senyawa
karbon organik yang dapat dengan mudah digunakan sebagai sumber energi
(Müller et al. 2004).
Senyawa Bioaktif dari Mikroorganisme Laut yang Berasosiasi dengan
Spons
Senyawa bioaktif dari mikroba yang berasosiasi dengan spons telah
ditemukan lebih dari 200 senyawa bioaktif baru setiap tahunnya (Taylor et. al.
2007). Senyawa bioaktif dari mikroba yang berasosiasi dengan spons memiliki
potensi sebagai antibakteri, antifungi, antitumor, antikanker, sitotoksik,
antimalaria, dan antioksidan (Tabel 1).

4
Tabel 1 Aktivitas senyawa bioaktif dari mikroorganisme yang berasosiasi dengan
spons (Thomas et al. 2010)
Mikroorganisme
Spons
Senyawa bioaktif
Aktivitas
simbion
Stelletta tenuis
Alcaligenes faecalis Cyclo-(L-Pro-L-Phe)
Antimikrob
A72
Jaspis johnstoni
Hyphomycete
Chloriolin B
Antitumor
fungus
Dendrilla nigra
Nocardiopsis
Acetic acid,-butylAntimikrob,
dassonvillei
Ester,
antioksidan,
Hexadecanoic acid,
hypocholesterolemic,
methyl- ester,
nematisida,
9-Octadecenoicacidantiandrogenic,
(Z)-, methyl- ester
hemolytic, Antiinflammatory,
cancer preventive,
dermatitigenic,
hypo-cholesterolemic,
anemiagenic
Haliclona
Emericella
Evariquinone
Anti-proliferasi
valliculata
variecolor
Haliclona
Pseudo-alteromonas Belum diidentifikasi
Antimikrob
simulans
sp., Halomonas sp.
Streptomyces sp.
Bacillus sp.
Haliclona sp.
Mikroorganisme
Hirsutanol A
Antibiotik
yang
belum
diidentifikasi
Lamellodysidea
Oscillatoria
Dihydrodysamide C
therapeutic
herbacea
spongeliae
Halichondria
Alteromonas sp.
Alteramide A
Antikanker,
okadai
Rubritalea
Dia-polycopenedioic
sitotoksik,
squalenifasciens
acid
Antioksidan
HOact23T
xylosyl esters A
Halichondria
Microbacterium sp. 1-O-acylAntitumor
panacea
3-[R-glucopyranosyl-(13)(6-O-acyl-Rmannopyranosyl)]glycerol
Halichondria
Gymnascella
Gymnostatin A
Anti leukemia,
japonica
dankaliensis
YM-202204
sitotoksik, antifungal
Phoma sp.
Acanthella acuta Bacillus pumilus
GG11
Antitumor
Acanthostrongylo Micromonospora sp. Manzamine A
Antitumor,
phorora sp.
antimalaria
Aplysina
Bacillus subtilis
Surfactin , iturin,
Antifungi,
aerophoba
fengycin
antibakteri

