Pengaruh Pemberian Ekstrak Etanol Sambiloto (Andrographis paniculata Ness) Dosis Bertingkat diberikan saat Diinfeksi Eimeria tenella terhadap Jumlah Ookista pada Tinja Ayam
!!
!
" #"$
%
"
#
&' ()$*)+'+, '$-
!
!
!
!
'
$%$& (
$* +* ,* - *
-
"
)
)
)
-
-
*
"
-
$.&
-
* $* +*
(
,
*
*
/
*
*
"
/0
/++
"
#
$&
$0
$'&&
"1
)
#
2
2
*
" 1
3
) 4
1
#
/$7
2
56 "
)
- * - * $*
-
/$$
/$0
+
!
$.&
,
(
- *
*
,
/$'
"
!
.$"87 9*
$ ::"&:9*
,&"8+9"
-
) ;
*
*
+
!
<
1 #
-
1 #
.#./ 0"'1 '
2
)&)
2
'+' +,,")'+'
2
!!
' 3.%.' 4/ $
" #"$
&' ()$*)+'+, '$&5'&5'+,
'0 3)$.'
"
) 3'3'
)0'/
)+,,)/ ./. 2
. .&4"'+'
0)+
!
=
!
!
"
!
!
!
!
*
"5
$"
"
" 1" >
? !
*
3
;
* 5
@ !
"
+"
"
6
*5
5
*
*
!
"
,"
"1
0" -
#
"
*
*
"
=
"<
*5
!
"
1
)
!
*
5
5
5
@
4
!
*
6
/
!
/
*
'"
*
*
"
6
@
"=#
"
!
"
"
*
!
"
"
7"
A
!
"-
*
"
! *
!
:"
."
8" -
$&"
$$" C
$+"
$,"
$0"
"
?
* -1
!
B? ??@ @ @5 >5B
*
*
*
!
*
/
6 #
"
*
*
# 5 ! #
!
!
-< D 5 @
! "
/
+7 6
* > * E* 2 * F
!
0$*
*
"
* 5
!*
B
B*
2
*
"
-
>-5
! !
@
!
#
! "
B
B*
"
**=
!*
"
*
* 54 @
# "
4- #
54
* D>
GGGGGGGGGGGGGGGGG
$
GGGGGGGGGGGGGGGG"
+
GGGGGGGGGGGGGGGGGGG"""
+
$"$ D
$"+
$", 5
@@
>
-
+"$
+"$"$ +"$"+
,
GGGGGGGGGGGGGGGG""
,
5
+"$",
GGGGGGGGGGG""
,
GGGGGGGGGGGGGGG"""
7
GGGGGGGGGGGGGGGG"
$&
GGGGGGGGGGGGGGG""
$$
GGGGGGGGG""
$$
1
+"$"0
+"$"' 2
+"$"7
GGGGGGGGGGGGGGGGG
)
+"+
+"+"$ -
5
GGGGGGGGGG""
$,
+"+"+ 1
!
GGGGGGGGGGG"
$0
+"+", -
GGGGGGGGGGGGGGG"""""
$'
+"+"0 -
GGGGGGGGGGGGGGGGG"""
$7
@@@
,"$ =
,"+
,", 5
1
5
GGGGGGGGGGGGGGG"""
$.
GGGGGGGGGGGGGGGGG
$.
GGGGGGGGGGGGGGG"""
$.
@H 1
H'"$ '"+
<
++
"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
,&
5
@5 >D
@5 >D
6
"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
@D
1
6
GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG
6 >
-
,&
!!
!
" #"$
%
"
#
&' ()$*)+'+, '$-
!
!
!
!
'
$%$& (
$* +* ,* - *
-
"
)
)
)
-
-
*
"
-
$.&
-
* $* +*
(
,
*
*
/
*
*
"
/0
/++
"
#
$&
$0
$'&&
"1
)
#
2
2
*
" 1
3
) 4
1
#
/$7
2
56 "
)
- * - * $*
-
/$$
/$0
+
!
$.&
,
(
- *
*
,
/$'
"
!
.$"87 9*
$ ::"&:9*
,&"8+9"
-
) ;
*
*
+
!
<
1 #
-
1 #
.#./ 0"'1 '
2
)&)
2
'+' +,,")'+'
2
!!
' 3.%.' 4/ $
" #"$
&' ()$*)+'+, '$&5'&5'+,
'0 3)$.'
"
) 3'3'
)0'/
)+,,)/ ./. 2
. .&4"'+'
0)+
!
=
!
!
"
!
!
!
!
*
"5
$"
"
" 1" >
? !
*
3
;
* 5
@ !
"
+"
"
6
*5
5
*
*
!
"
,"
"1
0" -
#
"
*
*
"
=
"<
*5
!
"
1
)
!
*
5
5
5
@
4
!
*
6
/
!
/
*
'"
*
*
"
6
@
"=#
"
!
"
"
*
!
"
"
7"
A
!
"-
*
"
! *
!
:"
."
8" -
$&"
$$" C
$+"
$,"
$0"
"
?
* -1
!
B? ??@ @ @5 >5B
*
*
*
!
*
/
6 #
"
*
*
# 5 ! #
!
!
-< D 5 @
! "
/
+7 6
* > * E* 2 * F
!
0$*
*
"
* 5
!*
B
B*
2
*
"
-
>-5
! !
@
!
#
! "
B
B*
"
**=
!*
"
*
* 54 @
# "
4- #
54
* D>
GGGGGGGGGGGGGGGGG
$
GGGGGGGGGGGGGGGG"
+
GGGGGGGGGGGGGGGGGGG"""
+
$"$ D
$"+
$", 5
@@
>
-
+"$
+"$"$ +"$"+
,
GGGGGGGGGGGGGGGG""
,
5
+"$",
GGGGGGGGGGG""
,
GGGGGGGGGGGGGGG"""
7
GGGGGGGGGGGGGGGG"
$&
GGGGGGGGGGGGGGG""
$$
GGGGGGGGG""
$$
1
+"$"0
+"$"' 2
+"$"7
GGGGGGGGGGGGGGGGG
)
+"+
+"+"$ -
5
GGGGGGGGGG""
$,
+"+"+ 1
!
GGGGGGGGGGG"
$0
+"+", -
GGGGGGGGGGGGGGG"""""
$'
+"+"0 -
GGGGGGGGGGGGGGGGG"""
$7
@@@
,"$ =
,"+
,", 5
1
5
GGGGGGGGGGGGGGG"""
$.
GGGGGGGGGGGGGGGGG
$.
GGGGGGGGGGGGGGG"""
$.
@H 1
H'"$ '"+
<
++
"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
,&
5
@5 >D
@5 >D
6
"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
@D
1
6
GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG
6 >
-
,&
1
$"
!
+"
""""""""""""""""""
0
"GGGGGG""""""""""""""""
7
""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
:
""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
:
!
,"
5
A
0"
<
5
'"
<
5
A
A
5
7"
) ))
.
""""""""""""""
8
:"
""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
$$
."
"""""""""""
$0
8"
$&"
6
!
*
F
""""""""""
/
!
$7
!
/.
""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
$$"
6
/
!
!
/8
/$7
""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
$+"
6
/
!
+0
!
/$:
/++
""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
$,"
++
!
+:
!
"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
+.
1
$"
-
+"
6
"""""""""""""""""""""
/
!
'
!
"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
+8
1
$"
/0
/++
+"
""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
,7
) """"""""""""""""""""""""""""
,:
1
Koksidiosis merupakan salah satu penyakit penting bagi peternakan ayam di
Indonesia, bahkan di dunia. Penyakit ini menimbulkan berbagai kerugian yaitu
morbiditas (kesakitan), mortalitas (kematian), nafsu makan dan produksi telur
yang menurun, serta biaya kesehatan yang meningkat dan menurunkan nilai
ekonomis (Ashadi 1980).
Koksidiosis adalah penyakit yang disebabkan oleh golongan protozoa yang
termasuk genus
. Pada ayam telah ditemukan 9 (sembilan) spesies
, yaitu
,
,
,
,
,
,
,
, dan
(Tampubolon 1992). Diantara sembilan spesies tersebut spesies
yang paling patogen pada unggas adalah
dan
(Levine 1985). Gejala klinis ditandai dengan kehilangan nafsu makan, jengger dan
pial yang pucat, bulu kusut, diare, serta kotoran sekum bercampur darah, dehidrasi
dan terkadang menyebabkan kematian. Gejala klinis lainnya adalah rendahnya
penyerapan pakan, pertambahan bobot badan yang rendah dan efisiensi pakan
yang rendah (Fanatico 2007).
Berbagai usaha dilakukan untuk memerangi penyakit ini, penggunaan
berbagai macam obat serta perbaikan tata laksana seperti menjaga kebersihan
kandang, memberikan koksidiostat secara berkala (Anonim 2008e), pemberian
vaksin yang mampu menginduksi sistem kekebalan, dengan menstimulasi limfosit
untuk menghasilkan antibodi dan sel memori yang akan bekerja ketika ada
patogen (Abbas dan Sharma 2003
Ameiss 2005). Pengendalian dan
pemberantasan dengan menggunakan koksidiostat belum optimal, bahkan
menimbulkan resistensi bila tidak digunakan dengan tepat (Anonim 2008f), serta
adanya residu obat dalam daging dan telur (Cahyaningsih 2007: Wardana
.
2001). Dengan adanya efek residu dan resistensi tersebut, maka perlu dicari suatu
solusi untuk menanggulangi agar tidak menimbulkan bahaya residu pada produk
akhir, resistensi parasit, mudah diperoleh, murah dan aman bagi peternak. Salah
satunya adalah tanaman sambiloto (
Ness). Dalam
2
masyarakat, sambiloto sudah dikenal sebagai salah satu bahan obat tradisional,
baik di Indonesia maupun bangsa lain di dunia.
Sambiloto bukan tanaman asli Indonesia, diduga berasal dari daerah asia
tropik. Tanaman ini memiliki banyak nama diantaranya bidara, sambiroto,
sandiloto, sadilata, takilo, paitan (Jawa); ki oray, takila, ki peurat (Sunda);
pepaitan, ampadu (Sumatera);
,
,
(Arab);
(India);
,
,
(Cina
,
,
(Vietnam);
(Persia);
,
(Inggris)
(Prapanza dan Marianto 2003). Sambiloto dapat tumbuh dimana saja termasuk di
tipe tanah yang jarang ditanami khususnya tanah yang bergelombang (
) yang memiliki kandungan aluminium, tembaga dan zink yang tinggi
(Anonimous 2008d).
Menurut Prapanza dan Marianto (2003), semua bagian dari tanaman
sambiloto akan terasa pahit jika dimakan atau direbus. Rasa pahit tersebut
disebabkan oleh adanya senyawa andrographolid. Senyawa ini berbentuk kristal
tak berwarna dan disebut deterpen laktone (Anonimous 2008d). Sambiloto
memiliki khasiat sebagai obat anti radang, analgesik, anti bakteri, penawar racun,
menghilangkan panas dalam dan anti piretik (Anonimous 2008a).
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui
etanol sambiloto (
diinfeksi
pengaruh pemberian ekstrak
Ness) dosis bertingkat diberikan saat
terhadap jumlah produksi ookista pada tinja ayam
Untuk mengetahui gambaran tentang khasiat obat alternatif yaitu ekstrak
sambiloto untuk menurunkan produksi ookista, sehingga dapat digunakan sebagai
anticoccidia.
3
!
!
Koksidiosis adalah penyakit yang disebabkan oleh golongan protozoa yang
termasuk genus
. Berdasarkan lokasi kerusakan yang ditimbulkan,
koksidiosis dapat dibagi atas dua bentuk yaitu koksidiosis sekum dan koksidiosis
usus halus. Pada ayam telah ditemukan 9 (sembilan) spesies
,
,
,
,
,
,
, yaitu
,
, dan
(Tampubolon 1992). Spesies yang paling patogen pada unggas adalah
dan
(Levine 1985).
Menurut Levine (1985),
Filum
diklasifikasikan sebagai berikut:
: Protozoa
Sub filum : Apicomplexa
Kelas
: Sporozoasida
Seb Kelas : Coccidiasina
Ordo
: Eucoccidiorida
Sub Ordo : Eimeriorina
Famili
: Eimeriidae
Genus
:
Spesies
:
"
# ##
Secara umum coccidia merupakan parasit intraselluler dari saluran
pencernaan dari inang vertebrata dengan spektrum yang luas (Bowman
.
2003). Coccidia ditemukan tidak hanya pada ayam, namun juga ditemukan pada
kalkun, kelinci, domba, sapi, babi, anjing dan kucing (Tampubolon 1992).
Coccidia mempunyai berbagai macam bentuk yang berbeda>beda yaitu: ookista,
sporokista, sporozoit, tropozoit, skizon, merozoit dan gametosit (Tampubolon
1996).
merupakan coccidia yang paling umum dan penting pada
4
ayam yang terdapat di dalam sekum. Ookista berbentuk telur yang lebar, halus,
tanpa mikropil, dan berukuran 14>31x 9>25Am. Dinding ookista terdiri dari satu
atau dua lapis dan mungkin dilapisi selaput (Levine 1985). Menurut Tampubolon
(1992) ookista
berbentuk bulat, lebar dan memiliki ukuran yang
bervariasi, dengan panjang sekitar 19.5>26 Am, lebar 16.5>22.8 Am, dengan rata>
rata panjang 22.6Am dan lebar 19.0Am. Ookista memiliki dinding yang terdiri dari
dua lapis yaitu sebelah dalam yang tersusun dari senyawa protein tannin dan
kinin, sedangkan lapisan luar tersusun atas lemak dan protein. Tahap ini
merupakan tahap yang resisten dari coccidia.
Apabila ookista disimpan di dalam suhu kamar dengan oksigen dan
kelembapan yang cukup, ookista akan mengalami sporulasi dalam waktu kira>kira
48jam. Ookista bersporulasi mengandung empat sporokista dan masing>masing
sporokista mengandung dua sporozoit. Sporokista merupakan hasil sporulasi dari
ookista, memiliki bentuk oval memanjang, satu ujungnya lebih runcing dari yang
lainnya (Tampubolon 1992).
Gambar 1: Ookista
yang telah bersporulasi
(Levine 1985)
Sporozoit yang dilepaskan oleh sporokista, terdiri dari dua generasi yaitu
generasi I dan generasi II. Sporozoit memiliki bentuk seperti koma dengan ukuran
10 x 15 Am, bersifat transparan, dan sitoplasma bergranul. Sporozoit mampu
memendek dan memanjang dengan gerakan meluncur cepat (Tampubolon 1992).
5
Sporozoit biasanya memanjang dan mungkin berisi satu atau lebih gelembung
jernih dari bahan protein (Levine 1985).
Tropozoit merupakan hasil perkembangan dari sporozoit yang akan
melakukan proses schizogoni. Pada perkembangan selanjutnya, inti tropozoit
mengalami pembelahan disebut skizon (Tampubolon 1992). Perkembangan
sporozoit di dalam vili epitel sekum menghasilkan merozoit generasi I dengan
panjang 2 – 4 mikron (Levine 1985). Tampubolon (1992), menyebutkan bahwa
ukuran dari merozoit generasi I adalah 5 – 10 mikron x 1,5 mikron dan memiliki
granular disekeliling intinya.
Gametosit merupakan perkembangan dari merozoit generasi II yang
selanjutnya
berkembang
menjadi
makrogametosit
dan
mikrogametosit
(Tampubolon 1992). Menurut Gregel, (1973) mikrogamet adalah gamet jantan
sedangkan makrogamet adalah gamet betina. Makrogamet memiliki ukuran yang
hampir sama dengan ookista, memiliki inti, kariosoma dan granula metakromatik
yang tersebar di bagian sitoplasmanya. Mikrogametosit memiliki bentuk seperti
koma, langsing agak membengkok, pada bagian anterior terdapat flagela sebagai
alat geraknya (Tampubolon 1992).
