Isolasi dan Karakterisasi cDNA Gen Penyandi Metallothionein Tipe 2 dari Melastoma malabatrhicum L.

ISOLASI DAN KARAKTERISASI cDNA GEN PENYANDI
METALLOTHIONEIN TIPE 2 DARI Melastoma malabathricum L.

THESIAWATY DIAN FAUZIAH

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009

Lampiran 1 Hasil sekuensing dengan mesin sekuensing otomatis ABI PRISM 310 Genetic Analyzer

12

Lanjutan Lampiran 1

13

14
Lampiran 2 Hasil pengurutan sisipan pada pGEM®-T Easy menggunakan primer T7

TATGGCCGAACTTTCTCTTGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCG
GGAATTCGATTTCGAGAAAAATGTCTTGCTGTGGAGGAAACTGC
GGATGTGGATCTGGCTGCAAGTGCGGCAACGGTTGTGGAGGTTG
CAAAATGTACCCTGACTTGGGATTCTCCGGCGAGACAACCACAA
CTGAGACTTTTGTCTTGGGCGTTGCACCGGCGATGAAGAATCAG
TACGAGGCTTCAGGGGAGAGTAACAACGCTGAGAACGATGCTTG
CAAGTGTGGATCTGACTGCAAGTGTGATCCTTGCACCTGCAAGT
GAAGAATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATA
TGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTA
TAGTGTCACCTAAATAGCTTAA

Keterangan.
: bagian dari DNA vektor
: primer Mt2F dan Mt2R
: situs pemotongan EcoR1
: DNA sisipan

15
Lampiran 3 Hasil analisis kesejajaran urutan nukleotida cDNA MmMt2 dengan data gen di

GeneBank menggunakan program BLASTn
Accession

Source

Max
score

Total
score

Query
coverage

E value

Max
ident

NM_111773.3

Arabidopsis thaliana MT2A
(METALLOTHIONEIN 2A) (MT2A)
mRNA, complete cds

444

444

100%

6e-122

100%

U15108.1

Arabidopsis thaliana metallothioneinlike protein (AtMT-K) mRNA, complete
cds

444

444

100%

6e-122

100%

X62818.1

A.thaliana AtMT-1 mRNA for
metallothionein-like protein

439

439

100%

3e-120

99%

Y10850.1

Brassica juncea mRNA for
metallothionein-like protein type 2,
clone mt2-18

334

334

100%

8e-89

90%

AC011436.7

Arabidopsis thaliana chromosome III
BAC F3L24 genomic sequence,
complete sequence

331

449

100%

1e-87

100%

DQ244693.1

Zea mays clone 10085 mRNA

sequence

325

325

100%

4e-86

89%

D78498.1

Brassica rapa mRNA for
metallothionein-like protein, complete
cds

325

325

100%

4e-86

89%

D11394.1

Arabidopsis thaliana AtMT-1G gene for
324
metallothionein-like protein, complete
cds

437

100%

1e-85

99%

D78494.1

Brassica rapa mRNA for
metallothionein-like protein, complete
cds

320

320

100%

2e-84

89%

L31940.1

Brassica campestris L. ssp pekinensis
(clone bif98) metallothionein-like protein 316
mRNA, complete cds

316

100%

2e-83

88%

AF200712.1

Brassica oleracea cultivar Green King
metallothionein-like protein 2 (MT2)
mRNA, complete cds

307

307

97%

1e-80

88%

AY333930.1

Pringlea antiscorbutica metallothionein271
like protein type 2 mRNA, complete cds

271

100%

8e-70

84%

AY847455.1

Thlaspi caerulescens metallothionein
class II (MT2) mRNA, complete cds

264

264

100%

1e-67

83%

Y10852.1

Brassica juncea mRNA for
metallothionein-like protein type 2,
clone mt2-25

253

253

100%

2e-64

82%

Y10849.1

Brassica juncea mRNA for
metallothionein-like protein type 2,
clone mt2-4

253

253

100%

2e-64

82%

Y10851.1

Brassica juncea mRNA for
metallothionein-like protein type 2,
clone mt2-22

246

246

98%

3e-62

82%

Y10853.1

Brassica juncea mRNA for
metallothionein-like protein type 2,
clone mt2-28

232

232

98%

7e-58

81%

NM_120316.2

Arabidopsis thaliana MT2B
(METALLOTHIONEIN 2B) (MT2B)
mRNA, complete cds

224

224

100%

1e-55

79%

AK227568.1

Arabidopsis thaliana mRNA for
metallothionein 2b, complete cds,
clone: RAFL14-16-I02