5
Senyawa bioaktif dari spons memiliki potensi sebagai antibakteri, antifungi,
antitumor, antikanker, sitotoksik, antimalaria, dan antioksidan. Pengembangan
senyawa bioaktif yang berasal dari spons mengalami hambatan karena
memerlukan biomassa spons yang besar untuk mengekstraksi senyawa bioaktif
dalam aplikasinya di bidang medis (Proksch et al. 2002). Oleh karena itu
dibutuhkan metode produksi senyawa bioaktif yang tetap mempertahankan
kelestarian sumber daya alam secara berkesinambungan salah satunya dengan
mengekstrak senyawa bioaktif dari mikrob yang berasosiasi dengan spons (Tabel
1).
Gen Penyandi Senyawa bioaktif
Senyawa bioaktif umumnya disintesis oleh enzim Polyketide sintase
(PKS) dan nonribosomal peptide sintase (NRPS) (Cane et al. 1998; Moffit &
Neilan 2003). Enzim PKS terorganisasi secara modular dan setiap modul
memiliki informasi esensial untuk pengenalan, aktivasi dan modifikasi dari suatu
substrat menjadi senyawa polimernya. Setiap modul dapat dibagi menjadi
beberapa domain yang terlibat dalam reaksi spesifik. Jumlah modul dan organisasi
domain-domain pada kluster gen tersebut menentukan struktur senyawa poliketid
(Schwarez & Marhiel 2001). Nonribosomal peptides merupakan senyawa bioaktif
yang dibentuk dari monomer asam amino yang sederhana. Nonribosomal peptida
disintesis oleh gen NRPS yang terdiri dari multimodular dan protein
multifungsional.
Enzim PKS dan NRPS disusun oleh tiga domain utama yaitu dua domain
berfungsi sebagai katalitik dan satu domain sebagai pembawa (carrier). Domain
utama pada PKS antara lain, ketosintase (KS), acyl tranferase (AT), dan acyl
carrier protein (ACP) sedangkan pada NRPS kondensasi (C), adenilasi (A), dan
peptidyl carrier protein (PCP) (Cane & Walsh 1999). Enzim tersebut memiliki
ukuran yang besar sekitar 200 sampai 2000 kDa sebagai enzim mutifungsional
yang memiki modul-modul dalam membuat suatu senyawa. Beberapa produk
poliketida dan peptida nonribosom dalam dunia medis antara lain, antibakteri
vancomycin dan erythromycin, immunosuppressant cyclosporin dan rapamycin,
serta antitumor bleomycin dan epothilone. Penggunaan domain KS dan A dalam
studi keragaman gen PKS dan NRPS disebabkan domain ketosintase (KS) dan
domain adenilasi (A) merupakan domain yang ada dalam tiap modul dan
memperlihatkan derajat konservasi yang tinggi di antara domain lainnya (Moffitt
& Neilan 2003).
Kanker
Kanker merupakan penyakit yang disebabkan karena adanya kerusakan
dalam struktur DNA sehingga mengakibatkan pertumbuhan sel yang tidak
terkendali. Sel-sel yang mengalami kerusakan genetik akan terus melakukan
proliferasi tanpa kontrol karena mekanisme regulasi siklus sel normal. Faktor
lingkungan seperti gaya hidup dan pola makan berkorelasi dengan penyakit
kanker misalnya paparan sinar ultraviolet dengan kanker kulit, merokok dengan
kanker paru-paru. Selain itu ada faktor lain di luar faktor lingkungan yakni
kesalahan replikasi DNA dan bawaan (McKelvery & Evans 2003; Go et al. 2003;