Tabel 1. Karakteristik ookista
sp pada Unggas
(Richardson dan Kendal 1963)
Spesies
Bentuk
Ukuran (micron)
Ovoid
19 x 14
Ovoid
26 x 20
Ovoid
19 x 17
Ovoid
30 x 20
Subspherical
16 x 15
Ovoid
20 x 17
Ovoid
21 x 17
Ovoid
23 x 19
6
$" %
Siklus hidup dari
.
adalah sama dan dapat diperlihatkan oleh
mengalami perkembangan siklus hidup secara
endogenous dan eksogenous. Stadium endogenous terjadi di dalam tubuh induk
semang yang meliputi tahap aseksual (merogoni) dan tahap seksual (gametogoni).
Stadium eksogenous terjadi di luar tubuh induk semang (Levine 1985). Menurut
Soulsby (1972), perkembangan
terdiri dari perkembangan aseksual
(skhizogoni) dan seksual (gametogoni). Selama proses skhizogoni, generasi
skizon terdiri dari bentuk invasif yaitu merozoit. Merozoit berkembang menjadi
gametosit dan dengan pembuahan menjadi makrogametosit (zigot) yang kemudian
menghasilkan ookista. Setelah mengalami proses eksogenous (sporogoni), ookista
akan menjadi bentuk yang infektif yaitu sporozoit, yang dihasilkan ketika induk
semang memakan ookista yang bersporulasi.
%# # #
Infeksi pada ayam terjadi ketika ayam memakan sporozoit pada ookista
yang telah bersporulasi. Ookista yang ditemukan pada feses induk semang
merupakan tahap non infektif karena tidak mengandung sporozoit (Anonim
2008c; Anonim 2008h). Ookista akan infektif setelah mengalami sporulasi.
Ookista bersporulasi selama 48 jam (Tampubolon 1992). Ookista yang keluar
bersama feses terdiri dari satu sel sporon. Sel ini diploid, tetapi mengalami
pembagian reduksi, dengan timbulnya badan kutub, dan semua siklus hidup
selanjutnya adalah haploid. Sporon membagi menjadi empat sporoblast, masing>
masing akan menjadi empat sporokista dan dua sporozoit terbentuk di dalamnya
(Levine 1985).
Gambar 2. Ookista yang belum bersporulasi
(Anonim 2000)
7
Di lingkungan sporulasi membutuhkan kondisi oksigen bebas dan
kelembapan yang cukup (Tampubolon 1992). Menurut Duszynski
(2004),
suhu dan arah pencahayaan matahari akan mempengaruhi kemampuan ookista
untuk bersporulasi di lingkungan luar. Ookista akan bersporulasi lebih cepat pada
suhu tinggi dan akan lebih lambat pada suhu rendah. Pencahayaan untuk suhu
yang kurang dari 100C atau 500C akan mematikan ookista yang belum
bersporulasi.
# #
Apabila ookista dimakan oleh ayam, maka dinding ookista akan pecah,
sporokista dibebaskan dan sporozoit keluar. Sporozoit akan memasuki vili epitel
dari sekum, membulat menjadi meron generasi I. Merozoit ini memecahkan sel
induk semangnya, masuk ke dalam sel baru dan berubah menjadi meron generasi
II, kemudian membelah dan menghasilkan 200>350 merozoit generasi II. Merozoit
keluar dari induk semang dan masuk ke dalam sel baru dari induk semang
tersebut. Beberapa dari mereka berkembang menjadi meron generasi III yang
memproduksi 4 > 30 merozoit generasi III (Levine 1985).
Gambar 3. Merozoit di dalam Skizon
(Anonim 2000)
Gambar 4. Fase Merozoit
(Anonim 2000)
& ' # #
Merozoit>merozoit generasi II berkembang menjadi gametosit melalui siklus
hidup seksual. Merozoit tersebut membulat membentuk gamon (Levine 1985).
Gametosit berdiferensiasi menjadi makro dan mikrogametosit. Mikrogametosit
menghasilkan mikrogamet motil dan berflagela. Makrogametosit berkembang
menjadi makrogamet. Hasil pembuahan makrogamet oleh mikrogamet adalah
8
zigot dengan dinding yang mengelilinginya yang disebut ookista (Richardson dan
Kendall, 1963).
Gambar 5. Fase Makro dan mikrogametosit
(Anonim 2000)
9
Gambar 6: Siklus Hidup coccidia pada ayam
(Levine 1985)
Keterangan Gambar:
Satu sporozoit (1) masuk ke dalam satu sel epitel usus (2), membulat, tumbuh dan
menjadi sebuah meron generasi pertama (3). Meron ini memproduksi sejumlah
besar merozoit generasi pertama (4), yang kemudian melepaskan diri keluar dari
sel induk semang (5), memasuki sel>sel epitel usus yang baru (6), membulat,
tumbuh, dan menjadi meron generasi kedua (7,8). Meron generasi kedua ini
memproduksi sejumlah besar merozoit generasi kedua (9,10) yang melepaskan
diri keluar dari induk semang (11). Beberapa diantaranya memasuki sel>sel epitel
yang baru dari usus induk semang dan membulat menjadi meron generasi ketiga
(12,13), yang memproduksi merozoit generasi ketiga (14). Merozoit generasi
ketiga (15) dan sebagian besar merozoit>merozoit generasi kedua memasuki sel>
sel epitel usus yang baru. Beberapa diantaranya menjadi mikrogamon (16,17), dan
setiap mikrogamon memproduksi sejumlah besar mikrogamet (18). Lainnya
berubah menjadi makrogamet (19,20). Makrogamet dibuahi oleh mikrogamet dan
menjadi zigot (21), yang membungkus dirinya dengan dinding tebal
disekelilingnya dan berubah menjadi ookista muda. Ookista ini keluar dengan
memecah sel induk semang dan keluar bersama tinja (22). Ookista tersebut
kemudian mulai bersporulasi. Sporon membuang badan kutub dan membentuk
empat sporoblast (23) yang masing>masing membentuk sebuah sporokista yang
berisi dua sporozoit (24). Bilamana ookista yang telah bersporulasi (24) di telan
oleh seekor ayam, sporozoit itu dibebaskan (1)
10
(
#
Menurut Levine (1985), patogenitas koksidiosis disebabkan oleh beberapa
faktor yaitu : jumlah sel induk semang yang rusak, besarnya dosis infeksi ookista,
patogenitas galur koksidia, ras, umur ayam, status gizi, stress, lokasi parasit
didalam jaringan, atau didalam sel induk semang, derajat dan waktu reinfeksi serta
derajat imunitas yang diperoleh atau imunitas alami induk semang. Koksidiosis
dapat ditularkan melalui kotoran ayam yang mengandung ookista. Ookista yang
bersporulasi merupakan stadium infektif dari siklus hidup coccidia. Ookista dapat
ditularkan secara mekanik melalui pekerja, peralatan yang tercemar atau terbawa
angin yang menyebarkan debu kandang dan litter dalam jangkauan pendek. Faktor
pendukung terjadinya wabah antara lain karena kandungan air pada litter yang
melebihi 30% (Anonim 2008h). Penularan koksidiosis dapat terjadi bila tata
laksana kandang yang buruk, dapat juga melalui kotoran ayam penderita, melalui
makanan dan minuman serta peralatan yang tercemar coccidia. Litter yang basah
merupakan media yang paling disukai bagi coccidia (Tampubolon 1996).
Menurut Mc Dougald dan Reid (1990)
Harismah (2006) dituliskan
bahwa patogenitas dimulai saat sporozoit dikeluarkan dari ookista yang telah
bersporulasi dan kemudian menembus dinding lamina propia. Saat yang
menentukan dalam infeksi adalah saat perkembangan skizon generasi II yang
telah matang, terjadi pada hari ke>4 setelah infeksi. Perkembangan pada lamina
propia menyebabkan mukosa usus rusak dan pecah pada saat skizon matang dan
merozoit dilepaskan. Patogenitas dipengaruhi oleh genetik inang, faktor nutrisi,
penyakit yang terjadi bersamaan dan spesies dari coccidia.
sangat
patogen pada ayam, karena proses skizogoni terjadi di lamina propria dan kripta
liberkhun dari usus halus dan sekum yang terjadi berulang kali sehingga
menyebabkan hemorrhagi (Anonim 2008h).
Koksidiosis terjadi pada unggas yang muda, sedangkan unggas yang tua
sebagai sumber infeksi (Levine 1985).
sangat patogen dengan,
mortalitas 74.5 % pada ayam petelur Babcock>300 dan 74% pada ayam pedaging
Startbro (Ashadi 1980). Patogenitas infeksi menurut Levine (1985), dipengaruhi
oleh umur induk semang, kekebalan dan ukuran dosis infeksi.
11
)&
!
Ayam yang menderita koksidiosis akan terlihat bergerombol di sudut>sudut
kandang, lesu dan lemah. Gejala klinis ditandai dengan kehilangan nafsu makan,
jengger dan pial yang pucat, bulu kusut, diare, serta kotoran sekum bercampur
darah, dehidrasi dan terkadang menyebabkan kematian. Gejala lainnya adalah
rendahnya penyerapan pakan, pertambahan bobot badan yang rendah dan efisiensi
pakan yang rendah (Fanatico 2007). Menurut Soulsby (1982), gangguan umum
yang terlihat setelah infeksi terjadi sekitar 72 jam adalah: Ayam lesu, nafsu makan
menurun atau bahkan berhenti makan, ayam bergerombol, berat badan menurun,
nafsu minum meningkat, nafsu makan menurun, bulu kusam dan pucat.
Pada saat skizon generasi II matang dan berkembang dilapisan dalam lamina
propria, merupakan tahap yang paling patogen karena dapat menyebabkan
kerusakan mukosa, akibat skizon dewasa mengeluarkan merozoit. Pada hari ke>4
sampai hari ke>6 setelah infeksi memberikan angka kematian yang tinggi.
Kematian tersebut disebabkan karena ayam kehilangan darah dalam jumlah yang
besar (Calnek
. 1997).
Gambar 7. Pendarahan sekum
( FAO 2008)
)
*
$
"
#+
Pengendalian coccidiosis pada ayam di Indonesia dilakukan dengan
pemeliharaan kebersihan (sanitasi) dan diikuti dengan pemberian koksidiostat
yang dicampurkan pada makanan atau air minumnya (Ashadi 1982). Pencegahan
dapat dilakukan dengan perbaikan sistem manajemen dan sanitasi antara lain
dengan pemasangan dan pengaturan sistem pemberian air minum yang sesuai,
penyedian tempat pemberian pakan yang cukup, ventilasi yang baik, pengaturan
12
kepadatan kandang dan pemberian antikoksidia (Anonim 2008i). Perbaikan
manajemen untuk kontrol koksidiosis seperti sanitasi, vaksinasi, pemberian obat
serta manajemen kandang (Fanatico 2007).
Pemberian obat memiliki dua tujuan yaitu untuk mencegah terjadinya sakit
dan untuk mengobati sakit. Obat yang seringkali digunakan dalam mengatasi
koksidiosis adalah preparat sulfa, amprolium, quinolones, ionophores dan
antikoksidia lainnya (Fanatico 2007). Pemberian larutan amprolium dengan
konsentrasi 0.0125, dalam pakan sebanyak 0.006 % hingga 0.008% pada kondisi>
kondisi tertentu serta pemberian antibiotik seperti klortetrasiklin yang memiliki
efek sinergis dengan sulphonamide. Pemberian bifuran (0.0055 % nitrofurazone
dan 0.0008% furazolidone), nicarbazine, nitrofurazone dan sulphaquinoxaline.
Pada pengobatan kasus terinfeksi dapat dilakukan dengan pemberian preparat
sulphonamides,
sulphamezathine
(sulphadimidine)
dan
sulphaquinoxaline,
campuran dari nitrofurazone dengan pyrimethamin, dan campuran larutan
nitrofurazone dan furazolidone. Dengan penggunaan sesuai konsentrasi, akan
menghambat perkembangan skizon generasi ke II pada awal perkembangan
parasit (Richardson dan Kendall 1963).
Pemberian vaksin juga akan menginduksi sistem kekebalan dengan
menstimulasi limfosit untuk menghasilkan antibodi atau sitokin dan menghasilkan
sel memori yang akan bekerja dengan cepat dan efisien ketika bertemu dengan
patogen (Abbas dan Sharma 2003
Ameiss 2005). Pemberian vaksin dapat
dilakukan dengan pencampuran pada air minum, pencampuran pada pakan,
penyemprotan kabinet pada DOC, dan pemberian dengan gel yang dapat dimakan
(Fanatico 2007).
13
'+ # #
!
"
'# # #
Sambiloto dikenal sebagai salah satu obat tradisional sejak abad ke>18.
Sambiloto (
Ness) merupakan salah satu bahan obat
tradisional yang dikenal sejak dulu terbukti mampu menyembuhkan berbagai
penyakit. Menurut Prapanza dan Marianto (2003) sambiloto (
Ness) diklasifikasikan sebagai berikut:
Divisi
: Angiospermae
Kelas
: Dicotyledone
Sub Kelas
: Gamopetalae
Ordo
: Personales
Famili
: Acanthaceae
Sub Famili : Acanthoidae
Genus
:
Spesies
:
Sambiloto (
Ness
Ness) merupakan tanaman yang
digolongkan jenis perdu atau semak, bercabang banyak (Prapanza dan Marianto,
2003), biasanya tumbuh melalui benih (Anonimous 2008d). Memiliki daun yang
kecil (Anonimous 2008a), tunggal, bertangkai pendek, letak berhadapan bersilang,
berbentuk lanset, pangkal runcing dan tepi rata dengan panjang 2>8 cm dan lebar
1>3 cm (Dalimartha 1999). Dengan permukaan atas daun berwarna hijau tua dan
permukaan bawahnya berwarna hijau muda, berbunga putih keunguan (Prapanza
dan Marianto 2003).
Tanaman ini memiliki ketinggian 50>90 cm (Dalimartha 1999), 30 – 100 cm
(Prapanza dan Lukito 2003), 40 – 90 cm (Anonimous 2008a), memiliki banyak
cabang berbentuk segi empat (kwadrangularis) dengan nodus membesar
(Dalimartha 1999). Sambiloto memiliki buah yang berbentuk jorong (bulat
panjang), dengan pangkal dan ujungnya tajam, dengan panjang sekitar 2 cm.
Setiap buah terdiri dari dua rongga, dengan tiap rongga berisi 3 – 7 biji kecil yang
berwarna coklat muda dan berbentuk gepeng (Prapanza dan Marianto 2003).
14
Gambar 8: Tanaman Sambiloto (
(Anonimous, 2007)
+
"
Ness)
, +
Sambiloto dapat tumbuh di tipe tanah yang jarang ditanami khususnya tanah
yang bergelombang (
) yang memiliki kandungan aluminium,
tembaga dan zink yang tinggi (Anonimous 2008d). Habitat asli sambiloto
(
Ness) adalah tempat terbuka yang teduh seperti kebun,
tepi sungai, tanah kosong yang agak lembab atau di pekarangan (Prapanza dan
Marianto 2003), tumbuh berkelompok (Anonimous 2008a), berkembang biak
dengan benih (Bethesda 1983). Tumbuh mulai dari dataran rendah hingga
ketinggian 700 mdpl. Dengan curah hujan 2.000 – 3.000 mm /tahun, memiliki
suhu 25oC > 32oC, dengan kelembapan sedang dan pH 5.5 – 6.5 (Prapanza dan
Marianto 2003).
Sambiloto (
Asia Tenggara seperti
Ness) tumbuh dengan subur di daerah
India dan Sri lanka, Pakistan dan Indonesia. Namun
dikembangkan secara ektensif di China, Thailand, India bagian barat dan timur,
serta Mauritius (Anonimous 2008d). Tanaman ini memiliki banyak nama
diantaranya bidara, sambiroto, sandiloto, sadilata, takilo, paitan (Jawa); ki oray,
takila, ki peurat (Sunda); pepaitan, ampadu (Sumatera);
(Cina);
,
,
(India);
,
,
,
,
15
(Vietnam);
(Arab);
(Persia);
,
(Inggris) (Prapanza dan Marianto 2003).