224

224

100%

1e-55

79%

AF339712.1

Arabidopsis thaliana putative
metallothionein 2b protein (At5g02380) 224
mRNA, complete cds

224

100%

1e-55

79%

EU280163.1

Vitis vinifera metallothionein (MT)
mRNA, complete cds

159

159

100%

4e-36

75%

AF201384.1

Petunia x hybrida putative

159

159

97%

4e-36

76%

16
Accession

Source

Max
score

Total
score

Query
coverage

E value

Max
ident

metallothionein-like protein (Mt2)
mRNA, complete cds
DQ132853.1

Nicotiana tabacum metallothionein-like
158
protein mRNA, complete cds

158

97%

1e-35

75%

EF421200.1

Nelumbo nucifera metallothionein-like
protein class II (MT) mRNA, complete
cds

154

154

100%

2e-34

74%

DQ178618.1

Arachis hypogaea type 2
metallothionein (MT2c) mRNA,
complete cds

152

152

100%

5e-34

74%

DQ178617.1

Arachis hypogaea type 2
metallothionein (MT2b) mRNA,
complete cds

152

152

100%

5e-34

74%

AJ309387.1

Atropa belladonna mRNA for putative
metallothionein-like protein type 2B

152

152

97%

5e-34

76%

EF564345.1

Sesbania drummondii metallothionein
type 2 (MT2) mRNA, complete cds

149

149

100%

7e-33

74%

AJ879116.1

Capsicum chinense mRNA for
metallothionein-like protein (mtb gene)

145

145

100%

8e-32

74%

U11256.1

Arabidopsis thaliana Columbia ecotype
metallothionein (MT2b) gene, complete 141
cds

227

100%

1e-30

89%

AB176559.1

Glycine max MET mRNA for type 2
metallothionein, complete cds

140

140

100%

3e-30

73%

AJ297968.1

Atropa belladonna mRNA for
methallothioneine-like protein (mt2B
gene)

140

140

97%

3e-30

74%

L02306.1

Ricinus communis metallothionein
(RCMIT) mRNA, complete cds

138

138

53%

1e-29

84%

EF157297.1

Salix matsudana metallothionein-like
protein MT2A mRNA, complete cds

136

136

100%

4e-29

73%

CU227084.1

Populus EST from severe droughtstressed leaves

134

134

58%

1e-28

80%

17
Lampiran 4 Hasil analisis kesejajaran urutan asam amino deduksi dari cDNA MmMt2 dengan data
protein di GeneBank menggunakan program BLASTp
DB:ID

Source

UNIPROT:MT2
A_ARATH

Metallothionein-like protein
2A OS=Arabidopsis thaliana
GN=MT2A PE=2 SV=2
Metallothionein-like protein
type 2 OS=Brassica rapa
PE=3 SV=1
Metallothionein-like protein
type 2, MT2-18 OS=Brassica
juncea PE=3 SV=1
Metallothionein class II
OS=Thlaspi caerulescens
GN=MT2 PE=4 SV=1
Metallothionein-like protein
BIF98 OS=Brassica rapa
subsp. pekinensis PE=3
SV=1
Metallothionein-like protein 2
OS=Brassica oleracea
GN=MT2 PE=4 SV=1
Metallothionein-like protein
type 2 OS=Pringlea
antiscorbutica PE=4 SV=1
Metallothionein-like protein
type 2, MT2-4/MT2-25
OS=Brassica juncea PE=3
SV=1
Metallothionein-like protein
type 2, MT2-28 OS=Brassica
juncea PE=3 SV=1
Metallothionein-like protein
type 2, MT2-22 OS=Brassica
juncea PE=3 SV=1
Metallothionein 2b
OS=Arabidopsis thaliana
GN=At5g02380 PE=4 SV=1
Metallothionein-like protein
2B OS=Arabidopsis thaliana
GN=MT2B PE=2 SV=1
Metallothionein 2b
OS=Arabidopsis thaliana
PE=4 SV=1
Metallothionein-like protein
class II OS=Nelumbo nucifera
GN=MT PE=4 SV=1
Metallothionein-like protein
(Type 2 metallothionein)
OS=Arachis hypogaea
GN=MT2d PE=4 SV=1
Type 2 metallothionein
OS=Glycine max GN=MET
PE=4 SV=1
Metallothionein OS=Glycine
max PE=4 SV=1
Type 2 metallothionein
OS=Arachis hypogaea
GN=MT2a PE=4 SV=1
Type 2 metallothionein
OS=Arachis hypogaea
GN=MT2c PE=4 SV=1
Type 2 metallothionein
OS=Phaseolus aureus
GN=MET PE=4 SV=1
Chrom osom e chr8
scaffold_23, whole genome
shotgun sequence
(Metallothionein) OS=Vitis