6
Milner 2004; Nowell et al. 2004). Senyawa radikal bebas juga berpotensi merusak
basa DNA sehingga mengacaukan sistem informasi genetik, dan berlanjut pada
pembentukan sel kanker. Antioksidan berperan penting bagi tubuh manusia dalam
menetralisir radikal bebas yang mengakibatkan penyakit degeneratif termasuk
kanker (Halliwell & Gutteridge 1999). Jumlah penderita kanker di dunia terus
meningkat, saat ini jumlahnya meningkat sekitar 7 juta penderita kanker dari
tahun sebelumnya. Menurut WHO, di Indonesia terjadi sebanyak 165 kasus
kanker dalam 100.000 penduduk. Kanker leher rahim (servic) merupakan salah
satu penyebab utama kematian wanita yang berhubungan dengan kanker. Kanker
leher rahim menyebabkan 270.000 kematian setiap tahunnya. Sekitar 85% kasus
kanker leher rahim terjadi di negara berkembang (WHO 2013). Penelitian
epidemiologi menunjukkan lebil dari 90% kanker serviks dihubungkan dengan
jenis human papiloma virus (HPV). HPV merupakan faktor inisiator kanker
serviks. Onkoprotein E6 dan E7 yang berasal dari HPV merupakan penyebab
terjadinya degenerasi keganasan. Onkoprotein E6 akan mengikat p53 sehingga
tumor supressor gene (TSG) p53 akan kehilangan fungsinya. Onkoprotein E7
akan mengikat TSG Rb, ikatan ini menyebabkan terlepasnya E2F yang merupakan
faktor transkripsi sehingga siklus sel berjalan tanpa kontrol (Garcia 2007).
Pengobatan kanker yang umum dilakukan saat ini adalah dengan cara
kemoterapi. Kemoterapi adalah terapi kimia dengan menggunakan zat-zat
kemoterapi untuk menekan pertumbuhan kanker dengan menggunakan bahanbahan bioaktif dari hasil sintesis atau isolasi dari bahan alam. Penggunaan bahan
bioaktif hasil isolasi dari bahan alam terus dikembangkan karena sifatnya yang
mudah teruraikan, dan dapat dikeluarkan dari dalam tubuh, sedangkan bahan
sintetis dapat menyisakan residu yang berbahaya bagi tubuh. Hal ini menyebabkan
pelacakan senyawa-senyawa antikanker dari bahan alam banyak dilakukan, untuk
mendapatkan senyawa yang berpotensi sebagai antikanker baru dalam strategi
pengembangan kemoterapi (Ramanthan et al. 1992).
Radikal Bebas
Radikal bebas adalah molekul dengan satu atau lebih elektron yang tidak
berpasangan pada orbitalnya. Radikal bebas sangat reaktif, merupakan molekul
yang tidak stabil dan bereaksi dengan cepat pada biomolekul melalui banyak jenis
reaksi antara lain penangkapan hidrogen, donasi elektron dan penggunaan
elektron bersama. Radikal bebas akan melepaskan elektron pada molekul
sekitarnya untuk menghasilkan pasangan elektron agar menjadi molekul yang
stabil (Hosseinian 2006; Maxwell & Lip 1997).
Radikal bebas oksigen dan produk non radikalnya dikelompokkan dalam
reactive oxygen species (ROS). ROS dapat dikelompokkan menjadi radikal
oksigen dan kelompok derivat non radikal oksigen. Kelompok radikal oksigen
terdiri dari O2-(superoksid), HO2-(hidroperoksil), OH-(hidroksil), L(R)OO(peroksil) serta NO-(nitrit oksid) sedangkan yang derivat non radikal oksigen
antara lain ONOO- (peroksi nitrit),-OCl (hipoklorit), -O2-(oksigen singlet),
L(R)OOH (hidroperoksida) dan H2O2 (hidrogen peroksida) (Danusantoso 2003).
Radikal bebas dapat menyebabkan terjadinya penyakit degeneratif dan kanker
(Mc Cord 2000).

7
Antioksidan
Antioksidan adalah suatu substansi yang pada konsentrasi kecil secara
signifikan mampu menghambat atau mencegah oksidasi pada substrat (Isnindar et
al. 2011). Antioksidan menstabilkan radikal bebas dengan melengkapi
kekurangan elektron yang dimiliki radikal bebas dan menghambat terjadinya
reaksi berantai dari pembentukan radikal bebas yang dapat menimbulkan stres
oksidatif. Antioksidan dapat berperan sebagai peredam radikal bebas (free radical
scavenger) (Dean 2003). Antioksidan akan bereaksi dengan radikal bebas dan
mengubahnya menjadi senyawa yang tidak reaktif dan relatif stabil sehingga tidak
menyebabkan kerusakan membran dan permeabilitas sel. Berdasarkan sumbernya,
antioksidan dibagi menjadi dua kelompok yaitu antioksidan endogen dan eksogen.
Antioksidan endogen terdapat secara alamiah di dalam tubuh contohnya bilirubin,
thiols seperti glutathione, N-acetyl cystein, nicotinamide adenine dinucleotide
phosphate (NADPH) dan nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), ubiquinone,
uric acid, enzim superoxide dismutases (SOD) dan glutathione peroxidase.
Antioksidan eksogen berasal dari luar tubuh contohnya vitamin C, vitamin E, beta
karoten dan polifenol. Antioksidan eksogen dapat berupa antioksidan alami
maupun sintetik.
Antioksidan berperan penting bagi tubuh manusia dalam menetralisir
radikal bebas, menghalangi terjadinya stres oksidatif, kerusakan jaringan dan
timbulnya penyakit degeneratif. Adanya senyawa antioksidan di dalam tubuh
dapat memutuskan rantai radikal bebas, mencegah reaksi fenton, mengkatalisis
proses oksidasi molekul, mengubah radikal bebas yang reaktif menjadi tidak
reaktif, memperbaiki jaringan atau sel yang telah dirusak oleh radikal bebas dan
menyediakan lingkungan yang baik sehingga mendorong antioksidan bekerja
dengan optimal di dalam tubuh.
Troloks
Troloks merupakan antioksidan sintetis yang memiliki nama dalam IUPAC 6hidroksi-2,5,7,8-tetrametilkroman-2-asam karboksilat (Gambar 1). Troloks
memiliki tekstur bubuk berwarna putih dan mempunyai aktivitas antioksidan yang
lebih tinggi dibandingkan α-tokoferol, butylated hydroxyanisole (BHA), serta
butylated hydroxytoluen (BHT) (Belitz & Grosch 1999). Troloks umumnya
digunakan sebagai standar dalam pengukuran antioksidan yang dapat dinyatakan
sebagai ekivalen troloks. Koefisien TEAC (troloks equivalent antioxidant
capacity) merupakan konsentrasi troloks yang memiliki kapasitas antioksidan
yang ekuivalen dengan ekstrak yang duji. Kapasitas antioksidan dari setiap
metode dinyatakan dalam μmol troloks/g ekstrak (Apak et al. 2008).