!
"
Ness
(sambiloto)
memiliki
zat
aktif
andrographolide sebagai komponen utama serta saponin, flavonoid, alkaloid dan
tannin (Yusron
2005). Daun dan percabangannya mengandung laktone yang
terdiri dari deoksiandrografolid, andrografolid (zat pahit), neoandrografolid, 14>
deoksi>11>12>didehidroandrografolid, dan homoandrografolid. Juga terdapat
flavonoid, alkane, keton, aldehid, mineral (kalium, kalsium, natrium) dan damar.
Flavonioid diisolasi terbanyak dari akar, yaitu polimetoksiflavon, andrografin,
panikulin,
mono>0>metilwithin,
dan
apigenin>7,4>
dimetileter.
Zat
aktif
andrografolid terbukti berkhasiat sebagai hepatoprotektor (melindungi sel hati dari
zat toksik) (Anonimous 2008b; Dalimartha 1999; Prapanza dan Marianto 2003).
Menurut Prapanza dan Marianto (2003), semua bagian dari tanaman
sambiloto akan terasa pahit jika dimakan atau direbus. Rasa pahit tersebut
disebabkan oleh adanya senyawa andrographolid. Senyawa ini berbentuk kristal
tak berwarna dan disebut deterpen laktone. Senyawa andrographolid merupakan
senyawa utama yang digunakan sebagai komponen obat. Andrographolid diisolasi
terbanyak pada daun sebesar 2.39 % (Anonimous 2008d), sedangkan menurut
Prapanza dan Marianto (2003) adalah sebesar 2.5 – 4.8 % dari berat keringnya.
Hasil analisa fitokimia pada serbuk kering sambiloto menunjukkan senyawa
steroid lebih banyak dari pada flavonoid, hidroquinon, terpenoid, saponin dan
tanin. Sedangkan analisa fitokimia pada ekstrak sambiloto dengan pelarut air,
alkohol dan metanol menunjukkan senyawa alkaloid dan flavonoid lebih banyak
dari pada hidroquinon, terpenoid, steroid, saponin dan tannin (Cahyaningsih
2007).
16
Gambar 9. Struktur Kimia Zat Aktif
(Naiyana 2002)
!
( !$
Kandungan andrographolid mampu meningkatkan fungsi sistem pertahanan
tubuh (Anonimous 2008c) karena meningkatkan daya fagositosis leukosit, dan
menurunkan demam (Prapanza dan Marianto 2003). Selain itu sambiloto juga
mampu menurunkan kadar glukosa darah, mengatasi disentri dan radang lambung
(Anonimous 2008a). Kalium yang terkandung dalam sambiloto (
Ness) berfungsi dalam meningkatkan jumlah urine serta membantu
dalam pengeluarannya. Flavonoid berfungsi dalam mencegah dan menghancurkan
penggumpalan darah (Prapanza dan Marianto 2003).
Dehidroandrographolid yang terkandung dalam sambiloto berfungsi sebagai
anti radang dengan meningkatkan sintesa
(ACTH)
17
dari pituitari otak yang mengirim sinyal ke kelenjar adrenal untuk memproduksi
kortisol yang merupakan anti radang alami (Deng 1985
Harismah 2006).
Sambiloto juga berkhasiat sebagai bakteriostatik pada "
#
#
"
. Selain itu juga memiliki efek muskarinik pada pembuluh darah dan efek
iskenik pada jantung (Anonimous 2008b & Dalimartha 1999). Sambiloto
memiliki khasiat sebagai obat anti radang, analgesik, anti bakteri, penawar racun,
menghilangkan panas dalam dan antipiretik (Anonimous 2008a). Kandungan zat
aktif dari sambiloto yaitu tanin dapat bersifat sebagai astringen di dalam saluran
gastrointestinal (Tyler 1981
Cahyaningsih 2007), dan flavonoid dapat
menunjukkan efek anti inflamasi (Bisset 1991
Menurut Miller (1996)
Cahyaningsih (2007), flavonoid berfungsi sebagai
antiinflamasi dengan cara menghambat enzim
Penghambatan enzim
Cahyaningsih 2007).
dan
untuk pengobatan gejala peradangan dan alergi.
dan
.
dapat memberi harapan
18
.
"
'%
Penelitian ini dilaksanakan pada Juli 2007 – Juli 2008 di Laboratorium
Protozoologi, bagian Parasitologi dan Entomologi Kesehatan, Departemen Ilmu
Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner, Fakultas Kedokteran
Hewan, Institut Pertanian Bogor.
"
$
Alat>alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah kandang ayam
berukuran 1x1 m dan 75x40 cm, sekam, tempat makan dan minum, bola lampu 40
watt, plastik, mikroskop, gelas ukur, sentrifius, tabung reaksi, syringe 1ml,
pengaduk, pipet tetes, kamar hitung McMaster, dan kertas label.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 210 ekor ayam umur
sehari (DOC) strain Hybro PN, isolat
, pakan, air minum, ekstrak
sambiloto dengan pelarut etanol dosis rendah, sedang, dan tinggi, koksidiostat
$
, dan larutan garam jenuh sebagai larutan pengapung.
#" %
1. Persiapan Kandang
Setelah kandang dibersihkan dari kotoran dengan menggunakan air
dan sabun, maka kandang dikeringkan. Seminggu sebelum penggunaan
kandang, permukaan dalam dan samping kandang diberi kapur,
sedangkan lantai kandang diberi sekam.
2. Pembuatan Ekstrak Sambiloto
Proses
ekstraksi
sambiloto
dilakukan
dengan
pengeringan
kemudian dihaluskan. Sambiloto yang telah halus direndam dengan
etanol selama 24 jam. Setelah direndam kemudian disaring untuk
memisahkan dari endapan. Pengendapan dan penyaringan dilakukan
sebanyak tiga kali. Hasil saringan diuapkan pelarutnya dengan rotary
evaporator, sehingga tersisa ekstrak yang berbentuk gel. Selanjutnya
19
ekstrak sambiloto tersebut diencerkan dengan menggunakan pelarut
aquades sehingga dihasilkan ekstrak sambiloto dengan dosis rendah,
sedang dan tinggi.
3. Pengelompokan Ayam
Dua ratus sepuluh ekor ayam umur sehari (DOC) dibagi menjadi 7
kelompok, masing>masing terdiri dari 30 ekor ayam yaitu:
Kontrol negatif (KN)
: kelompok ayam yang tidak diinfeksi dan
tidak diberi obat.
Kontrol positif (KP)
: Kelompok ayam yang diinfeksi ookista
dengan dosis 1x105/ ekor
dan tidak diberi obat.
Kontrol obat (KO)
: Kelompok ayam yang diinfeksi ookista
dengan dosis 1x105/ ekor
dan diberi obat sulfacholopyrazine dengan
dosis 180 mg/kgBB.
Kontrol sambiloto (KSB) : Kelompok ayam yang tidak diinfeksi ookista
dan diberi ekstrak sambiloto
E1
: Kelompok ayam yang diinfeksi ookista
dengan dosis 1 x 105/ ekor
dan diberi ekstrak sambiloto dengan pelarut
etanol dosis rendah.
E2
: Kelompok ayam yang diinfeksi ookista
dengan dosis 1 x 105/ ekor
dan diberi ekstrak sambiloto dengan pelarut
etanol dosis sedang.
E3
: Kelompok ayam yang diinfeksi ookista
dengan dosis 1x105/ ekor
dan diberi ekstrak sambiloto dengan pelarut
etanol dosis tinggi.
20
4. Perlakuan pada ayam
Ayam yang berumur dua minggu diinfeksi dengan ookista
dengan dosis 1x105 /ekor secara per oral (cekok) pada kelompok
E1, E2, E3, KO, dan KP kecuali pada kelompok kontrol negatif (KN),
dan kontrol sambiloto (Ksb) tidak diinfeksi. Setelah dua jam diinfeksi
kelompok perlakuan kontrol obat (KO) diberi S
$
dosis
180 mg/kg BB, kelompok perlakuan kontrol sambiloto (KSb), E1, E2,
dan E3 berturut>turut diberi ekstrak sambiloto, ekstrak sambiloto pelarut
etanol dosis rendah, sedang, dan tinggi.
5. Pengambilan tinja
a). Tinja diambil setiap hari berturut>turut mulai hari ke>4 sampai hari
ke>22 setelah infeksi secara acak (empat didaerah ujung, dan satu
dibagian tengah kandang) dari setiap kelompok perlakuan.
b). Tinja yang sudah diambil kemudian dimasukkan kedalam kantong
plastik putih yang sudah diberi label sesuai dengan pembagian
kelompok ayam.
c). Tinja ayam yang sudah dikumpulkan, kemudian dimasukkan kedalam
kulkas untuk beberapa saat sebelum dilakukan pemeriksaan tinja
6. Penghitungan ookista pergram tinja
Adapun urutan penghitungan jumlah ookista pergram tinja dengan
metode McMaster adalah sebagai berikut:
a. Tiap kelompok ayam dilakukan pemeriksaan terhadap tinja dengan 2
kali pengulangan.
b. Tinja ditimbang sebanyak satu gram dan kemudian dimasukkan ke
dalam tabung sentrifius.
c. Kemudian ditambahkan larutan garam jenuh sebanyak 14 ml dan
diaduk supaya homogen, lalu disentrifius dengan kecepatan 1500
rpm selama 10 menit.
21
d. Bagian supernatan/ permukaan dari campuran tersebut diambil
dengan menggunakan pipet dan kemudian dimasukkan ke dalam
kamar hitung Mc Master.
e. Pemeriksaaan dilakukan dibawah mikroskop dengan pembesaran
100x (objektif 10x dan okuler 10x) dan jumlah ookista dihitung
dengan menggunakan kamar hitung Mc Master.
f. Jumlah ookista pergram tinja dihitung dengan menggunakan rumus:
'()(=
1 %
& %
Keterangan : n
: jumlah ookista dalam kamar hitung
Vk
: volume kamar hitung (0.5 ml)
Vt
: volume sampel total (15 ml)
Bt
: berat tinja (1 gram)
OTGT: ookista tiap gram tinja
g. Persentase penghambatan ookista dihitung dengan rumus:
%
=
(*
−+)
100%
*
Keterangan : Kp
: Total produksi ookista kontrol negatif
X
: Total produksi ookista kelompok perlakuan
%Efektifitas : % efektifitas penghambatan produksi ookista
h. Persentase peningkatan/ penurunan jumlah produksi ookista dihitung
dengan rumus:
%
tan
Keterangan : Hx
Hx>1
=
(,
−1
,
−,
)
100%
−1
: Produksi ookista pada hari ke>x
: Produksi ookista pada hari ke X>1
(
Analisis data hasil penelitian dengan menggunakan analisis sidik ragam
(
, ANOVA) untuk melihat perlakuan yang diberikan
menunjukkan pengaruh nyata atau tidak berbeda nyata. Jika analisis menunjukkan
berbeda nyata, maka dilanjutkan dengan uji wilayah berganda duncan (/
0
(
/DMRT) (Mattjik dan Sumertajaya 1999).
.
!
"
#
$
"
"
%
$
&&'
"
" (& &&&
"
)
"
"
$ #
"
"
!"
*
+
&
$
,
"
"
"
"
!
!
"
!
#
)-
.'/
(
5
1
+
&0
"
"
'
,
1
"
2
"
!
2
2(
2(
"
1 2
2
!
1
#
" "
%*% 3
)
&&/
"
"
"
%
4 %
&&'
"
"
"
&&'
"
#
%
!
-
"
/
"
1
2
!
2
2(
"
"
, 6
"
"
2(
!
/ '/6 2
"
7&6
7&76
1 7( 6
2 7./ .6
1
#
$
%
!"
&
"
"
1
!
2
2(
.
"
"
2(
,7,6
1.
2 ' &6
! (,/ ,6
6
"
1 2
"
!
2
2(
2
1
5
+
,/ ,6
1
0
"
.
,
"
7
"
1
"
!
2
2(
2
2
(
+
$
1
2
!
2
2(
"
"
2
2(
2(
"
2 2
!
1
"
"
7
"
2
,
"
!
7
,
"
,
*
+
$
#
,
1 2
!
2(
2
7
!
#
"
+
$
"
"
"
-
,
"
8
9
-
"
3 "
&&
4
&&/
&&7
-
:
&&(
:
"
"
#
-
"
#
-
"
#
; 9
9
<
; 9
#
-
9
"
:
"
"
%
&&'
&&
4
&&7
"
" $
=
$
" $
#
>
../
3
&&
?
!
..7
3
?
&&
"
#
%)
=
...
3
&
&&
'
!
##
#
!"
#
"
"
#
"
/
!
"
"
@ 9
.'7
%"
"
"
"
"
"
5
"
"
"
1
+
0
"
"
/
+
(
/
!
1
2
2
2(
.
1
!
.
2(
2
&
"
2(
' , .'6
1 ( 6 2
"
(6
,
!
6
&& 6
2
( 6
2
'
(
5
)
+
1
( )
"
)
2
2
"
2(
!
1
2
1
"
)
2(
2
2(
"
/ . 6
' ., 6
2 (& . 6
2 2
1
2
$
// &/6
1
2(
# # $
% &
!
"
'
()
"
#
&
#
"
$ #
)
)
%
# *&
+ '
)
)
''
)
'
# &
'
&
)
) +
)
)
)
)
'
.
'
& * /
)
'- ' ))
)
'' "
& ***
)
+ ,
)
'
%
)
'
" $$ $/
"
* /
)
+ '
)
)
)
'
+ '
'
'
'
'
)
)
+
+
+ '
'
)
)
- " +&&'"
? 2/
)
"
;((###"
%"
J$0
%
I5
/
)
#
!"
3
+&&&"
") ( )
+&&.K
" +&&. "
;((###"
)
"
()
;
) (A
!( )
6
+& 5
D
"
+&&.
+&&. "
"
;
")
5
" +&&. " 3
"
;((###"
+& 5
+&&.
*
6 3 #"
+&&. "
-
5
+& 5
( #(
")
(
K" +&&. "
5 ) H
! 5
;((###"
) 3
") ( 3 (
%"
I# N) ))
9+?
)
"
" $8.&" -
"
+&&.
-
#
"
+&&. "
@
$8
#
")
3
$8
) "
;((###"
5
N+I N$'+/////
*
48' H
") (
"
M
() ))
*
(
"
+&&. "
;((###"
!
" +&&. " < 3
"
" ( ( L
(3 #"
$8
+&&. "
"
+&&. "
;((###" ) ) ")
2
!( ) (A,07(
>
") "
" +&&.)" ? ))
;((###"
J
/
A
"
"
;((###"
)!
) "
)(
M)
M
@
! N$$$
3
" 5 ) I? "@ )">
N
( )(+&&.&&"
/
!
JD
;
!
2" $8.+"
"
-
@
JD
-
!
;
!
"
"
? " $8.,"
"
#
"C !
5
!
$#
;C !
#
" +&&," %
*> "
? !
>*
"
"
"
&
'
@#
!
((###"
"
*
$
"? 6
-" +&&$"
! 'O $&:/$$,"
!
?
#
@
"
*
" +&&:"
"
"
" )"
" =* 1" "
$8
"
+&&. "
* ?"="
* D"6 5)
;@ =
/$&" >
!
* C"5"
> 3
!
" $88:"
;
3
%!
3 3
$,'O ,88/
.7'/.:."
?
C* ? < ?
)
)
/
0&7"
?
*=<
!
!
?
" +&&+"
;
)"(
)
)
F* = C "* = < " +&&:"
/ )
( #
)
)
3
+8."$' ,,,"$' -" ( "
*
+ " +.O :; $$.,"
?
*
"
)
<
/
" +&&0"
#
* "@ 2
)
1 " +&&'" <
)
3
)
> 3
/
33
!
*
) )
!
3
J
!*
$#
" " (
3
!"