UNIPROT:MT2
_BRARA
UNIPROT:MT2
2_BRAJU
UNIPROT:A9U
KL1_THLCA
UNIPROT:MT2
_BRARP

UNIPROT:Q9M
697_BRAOL
UNIPROT:Q7X
AF3_PRIAN
UNIPROT:MT2
1_BRAJU

UNIPROT:MT2
5_BRAJU
UNIPROT:MT2
3_BRAJU
UNIPROT:Q0W
TI6_ARATH
UNIPROT:MT2
B_ARATH
UNIPROT:Q8L
DX5_ARATH
UNIPROT:A3F
PG0_NELNU
UNIPROT:Q45
W72_ARAHY

UNIPROT:Q75
NI1_SOYBN
UNIPROT:Q7M
213_SOYBN
UNIPROT:Q45
W73_ARAHY
UNIPROT:Q3L
TN2_ARAHY
UNIPROT:Q75
NI3_PHAAU
UNIPROT:A7P
NM4_VITVI

Length

Score

Identity
%

Positives
%

81

482

100

100

3e-47

80

443

93

95

1e-42

80

443

93

95

1e-42

81

439

91

95

3e-42

80

438

92

93

4e-42

80

428

90

92

5e-41

80

414

88

92

2e-39

80

403

86

91

4e-38

80

397

83

91

2e-37

80

392

82

90

8e-37

77

376

80

85

6e-35

77

376

80

85

6e-35

77

368

79

83

5e-34

80

345

71

79

2e-31

81

340

70

82

9e-31

79

337

70

83

2e-30

79

335

70

81

3e-30

80

333

67

80

6e-30

80

333

67

80

6e-30

79

329

69

80

2e-29

79

328

70

76

2e-29

E()

18

UNIPROT:Q75
NH9_PHAAN
UNIPROT:A5G
ZZ9_9ROSI
UNIPROT:A1Z0
N9_9ROSI
UNIPROT:MT2
B_SOLLC

UNIPROT:A5JS
U2_9FABA
UNIPROT:O04
688_MESCR
UNIPROT:Q94I
87_ATRBE
UNIPROT:MT2
_CICAR
UNIPROT:MT1
_COFAR
UNIPROT:Q9F
R40_PETHY
UNIPROT:A1Z0
P0_9ROSI
UNIPROT:Q5D
UH5_CAPCH
UNIPROT:Q6P
ML4_POPJC
UNIPROT:Q6L
8H8_9ASTR

UNIPROT:A9Y
TZ1_SOLTU
UNIPROT:Q9Z
RV0_FAGSY
UNIPROT:B3V
KV4_SOLNI
UNIPROT:B3V
KV3_SOLNI
UNIPROT:Q6P
ML3_POPJC
UNIPROT:A5J0
91_9ROSI
UNIPROT:A9P
ES1_POPTR
UNIPROT:MT2
_ACTDE
UNIPROT:MT2
_RICCO