Gambar 1 Struktur troloks.

8
METODE
Penelitian ini terdiri atas beberapa tahap. Tahapan kerja penelitian
disajikan pada Gambar 2. Dokumentasi penelitian terlampir pada bab Lampiran.
Isolat bakteri dengan kode SAB E-31, SAB E-35,
SAB E-38, SAB E-40, SAB E-41, SAB E-57, HAL08, dan HAL-20

Isolat bakteri kode
HAL-08, HAL-20

Ekstraksi

Dipekatkan dengan
menggunakan
evaporator

Isolasi DNA

Ekstrak

Uji Fitokimia







Alkaloid
Saponin
Flavonoid
Tanin
Steroid dan
Terpenoid

Uji Antioksidan



Aktivitas
Antioksidan
metode DPPH
Kapasitas
Antioksidan
metode
CUPRAC

Amplifikasi DNA
Penyandi Domain
Ketosintase (KS) dan
Domain Adenilasi (A)
Uji Antikanker


Aktivitas
antikanker

Analisis Bioinformatika

Gambar 2 Tahapan kerja penelitian.

Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan mulai bulan Desember 2013 hingga Juni 2014.
Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi, dan
Laboratorium Kimia Analitik Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor, Laboratorium Pusat Studi Satwa
Primata, dan Laboratorium Pusat Studi Penelitian Biofarmaka LPPM IPB.

9
Bahan
Bahan yang digunakan adalah isolat bakteri dengan kode SAB E-31, SAB
E-35, SAB E-38, SAB E-40, SAB E-41, dan SAB E-57 yang diisolasi oleh
Abubakar et al. (2011) dari spons Jaspis sp dan isolat bakteri dengan kode HAL08, HAL-20 (Tokasaya 2010) yang diisolasi dari spons Haliclona sp. akuades, etil
asetat, etanol, HCl pekat, n-amil alkohol, anhidrida asetat, kloroform-amoniak,
H2SO4 2 M, pereaksi Mayer, Dragendorf, Wagner, serbuk Mg, pereaksi FeCl3 1%,
NaOH 10%, DPPH (2,2 difenil-1-pikril hidrazil), troloks, CuCl2, Neucoprine,
NH4Ac, Dimetyl sulphoxide (DMSO), sel kanker Hela, Dubecco's Modified
Eagle's Medium (DMEM), 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]2,5-difeniltetrazolium
bromida (MTT), Tris HCL, EDTA, Lisozim, Proteinase-K, Phenol, Kloroform,
Agarose 1%, Etidium Bromida, Loading dye, ddH2O,dan master mix PCR.

Alat
Alat yang digunakan adalah peralatan mikrobiologi pada umumnya,
Laminar Air Flow Cabinet (Jouan, Prancis), autoklaf, hot plate, evaporator,
elektroporator. spektrofotometer, seperangkat alat uji antikanker termasuk
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) reader dan inkubator CO2,
spektrofotometer, seperangkat alat isolasi dan amplifikasi DNA termasuk mesin
PCR (Polymerise Chain Reaction), dan peralatan elektroforesis.