"
6 !
)
K"
;
H
!
!"
#
>
*
% )
" 6 " ',; $,:/$00"
) )
"
+&&."
;((###"
"
+&&. "
=*
;((###"
+&&. "
A
)
" $888"
# ! ""
A!
*5
%
)
"
D
)
!
)
(
? D " +&&0"
(
!() )) (
(
!"
/
;
$
"
5
"
,
,
+& 5
"
"
<
)
" +&&:"
? ))
"
6
3) "
;((###"
<
"
+&&."
;((###" "
2
*
> 3
2
5
/
" (
@ 1
!
*<
/
(
() ))
"
"
$+
/878 "
J$0
+&&.K
" $88."
*
! *
"
"
"
"
" +&&7"
*
-
#
A *
!
*
-
O<
1 # "
" +&&7"
5
5
*5
;<
D 3
-
" $8.'"
O
"
5
5
A
!
#"
" +&&+"
) *
;2
A @*
D
" H
" C !
!
A
! " $888"
;@
/$"
; > 3
!"
"
2
#
*
+ +
)
" 3
A
1
@
=
@6" $8.:"
# "
)
*
#
"
!
'
> 3
!"
! ;
H
- )
!
*
"
# *6
"
!
#
5* 5
# *
6
!
"
"
;((###"
!
!
+ 7 ;$+7/$,,
'
" +&&'"
" "
" +&&$"
1
*
C
;
*?
#
")
;
"
"
!
&
$
'
+
+
)
1
'
#"
,5)0
3 "
./
%
#
%
&
7&
!
"
#
$
%
!
"
#
$
%
&
'
'
'
(
(
(
()*
'
+
+
./
)
'
(
(
"
# $
()*
(
,
-
%
! " # $ %
##
##
)
)0
1
)0
/
! !3%! # "
3$!%%# $
3"%
!3
%"
3 % %$"
" 3 % "!%
,
1)'
6
1
3 $
3! #% !
3 ""
))
1
)0
/
#3$" #""!
$3" $ !
! 3$
!3 $ # %
3 # #%
3$"
3 % !#
3 $
%
3 %
555555555555
6 55555555555
1
)
.
!
3!
!$
3!%""
!
!
3 %
!
3!$ #!
!
3 "% % !
3 ! !$#
!
3 % $#!
3"$ !#%#
!
3""% " %$
3 %!
$"
!
3 # ! %!!
3! %%%"
!
!3" ""
3% " "
!
3" %$ $"!
3!
"
!
3!# #$ %
3"" "
#
!
3! %##
3%
# %"
!
3 #%$# $
3$%%%%
!
3
% $%
3 !%% #
!
3 "" $
3% !#%
!
3
"
"
3! $
!
3$"%#! $
3$! " "
!
3" !%"!#"
3 ##
!
!
3 %""$!
3#
!
!
3% %## %
3## %"%
!
3%# #
3!" "#
555555555555
6 55555555555
1
)
.
%
3 # #$ $
3
#%"$$
%
3$%$$" %!
3% ## %$
%
3#$# $# #
3"##%
"
%
3"!""
3 $!% !#%
%
3
"!#$
3
!$#
%
3$"!# $""
3!"
$
%
3 "! %%
3 !# "
2 /
43
2 /
43
43
43
.
6&
':
8
1
&
&
,
9
6
;
<
&
'
'
+
. 9
1
1
,
+
3
3
"
3 %
#
3 # #
"
3 %%%
9
"
3 !$
3 ""
1
,
!
9
3 % "
1
;
3 %
3 %"
.
>
>
>
>
>
>
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
;
3
/
)0
!
9
=&
3 "
&
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
/
/
/
/
/
/
/
/
/
@
(
3 %$
9
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
?
?
?
?
?
%%
$
3 ##$
#
3
6
%
3 $
3
1
!3" ""
3" %%
!
!
#
$
3""%
!
!
3!# $
!
%
3!
!
3!
!
3 %"#
!
3 "%!
!
3 # !
!
3
!
%
$
"
3
!
3 #%%
!
3 %
!
3%# #
!
3% %$
!
%
3" !
3 ""
3$"%#
3
"
!
!
!
!
#
"
!
$
%
3
3 $!#
%
3
3 $$%
3
!
.
6&
':
8
1
&
,
&
9
6
;
<
&
'
'
+
. 9
1
9
1
.
3
$
3
9
.
&
$
'
A&
'
(
(
(
"'
"'
"'
"(
$()* %'
%'
%'
(
(
()*
'
!( !( !( !()* "'
$()* %' %' %' %(
+
)
1
'
)
&
A&
:
3
%%
3
3
9
&
*
*
*
*
*
. &
3 %
!
#
;
>
;
/
)0
1
,
=&
3 "
1
3$%$$"
%
&
'
3$"!$
3
""
%
%
(
(
3 #
$
%
'
3 "!!
3#$# %
3"!""
%
%
%
()*
'
(
"
"#
6
3
#
"
3
3
$
#
! " # $ %
! " # $ %
' ' ( ( ( ()*
'
'
'
(
(
(
()*
'
'
'
(
(
(
()*
'
'
()*
'
'
'
(
(
(
()* !'
!'
!'
!(
!(
!(
!()*
"(
"(
"()* #'
#'
#' #(
#(
#(
#()* $'
$'
$'
$(
$(
$(
%(
%(
%(
%()*
'
'
'
(
(
(
()*
'
'
'
(
'
'
(
(
(
()*
'
'
'
(
(
(
()* !' !' !'
"' "' "( "( "( "()* #' #' #' #( #( #( #()* $' $' $' $( $( $(
%( %( %()* '
'
'
(
(
(
()*
+
+
,
##
+
+
##
6
)
./
)0
1
)0
/
2 /
! !3%! # "
3$!%%# $
3"%
43
!3
%"
3 % %$"
#"
" 3 % "!%
,5)0
,
1)'
6
1
3 "
3 $
3! #% !
3 ""
./
6&
))
1
)0
/
2 /
%
#3$" #""!
$3" $ !
! 3$
43
#
!3 $ # %
3 # #%
3$"
43
%
3 % !#
3 $
%
3 %
43
)
./
&
A&
%
A&
'
'
'
(
(
(
()*
'
'
'
(
(
(
()*
'
'
'
(
(
(
()*
'
'
'
(
(
6&
))
3
3
3
1
% !#
> 1
555555555555
1
3
!%"
3 # % "
!3 "" " #
3$ ""## $
3 #!! #
!3 $"%
3"" $ #$
3"# ##$
3# $ #%
3#%! %##
3
3$$ ! !$
!3#!
$#
!3 "% !
!3# !"! !%
3 " !!$
!3
!$$%
3 $ " $
3
! !"
3! "##"#
3 ! !! $
3! $!
$
!3 ""$ "
3%$ %"#
3$!"#% %"
3# # # #
6
)0
3
3
3 $
/
%
55555555555
)
.
3
$! #
3 %! #%
3
!#$ %
3 %%
3 $"
3
% %
3 % $
3 " # %
3 ! $$
3
% ! $
3
3
#$ !
3 $ %
3
% # $
3 #"$ $
3" "
3 $ % %
3 %" " !"
3 # ! $"
3
$#% #
3
!#%
3 # %#%
3 $
"%
3
% #
3 "!"" $
3 ! $ $
2 /
3
3
3 %
3
3
43
(
()*
!'
!'
!'
!(
!(
!(
!()*
"'
"'
"'
"(
"(
"(
"()*
#'
#'
#'
#(
#(
#(
#()*
$'
$'
$'
$(
$(
$(
$()*
%'
%'
%'
%(
%(
%(
%()*
'
'
'
(
(
(
()*
'
'
'
(
(
(
()*
'
'
'
(
(
(
()*
'
'
'
(
(
(
()*
!'
!'
!'
!(
!(
!(
!()*
"'
"'
"'
"(
"(
"(
"()*
#'
"3 %! !$
!3
"
3 % # % "
!3 !#$" $
!3#
"
3$!"#% %"
!3! "!"$
3"! !$ !#
3 ## # "
3 ! #" !$
"3 !#" !%#
!3 $ # ! %
3$!"#% %"
3$ $ $ "
3! %%%!
3 !% "# !
!3# $
$
"3 #! ##%
!3!!!
#"
3
# $"
"3 "! $%#
"3 % $
!3 !% % !
!3" ! !
!3
#
%
3$"# #
3$!"#% %"
!3" "
$%
!3
%
3"
!"
!3
!
!3%$! !!%
3% $!
#
3
!3
% !
3#%
#
3!" # !
3$###
3$
"$
3 #
"
3
%
3%$$ $%!
!3#"# %%%
3$" ! $
3% $ $#$
3 !
$%
3%$ %"#
3 $ "
3$ $%
3$$"#!#$
3!!" "% "
3$
## !
3
$ "
3
%$ $
3% ##!
!3
"$ $
3$ % $ !
3!%"# $
3
3 # " % $
3
3 !
#
3
#$
!3"
#!#
3# ! %!
3$!"#% %"
3!% "
3
3" % !#"
3 % !%%!$
3
3
!3
"
3%#%# #"
3
3%$ %"#
3!$%"##"
3
3
3 "$% %$"
3
" "$
3 !
#
3 "# %
3" $ !#$
3" #% #
3 "!"" $
3 %# $%##
3
$%
3 # # ##
3 !# %
3
%"
3% %$ % $
3 "!"" $
3"! # #"!
3 !
3
! " !
3
%
3 % %#
3
$#"%
3 #$ !$
3 # #%#$
3 " " %%
3 $
#
3 ! %" $
3
! # #
3
# $"!
3 "!"" $
3 ! "%%!
3 "%#" $!
3 "
$%%
3 ## "!
3
%!%
3 $
$
3
3% #%!#
3
# #
3 "$$!
3 !$ "$!
3! !
$"
3
%!
3 %$"
3 %! %"!
3 $% $ #
3 " ! $
3 "!! %#
3
% %
3
% #
3
%% "
3
!! !
3 "
"
3 #!
3 #
!%
3!$ "" #
3"$ %# !$
3 # ! %%
3 $" "%#
3
%$"
3 #
$
3
3 "#$%""
3
3!$ $" ##
3
%
3 $"##
3 " # %#
3 "!"" $
3
$"$
3
3 !$ # %
3"! $# %
3
3
3
!#
3 # $! !
3
3
% #
3
3
3
3"# %!#
#'
#'
#(
#(
#(
#()*
$'
$'
$'
$(
$(
$(
$()*
%'
%'
%'
%(
%(
%(
%()*
'
'
'
(
(
(
()*
3!""$#$%
3% ##!
3%$ %"#
3 % $%" $
"3 %
#
3 !!
!
3$$ $
%
3
!% $
3
$%%#!
3"$!%! %
3%% !$% #
!3$" #" "
3!
%
3 % ! $
3""$#%$!
3 % $%" $
3
%
3
#
3""!"$#
3
#
3 " # $
3 "
3"$!%! %
3# %$ !%
3 % % #
3""
$!
3%% $ %
3
!
3 # ! %%
3
% #
3
3"
#%
3
"%$ !
3 !! $
3 !# "$
3 "! ! %%
3 !" " %
3 #
$
3 #%! ""!
3 %"$#
3 ! "$
3
"$!#
3
3 %$"
3 % !"
3 $$ $#
3 %# $! #
3
$!#"
3"!" % #
3 !" " %
3
! %
3 #%##!
3
%!
3 !! ! "
> 1
.
6&
':
8
1
&
&
,
9
6
;
<
&
'
'
+
1
,
+
9
3%!!
#
3
1
,
+
9
3%%
3
$
$
3
/
)0
#
$
3 "$ 3 $
"
3 !
3 !
3 !
1
,
+
9
3 #$
!!
3 %
"%
3 %$
$
3 %
%#
3
1
,
+
9
1
,
+
9
1
,
+
9
1
,
+
9
3 #%
!"
3 %
"
3 %$
$
3 %
%$
3
3 #
!#
3 %
#
3 %$
$!
3 %
%%
3
,
3 $
!$
3 %
#
3 %$
$"
3
%
3
,
3 %
3 %
9
#
3 %$
$
3 %$
%
3 %$
3 %$
3 %"
@
@
@
@
@
#
3 %"
;
3 %"
9
.
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
3 %#
3
3 %
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
3 %$
3
"
3 %$
1
3 %$
3
3 %
%
3 %"
3 %
$
3 %%
!
3 "#
%
3 $#
"
3 %"
##
3 %%
%
3
!
3
%
3 %%
3
!
3 %%
9
>
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
3
%%
3
#
3 $!
"
3 %!
#!
3 %%
$%
3
3 %
1
3
3 "!
$
3 $"
"
3 %!
#"
3 %%
$
3
9
,
3 %
3 "
"
3 %
+
3 %
3 !
"
3 $
!
3 %
#
3 %%
$$
3
!
1
;
%
3 !#
!
3 $
!%
3 %
#
3 %%
$#
3
1
+
(
(
(
(
. 9
1
!
%
%
=&
3 "
&
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
1
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
"
3
3
3
3 $$
"
3 %"
#$
3 %
%
3
"
3
#
3 #
!
3 $$
"!
3 %"
#%
3 %
%
3
#
3 %
$
3 #
!
3 $%
""
3 %#
#
3 %
%
3
$
3 %
3 #
!
3 $
"#
3 %#
$
3 %
%!
3
%
3 %
3 #"
!
3 %
"$
3 %#
$
3 %
%"
3
3 %%
!
3 %#
3 %%
"
3 %#
3 %%
#
3 %#
3 %%
$
3 %#
3 %%
3 %#
3 %"
6
9
$
"
3 "%
!
!
%
3
3 %"
3
1
"3 %
"3 !#"
"3 %
"3 %!
"3 #!
"3 "!
!3
#
!3%$!
!3$" $
!3#"#
!3#!
!3# !
!3# $
!3# !"
!3" "
!3" !
!3"
!3!!!
!3! "
!3
!3 $ $
A&
#(
"'
#(
(
#'
#(
$'
%'
$(
(
(
!'
#'
'
$(
$'
(
#'
!(
'
"'
3
3 %
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
*
*
*
*
*
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
-
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
!3 ""$
!3 !#%
!3
!3 "%
!3
!3
!3
%
!3 $#
!3
!3
!3 !%
!3 ""
3 % #
3 " !
3% $
3%$$
3%#%#
3% $!
3$ %
3$$"#
3$$ %
3$"
3$
3$ %
3$ !
3# #
3#%
3#%!
3# !
3"# $
3""$$
3""!#
3""
3"" $
3"! "
3"
3!%"$
3!% "
3!"
3!!"!
3! "$
3!
3!
3
!
3 !!
3 !
3
3
3 # "
3 #$
3 !%
3 "
3 !
3
"
3 #!
3
3 #
3 ! $
3 #!
3
3
%
3
3
3
!
3 %
3%% "
3%% %
3$ "#
3$$
3$###
3$"#
3$ $
3# %
3# %$
3"
3"$!%
3"$!%
3!$%#
3!""%
3! $"
'
!'
%'
()*
()*
%(
$(
(
"'
(
#()*
'
!'
'
'
(
"'
%'
(
(
$'
()*
'
(
'
(
%(
'
()*
'
%'
%(
(
()*
!(
$()*
()*
!'
%()*
()*
(
"(
$()*
'
#()*
'
%()*
$'
'
!()*
"()*
'
()*
'
(
(
'
"'
'
'
$'
%(
#(
(
(
$(
()*
(
(
'
$'
"(
'
(
!(
$(
'
"(
#'
'
>
>
>
>
/
/
/
'
?
?
?
?
?
?
(
(
(
(
(
(
(
(
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
3 "$%
3 % "
3 " #
3 $ "
3 % %
3 % %
3
3
3%$
3%$
3%$
3%$
3 % "
3 ! !
3 $ "
3% $
3% $
3$!"$
3$!"$
3$!"$
3$!"$
3$!"$
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
#'
%'
'
(
#(
%'
%(
(
'
'
"(
#(
!(
(
(
(
#'
(
$(
"(
!(
!'