vinifera GN=MT PE=4 SV=1
Type 2 metallothionein
OS=Phaseolus angularis
GN=MET PE=4 SV=1
Metallothionein
OS=Bruguiera gymnorhiza
PE=4 SV=1
Metallothionein-like protein
MT2A OS=Salix matsudana
PE=4 SV=1
Metallothionein-like protein
type 2 B OS=Solanum
lycopersicum GN=MTB PE=2
SV=1
Metallothionein type 2
OS=Sesbania drummondii
GN=MT2 PE=4 SV=1
Metallothionein
OS=Mesembryanthemum
crystallinum PE=4 SV=1
Putative metallothionein-like
protein type 2B OS=Atropa
belladonna PE=4 SV=1
Metallothionein-like protein 2
OS=Cicer arietinum PE=3
SV=2
Metallothionein-like protein 1
OS=Coffea arabica
GN=METAL1 PE=3 SV=1
Putative metallothionein-like
protein OS=Petunia hybrida
GN=Mt2 PE=4 SV=1
Metallothionein-like protein
MT2B OS=Salix matsudana
PE=4 SV=1
Metallothionein-like protein
OS=Capsicum chinense
GN=mtb PE=4 SV=1
Metallothionein 2a
OS=Populus jackii GN=MT2a
PE=4 SV=1
Metallothionein 2
(Metallothionein-like protein
type 2) OS=Codonopsis
lanceolata GN=MTII PE=4
SV=1
Metallothionein-like protein
OS=Solanum tuberosum
PE=4 SV=1
Metallothionein-like protein
class II OS=Fagus sylvatica
PE=4 SV=1
Type 2 metallothionein
OS=Solanum nigrum
GN=MT2b PE=4 SV=1
Type 2 metallothionein
OS=Solanum nigrum
GN=MT2a PE=4 SV=1
Metallothionein 2b
OS=Populus jackii GN=MT2b
PE=4 SV=1
Metallothienein-like protein
OS=Kandelia candel PE=4
SV=1
Putative uncharacterized
protein OS=Populus
trichocarpa PE=4 SV=1
Metallothionein-like protein
type 2 OS=Actinidia deliciosa
GN=pKIWI504 PE=2 SV=1
Metallothionein-like protein
type 2 OS=Ricinus communis
GN=MTI PE=3 SV=1

79

327

69

80

3e-29

79

327

69

77

3e-29

79

327

69

77

3e-29

82

324

70

78

6e-29

79

323

69

77

8e-29

80

322

67

74

1e-28

81

321

73

80

1e-28

79

321

66

79

1e-28

80

321

64

72

1e-28

80

320

66

76

2e-28

78

319

70

80

2e-28

81

318

65

73

3e-28

79

317

66

75

4e-28

78

317

64

75

4e-28

82

317

69

76

4e-28

79

314

66

75

9e-28

82

314

68

75

9e-28

82

314

68

75

9e-28

78

312

67

80

2e-27

79

312

66

75

2e-27

78

311

67

80

2e-27

78

311

69

75

2e-27

80

310

69

74

3e-27

19
UNIPROT:Q93
X22_QUESU
UNIPROT:Q6P
W24_CYNDA
UNIPROT:Q5U
7K6_9POAL

Metallothionein-like protein
OS=Quercus suber GN=mt
PE=4 SV=1
Metallothionein-like protein
OS=Cynodon dactylon PE=4
SV=1
Metallothionein-like protein
OS=Saccharum hybrid
cultivar PE=4 SV=1

77

309

66

76

3e-27

81

309

62

75

3e-27

81

309

65

75

3e-27

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tanaman memiliki beberapa mekanisme
toleransi terhadap Al antara lain melalui
immobilisasi Al di dinding sel, induksi pH di
daerah rizosfer, permeabilitas selektif
membran sel, kompartementasi Al di
vakuola, eksudasi ligan dan asam organik
pengkelat, dan induksi sintesis protein
pengkelat Al (Taylor 1991). Richards et al.
(1998) berhasil mengisolasi gen-gen dari
Arabidopsis thaliana yang ekspresinya
terinduksi oleh cekaman Al, yaitu gen-gen
penyandi glutathione s transferase (GST),
peroksidase, superoksida dismutase (SOD),
dan metallothionein.
Metallothionein
(MT)
merupakan
protein dengan berat molekul rendah (4-8
kDa), kaya akan sistein (25-33%), tidak
memiliki asam amino aromatik, bersifat
mengikat logam berat, serta diketahui
berperan dalam homeostasis dan detoksifikasi
ion-ion logam (Wong et al. 2004). Pada
tanaman, pengaruh ion logam pada ekspresi
gen Mt bervariasi tergantung jenis tanaman
dan tipe protein MT (Garcia-Hernandez et al.
1998). Berdasarkan klasifikasi Cobbet dan
Goldsbrough (2002), MT dibagi menjadi
empat tipe berdasarkan komposisi urutan
asam amino sistein (Cys). MT tipe 1 terdiri
atas dua domain dengan motif pengikatan
logam Cys-X-Cys (-X- merupakan asam
amino selain Cys). Pada Arabidopsis, MT1
berperan dalam homeostasis Cu pada akar
(Guo et al. 2008). MT tipe 2 memiliki
komposisi Cys-Cys pada asam amino ketiga
dan keempat dari sekuen asam aminonya,
serta memiliki motif Cys-Gly-Gly-Cys pada
ujung N-terminal dan motif Cys-X-Cys pada
ujung C-teminal. MT2 merupakan MT
pertama pada tanaman yang diisolasi (Kagi
1991). Pada tanaman Arabidopsis, MT2
ditemukan terutama pada daun tua dan
terlibat dalam mekaninsme sinyal ROS
(Reactive Oxygen Species) (Wong et al.
2004). Perlakuan menggunakan tembaga (Cu)
meningkatkan transkripsi MT2 ini (van Hoof
et al. 2001). Begitu pula pada Piper nigrum
(black pepper), transkripsi MT2 dideteksi
terutama pada daun tuanya. Ekspresi Mt2
yang tinggi pada daun terutama pada trikoma
yang berhubungan dengan fungsi sekretori
adalah untuk mengeksudasi kelebihan
akumulasi logam berat di daun (GarciaHernandez et al. 1998). Transkripsi MT2 P.
nigrum ini meningkat dengan perlakuan
menggunakan Cd, Fe, Cu, Mn, dan Zn