Metode Penelitian
Peremajaan bakteri yang berasosiasi dengan spons
Isolat bakteri yang digunakan dalam penelitian yaitu bakteri dengan kode
SAB E-31, SAB E-35, SAB E-38, SAB E-40, SAB E-41, dan SAB E-57 yang
diisolasi dari spons Jaspis sp oleh Abubakar et al. (2011) dari spons Jaspis sp dan
isolat bakteri dengan kode HAL-08, HAL-20 yang diisolasi dari spons Haliclona
sp (Tokasaya 2010). Bakteri tersebut diremajakan dalam medium agar Sea Water
Complete (SWC).
Ekstraksi bahan bioaktif dari bakteri laut yang berasosiasi dengan spons
Isolat bakteri masing-masing dikulturkan dalam 1000 mL medium cair Sea
Water Complete (SWC) (Lampiran 1). Kultur diinkubasi pada mesin penggoyang
(100 rpm; 30 °C) selama 72 jam, kemudian ditambahkan 1000 mL etil asetat dan
diaduk selama 12 jam. Lapisan etil asetat dievaporasi dan ekstrak yang diperoleh
disimpan pada suhu 5 °C (Muller et al. 2004).
Uji kandungan kimia
Uji kandungan kimia terdiri atas uji flavonoid, uji alkaloid, uji saponin, uji
tanin, uji terpenoid dan steroid (Harborne 1987).

10
Uji Flavonoid. Ekstrak sebanyak 0.1 g ekstrak ditambah dengan 10 mL
akuades, kemudian dipanaskan selama 5 menit. Filtrat sebanyak 10 mL
ditambahkan 0.5 g serbuk Mg, 1 mL HCl pekat, dan 1 mL amil alkohol.
Campuran dikocok dengan vortex dan hasil uji positif terhadap flavonoid ditandai
dengan munculnya warna merah, kuning, atau jingga pada lapisan amil alkohol.
Uji Alkaloid . Sebanyak 0.1 g ekstrak ditambah dengan 10 mL CHCl3 dan
beberapa tetes NH4OH. Larutan tersebut disaring dan filtratnya ditambahkan 10
tetes H2SO4 2M, lalu dikocok. Lapisan asam dipisahkan kedalam 3 spotplate dan
masing-masing ditambahkan dengan pereaksi Mayer menunjukkan hasil uji positif
jika terbentuk endapan putih, pereaksi Wagner menunjukkan hasil positif jika
terbentuk endapan cokelat, dan pereaksi Dragendorf menunjukkan hasil positif
jika terbentuk endapan merah jingga.
Uji Saponin. Ekstrak sebanyak 0.1 g ekstrak ditambah dengan 10 mL
akuades, kemudian dipanaskan selama 5 menit. Filtrat sebanyak 10 mL dikocok
selama 10 menit dalam keadaan tertutup. Ekstrak yang mengandung saponin akan
membentuk buih yang stabil selama 10 menit.
Uji Tanin. Sebanyak 0.1 g ekstrak dalam 10 mL akuades dipanaskan
selama 10 menit, kemudian disaring dan filtratnya ditambahkan dengan 5 tetes
FeCl3 1%. Ekstrak yang positif mengandung tanin akan membentuk warna biru
tua.
Uji Terpenoid dan Steroid. Sebanyak 0.1 g ekstrak dilarutkan dengan 10
mL etanol, disaring, dan diuapkan hingga kering. Residu yang dihasilkan
dilarutkan dalam eter, kemudian fase eter tersebut ditambahkan 1 tetes H2SO4 dan
3 tetes anhidrida asetat. Jika terbentuk warna biru kehijauan artinya ekstrak positif
mengandung steroid dan jika terbentuk warna ungu artinya ekstrak positif
mengandung terpenoid.
Uji aktivitas antikanker menggunakan metode MTT
Uji aktivitas antikanker meggunakan metode MTT (Thakur et al. 2005). Sel
kanker yang digunakan dalam penelitian sel kanker leher rahim yaitu sel HeLa
ATCC-CCL 2. Sel kanker dalam Dubecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)
diinokulasikan ke dalam sumuran dengan jumlah inokulan 100 μL (kepadatan
5×103 sel/sumuran) selama 24 jam. Sebanyak 100 μL ekstrak aktif dengan
konsentrasi 5 μg mL-1, 25 μg mL-1, 125 μg mL-1, dan 625 μg mL-1 ditambahkan
pada inokulan kemudian diinkubasi pada inkubator CO2 pada suhu 37 oC selama
24 jam. Selanjutnya setiap sumuran ditambahkan 100 μL 3-[4,5-dimetiltiazol-2il]2,5-difeniltetrazolium bromida (MTT) dan diinkubasi kembali selama 4 jam
dalam inkubator CO2. Sel hidup akan bereaksi dengan MTT membentuk formazan.
Formazan dilarutkan dalam larutan etanol. Serapan dibaca dengan alat EnzymeLinked Immunosorbent Assay (ELISA) reader pada panjang gelombang 595 nm.
Persentase penghambatan sel HeLa dihitung dengan rumus berikut :
enghambatan