"()*
'
!'
'
"(
!(
!()*
(
%(
"'
!
" #"$
%
"
#
&' ()$*)+'+, '$-
!
!
!
!
'
$%$& (
$* +* ,* - *
-
"
)
)
)
-
-
*
"
-
$.&
-
* $* +*
(
,
*
*
/
*
*
"
/0
/++
"
#
$&
$0
$'&&
"1
)
#
2
2
*
" 1
3
) 4
1
#
/$7
2
56 "
)
- * - * $*
-
/$$
/$0
+
!
$.&
,
(
- *
*
,
/$'
"
!
.$"87 9*
$ ::"&:9*
,&"8+9"
-
) ;
*
*
+
!
<
1 #
-
1 #
.#./ 0"'1 '
2
)&)
2
'+' +,,")'+'
2
!!
' 3.%.' 4/ $
" #"$
&' ()$*)+'+, '$&5'&5'+,
'0 3)$.'
"
) 3'3'
)0'/
)+,,)/ ./. 2
. .&4"'+'
0)+
!
=
!
!
"
!
!
!
!
*
"5
$"
"
" 1" >
? !
*
3
;
* 5
@ !
"
+"
"
6
*5
5
*
*
!
"
,"
"1
0" -
#
"
*
*
"
=
"<
*5
!
"
1
)
!
*
5
5
5
@
4
!
*
6
/
!
/
*
'"
*
*
"
6
@
"=#
"
!
"
"
*
!
"
"
7"
A
!
"-
*
"
! *
!
:"
."
8" -
$&"
$$" C
$+"
$,"
$0"
"
?
* -1
!
B? ??@ @ @5 >5B
*
*
*
!
*
/
6 #
"
*
*
# 5 ! #
!
!
-< D 5 @
! "
/
+7 6
* > * E* 2 * F
!
0$*
*
"
* 5
!*
B
B*
2
*
"
-
>-5
! !
@
!
#
! "
B
B*
"
**=
!*
"
*
* 54 @
# "
4- #
54
* D>
GGGGGGGGGGGGGGGGG
$
GGGGGGGGGGGGGGGG"
+
GGGGGGGGGGGGGGGGGGG"""
+
$"$ D
$"+
$", 5
@@
>
-
+"$
+"$"$ +"$"+
,
GGGGGGGGGGGGGGGG""
,
5
+"$",
GGGGGGGGGGG""
,
GGGGGGGGGGGGGGG"""
7
GGGGGGGGGGGGGGGG"
$&
GGGGGGGGGGGGGGG""
$$
GGGGGGGGG""
$$
1
+"$"0
+"$"' 2
+"$"7
GGGGGGGGGGGGGGGGG
)
+"+
+"+"$ -
5
GGGGGGGGGG""
$,
+"+"+ 1
!
GGGGGGGGGGG"
$0
+"+", -
GGGGGGGGGGGGGGG"""""
$'
+"+"0 -
GGGGGGGGGGGGGGGGG"""
$7
@@@
,"$ =
,"+
,", 5
1
5
GGGGGGGGGGGGGGG"""
$.
GGGGGGGGGGGGGGGGG
$.
GGGGGGGGGGGGGGG"""
$.
@H 1
H'"$ '"+
<
++
"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
,&
5
@5 >D
@5 >D
6
"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
@D
1
6
GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG
6 >
-
,&
!!
!
" #"$
%
"
#
&' ()$*)+'+, '$-
!
!
!
!
'
$%$& (
$* +* ,* - *
-
"
)
)
)
-
-
*
"
-
$.&
-
* $* +*
(
,
*
*
/
*
*
"
/0
/++
"
#
$&
$0
$'&&
"1
)
#
2
2
*
" 1
3
) 4
1
#
/$7
2
56 "
)
- * - * $*
-
/$$
/$0
+
!
$.&
,
(
- *
*
,
/$'
"
!
.$"87 9*
$ ::"&:9*
,&"8+9"
-
) ;
*
*
+
!
<
1 #
-
1 #
.#./ 0"'1 '
2
)&)
2
'+' +,,")'+'
2
!!
' 3.%.' 4/ $
" #"$
&' ()$*)+'+, '$&5'&5'+,
'0 3)$.'
"
) 3'3'
)0'/
)+,,)/ ./. 2
. .&4"'+'
0)+
!
=
!
!
"
!
!
!
!
*
"5
$"
"
" 1" >
? !
*
3
;
* 5
@ !
"
+"
"
6
*5
5
*
*
!
"
,"
"1
0" -
#
"
*
*
"
=
"<
*5
!
"
1
)
!
*
5
5
5
@
4
!
*
6
/
!
/
*
'"
*
*
"
6
@
"=#
"
!
"
"
*
!
"
"
7"
A
!
"-
*
"
! *
!
:"
."
8" -
$&"
$$" C
$+"
$,"
$0"
"
?
* -1
!
B? ??@ @ @5 >5B
*
*
*
!
*
/
6 #
"
*
*
# 5 ! #
!
!
-< D 5 @
! "
/
+7 6
* > * E* 2 * F
!
0$*
*
"
* 5
!*
B
B*
2
*
"
-
>-5
! !
@
!
#
! "
B
B*
"
**=
!*
"
*
* 54 @
# "
4- #
54
* D>
GGGGGGGGGGGGGGGGG
$
GGGGGGGGGGGGGGGG"
+
GGGGGGGGGGGGGGGGGGG"""
+
$"$ D
$"+
$", 5
@@
>
-
+"$
+"$"$ +"$"+
,
GGGGGGGGGGGGGGGG""
,
5
+"$",
GGGGGGGGGGG""
,
GGGGGGGGGGGGGGG"""
7
GGGGGGGGGGGGGGGG"
$&
GGGGGGGGGGGGGGG""
$$
GGGGGGGGG""
$$
1
+"$"0
+"$"' 2
+"$"7
GGGGGGGGGGGGGGGGG
)
+"+
+"+"$ -
5
GGGGGGGGGG""
$,
+"+"+ 1
!
GGGGGGGGGGG"
$0
+"+", -
GGGGGGGGGGGGGGG"""""
$'
+"+"0 -
GGGGGGGGGGGGGGGGG"""
$7
@@@
,"$ =
,"+
,", 5
1
5
GGGGGGGGGGGGGGG"""
$.
GGGGGGGGGGGGGGGGG
$.
GGGGGGGGGGGGGGG"""
$.
@H 1
H'"$ '"+
<
++
"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
,&
5
@5 >D
@5 >D
6
"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
@D
1
6
GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG
6 >
-
,&
1
$"
!
+"
""""""""""""""""""
0
"GGGGGG""""""""""""""""
7
""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
:
""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
:
!
,"
5
A
0"
<
5
'"
<
5
A
A
5
7"
) ))
.
""""""""""""""
8
:"
""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
$$
."
"""""""""""
$0
8"
$&"
6
!
*
F
""""""""""
/
!
$7
!
/.
""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
$$"
6
/
!
!
/8
/$7
""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
$+"
6
/
!
+0
!
/$:
/++
""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
$,"
++
!
+:
!
"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
+.
1
$"
-
+"
6
"""""""""""""""""""""
/
!
'
!
"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
+8
1
$"
/0
/++
+"
""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
,7
) """"""""""""""""""""""""""""
,:
1
Koksidiosis merupakan salah satu penyakit penting bagi peternakan ayam di
Indonesia, bahkan di dunia. Penyakit ini menimbulkan berbagai kerugian yaitu
morbiditas (kesakitan), mortalitas (kematian), nafsu makan dan produksi telur
yang menurun, serta biaya kesehatan yang meningkat dan menurunkan nilai
ekonomis (Ashadi 1980).
Koksidiosis adalah penyakit yang disebabkan oleh golongan protozoa yang
termasuk genus
. Pada ayam telah ditemukan 9 (sembilan) spesies
, yaitu
,
,
,
,
,
,
,
, dan
(Tampubolon 1992). Diantara sembilan spesies tersebut spesies
yang paling patogen pada unggas adalah
dan
(Levine 1985). Gejala klinis ditandai dengan kehilangan nafsu makan, jengger dan
pial yang pucat, bulu kusut, diare, serta kotoran sekum bercampur darah, dehidrasi
dan terkadang menyebabkan kematian. Gejala klinis lainnya adalah rendahnya
penyerapan pakan, pertambahan bobot badan yang rendah dan efisiensi pakan
yang rendah (Fanatico 2007).
Berbagai usaha dilakukan untuk memerangi penyakit ini, penggunaan
berbagai macam obat serta perbaikan tata laksana seperti menjaga kebersihan
kandang, memberikan koksidiostat secara berkala (Anonim 2008e), pemberian
vaksin yang mampu menginduksi sistem kekebalan, dengan menstimulasi limfosit
untuk menghasilkan antibodi dan sel memori yang akan bekerja ketika ada
patogen (Abbas dan Sharma 2003
Ameiss 2005). Pengendalian dan
pemberantasan dengan menggunakan koksidiostat belum optimal, bahkan
menimbulkan resistensi bila tidak digunakan dengan tepat (Anonim 2008f), serta
adanya residu obat dalam daging dan telur (Cahyaningsih 2007: Wardana
.
2001). Dengan adanya efek residu dan resistensi tersebut, maka perlu dicari suatu
solusi untuk menanggulangi agar tidak menimbulkan bahaya residu pada produk
akhir, resistensi parasit, mudah diperoleh, murah dan aman bagi peternak. Salah
satunya adalah tanaman sambiloto (
Ness). Dalam
2
masyarakat, sambiloto sudah dikenal sebagai salah satu bahan obat tradisional,
baik di Indonesia maupun bangsa lain di dunia.
Sambiloto bukan tanaman asli Indonesia, diduga berasal dari daerah asia
tropik. Tanaman ini memiliki banyak nama diantaranya bidara, sambiroto,
sandiloto, sadilata, takilo, paitan (Jawa); ki oray, takila, ki peurat (Sunda);
pepaitan, ampadu (Sumatera);
,
,
(Arab);
(India);
,
,
(Cina
,
,
(Vietnam);
(Persia);
,
(Inggris)
(Prapanza dan Marianto 2003). Sambiloto dapat tumbuh dimana saja termasuk di
tipe tanah yang jarang ditanami khususnya tanah yang bergelombang (
) yang memiliki kandungan aluminium, tembaga dan zink yang tinggi
(Anonimous 2008d).
Menurut Prapanza dan Marianto (2003), semua bagian dari tanaman
sambiloto akan terasa pahit jika dimakan atau direbus. Rasa pahit tersebut
disebabkan oleh adanya senyawa andrographolid. Senyawa ini berbentuk kristal
tak berwarna dan disebut deterpen laktone (Anonimous 2008d). Sambiloto
memiliki khasiat sebagai obat anti radang, analgesik, anti bakteri, penawar racun,
menghilangkan panas dalam dan anti piretik (Anonimous 2008a).
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui
etanol sambiloto (
diinfeksi
pengaruh pemberian ekstrak
Ness) dosis bertingkat diberikan saat
terhadap jumlah produksi ookista pada tinja ayam
Untuk mengetahui gambaran tentang khasiat obat alternatif yaitu ekstrak
sambiloto untuk menurunkan produksi ookista, sehingga dapat digunakan sebagai
anticoccidia.
3
!
!
Koksidiosis adalah penyakit yang disebabkan oleh golongan protozoa yang
termasuk genus
. Berdasarkan lokasi kerusakan yang ditimbulkan,
koksidiosis dapat dibagi atas dua bentuk yaitu koksidiosis sekum dan koksidiosis
usus halus. Pada ayam telah ditemukan 9 (sembilan) spesies
,
,
,
,
,
,
, yaitu
,
, dan
(Tampubolon 1992). Spesies yang paling patogen pada unggas adalah
dan
(Levine 1985).
Menurut Levine (1985),
Filum
diklasifikasikan sebagai berikut:
: Protozoa
Sub filum : Apicomplexa
Kelas
: Sporozoasida
Seb Kelas : Coccidiasina
Ordo
: Eucoccidiorida
Sub Ordo : Eimeriorina
Famili
: Eimeriidae
Genus
:
Spesies
:
"
# ##
Secara umum coccidia merupakan parasit intraselluler dari saluran
pencernaan dari inang vertebrata dengan spektrum yang luas (Bowman
.
2003). Coccidia ditemukan tidak hanya pada ayam, namun juga ditemukan pada
kalkun, kelinci, domba, sapi, babi, anjing dan kucing (Tampubolon 1992).
Coccidia mempunyai berbagai macam bentuk yang berbeda>beda yaitu: ookista,
sporokista, sporozoit, tropozoit, skizon, merozoit dan gametosit (Tampubolon
1996).
merupakan coccidia yang paling umum dan penting pada
4
ayam yang terdapat di dalam sekum. Ookista berbentuk telur yang lebar, halus,
tanpa mikropil, dan berukuran 14>31x 9>25Am. Dinding ookista terdiri dari satu
atau dua lapis dan mungkin dilapisi selaput (Levine 1985). Menurut Tampubolon
(1992) ookista
berbentuk bulat, lebar dan memiliki ukuran yang
bervariasi, dengan panjang sekitar 19.5>26 Am, lebar 16.5>22.8 Am, dengan rata>
rata panjang 22.6Am dan lebar 19.0Am. Ookista memiliki dinding yang terdiri dari
dua lapis yaitu sebelah dalam yang tersusun dari senyawa protein tannin dan
kinin, sedangkan lapisan luar tersusun atas lemak dan protein. Tahap ini
merupakan tahap yang resisten dari coccidia.
Apabila ookista disimpan di dalam suhu kamar dengan oksigen dan
kelembapan yang cukup, ookista akan mengalami sporulasi dalam waktu kira>kira
48jam. Ookista bersporulasi mengandung empat sporokista dan masing>masing
sporokista mengandung dua sporozoit. Sporokista merupakan hasil sporulasi dari
ookista, memiliki bentuk oval memanjang, satu ujungnya lebih runcing dari yang
lainnya (Tampubolon 1992).
Gambar 1: Ookista
yang telah bersporulasi
(Levine 1985)
Sporozoit yang dilepaskan oleh sporokista, terdiri dari dua generasi yaitu
generasi I dan generasi II. Sporozoit memiliki bentuk seperti koma dengan ukuran
10 x 15 Am, bersifat transparan, dan sitoplasma bergranul. Sporozoit mampu
memendek dan memanjang dengan gerakan meluncur cepat (Tampubolon 1992).
5
Sporozoit biasanya memanjang dan mungkin berisi satu atau lebih gelembung
jernih dari bahan protein (Levine 1985).
Tropozoit merupakan hasil perkembangan dari sporozoit yang akan
melakukan proses schizogoni. Pada perkembangan selanjutnya, inti tropozoit
mengalami pembelahan disebut skizon (Tampubolon 1992). Perkembangan
sporozoit di dalam vili epitel sekum menghasilkan merozoit generasi I dengan
panjang 2 – 4 mikron (Levine 1985). Tampubolon (1992), menyebutkan bahwa
ukuran dari merozoit generasi I adalah 5 – 10 mikron x 1,5 mikron dan memiliki
granular disekeliling intinya.
Gametosit merupakan perkembangan dari merozoit generasi II yang
selanjutnya
berkembang
menjadi
makrogametosit
dan
mikrogametosit
(Tampubolon 1992). Menurut Gregel, (1973) mikrogamet adalah gamet jantan
sedangkan makrogamet adalah gamet betina. Makrogamet memiliki ukuran yang
hampir sama dengan ookista, memiliki inti, kariosoma dan granula metakromatik
yang tersebar di bagian sitoplasmanya. Mikrogametosit memiliki bentuk seperti
koma, langsing agak membengkok, pada bagian anterior terdapat flagela sebagai
alat geraknya (Tampubolon 1992).