(Ozkuthu et al. 2006). MT tipe 3 yang sering
disebut sebagai fitokelatin (PC) memiliki
empat asam amino Cys pada N-terminal. Tiga
Cys pertama membentuk motif Cys-GlyAsn-Cys-Asp-Cys. Sedangkan Cys keempat
membentuk motif Gln-Cys-X-Lys-Lys-Gly.
Pada C-terminal terdapat enam asam amino
Cys yang membentuk tiga motif Cys-X-Cys.
MT3 berperan dalam transpor Cd dari akar ke
pucuk dalam mekanisme pengurangan
kelebihan akumulasi Cd di akar (Guo et al.
2008). Sedangkan MT tipe 4 memiliki tiga
wilayah yang masing-masing memiliki 5
sampai 6 Cys dan biasanya membentuk motif
Cys-X-Cys. MT4 berperan dalam toleransi
dan akumulasi yang tinggi terhadap Zn (Guo
et al. 2008).
Melastoma malabathricum L. merupakan
tumbuhan yang tersebar di hutan hujan tropis
di Asia Tenggara. Tumbuhan ini dapat
menyerap dan mengakumulasi
Al pada
jaringan mesofil dan epidermis atas daun,
serta pada seluruh jaringan akar terutama
pada sel-sel epidermis dan endodermisnya
(Watanabe et al. 1998). Menurut Chenery
(1948) dalam Watanabe et al. (1998),
tumbuhan yang dapat mengembangkan
mekanisme pertahanan dan mengakumulasi
lebih dari 1000 mg/kg Al didefinisikan
sebagai akumulator Al. Watanabe et al.
(1998) juga berhasil mengukur akumulasi Al
dalam pucuk daun, daun muda, daun tua, dan
ujung akar M. malabathricum, yaitu masingmasing sebesar 8.0, 9.2, 14.4, dan 10.1 mg/g
berat basah daun.
Pada M. malabatrichum, MT diduga
berperan dalam detoksifikasi ion logamlogam berat, termasuk Al. Berdasarkan
peranan MT tersebut, maka isolasi dan
karakterisasi dari cDNA gen penyandi Mt2
dari tanaman M. malabatrichum penting
dilakukan untuk memahami peran MT2
khususnya dalam ketahanan terhadap
cekaman Al. Suharsono et al. (in press) telah
berhasil mengisolasi metallothionein tipe 2
dari
Melastoma
affine.
MT2
M.
malabatrichum diduga memiliki fungsi yang
sama dengan MT2 M. affine karena kedua
tumbuhan ini toleran terhadap cekaman Al.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan
mengkarakterisasi cDNA dari gen penyandi
metallothionein tipe 2 dari tumbuhan M.
malabathricum.

2

BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Kegiatan penelitian dilaksanakan mulai
bulan Desember 2007 sampai dengan
Oktober
2008
di
Laboratorium
Biotechnology Research Indonesia – The
Netherlands (BIORIN) dan Laboratorium
Biologi Molekuler dan Seluler Tanaman
Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan
Bioteknologi, Kampus IPB Darmaga, Bogor.
Bahan
Daun M. malabathrichum digunakan
sebagai bahan tumbuhan. Plasmid pGEM®-T
Easy (Gambar 1) digunakan sebagai vektor
pengklonan dan Escherichia coli galur DH5
digunakan sebagai inang vektor rekombinan.