Absorbansi kontrol Absorbansi sampel
100
Absorbansi kontrol

11
Nilai penghambatan sel HeLa 50% (IC50) ditentukan dengan menggunakan
kurva hubungan antara konsentrasi ekstrak (x) dan nilai persentase penghambatan
sel HeLa (y) (Lampiran 7).
Uji aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH
Sebanyak 0.01 g ekstrak dilarutkan dengan 1 mL DMSO sehingga menjadi
larutan stok 10 000 µg mL-1. Kemudian Ekstrak 10 000 µg mL-1 dilarutkan dalam
etanol dan dibuat dengan konsentrasi 100 µg mL-1 dan 200 µg mL-1 dalam
microplate well. Setiap sumur ditambahkan 100 μl larutan D H (1,1-difenil-2pikrilhidrazil) dan 100 μl etanol. Kemudian diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 30
menit, serapannya diukur pada panjang gelombang 514 nm. Kontrol positif yang
digunakan yaitu vitamin C dengan konsentrasi 16 µg mL-1. Persentase aktivitas
penghambatan dihitung dari :
enghambatan 1

(Absorbansi sampel Absorbansi kontrol)
100
(Absorbansi blanko Absorbansi kontrol)

Dimana Absorbansi kontrol adalah absorbansi kontrol vitamin C,
Absorbansi blanko adalah absorbansi kontrol etanol, dan absorbansi sampel
adalah absorbans ekstrak (Lampiran 9).
Uji aktivitas antioksidan menggunakan metode CUPRAC
Sebanyak 1 mL 10-2 M CuCl2, 1 mL 7.5×10-3 M Neucoprine, 1 mL 1 M
NH4Ac, dan 0.1 mL H2O ditambahkan 1 mL ekstrak dalam etanol. Volume total
4.1 mL diinkubasi selama 30 menit, kemudian diukur absorbansinya pada panjang
gelombang 450 nm (Apak et al. 2008). Kurva standar pengukuran kapasitas
antioksidan menggunakan troloks dengan konsentrasi 10, 25, 50, 75, 100, 150,
200, dan 250 µM (Lampiran 10). Kapasitas antioksidan dinyatakan dalam µmol
troloks/g ekstrak (Lampiran 11).
Amplifikasi DNA penyandi domain ketosintase (KS) dan domain adenilasi
(A)
Isolat bakteri dengan kode HAL-08 dan HAL-20 masing-masing
dikulturkan pada medium SWC cair yang telah diinkubasi pada suhu 30 ºC selama
24 jam. Isolasi DNA Genom dilakukan menggunakan metode lisis dengan cetyl
trimethyl ammonium bromide (CTAB) (Sambrook & Russel 2001).
Amplifikasi gen penyandi domain KS dari PKS dan domain A dari NRPS
dilakukan dengan mengikuti metode Schirmer et al. (2005). Amplifikasi
dilakukan dengan mencampurkan berturut-turut 20 µl ddH2O, 25 µl master mix
taq polimerase PCR, 1.5 µl primer dan 2 µl template. Primer yang digunakan
untuk mengamplifikasi domain KS adalah forward : 5’- CSATGGA
YCCSCARCARCGSVT-3’, reverse : 5’TSCCSGTSCCRTGSSC YTCSAC-3’
dan sekuen primer spesifik untuk domain A yaitu forward : 5’AARDSIGGIGSIGSITAYBICC-3’, reverse: 5’-CKRWAICCICKIAIYTTIAY
YTG-3’ (Schirmer et al. 2005). Reaksi PCR dilakukan sebanyak 35 siklus yang
terdiri dari beberapa tahap yaitu predenaturasi selama 5 menit dan denaturasi