Tabel 1. Karakteristik ookista
sp pada Unggas
(Richardson dan Kendal 1963)
Spesies
Bentuk
Ukuran (micron)
Ovoid
19 x 14
Ovoid
26 x 20
Ovoid
19 x 17
Ovoid
30 x 20
Subspherical
16 x 15
Ovoid
20 x 17
Ovoid
21 x 17
Ovoid
23 x 19
6
$" %
Siklus hidup dari
.
adalah sama dan dapat diperlihatkan oleh
mengalami perkembangan siklus hidup secara
endogenous dan eksogenous. Stadium endogenous terjadi di dalam tubuh induk
semang yang meliputi tahap aseksual (merogoni) dan tahap seksual (gametogoni).
Stadium eksogenous terjadi di luar tubuh induk semang (Levine 1985). Menurut
Soulsby (1972), perkembangan
terdiri dari perkembangan aseksual
(skhizogoni) dan seksual (gametogoni). Selama proses skhizogoni, generasi
skizon terdiri dari bentuk invasif yaitu merozoit. Merozoit berkembang menjadi
gametosit dan dengan pembuahan menjadi makrogametosit (zigot) yang kemudian
menghasilkan ookista. Setelah mengalami proses eksogenous (sporogoni), ookista
akan menjadi bentuk yang infektif yaitu sporozoit, yang dihasilkan ketika induk
semang memakan ookista yang bersporulasi.
%# # #
Infeksi pada ayam terjadi ketika ayam memakan sporozoit pada ookista
yang telah bersporulasi. Ookista yang ditemukan pada feses induk semang
merupakan tahap non infektif karena tidak mengandung sporozoit (Anonim
2008c; Anonim 2008h). Ookista akan infektif setelah mengalami sporulasi.
Ookista bersporulasi selama 48 jam (Tampubolon 1992). Ookista yang keluar
bersama feses terdiri dari satu sel sporon. Sel ini diploid, tetapi mengalami
pembagian reduksi, dengan timbulnya badan kutub, dan semua siklus hidup
selanjutnya adalah haploid. Sporon membagi menjadi empat sporoblast, masing>
masing akan menjadi empat sporokista dan dua sporozoit terbentuk di dalamnya
(Levine 1985).
Gambar 2. Ookista yang belum bersporulasi
(Anonim 2000)
7
Di lingkungan sporulasi membutuhkan kondisi oksigen bebas dan
kelembapan yang cukup (Tampubolon 1992). Menurut Duszynski
(2004),
suhu dan arah pencahayaan matahari akan mempengaruhi kemampuan ookista
untuk bersporulasi di lingkungan luar. Ookista akan bersporulasi lebih cepat pada
suhu tinggi dan akan lebih lambat pada suhu rendah. Pencahayaan untuk suhu
yang kurang dari 100C atau 500C akan mematikan ookista yang belum
bersporulasi.
# #
Apabila ookista dimakan oleh ayam, maka dinding ookista akan pecah,
sporokista dibebaskan dan sporozoit keluar. Sporozoit akan memasuki vili epitel
dari sekum, membulat menjadi meron generasi I. Merozoit ini memecahkan sel
induk semangnya, masuk ke dalam sel baru dan berubah menjadi meron generasi
II, kemudian membelah dan menghasilkan 200>350 merozoit generasi II. Merozoit
keluar dari induk semang dan masuk ke dalam sel baru dari induk semang
tersebut. Beberapa dari mereka berkembang menjadi meron generasi III yang
memproduksi 4 > 30 merozoit generasi III (Levine 1985).
Gambar 3. Merozoit di dalam Skizon
(Anonim 2000)
Gambar 4. Fase Merozoit
(Anonim 2000)
& ' # #
Merozoit>merozoit generasi II berkembang menjadi gametosit melalui siklus
hidup seksual. Merozoit tersebut membulat membentuk gamon (Levine 1985).
Gametosit berdiferensiasi menjadi makro dan mikrogametosit. Mikrogametosit
menghasilkan mikrogamet motil dan berflagela. Makrogametosit berkembang
menjadi makrogamet. Hasil pembuahan makrogamet oleh mikrogamet adalah
8
zigot dengan dinding yang mengelilinginya yang disebut ookista (Richardson dan
Kendall, 1963).
Gambar 5. Fase Makro dan mikrogametosit
(Anonim 2000)
9
Gambar 6: Siklus Hidup coccidia pada ayam
(Levine 1985)
Keterangan Gambar:
Satu sporozoit (1) masuk ke dalam satu sel epitel usus (2), membulat, tumbuh dan
menjadi sebuah meron generasi pertama (3). Meron ini memproduksi sejumlah
besar merozoit generasi pertama (4), yang kemudian melepaskan diri keluar dari
sel induk semang (5), memasuki sel>sel epitel usus yang baru (6), membulat,
tumbuh, dan menjadi meron generasi kedua (7,8). Meron generasi kedua ini
memproduksi sejumlah besar merozoit generasi kedua (9,10) yang melepaskan
diri keluar dari induk semang (11). Beberapa diantaranya memasuki sel>sel epitel
yang baru dari usus induk semang dan membulat menjadi meron generasi ketiga
(12,13), yang memproduksi merozoit generasi ketiga (14). Merozoit generasi
ketiga (15) dan sebagian besar merozoit>merozoit generasi kedua memasuki sel>
sel epitel usus yang baru. Beberapa diantaranya menjadi mikrogamon (16,17), dan
setiap mikrogamon memproduksi sejumlah besar mikrogamet (18). Lainnya
berubah menjadi makrogamet (19,20). Makrogamet dibuahi oleh mikrogamet dan
menjadi zigot (21), yang membungkus dirinya dengan dinding tebal
disekelilingnya dan berubah menjadi ookista muda. Ookista ini keluar dengan
memecah sel induk semang dan keluar bersama tinja (22). Ookista tersebut
kemudian mulai bersporulasi. Sporon membuang badan kutub dan membentuk
empat sporoblast (23) yang masing>masing membentuk sebuah sporokista yang
berisi dua sporozoit (24). Bilamana ookista yang telah bersporulasi (24) di telan
oleh seekor ayam, sporozoit itu dibebaskan (1)
10
(
#
Menurut Levine (1985), patogenitas koksidiosis disebabkan oleh beberapa
faktor yaitu : jumlah sel induk semang yang rusak, besarnya dosis infeksi ookista,
patogenitas galur koksidia, ras, umur ayam, status gizi, stress, lokasi parasit
didalam jaringan, atau didalam sel induk semang, derajat dan waktu reinfeksi serta
derajat imunitas yang diperoleh atau imunitas alami induk semang. Koksidiosis
dapat ditularkan melalui kotoran ayam yang mengandung ookista. Ookista yang
bersporulasi merupakan stadium infektif dari siklus hidup coccidia. Ookista dapat
ditularkan secara mekanik melalui pekerja, peralatan yang tercemar atau terbawa
angin yang menyebarkan debu kandang dan litter dalam jangkauan pendek. Faktor
pendukung terjadinya wabah antara lain karena kandungan air pada litter yang
melebihi 30% (Anonim 2008h). Penularan koksidiosis dapat terjadi bila tata
laksana kandang yang buruk, dapat juga melalui kotoran ayam penderita, melalui
makanan dan minuman serta peralatan yang tercemar coccidia. Litter yang basah
merupakan media yang paling disukai bagi coccidia (Tampubolon 1996).
Menurut Mc Dougald dan Reid (1990)
Harismah (2006) dituliskan
bahwa patogenitas dimulai saat sporozoit dikeluarkan dari ookista yang telah
bersporulasi dan kemudian menembus dinding lamina propia. Saat yang
menentukan dalam infeksi adalah saat perkembangan skizon generasi II yang
telah matang, terjadi pada hari ke>4 setelah infeksi. Perkembangan pada lamina
propia menyebabkan mukosa usus rusak dan pecah pada saat skizon matang dan
merozoit dilepaskan. Patogenitas dipengaruhi oleh genetik inang, faktor nutrisi,
penyakit yang terjadi bersamaan dan spesies dari coccidia.
sangat
patogen pada ayam, karena proses skizogoni terjadi di lamina propria dan kripta
liberkhun dari usus halus dan sekum yang terjadi berulang kali sehingga
menyebabkan hemorrhagi (Anonim 2008h).
Koksidiosis terjadi pada unggas yang muda, sedangkan unggas yang tua
sebagai sumber infeksi (Levine 1985).
sangat patogen dengan,
mortalitas 74.5 % pada ayam petelur Babcock>300 dan 74% pada ayam pedaging
Startbro (Ashadi 1980). Patogenitas infeksi menurut Levine (1985), dipengaruhi
oleh umur induk semang, kekebalan dan ukuran dosis infeksi.
11
)&
!
Ayam yang menderita koksidiosis akan terlihat bergerombol di sudut>sudut
kandang, lesu dan lemah. Gejala klinis ditandai dengan kehilangan nafsu makan,
jengger dan pial yang pucat, bulu kusut, diare, serta kotoran sekum bercampur
darah, dehidrasi dan terkadang menyebabkan kematian. Gejala lainnya adalah
rendahnya penyerapan pakan, pertambahan bobot badan yang rendah dan efisiensi
pakan yang rendah (Fanatico 2007). Menurut Soulsby (1982), gangguan umum
yang terlihat setelah infeksi terjadi sekitar 72 jam adalah: Ayam lesu, nafsu makan
menurun atau bahkan berhenti makan, ayam bergerombol, berat badan menurun,
nafsu minum meningkat, nafsu makan menurun, bulu kusam dan pucat.
Pada saat skizon generasi II matang dan berkembang dilapisan dalam lamina
propria, merupakan tahap yang paling patogen karena dapat menyebabkan
kerusakan mukosa, akibat skizon dewasa mengeluarkan merozoit. Pada hari ke>4
sampai hari ke>6 setelah infeksi memberikan angka kematian yang tinggi.
Kematian tersebut disebabkan karena ayam kehilangan darah dalam jumlah yang
besar (Calnek
. 1997).
Gambar 7. Pendarahan sekum
( FAO 2008)
)
*
$
"
#+
Pengendalian coccidiosis pada ayam di Indonesia dilakukan dengan
pemeliharaan kebersihan (sanitasi) dan diikuti dengan pemberian koksidiostat
yang dicampurkan pada makanan atau air minumnya (Ashadi 1982). Pencegahan
dapat dilakukan dengan perbaikan sistem manajemen dan sanitasi antara lain
dengan pemasangan dan pengaturan sistem pemberian air minum yang sesuai,
penyedian tempat pemberian pakan yang cukup, ventilasi yang baik, pengaturan
12
kepadatan kandang dan pemberian antikoksidia (Anonim 2008i). Perbaikan
manajemen untuk kontrol koksidiosis seperti sanitasi, vaksinasi, pemberian obat
serta manajemen kandang (Fanatico 2007).
Pemberian obat memiliki dua tujuan yaitu untuk mencegah terjadinya sakit
dan untuk mengobati sakit. Obat yang seringkali digunakan dalam mengatasi
koksidiosis adalah preparat sulfa, amprolium, quinolones, ionophores dan
antikoksidia lainnya (Fanatico 2007). Pemberian larutan amprolium dengan
konsentrasi 0.0125, dalam pakan sebanyak 0.006 % hingga 0.008% pada kondisi>
kondisi tertentu serta pemberian antibiotik seperti klortetrasiklin yang memiliki
efek sinergis dengan sulphonamide. Pemberian bifuran (0.0055 % nitrofurazone
dan 0.0008% furazolidone), nicarbazine, nitrofurazone dan sulphaquinoxaline.
Pada pengobatan kasus terinfeksi dapat dilakukan dengan pemberian preparat
sulphonamides,
sulphamezathine
(sulphadimidine)
dan
sulphaquinoxaline,
campuran dari nitrofurazone dengan pyrimethamin, dan campuran larutan
nitrofurazone dan furazolidone. Dengan penggunaan sesuai konsentrasi, akan
menghambat perkembangan skizon generasi ke II pada awal perkembangan
parasit (Richardson dan Kendall 1963).
Pemberian vaksin juga akan menginduksi sistem kekebalan dengan
menstimulasi limfosit untuk menghasilkan antibodi atau sitokin dan menghasilkan
sel memori yang akan bekerja dengan cepat dan efisien ketika bertemu dengan
patogen (Abbas dan Sharma 2003
Ameiss 2005). Pemberian vaksin dapat
dilakukan dengan pencampuran pada air minum, pencampuran pada pakan,
penyemprotan kabinet pada DOC, dan pemberian dengan gel yang dapat dimakan
(Fanatico 2007).
13
'+ # #
!
"
'# # #
Sambiloto dikenal sebagai salah satu obat tradisional sejak abad ke>18.
Sambiloto (
Ness) merupakan salah satu bahan obat
tradisional yang dikenal sejak dulu terbukti mampu menyembuhkan berbagai
penyakit. Menurut Prapanza dan Marianto (2003) sambiloto (
Ness) diklasifikasikan sebagai berikut:
Divisi
: Angiospermae
Kelas
: Dicotyledone
Sub Kelas
: Gamopetalae
Ordo
: Personales
Famili
: Acanthaceae
Sub Famili : Acanthoidae
Genus
:
Spesies
:
Sambiloto (
Ness
Ness) merupakan tanaman yang
digolongkan jenis perdu atau semak, bercabang banyak (Prapanza dan Marianto,
2003), biasanya tumbuh melalui benih (Anonimous 2008d). Memiliki daun yang
kecil (Anonimous 2008a), tunggal, bertangkai pendek, letak berhadapan bersilang,
berbentuk lanset, pangkal runcing dan tepi rata dengan panjang 2>8 cm dan lebar
1>3 cm (Dalimartha 1999). Dengan permukaan atas daun berwarna hijau tua dan
permukaan bawahnya berwarna hijau muda, berbunga putih keunguan (Prapanza
dan Marianto 2003).
Tanaman ini memiliki ketinggian 50>90 cm (Dalimartha 1999), 30 – 100 cm
(Prapanza dan Lukito 2003), 40 – 90 cm (Anonimous 2008a), memiliki banyak
cabang berbentuk segi empat (kwadrangularis) dengan nodus membesar
(Dalimartha 1999). Sambiloto memiliki buah yang berbentuk jorong (bulat
panjang), dengan pangkal dan ujungnya tajam, dengan panjang sekitar 2 cm.
Setiap buah terdiri dari dua rongga, dengan tiap rongga berisi 3 – 7 biji kecil yang
berwarna coklat muda dan berbentuk gepeng (Prapanza dan Marianto 2003).
14
Gambar 8: Tanaman Sambiloto (
(Anonimous, 2007)
+
"
Ness)
, +
Sambiloto dapat tumbuh di tipe tanah yang jarang ditanami khususnya tanah
yang bergelombang (
) yang memiliki kandungan aluminium,
tembaga dan zink yang tinggi (Anonimous 2008d). Habitat asli sambiloto
(
Ness) adalah tempat terbuka yang teduh seperti kebun,
tepi sungai, tanah kosong yang agak lembab atau di pekarangan (Prapanza dan
Marianto 2003), tumbuh berkelompok (Anonimous 2008a), berkembang biak
dengan benih (Bethesda 1983). Tumbuh mulai dari dataran rendah hingga
ketinggian 700 mdpl. Dengan curah hujan 2.000 – 3.000 mm /tahun, memiliki
suhu 25oC > 32oC, dengan kelembapan sedang dan pH 5.5 – 6.5 (Prapanza dan
Marianto 2003).
Sambiloto (
Asia Tenggara seperti
Ness) tumbuh dengan subur di daerah
India dan Sri lanka, Pakistan dan Indonesia. Namun
dikembangkan secara ektensif di China, Thailand, India bagian barat dan timur,
serta Mauritius (Anonimous 2008d). Tanaman ini memiliki banyak nama
diantaranya bidara, sambiroto, sandiloto, sadilata, takilo, paitan (Jawa); ki oray,
takila, ki peurat (Sunda); pepaitan, ampadu (Sumatera);
(Cina);
,
,
(India);
,
,
,
,
15
(Vietnam);
(Arab);
(Persia);
,
(Inggris) (Prapanza dan Marianto 2003).