®

Gambar 1 Peta fisik plasmid pGEM -T Easy.
Primer aktin ActF (ATGGCAGATGCC
GAGGATAT) dan ActR (CAGTTGTGCGA
CCACTTGCA) digunakan untuk verifikasi
cDNA, primer spesifik Mt2F (TCGAGAAA
AATGTCTTGCTGTG) dan Mt2R (CTTCAC
TTGCAGGTGCAAGG)
yang
didesain
berdasarkan cDNA Arabidopsis thaliana
(Nomor aksesi: AY037263) digunakan untuk
mengisolasi cDNA Mt2 dari
M.
malabatrichum.
Metode
Isolasi RNA total dari daun
Semua alat dan media yang digunakan
untuk isolasi RNA total disterilkan
(diautoklaf pada 121 °C 20 menit), ddH2O
yang digunakan diperlakukan dengan 0.1%
(v/v) DEPC (Diethylpirocarbonate) dan
disterilkan.
RNA total diisolasi dari daun muda M.
malabathricum
dengan
menggunakan
prosedur LiCl (Chang et al. 1993) yang
dimodifikasi. Sebanyak 0.5 gram daun yang
telah dipisahkan dari tulang daunnya digerus
sampai halus bersama 0.3 gram pasir kuarsa,
lau ditambahkan 3 ml buffer ekstraksi [2%
CTAB (hexadecyl trimethyl amonium

bromide), 2% PVP (Polyvinyl pirolidon), 100
mM Tris-HCl pH 8, 25 mM EDTA, 2 M
NaCl, dan 100mM -merkaptoetanol] yang
bersuhu 65 °C dan digerus hingga halus, lalu
dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml dan
diinkubasi pada 65 °C 10 menit sambil
dibolak-balik, ditambahkan 1x volume CI
(kloroform:isoamilalkohol
24:1),
lalu
divorteks sebentar dan disentrifugasi 10000
rotasi per menit (rpm) pada 4 °C 10 menit
(Jouan BR4i). Supernatan ditambah 1/4 kali
volume LiCl 10 M dan diinkubasi pada suhu
–20 °C selama 2 jam, lalu disentrifugasi
10000 rpm pada 4 °C 20 menit. Endapan
yang terbentuk ditambah 400 l TE (10 mM
Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA pH 8) dan
diekstraksi dengan 1x volume fenol pH 9,
divorteks sebentar lalu disentrifugasi 10000
rpm pada 20 °C 10 menit. Supernatan
ditambah 1/4 kali volume LiCl 10 M dan
diinkubasi pada –20 °C selama 2 jam.
Larutan kemudian disentrifugasi 10000 rpm
pada 4°C 10 menit. Endapan selanjutnya
dicuci
dengan
etanol
70%
(v/v),
disentrifugasi,
dikeringudarakan,
lalu
diresuspensi dengan 20 l air DEPC.
Kuantifikasi dan kualifikasi RNA total
Kuantitas RNA total hasil isolasi
ditentukan dengan spektrofotometer UV-VIS
(Cecil CE 2020) pada panjang gelombang
260 dan 280 nm. Konsentrasi RNA
ditentukan dengan penyetaraan bahwa satu
satuan absorban pada panjang gelombang 260
nm sebanding dengan 40 g/ml RNA.
Kemurnian RNA total diukur melalui
perbandingan absorban panjang gelombang
260 nm dengan 280 nm, yaitu antara 1.8
sampai 2 (Sauders & Parker 1999).
Kualitas RNA ditentukan dengan
elektroforesis pada gel agarosa 1% (b/v)
(Sigma, Germany) dengan larutan penyangga
MOPS [4.2/l gram MOPS (3-Morpholino
propanesulfonic acid), 0.41 g/l Na-asetat,
0.37 g/l EDTA(2NA)H2O]. Sebanyak 1 l
RNA dicampur dengan 12 l larutan premiks
[5% 20 kali MOPS, 50% (v/v) formamida,
17.5% (v/v) formaldehid, 27.5% (v/v) air
DEPC] dipanaskan pada 65 °C 10 menit,
didinginkan di es selama 5 menit, dan diberi
1/6 kali volume loading dye [0.25% (b/v)
bromphenol blue, 0.25% (b/v) xylene cyanol
FF, 30% (v/v) gliserol], kemudian
dielektroforesis pada tegangan 100 volt
selama 30 menit. Visualisasi RNA dilakukan
di atas UV transluminator GelDoc (Labquip)
setelah direndam dalam EtBr (0.5 g/ml)
selama 5 menit.

