Aktifitas Ekstrak Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons Haliclona sp2. dan Axinellid sp. sebagai Antibakteri.

Lampiran1. Bagan Alir Penelitian

Pengambilan sampel
spons dari perairan Pulau
Ngge Sibolga

Isolasi dan pemurnian
bakteri simbion spons

Uji antibakteri isolat
terhadap bakteri patogen
secara in-vitro

Ekstraksi metabolit
sekunder isolat bakteri
potensial secara bertingkat
(n- heksana, etil asetat dan
metanol)

Skrining aktifitas ekstrak nheksana, etil asetat dan
metanol.

Skrining komponen
senyawa ekstrak potensial

Pemisahan golongan
senyawa metabolit sekunder
ekstrak isolat potensial
dengan KLT

Uji aktifitas antibakteri
fraksi ekstrak isolat potensial

Universitas Sumatera Utara

Lampiran 2a. Isolasi dan Pemurnian Bakteri Simbion
Sampel dihaluskan

Sampel yang telah halus
diambil 1 gr

Dimasukkan ke dalam tabung
reaksi berisi 9 ml air laut
steril

Dilakukan pengenceran
bertingkat

Diambil 1 ml

Diinokulasi pada media
nutrien agar

Inkubasi selama 2x24
jam

Diinokulasi kembali
pada media nutrien agar

Diperoleh koloni
tunggal

Universitas Sumatera Utara

Lampiran 2b. Isolat Tunggal Bakteri Simbion

Universitas Sumatera Utara

A1

A4

A6

A8

A3

A5

A7

A9

Universitas Sumatera Utara

Lampiran 3a . Bagan Alir Uji aktifitas Antibakteri

Uji Aktivitas Antibakteri

Terhadap bakteri patogen
secara in-vitro

Isolat bakteri
disubkultur pada media
NA

Hasil subkultur
diambil dengan ose
dan dilarutkan dalam
air laut steril

10 μl suspensi bakteri
simbion diteteskan
pada cakram oxoid

Cakram oxoid
diletakkan pada media
NA yang diinokulasi
dengan bakteri uji

Inkubasi 24-48 jam

Terhadap ekstrak nheksana, etil asetat dan
metanol.

Inokulasi 200 µl
suspensi bakteri uji ke
dalam media nutrien
agar

Terhadap fraksi ekstrak nheksana, etil asetat dan
metanol.

Inokulasi 200 µl
suspensi bakteri uji ke
dalam media nutrien
agar

Cakram oxoid yang
telah ditetesi 10 µl dari
masing-masing ekstrak
n-Heksana, Etil asetat
dan Metanol
diletakkan pada media
NA yang telah
diinokulasi suspensi
bakteri uji

Cakram oxoid yang
telah ditetesi 10 µl dari

masing-masing fraksi
ekstrak n-Heksana, Etil
asetat dan Metanol
diletakkan pada media
NA yang telah
diinokulasi suspensi
bakteri uji

Inkubasi selama 24
jam

Inkubasi selama 24
jam

Pengukuran zona
hambat (mm)

Pengukuran zona
hambat (mm)

Pengukuran zona
hambat (mm)
Universitas Sumatera Utara

Lampiran 3b. Pengujian Isolat Bakteri Terhadap Bakteri Uji
1. Pengujian Isolat Bakteri Terhadap S.aureus

H1
H6

H4

H2

H3
H6

A3

A7

A9

A6

A2

A1

A8

2. Pengujian Isolat Bakteri Terhadap E. coli
H1

H5

H6

H3
H2

H7

A6

A7

A1
A2

Universitas Sumatera Utara

A9
A8

3. Pengujian Isolat Bakteri Terhadap P. Aeruginosa
A3

H1

A3

A2
A1
H2
H3
A4

A7

A8

A9

Universitas Sumatera Utara

Lampiran 3c. Pengujian Ekstrak N-Heksana, Etil Asetat dan Metanol dari Isolat
HH2, A9 dan A10 Terhadap Bakteri Uji S.aureus, E.coli dan P.
aeruginosa
1. Ekstrak Isolat H2 Terhadap S.aureus

2. Ekstrak Isolat H2 Terhadap E. coli
MH2

MH2

EH2

HH2

EH2

HH2

MA1

MH2

EA1
HA1

HH2

EH2

Ekstrak Isolat H2 Terhadap P. aeruginosa

Ekstrak Isolat A1 terhadap S.aureus

MA1

MA1

HA1
HA1
EA1

Ekstrak Isolat A1 terhadap E. coli

EA1

Ekstrak isolat A1 terhadap P. Aeruginosa

Universitas Sumatera Utara

Ekstrak Isolat A2 Terhadap S.aureus

Ekstrak Isolat A2 Terhadap E. coli

MA2

EA2

MA2

HA2

EA2
HA2

Ekstrak Isolat A2 Terhadap P. Aeruginosa
MA2

HA2
EA2

Universitas Sumatera Utara

Lampiran 4a. Bagan Alir Ekstraksi Metabolit Sekunder dari Isolat Bakteri
Potensial
Kultur isolat bakteri
yang telah
difermantasi

Dipotong kecil- kecil

Maserasi selama 3 x 24 jam dengan n-Heksana

Penyaringan

Filtrat

I

Residu

Maserasi selama 3 x 24 jam dengan etil asetat asetat

Evaporasi

Penyaringan

Ekstrak nHeksana

Residu

Filtrat

Evaporasi

Maserasi selama 24 jam dengan metanol

Ekstrak etil asetat

Penyaringan

Filtrat

Residu
I

Evaporasi

Ekstrak metanol

Universitas Sumatera Utara

Lampiran 4b. Ekstraksi Metabolit Sekunder dari Isolat Bakteri Potensial
1. Kultur bakteri H2 yang dimaserasi pada pelarut ekstrak n-heksana, etil
asetat dan metanol