!
"
Ness
(sambiloto)
memiliki
zat
aktif
andrographolide sebagai komponen utama serta saponin, flavonoid, alkaloid dan
tannin (Yusron
2005). Daun dan percabangannya mengandung laktone yang
terdiri dari deoksiandrografolid, andrografolid (zat pahit), neoandrografolid, 14>
deoksi>11>12>didehidroandrografolid, dan homoandrografolid. Juga terdapat
flavonoid, alkane, keton, aldehid, mineral (kalium, kalsium, natrium) dan damar.
Flavonioid diisolasi terbanyak dari akar, yaitu polimetoksiflavon, andrografin,
panikulin,
mono>0>metilwithin,
dan
apigenin>7,4>
dimetileter.
Zat
aktif
andrografolid terbukti berkhasiat sebagai hepatoprotektor (melindungi sel hati dari
zat toksik) (Anonimous 2008b; Dalimartha 1999; Prapanza dan Marianto 2003).
Menurut Prapanza dan Marianto (2003), semua bagian dari tanaman
sambiloto akan terasa pahit jika dimakan atau direbus. Rasa pahit tersebut
disebabkan oleh adanya senyawa andrographolid. Senyawa ini berbentuk kristal
tak berwarna dan disebut deterpen laktone. Senyawa andrographolid merupakan
senyawa utama yang digunakan sebagai komponen obat. Andrographolid diisolasi
terbanyak pada daun sebesar 2.39 % (Anonimous 2008d), sedangkan menurut
Prapanza dan Marianto (2003) adalah sebesar 2.5 – 4.8 % dari berat keringnya.
Hasil analisa fitokimia pada serbuk kering sambiloto menunjukkan senyawa
steroid lebih banyak dari pada flavonoid, hidroquinon, terpenoid, saponin dan
tanin. Sedangkan analisa fitokimia pada ekstrak sambiloto dengan pelarut air,
alkohol dan metanol menunjukkan senyawa alkaloid dan flavonoid lebih banyak
dari pada hidroquinon, terpenoid, steroid, saponin dan tannin (Cahyaningsih
2007).
16
Gambar 9. Struktur Kimia Zat Aktif
(Naiyana 2002)
!
( !$
Kandungan andrographolid mampu meningkatkan fungsi sistem pertahanan
tubuh (Anonimous 2008c) karena meningkatkan daya fagositosis leukosit, dan
menurunkan demam (Prapanza dan Marianto 2003). Selain itu sambiloto juga
mampu menurunkan kadar glukosa darah, mengatasi disentri dan radang lambung
(Anonimous 2008a). Kalium yang terkandung dalam sambiloto (
Ness) berfungsi dalam meningkatkan jumlah urine serta membantu
dalam pengeluarannya. Flavonoid berfungsi dalam mencegah dan menghancurkan
penggumpalan darah (Prapanza dan Marianto 2003).
Dehidroandrographolid yang terkandung dalam sambiloto berfungsi sebagai
anti radang dengan meningkatkan sintesa
(ACTH)
17
dari pituitari otak yang mengirim sinyal ke kelenjar adrenal untuk memproduksi
kortisol yang merupakan anti radang alami (Deng 1985
Harismah 2006).
Sambiloto juga berkhasiat sebagai bakteriostatik pada "
#
#
"
. Selain itu juga memiliki efek muskarinik pada pembuluh darah dan efek
iskenik pada jantung (Anonimous 2008b & Dalimartha 1999). Sambiloto
memiliki khasiat sebagai obat anti radang, analgesik, anti bakteri, penawar racun,
menghilangkan panas dalam dan antipiretik (Anonimous 2008a). Kandungan zat
aktif dari sambiloto yaitu tanin dapat bersifat sebagai astringen di dalam saluran
gastrointestinal (Tyler 1981
Cahyaningsih 2007), dan flavonoid dapat
menunjukkan efek anti inflamasi (Bisset 1991
Menurut Miller (1996)
Cahyaningsih (2007), flavonoid berfungsi sebagai
antiinflamasi dengan cara menghambat enzim
Penghambatan enzim
Cahyaningsih 2007).
dan
untuk pengobatan gejala peradangan dan alergi.
dan
.
dapat memberi harapan
18
.
"
'%
Penelitian ini dilaksanakan pada Juli 2007 – Juli 2008 di Laboratorium
Protozoologi, bagian Parasitologi dan Entomologi Kesehatan, Departemen Ilmu
Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner, Fakultas Kedokteran
Hewan, Institut Pertanian Bogor.
"
$
Alat>alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah kandang ayam
berukuran 1x1 m dan 75x40 cm, sekam, tempat makan dan minum, bola lampu 40
watt, plastik, mikroskop, gelas ukur, sentrifius, tabung reaksi, syringe 1ml,
pengaduk, pipet tetes, kamar hitung McMaster, dan kertas label.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 210 ekor ayam umur
sehari (DOC) strain Hybro PN, isolat
, pakan, air minum, ekstrak
sambiloto dengan pelarut etanol dosis rendah, sedang, dan tinggi, koksidiostat
$
, dan larutan garam jenuh sebagai larutan pengapung.
#" %
1. Persiapan Kandang
Setelah kandang dibersihkan dari kotoran dengan menggunakan air
dan sabun, maka kandang dikeringkan. Seminggu sebelum penggunaan
kandang, permukaan dalam dan samping kandang diberi kapur,
sedangkan lantai kandang diberi sekam.
2. Pembuatan Ekstrak Sambiloto
Proses
ekstraksi
sambiloto
dilakukan
dengan
pengeringan
kemudian dihaluskan. Sambiloto yang telah halus direndam dengan
etanol selama 24 jam. Setelah direndam kemudian disaring untuk
memisahkan dari endapan. Pengendapan dan penyaringan dilakukan
sebanyak tiga kali. Hasil saringan diuapkan pelarutnya dengan rotary
evaporator, sehingga tersisa ekstrak yang berbentuk gel. Selanjutnya
19
ekstrak sambiloto tersebut diencerkan dengan menggunakan pelarut
aquades sehingga dihasilkan ekstrak sambiloto dengan dosis rendah,
sedang dan tinggi.
3. Pengelompokan Ayam
Dua ratus sepuluh ekor ayam umur sehari (DOC) dibagi menjadi 7
kelompok, masing>masing terdiri dari 30 ekor ayam yaitu:
Kontrol negatif (KN)
: kelompok ayam yang tidak diinfeksi dan
tidak diberi obat.
Kontrol positif (KP)
: Kelompok ayam yang diinfeksi ookista
dengan dosis 1x105/ ekor
dan tidak diberi obat.
Kontrol obat (KO)
: Kelompok ayam yang diinfeksi ookista
dengan dosis 1x105/ ekor
dan diberi obat sulfacholopyrazine dengan
dosis 180 mg/kgBB.
Kontrol sambiloto (KSB) : Kelompok ayam yang tidak diinfeksi ookista
dan diberi ekstrak sambiloto
E1
: Kelompok ayam yang diinfeksi ookista
dengan dosis 1 x 105/ ekor
dan diberi ekstrak sambiloto dengan pelarut
etanol dosis rendah.
E2
: Kelompok ayam yang diinfeksi ookista
dengan dosis 1 x 105/ ekor
dan diberi ekstrak sambiloto dengan pelarut
etanol dosis sedang.
E3
: Kelompok ayam yang diinfeksi ookista
dengan dosis 1x105/ ekor
dan diberi ekstrak sambiloto dengan pelarut
etanol dosis tinggi.
20
4. Perlakuan pada ayam
Ayam yang berumur dua minggu diinfeksi dengan ookista
dengan dosis 1x105 /ekor secara per oral (cekok) pada kelompok
E1, E2, E3, KO, dan KP kecuali pada kelompok kontrol negatif (KN),
dan kontrol sambiloto (Ksb) tidak diinfeksi. Setelah dua jam diinfeksi
kelompok perlakuan kontrol obat (KO) diberi S
$
dosis
180 mg/kg BB, kelompok perlakuan kontrol sambiloto (KSb), E1, E2,
dan E3 berturut>turut diberi ekstrak sambiloto, ekstrak sambiloto pelarut
etanol dosis rendah, sedang, dan tinggi.
5. Pengambilan tinja
a). Tinja diambil setiap hari berturut>turut mulai hari ke>4 sampai hari
ke>22 setelah infeksi secara acak (empat didaerah ujung, dan satu
dibagian tengah kandang) dari setiap kelompok perlakuan.
b). Tinja yang sudah diambil kemudian dimasukkan kedalam kantong
plastik putih yang sudah diberi label sesuai dengan pembagian
kelompok ayam.
c). Tinja ayam yang sudah dikumpulkan, kemudian dimasukkan kedalam
kulkas untuk beberapa saat sebelum dilakukan pemeriksaan tinja
6. Penghitungan ookista pergram tinja
Adapun urutan penghitungan jumlah ookista pergram tinja dengan
metode McMaster adalah sebagai berikut:
a. Tiap kelompok ayam dilakukan pemeriksaan terhadap tinja dengan 2
kali pengulangan.
b. Tinja ditimbang sebanyak satu gram dan kemudian dimasukkan ke
dalam tabung sentrifius.
c. Kemudian ditambahkan larutan garam jenuh sebanyak 14 ml dan
diaduk supaya homogen, lalu disentrifius dengan kecepatan 1500
rpm selama 10 menit.
21
d. Bagian supernatan/ permukaan dari campuran tersebut diambil
dengan menggunakan pipet dan kemudian dimasukkan ke dalam
kamar hitung Mc Master.
e. Pemeriksaaan dilakukan dibawah mikroskop dengan pembesaran
100x (objektif 10x dan okuler 10x) dan jumlah ookista dihitung
dengan menggunakan kamar hitung Mc Master.
f. Jumlah ookista pergram tinja dihitung dengan menggunakan rumus:
'()(=
1 %
& %
Keterangan : n
: jumlah ookista dalam kamar hitung
Vk
: volume kamar hitung (0.5 ml)
Vt
: volume sampel total (15 ml)
Bt
: berat tinja (1 gram)
OTGT: ookista tiap gram tinja
g. Persentase penghambatan ookista dihitung dengan rumus:
%
=
(*
−+)
100%
*
Keterangan : Kp
: Total produksi ookista kontrol negatif
X
: Total produksi ookista kelompok perlakuan
%Efektifitas : % efektifitas penghambatan produksi ookista
h. Persentase peningkatan/ penurunan jumlah produksi ookista dihitung
dengan rumus:
%
tan
Keterangan : Hx
Hx>1
=
(,
−1
,
−,
)
100%
−1
: Produksi ookista pada hari ke>x
: Produksi ookista pada hari ke X>1
(
Analisis data hasil penelitian dengan menggunakan analisis sidik ragam
(
, ANOVA) untuk melihat perlakuan yang diberikan
menunjukkan pengaruh nyata atau tidak berbeda nyata. Jika analisis menunjukkan
berbeda nyata, maka dilanjutkan dengan uji wilayah berganda duncan (/
0
(
/DMRT) (Mattjik dan Sumertajaya 1999).
.
!
"
#
$
"
"
%
$
&&'
"
" (& &&&
"
)
"
"
$ #
"
"
!"
*
+
&
$
,
"
"
"
"
!
!
"
!
#
)-
.'/
(
5
1
+
&0
"
"
'
,
1
"
2
"
!
2
2(
2(
"
1 2
2
!
1
#
" "
%*% 3
)
&&/
"
"
"
%
4 %
&&'
"
"
"
&&'
"
#
%
!
-
"
/
"
1
2
!
2
2(
"
"
, 6
"
"
2(
!
/ '/6 2
"
7&6
7&76
1 7( 6
2 7./ .6
1
#
$
%
!"
&
"
"
1
!
2
2(
.
"
"
2(
,7,6
1.
2 ' &6
! (,/ ,6
6
"
1 2
"
!
2
2(
2
1
5
+
,/ ,6
1
0
"
.
,
"
7
"
1
"
!
2
2(
2
2
(
+
$
1
2
!
2
2(
"
"
2
2(
2(
"
2 2
!
1
"
"
7
"
2
,
"
!
7
,
"
,
*
+
$
#
,
1 2
!
2(
2
7
!
#
"
+
$
"
"
"
-
,
"
8
9
-
"
3 "
&&
4
&&/
&&7
-
:
&&(
:
"
"
#
-
"
#
-
"
#
; 9
9
<
; 9
#
-
9
"
:
"
"
%
&&'
&&
4
&&7
"
" $
=
$
" $
#
>
../
3
&&
?
!
..7
3
?
&&
"
#
%)
=
...
3
&
&&
'
!
##
#
!"
#
"
"
#
"
/
!
"
"
@ 9
.'7
%"
"
"
"
"
"
5
"
"
"
1
+
0
"
"
/
+
(
/
!
1
2
2
2(
.
1
!
.
2(
2
&
"
2(
' , .'6
1 ( 6 2
"
(6
,
!
6
&& 6
2
( 6
2
'
(
5
)
+
1
( )
"
)
2
2
"
2(
!
1
2
1
"
)
2(
2
2(
"
/ . 6
' ., 6
2 (& . 6
2 2
1
2
$
// &/6
1
2(
# # $
% &
!
"
'
()
"
#
&
#
"
$ #
)
)
%
# *&
+ '
)
)
''
)
'
# &
'
&
)
) +
)
)
)
)
'
.
'
& * /
)
'- ' ))
)
'' "
& ***
)
+ ,
)
'
%
)
'
" $$ $/
"
* /
)
+ '
)
)
)
'
+ '
'
'
'
'
)
)
+
+
+ '
'
)
)
- " +&&'"
? 2/
)
"
;((###"
%"
J$0
%
I5
/
)
#
!"
3
+&&&"
") ( )
+&&.K
" +&&. "
;((###"
)
"
()
;
) (A
!( )
6
+& 5
D
"
+&&.
+&&. "
"
;
")
5
" +&&. " 3
"
;((###"
+& 5
+&&.
*
6 3 #"
+&&. "
-
5
+& 5
( #(
")
(
K" +&&. "
5 ) H
! 5
;((###"
) 3
") ( 3 (
%"
I# N) ))
9+?
)
"
" $8.&" -
"
+&&.
-
#
"
+&&. "
@
$8
#
")
3
$8
) "
;((###"
5
N+I N$'+/////
*
48' H
") (
"
M
() ))
*
(
"
+&&. "
;((###"
!
" +&&. " < 3
"
" ( ( L
(3 #"
$8
+&&. "
"
+&&. "
;((###" ) ) ")
2
!( ) (A,07(
>
") "
" +&&.)" ? ))
;((###"
J
/
A
"
"
;((###"
)!
) "
)(
M)
M
@
! N$$$
3
" 5 ) I? "@ )">
N
( )(+&&.&&"
/
!
JD
;
!
2" $8.+"
"
-
@
JD
-
!
;
!
"
"
? " $8.,"
"
#
"C !
5
!
$#
;C !
#
" +&&," %
*> "
? !
>*
"
"
"
&
'
@#
!
((###"
"
*
$
"? 6
-" +&&$"
! 'O $&:/$$,"
!
?
#
@
"
*
" +&&:"
"
"
" )"
" =* 1" "
$8
"
+&&. "
* ?"="
* D"6 5)
;@ =
/$&" >
!
* C"5"
> 3
!
" $88:"
;
3
%!
3 3
$,'O ,88/
.7'/.:."
?
C* ? < ?
)
)
/
0&7"
?
*=<
!
!
?
" +&&+"
;
)"(
)
)
F* = C "* = < " +&&:"
/ )
( #
)
)
3
+8."$' ,,,"$' -" ( "
*
+ " +.O :; $$.,"
?
*
"
)
<
/
" +&&0"
#
* "@ 2
)
1 " +&&'" <
)
3
)
> 3
/
33
!
*
) )
!
3
J
!*
$#
" " (
3
!"
"
6 !
)
K"
;
H
!
!"
#
>
*
% )
" 6 " ',; $,:/$00"
) )
"
+&&."