12
selama 1 menit pada suhu 94 ºC, annealing pada 50 ºC selama 1 menit,
polimerisasi pada 72 ºC selama 1 menit, dan post PCR dilakukan pada suhu 72 ºC
selama 10 menit. Amplikon fragmen DNA penyandi domain ketosintase
divisualisasi menggunakan teknik elektroforesis dengan gel agarosa (1% b/v),
pewarnaan molekul DNA dilakukan menggunakan etidium bromida (5 μg mL-1).
Isolat yang mempunyai gen penyandi domain KS menunjukkan terbentuknya pita
pada berukuran 700 pb, sedangkan domain A berukuran 1000 pb. Hasil
amplifikasi disekuen menggunakan jasa 1st Base Malaysia.
Analisis Bioinformatika
Sekuen DNA dianalisis menggunakan program Basic Local Alignment
Search Tools (BLASTX) yang tersedia di situs web http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Hasil analisis sekuen DNA diterjemahkan ke dalam runutan protein menggunakan
ExPASY Molecular Biology (http://web.expasy.org/cgi-bin/translate/dna_aa).
Konstruksi pohon filogenetik berdasarkan sekuen domain KS dan domain A
dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak Molecular Evolutionary
Genetics Analysis (MEGA) versi 5.0 dengan metode neighbor-joining. (Tamura et
al. 2011).

HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Ekstraksi Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons
Ekstrak bahan bioaktif yang berasal dari bakteri diekstraksi menggunakan
pelarut etil asetat. Rendemen ekstrak etil asetat senyawa bioaktif yang berasal dari
bakteri menghasilkan jumlah rendemen 0.01% hingga 0.03% (Gambar 3 &
Lampiran 2).
0.035

0.03

0.03
0.025

Rendemen 0.02
(%(b/v)) 0.015

0.02

0.02

0.01

0.02

0.02

0.02

0.01

0.01
0.005
0

Kode Isolat
Gambar 3 Rendemen ekstrak bakteri yang berasosiasi dengan spons

13
Kandungan Fitokimia Ekstrak Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons
Ekstrak bakteri yang berasosiasi dengan spons memiliki kandungan
flavonoid, alkaloid, dan terpenoid. Selain itu ekstrak bakteri SAB E-38 dan SAB
E-41 juga memiliki kandungan steroid (Tabel 2 & Lampiran 5).
Tabel 2 Kandungan kimia ekstrak bakteri yang berasosiasi dengan spons
Ekstrak bakteri yang berasosiasi dengan spons
Golongan
SAB SAB
SAB
SAB SAB SAB HAL- HALsenyawa
E-31 E-35
E-38
E-40 E-41 E-57
08
20
Flavonoid
+
+
+
+
+
+
+
+
Alkaloid
+
+
+
+
+
+
+
+
Saponin
Tanin
Terpenoid
+
+
+
+
+
+
+
+
Steroid
+
+
Keterangan : + = terdeteksi, - = tidak terdeteksi
Aktivitas Antikanker Ekstrak Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons
Ekstrak senyawa bioaktif bakteri yang berasosiasi dengan spons memiliki
aktivitas sitotoksik atau menyebabkan kematian sel HeLa. Sel kanker yang diberi
perlakuan mulai dari konsentrasi ekstrak 25 µg mL-1 hingga 625 µg mL-1
menunjukkan peningkatan aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker HeLa seiring
dengan peningkatan konsentrasi ekstrak yang digunakan (Tabel 3 & Lampiran 6).
Hasil yang diperoleh yaitu ekstrak senyawa bioaktif bakteri pada konsentrasi 125
µg mL-1 menyebabkan kematian sel HeLa sebesar 31.79% hingga 43.57% dan
pada konsentrasi 625 µg mL-1 menyebabkan kematian sel HeLa ± 90%.
Berdasarkan hubungan dari kurva persentase kematian sel HeLa dan konsentrasi
ekstrak diperoleh nilai IC50. Menurut National Cancer Institut (NCI) nilai IC50
adalah konsentrasi ekstrak yang diperlukan untuk menghambat pertumbuhan sel
kanker sebesar 50% (Boyd et al. 1992). Nilai IC50 ekstrak bakteri terendah yaitu
ekstrak SAB E-40 dengan nilai IC50 234.59 µg mL-1 (Tabel 3). Perbedaan
morfologi sel HeLa setelah diberi perlakuan ekstrak SAB E-40 pada berbagai
konsentrasi dengan kontrol negatif menunjukkan pengaruh ekstrak terhadap sel
HeLa (Gambar 4).