2. Kultur bakteri A1 yang dimaserasi pada pelarut ekstrak n-heksana, etil
asetat dan metanol

3. Kultur bakteri A2 yang dimaserasi pada pelarut ekstrak n-heksana, etil
asetat dan metanol

4. Ekstrak metabolit sekunder isolat H2, A1 dan A2 bakteri potensial

Universitas Sumatera Utara

Lampiran 5a. Bagan Alir Uji Senyawa Metabolit Sekunder Ekstrak nHeksana, Etil asetat dan Metanol Isolat Potensial

Ekstrak
- Ditambahkan 5 ml aquades dan kloroform
lalu dikocok dan biarkan beberapa saat
sampai terbentuk dua lapisan (Lapisan air
untuk uji flavonoid, fenolik dan saponin
sedangkan lapisan kloroform untuk uji
terpenoid dan steroid)

Lapisan air

Lapisan kloroform

Uji flavonoid

Uji terpenoid

Uji fenolik

Uji steroid

Uji saponin

Uji alkaloid

Universitas Sumatera Utara

Bagan Alir Uji Flavonoid
Lapisan air

- Ditambahkan 1-2 butir logam magnesium dan
beberapa tetes asam klorida pekat
Terbentuk warna jingga, merah
muda sampai merah

1.

Bagan Alir Uji Fenolik
Lapisan air

- Ditambahkan 1-2 larutan FeCl 3 1%
Terbentuk warna
biru/ungu

2.

Bagan Alir Uji Saponin
Lapisan air

- Dimasukkan ke dalam tabung reaksi
lalu dikocok
Terbentuk busa yang bertahan
5 menit

Universitas Sumatera Utara

3.

Bagan Alir Uji Terpenoid dan Steroid
Lapisan kloroform

- Dilakukan penyaringan terhadap lapisan kloroform melalui
pipet yang ujungnya diberi kapas
- Dipipet sebanyak 2-3 tetes dan biarkan mengering pada plat
tetes
- Ditambahkan pereaksi Lieberman-Burchard (2 tetes asam
asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat)
- Terbentuk warna merah (terpenoid)
- Terbentuk warna hijau-biru (steroid)

4.

Bagan Alir Uji Alkaloid
Ekstrak

- Ditambahkan 10 ml larutan kloroform beramoniak 0,05 M
- Diaduk kemudian disaring dan dimasukkan ke dalam tabung
reaksi.
- Ke dalam tabung reaksi tersebut ditambahkan 1 ml asam sulfat
2 N, dikocok selama 2 menit dan dibiarkan hingga terbentuk
dua lapisan dan terjadi pemisahan.
- Lapisan asam (bagian atas) diambil dan ditambahkan 1-2 tetes
pereaksi Mayer atau pereaksi Dragendorff
- Terbentuknya endapan putih (pereaksi meyer)
- Terbentuk warna merah (pereaksi Dragendorff)

Universitas Sumatera Utara

Lampiran 5b. Hasil Uji Senyawa Metabolit Sekunder Ekstrak n-Heksana,
Etil asetat dan Metanol Isolat Potensial

EA1F3

EA2F3

Gambar: Uji alkaloid Ekstrak isolat EA1 dan EH2

MA2F3

MA2F2

MA1F33

EA2F3

Gambar: Uji Alkaloid Fraksi MA2F3, MA2F2, MA1F3 dan EH2F3

MA2

MA2F3

MA2F2

Gambar: Uji saponin ekstrak isolat Uji saponin MA2F2 dan MA2F3

Universitas Sumatera Utara

Lampiran 6. Bagan Alir Proses Identifikasi Golongan Senyawa Metabolit
Sekunder Ekstrak Isolat Potensial dengan Kromatografi
Lapis Tipis (KLT) Preparatif

1. Pembuatan Kromatografi Lapis Tipis

Bahan
- Disiapkan plat kaca ukuran 20x20 cm
- Diletakkan plat kaca tersebut diatas alat pencetak plat KLT sekaligus alat
pengukur ketebalan plat (ukuran 1mm)
- Disiapkan bubur silica, lalu tuangkan pada plat kaca sampai merata
sambil terus diaduk
- Setelah bubur silica rata, dibiarkan pada suhu ruang selama ±12 jam
- Diaktivasi plat dengan cara memanaskan pada suhu 100 oC dalam oven
selama ± 30 menit.

KLT Preparatif

2. Pemisahan Senyawa dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
KLT Preparatif
- Chamber dijenuhkan dengan pelarut pengembang (EtOAc:MeOH, 3:2 v/v)
yang dilapisi dengan kertas saring
- Di masukkan pelarut pengembang kedalam chamber sampai kertas saring
basah oleh pelarut.
- Larutan ekstrak metabolit sekunder isolat bakteri ditotolkan pada garis bawah
batas bawah plat
- Plat dibiarkan kering selama ± 15 menit
- Dimasukkan plat kedalam chamber yang sudah jenuh dan dielusi sampai
pelarut mencapai bagian atas plat
- Noda yang terbentuk diamati dibawah sinar UV, lalu digambar pola
pemisahan dengan menggunakan pensil
- Dikerok pola noda yang telah digambar lalu dimasukkan ke dalam vial lalu
dicuci dan dipisahkan dari silikanya.
- Masing-masing senyawa yang dihasilkan diuapkan.
Hasil

Universitas Sumatera Utara