;((###"
"
+&&. "
=*
;((###"
+&&. "
A
)
" $888"
# ! ""
A!
*5
%
)
"
D
)
!
)
(
? D " +&&0"
(
!() )) (
(
!"
/
;
$
"
5
"
,
,
+& 5
"
"
<
)
" +&&:"
? ))
"
6
3) "
;((###"
<
"
+&&."
;((###" "
2
*
> 3
2
5
/
" (
@ 1
!
*<
/
(
() ))
"
"
$+
/878 "
J$0
+&&.K
" $88."
*
! *
"
"
"
"
" +&&7"
*
-
#
A *
!
*
-
O<
1 # "
" +&&7"
5
5
*5
;<
D 3
-
" $8.'"
O
"
5
5
A
!
#"
" +&&+"
) *
;2
A @*
D
" H
" C !
!
A
! " $888"
;@
/$"
; > 3
!"
"
2
#
*
+ +
)
" 3
A
1
@
=
@6" $8.:"
# "
)
*
#
"
!
'
> 3
!"
! ;
H
- )
!
*
"
# *6
"
!
#
5* 5
# *
6
!
"
"
;((###"
!
!
+ 7 ;$+7/$,,
'
" +&&'"
" "
" +&&$"
1
*
C
;
*?
#
")
;
"
"
!
&
$
'
+
+
)
1
'
#"
,5)0
3 "
./
%
#
%
&
7&
!
"
#
$
%
!
"
#
$
%
&
'
'
'
(
(
(
()*
'
+
+
./
)
'
(
(
"
# $
()*
(
,
-
%
! " # $ %
##
##
)
)0
1
)0
/
! !3%! # "
3$!%%# $
3"%
!3
%"
3 % %$"
" 3 % "!%
,
1)'
6
1
3 $
3! #% !
3 ""
))
1
)0
/
#3$" #""!
$3" $ !
! 3$
!3 $ # %
3 # #%
3$"
3 % !#
3 $
%
3 %
555555555555
6 55555555555
1
)
.
!
3!
!$
3!%""
!
!
3 %
!
3!$ #!
!
3 "% % !
3 ! !$#
!
3 % $#!
3"$ !#%#
!
3""% " %$
3 %!
$"
!
3 # ! %!!
3! %%%"
!
!3" ""
3% " "
!
3" %$ $"!
3!
"
!
3!# #$ %
3"" "
#
!
3! %##
3%
# %"
!
3 #%$# $
3$%%%%
!
3
% $%
3 !%% #
!
3 "" $
3% !#%
!
3
"
"
3! $
!
3$"%#! $
3$! " "
!
3" !%"!#"
3 ##
!
!
3 %""$!
3#
!
!
3% %## %
3## %"%
!
3%# #
3!" "#
555555555555
6 55555555555
1
)
.
%
3 # #$ $
3
#%"$$
%
3$%$$" %!
3% ## %$
%
3#$# $# #
3"##%
"
%
3"!""
3 $!% !#%
%
3
"!#$
3
!$#
%
3$"!# $""
3!"
$
%
3 "! %%
3 !# "
2 /
43
2 /
43
43
43
.
6&
':
8
1
&
&
,
9
6
;
<
&
'
'
+
. 9
1
1
,
+
3
3
"
3 %
#
3 # #
"
3 %%%
9
"
3 !$
3 ""
1
,
!
9
3 % "
1
;
3 %
3 %"
.
>
>
>
>
>
>
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
;
3
/
)0
!
9
=&
3 "
&
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
/
/
/
/
/
/
/
/
/
@
(
3 %$
9
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
?
?
?
?
?
%%
$
3 ##$
#
3
6
%
3 $
3
1
!3" ""
3" %%
!
!
#
$
3""%
!
!
3!# $
!
%
3!
!
3!
!
3 %"#
!
3 "%!
!
3 # !
!
3
!
%
$
"
3
!
3 #%%
!
3 %
!
3%# #
!
3% %$
!
%
3" !
3 ""
3$"%#
3
"
!
!
!
!
#
"
!
$
%
3
3 $!#
%
3
3 $$%
3
!
.
6&
':
8
1
&
,
&
9
6
;
<
&
'
'
+
. 9
1
9
1
.
3
$
3
9
.
&
$
'
A&
'
(
(
(
"'
"'
"'
"(
$()* %'
%'
%'
(
(
()*
'
!( !( !( !()* "'
$()* %' %' %' %(
+
)
1
'
)
&
A&
:
3
%%
3
3
9
&
*
*
*
*
*
. &
3 %
!
#
;
>
;
/
)0
1
,
=&
3 "
1
3$%$$"
%
&
'
3$"!$
3
""
%
%
(
(
3 #
$
%
'
3 "!!
3#$# %
3"!""
%
%
%
()*
'
(
"
"#
6
3
#
"
3
3
$
#
! " # $ %
! " # $ %
' ' ( ( ( ()*
'
'
'
(
(
(
()*
'
'
'
(
(
(
()*
'
'
()*
'
'
'
(
(
(
()* !'
!'
!'
!(
!(
!(
!()*
"(
"(
"()* #'
#'
#' #(
#(
#(
#()* $'
$'
$'
$(
$(
$(
%(
%(
%(
%()*
'
'
'
(
(
(
()*
'
'
'
(
'
'
(
(
(
()*
'
'
'
(
(
(
()* !' !' !'
"' "' "( "( "( "()* #' #' #' #( #( #( #()* $' $' $' $( $( $(
%( %( %()* '
'
'
(
(
(
()*
+
+
,
##
+
+
##
6
)
./
)0
1
)0
/
2 /
! !3%! # "
3$!%%# $
3"%
43
!3
%"
3 % %$"
#"
" 3 % "!%
,5)0
,
1)'
6
1
3 "
3 $
3! #% !
3 ""
./
6&
))
1
)0
/
2 /
%
#3$" #""!
$3" $ !
! 3$
43
#
!3 $ # %
3 # #%
3$"
43
%
3 % !#
3 $
%
3 %
43
)
./
&
A&
%
A&
'
'
'
(
(
(
()*
'
'
'
(
(
(
()*
'
'
'
(
(
(
()*
'
'
'
(
(
6&
))
3
3
3
1
% !#
> 1
555555555555
1
3
!%"
3 # % "
!3 "" " #
3$ ""## $
3 #!! #
!3 $"%
3"" $ #$
3"# ##$
3# $ #%
3#%! %##
3
3$$ ! !$
!3#!
$#
!3 "% !
!3# !"! !%
3 " !!$
!3
!$$%
3 $ " $
3
! !"
3! "##"#
3 ! !! $
3! $!
$
!3 ""$ "
3%$ %"#
3$!"#% %"
3# # # #
6
)0
3
3
3 $
/
%
55555555555
)
.
3
$! #
3 %! #%
3
!#$ %
3 %%
3 $"
3
% %
3 % $
3 " # %
3 ! $$
3
% ! $
3
3
#$ !
3 $ %
3
% # $
3 #"$ $
3" "
3 $ % %
3 %" " !"
3 # ! $"
3
$#% #
3
!#%
3 # %#%
3 $
"%
3
% #
3 "!"" $
3 ! $ $
2 /
3
3
3 %
3
3
43
(
()*
!'
!'
!'
!(
!(
!(
!()*
"'
"'
"'
"(
"(
"(
"()*
#'
#'
#'
#(
#(
#(
#()*
$'
$'
$'
$(
$(
$(
$()*
%'
%'
%'
%(
%(
%(
%()*
'
'
'
(
(
(
()*
'
'
'
(
(
(
()*
'
'
'
(
(
(
()*
'
'
'
(
(
(
()*
!'
!'
!'
!(
!(
!(
!()*
"'
"'
"'
"(
"(
"(
"()*
#'
"3 %! !$
!3
"
3 % # % "
!3 !#$" $
!3#
"
3$!"#% %"
!3! "!"$
3"! !$ !#
3 ## # "
3 ! #" !$
"3 !#" !%#
!3 $ # ! %
3$!"#% %"
3$ $ $ "
3! %%%!
3 !% "# !
!3# $
$
"3 #! ##%
!3!!!
#"
3
# $"
"3 "! $%#
"3 % $
!3 !% % !
!3" ! !
!3
#
%
3$"# #
3$!"#% %"
!3" "
$%
!3
%
3"
!"
!3
!
!3%$! !!%
3% $!
#
3
!3
% !
3#%
#
3!" # !
3$###
3$
"$
3 #
"
3
%
3%$$ $%!
!3#"# %%%
3$" ! $
3% $ $#$
3 !
$%
3%$ %"#
3 $ "
3$ $%
3$$"#!#$
3!!" "% "
3$
## !
3
$ "
3
%$ $
3% ##!
!3
"$ $
3$ % $ !
3!%"# $
3
3 # " % $
3
3 !
#
3
#$
!3"
#!#
3# ! %!
3$!"#% %"
3!% "
3
3" % !#"
3 % !%%!$
3
3
!3
"
3%#%# #"
3
3%$ %"#
3!$%"##"
3
3
3 "$% %$"
3
" "$
3 !
#
3 "# %
3" $ !#$
3" #% #
3 "!"" $
3 %# $%##
3
$%
3 # # ##
3 !# %
3
%"
3% %$ % $
3 "!"" $
3"! # #"!
3 !
3
! " !
3
%
3 % %#
3
$#"%
3 #$ !$
3 # #%#$
3 " " %%
3 $
#
3 ! %" $
3
! # #
3
# $"!
3 "!"" $
3 ! "%%!
3 "%#" $!
3 "
$%%
3 ## "!
3
%!%
3 $
$
3
3% #%!#
3
# #
3 "$$!
3 !$ "$!
3! !
$"
3
%!
3 %$"
3 %! %"!
3 $% $ #
3 " ! $
3 "!! %#
3
% %
3
% #
3
%% "
3
!! !
3 "
"
3 #!
3 #
!%
3!$ "" #
3"$ %# !$
3 # ! %%
3 $" "%#
3
%$"
3 #
$
3
3 "#$%""
3
3!$ $" ##
3
%
3 $"##
3 " # %#
3 "!"" $
3
$"$
3
3 !$ # %
3"! $# %
3
3
3
!#
3 # $! !
3
3
% #
3
3
3
3"# %!#
#'
#'
#(
#(
#(
#()*
$'
$'
$'
$(
$(
$(
$()*
%'
%'
%'
%(
%(
%(
%()*
'
'
'
(
(
(
()*
3!""$#$%
3% ##!
3%$ %"#
3 % $%" $
"3 %
#
3 !!
!
3$$ $
%
3
!% $
3
$%%#!
3"$!%! %
3%% !$% #
!3$" #" "
3!
%
3 % ! $
3""$#%$!
3 % $%" $
3
%
3
#
3""!"$#
3
#
3 " # $
3 "
3"$!%! %
3# %$ !%
3 % % #
3""
$!
3%% $ %
3
!
3 # ! %%
3
% #
3
3"
#%
3
"%$ !
3 !! $
3 !# "$
3 "! ! %%
3 !" " %
3 #
$
3 #%! ""!
3 %"$#
3 ! "$
3
"$!#
3
3 %$"
3 % !"
3 $$ $#
3 %# $! #
3
$!#"
3"!" % #
3 !" " %
3
! %
3 #%##!
3
%!
3 !! ! "
> 1
.
6&
':
8
1
&
&
,
9
6
;
<
&
'
'
+
1
,
+
9
3%!!
#
3
1
,
+
9
3%%
3
$
$
3
/
)0
#
$
3 "$ 3 $
"
3 !
3 !
3 !
1
,
+
9
3 #$
!!
3 %
"%
3 %$
$
3 %
%#
3
1
,
+
9
1
,
+
9
1
,
+
9
1
,
+
9
3 #%
!"
3 %
"
3 %$
$
3 %
%$
3
3 #
!#
3 %
#
3 %$
$!
3 %
%%
3
,
3 $
!$
3 %
#
3 %$
$"
3
%
3
,
3 %
3 %
9
#
3 %$
$
3 %$
%
3 %$
3 %$
3 %"
@
@
@
@
@
#
3 %"
;
3 %"
9
.
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
3 %#
3
3 %
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
3 %$
3
"
3 %$
1
3 %$
3
3 %
%
3 %"
3 %
$
3 %%
!
3 "#
%
3 $#
"
3 %"
##
3 %%
%
3
!
3
%
3 %%
3
!
3 %%
9
>
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
3
%%
3
#
3 $!
"
3 %!
#!
3 %%
$%
3
3 %
1
3
3 "!
$
3 $"
"
3 %!
#"
3 %%
$
3
9
,
3 %
3 "
"
3 %
+
3 %
3 !
"
3 $
!
3 %
#
3 %%
$$
3
!
1
;
%
3 !#
!
3 $
!%
3 %
#
3 %%
$#
3
1
+
(
(
(
(
. 9
1
!
%
%
=&
3 "
&
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
1
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
"
3
3
3
3 $$
"
3 %"
#$
3 %
%
3
"
3
#
3 #
!
3 $$
"!
3 %"
#%
3 %
%
3
#
3 %
$
3 #
!
3 $%
""
3 %#
#
3 %
%
3
$
3 %
3 #
!
3 $
"#
3 %#
$
3 %
%!
3
%
3 %
3 #"
!
3 %
"$
3 %#
$
3 %
%"
3
3 %%
!
3 %#
3 %%
"
3 %#
3 %%
#
3 %#
3 %%
$
3 %#
3 %%
3 %#
3 %"
6
9
$
"
3 "%
!
!
%
3
3 %"
3
1
"3 %
"3 !#"
"3 %
"3 %!
"3 #!
"3 "!
!3
#
!3%$!
!3$" $
!3#"#
!3#!
!3# !
!3# $
!3# !"
!3" "
!3" !
!3"
!3!!!
!3! "
!3
!3 $ $
A&
#(
"'
#(
(
#'
#(
$'
%'
$(
(
(
!'
#'
'
$(
$'
(
#'
!(
'
"'
3
3 %
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
*
*
*
*
*
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
'
-
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
!3 ""$
!3 !#%
!3
!3 "%
!3
!3
!3
%
!3 $#
!3
!3
!3 !%
!3 ""
3 % #
3 " !
3% $
3%$$
3%#%#
3% $!
3$ %
3$$"#
3$$ %
3$"
3$
3$ %
3$ !
3# #
3#%
3#%!
3# !
3"# $
3""$$
3""!#
3""
3"" $
3"! "
3"
3!%"$
3!% "
3!"
3!!"!
3! "$
3!
3!
3
!
3 !!
3 !
3
3
3 # "
3 #$
3 !%
3 "
3 !
3
"
3 #!
3
3 #
3 ! $
3 #!
3
3
%
3
3
3
!
3 %
3%% "
3%% %
3$ "#
3$$
3$###
3$"#
3$ $
3# %
3# %$
3"
3"$!%
3"$!%
3!$%#
3!""%
3! $"
'
!'
%'
()*
()*
%(
$(
(
"'
(
#()*
'
!'
'
'
(
"'
%'
(
(
$'
()*
'
(
'
(
%(
'
()*
'
%'
%(
(
()*
!(
$()*
()*
!'
%()*
()*
(
"(
$()*
'
#()*
'
%()*
$'
'
!()*
"()*
'
()*
'
(
(
'
"'
'
'
$'
%(
#(
(
(
$(
()*
(
(
'
$'
"(
'
(
!(
$(
'
"(
#'
'
>
>
>
>
/
/
/
'
?
?
?
?
?
?
(
(
(
(
(
(
(
(
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
3 "$%
3 % "
3 " #
3 $ "
3 % %
3 % %
3
3
3%$
3%$
3%$
3%$
3 % "
3 ! !
3 $ "
3% $
3% $
3$!"$
3$!"$
3$!"$
3$!"$
3$!"$
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
#'
%'
'
(
#(
%'
%(
(
'
'
"(
#(
!(
(
(
(
#'
(
$(
"(
!(
!'
"()*
'
!'
'
"(
!(
!()*
(
%(
"'