3

Sintesis cDNA
Sintesis cDNA dilakukan melalui reaksi
transkripsi balik menggunakan Superscript III
Reverse
Transcriptase
(Invitrogen).
Komposisi reaksi sintesis cDNA ialah 5 g
RNA total, 1x RT buffer, 20 pmol primer
oligo-dT, 4 mM dNTP, 10 mM DTT, 40 U
enzim Superscript TMIII RTase, dan air DEPC
dengan volume reaksi 20 l. Kualitas cDNA
diperiksa menggunakan PCR dengan primer
spesifik aktin. Komposisi reaksi PCR-aktin
tersebut ialah 0.5 l cDNA, 1 l buffer Taq
(Gen Scr Inc.), 0.2 mM dNTP, 10 pmol
primer ActF, 10 pmol primer ActR, 4 % (b/v)
DMSO (dimetilsulfoksida), 0.5 U enzim Taq
DNA polimerase (Gen Scr Inc.), dan ddH2O
hingga volume akhir 10 l. PCR dilakukan
dengan kondisi pra-PCR pada 95 °C 5 menit,
denaturasi pada 94 °C 30 detik, penempelan
primer pada 55 °C 30 detik, dan pemanjangan
pada 72 °C 1.5 menit sebanyak 35 siklus,
pasca-PCR pada 72 °C 5 menit, dan inkubasi
pada 15 °C 10 menit.
Amplifikasi fragmen cDNA MmMt2
dengan primer spesifik
cDNA Mt2 dari M. malabatrichum
(MmMt2) diisolasi dan
diamplifikasi
menggunakan PCR dengan primer spesifik
Mt2. Sebanyak 1 l hasil reaksi RT ditambah
dengan 2 l 10x Taq buffer, 0.2 mM dNTP, 4
% (b/v) DMSO, 20 pmol primer Mt2F, 20
pmol primer Mt2R, 0.5 U enzim taq DNA
polimerase (Gen Scr Inc.), dan dH2O hingga
volume akhir 20 l. Reaksi PCR dilakukan
dengan kondisi pra-PCR pada 95 °C 5 menit,
denaturasi pada 94 °C 30 detik, penempelan
primer pada 58 °C 30 detik, pemanjangan
pada 72 °C 1.5 menit sebanyak 35 siklus,
pasca-PCR pada 72 °C 5 menit, dan inkubasi
pada 15°C 10 menit.
Pengklonan cDNA MmMt2 ke dalam
pGEM®-T Easy
Sebelum di klon ke dalam inang, cDNA
MmMt2 diligasikan ke dalam vektor
menggunakan prosedur Promega (1996).
Komposisi reaksi ligasi ialah 2 µl 5x buffer
rapid ligase, 1 µl pGEM®-T Easy (10 ng), 1
µl ml T4 DNA ligase (3 U/µl) (Promega),
dan 3 µl produk PCR, kemudian diinkubasi
pada 4 °C selama semalam. Hasil ligasi
diintroduksikan ke dalam E.coli galur DH5
menggunakan metode yang dipublikasikan
Suharsono (2002).