14
Tabel 3 Aktivitas antikanker ekstrak bakteri yang berasosiasi dengan spons
terhadap sel kanker HeLa
Kode Isolat Konsentrasi (µg mL-1) % Penghambatan IC50 (µg mL-1)
SAB E-31
625
84.33
267.03
125
33.97
25
29.80
5
24.64
SAB E-35
625
94.29
250.60
125
32.07
25
25.27
5
22.37
SAB E-38
625
89.58
263.23
125
32.25
25
30.25
5
18.30
SAB E-40
625
95.02
234.59
125
32.16
25
27.81
5
27.17
SAB E-41
625
91.92
242.54
125
35.96
25
31.07
5
20.20
SAB E-57
625
86.14
245.47
125
43.57
25
29.08
5
21.38
HAL-8
625
85.51
264.89
125
33.33
25
27.72
5
26.27
HAL-20
625
34.06
125
31.79
25
28.08
5
13.41
Keterangan :
- : aktivitas penghambatan ≤ 50 sehingga tidak dapat ditentukan nilai IC50.
* Nilai IC50 diperoleh dari hasil 2 kali ulangan.
Aktivitas Antioksidan Menggunakan Metode DPPH
Hasil uji aktivitas antioksidan peredaman radikal bebas DPPH ekstrak
bakteri yang berasosiasi dengan spons menggunakan metode DPPH pada
konsentrasi 100 µg mL-1 dan 200 µg mL-1 berkisar 1.26% hingga 19.34%
(Lampiran 8). Aktivitas peredaman radikal bebas DPPH tertinggi oleh ekstrak
bakteri SAB E-40 (Tabel 4).

15

(a)

(b)

(c)

(d)

Sel HeLa yang
mengalami
kematian

(e)
Gambar 4 Sel HeLa pada uji antikanker ekstrak dari bakteri SAB E-40 pada
konsentrasi (a) 0 µg mL-1 (kontrol negatif), (b) 5 µg mL-1, (c) 25 µg
mL-1, (d) 125 µg mL-1 , (e) 625 µg mL-1 pada perbesaran 100x .

16
Tabel 4 Aktivitas peredaman radikal bebas DPPH ekstrak bakteri yang berasosiasi
dengan spons menggunakan metode DPPH
Peredaman radikal bebas DPPH (%) pada
konsentrasi ekstrak*
Kode Isolat
100 (µg mL-1)
200 (µg mL-1)
SAB E-31
4.87
7.57
SAB E-35
1.62
5.53
SAB E-38
4.63
10.39
SAB E-40
10.09
19.34
SAB E-41
7.39
10.39
SAB E-57
4.02
10.15
HAL-08
4.08
7.51
HAL-20
1.26
4.44
*Nilai aktivitas peredaman diperoleh dari hasil 3 kali ulangan

Aktivitas Kapasitas Antioksidan Menggunakan Metode CUPRAC
Kapasitas antioksidan dinyatakan dalam μmol troloks/g ekstrak. Hasil
pengukuran kapasitas antioksidan dengan metode CUPRAC menunjukkan
sebanyak delapan ekstrak dari bakteri yang berasosiasi dengan spons memiliki
aktivitas antioksidan dengan kapasitas antioksidan berkisar 115.94 hingga 649.92
µmol troloks/g ekstrak. Aktivitas antioksidan tertinggi dimiliki oleh ekstrak
bakteri HAL-08 dengan kapasitas antioksidan 649.92 µmol troloks/g ekstrak
(Tabel 5).
Tabel 5 Kapasitas antioksidan ekstrak bakteri yang berasosiasi dengan spons
Kode Isolat

Kapasitas Antioksidan
(µmol troloks/g ekstrak)*
156.94
154.47
115.94
116.02
233.86
641.38
649.92
273.80

SAB E-31
SAB E-35
SAB E-38
SAB E-40
SAB E-41
SAB E-57
HAL-08