Seleksi koloni E. coli yang mengandung
vektor rekombinan
Seleksi yang digunakan ialah seleksi
resistensi terhadap ampisilin dan seleksi biruputih. Sebanyak 50
l bakteri hasil
transformasi dicawansebarkan pada media 15
ml LB padat [1% bakto tripton, 0.5 %
ekstrak khamir, 1% NaCl, 2.5 % agar (b/v)]
yang mengandung 100 mg/l ampisilin, 10 l
100 mM isopropiltio- -galaktosida (IPTG),
dan 50 l 2% (b/v) X-gal (5-bromo-4chloro-3-indolyl- -D-galactoside), kemudian
diinkubasi pada 37 °C selama semalam.
Koloni putih yang tumbuh kemudian diambil
menggunakan tusuk gigi steril dan digores
pada LB padat dengan ampisilin untuk stok
dan sisa goresannya digunakan sebagai bahan
cetakan PCR untuk mendeteksi keberadaan
sisipan cDNA MmMt2 dalam vektor
rekombinan.
Sisa
goresan
tersebut
disuspensikan ke dalam 6.5 l ddH2O,
dipanaskan pada 95 °C 10 menit, dan
didinginkan pada 15 °C 5 menit. Suspensi
ditambah dengan 1 l 10x buffer taq, 0.2 mM
dNTP, 4 % (b/v) DMSO, 20 pmol primer
Mt2F, 20 pmol primer Mt2R, 0.5 U enzim
taq DNA polimerase (Gen Scr Inc.) dengan
volume akhir 10 l. PCR dilakukan pada
kondisi yang sama dengan amplifikasi
fragmen cDNA MmMt2.
Analisis cDNA sisipan
Plasmid pGEM®-T Easy rekombinan
yang terdapat dalam koloni putih hasil seleksi
biru-putih diisolasi menggunakan prosedur
yang dipublikasikan oleh Suharsono (2002)
dan Anwar (2008). Plasmid rekombinan yang
telah diisolasi dikeluarkan sisipannya dengan
pemotongan menggunakan enzim EcoR1
(Promega Inc.). Sebanyak 100 ng DNA
plasmid dicampur dengan 10 U enzim
restriksi EcoR1, buffer 1x, dan ddH2O
sampai volume akhir 20 l, kemudian
diinkubasi pada 37 °C selama 8 jam.
Pengurutan DNA dan analisisnya
Pengurutan DNA menggunakan DNA
Sequencer ABI Prism model 310 versi 3.7.
Selanjutnya, urutan
cDNA
dianalisis
homologinya menggunakan program BLAST
(basic local alignment search tools)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/).
Deduksi asam amino fragmen MmMt2
menggunakan program translation dari
EXPASY (http://www.expasy.ch/tools/dna/).
Analisis keberadaan situs restriksi dalam
cDNA
MmMt2
dilakukan
dengan
menggunakan program NEBcutter ver.2.0

4
1
(http://www.tools.neb.com/NEBcutter2/htm).
Analisis kesamaan, filogenetik, dan profil
berdasarkan urutan nukleotida dan deduksi
asam amino dengan Mt2 dari spesies lain
menggunakan program MAFFT ver.6.0.
(http://align.bmr.kyushu-.ac.jp/mafft/online/
server/) (Katoh et al. 2005). Analisis urutan
nukleotida untuk mencari ORF (open reading
frame) menggunakan program BESTORF
(http://www.softberry/bestorf/).
Analisis
domain terkonservasi pada cDNA MmMt2
menggunakan program conserved domain
NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.
gov/
structure/cdd/wrpsb.cgi).

HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Isolasi RNA total dari daun
RNA total dari M. malabatrichum
berhasil diisolasi dari daun
muda.
Kuantifikasi
RNA
total
dengan
spektrofotometer pada 260 menunjukkan
bahwa total RNA yang berhasil diisolasi
berkisar antara 242-360 g setiap gram bahan
tanaman (Tabel 1).
Tabel 1 Hasil isolasi RNA total
No

1

2
3

Bahan
0.5 g daun
muda
(MD1)
0.5 g daun
muda
(MD2)
0.5 g daun
muda
(MD3)

Absorban
pada
260

280

Rasio
260/
280

0.451

0.265

1.70

Total
RNA
( g/g
sampel)
360.4

2

3

28S
18S
Gambar 2 Elektroforesis RNA total dari daun
muda MD1 (1), MD2 (2), dan MD3
(3).

Sintesis cDNA
PCR dengan primer spesifik gen aktin
digunakan sebagai kontrol untuk melihat
keberhasilan sintesis cDNA dan kemurnian
RNA total dari hasil reaksi RT. PCR dengan
menggunakan primer untuk ekson1-ekson2
dari gen aktin (ActF dan ActR) dan
menggunakan cetakan cDNA, menghasilkan
pita DNA yang berukuran sekitar 450 pb
(Gambar 3).
M
1
2
3
450 pb

Gambar 3 Hasil PCR aktin menggunakan cDNA
total MD1 (1), MD2 (2), dan MD3 (3)
sebagai cetakan.

Amplifikasi fragmen cDNA MmMt2
dengan primer spesifik
Amplifikasi fragmen cDNA MmMt2
dilakukan dengan menggunakan cDNA total
dari daun (cDNA MD2) sebagai cetakan dan
primer spesifik Mt2F dan Mt2R. Hasilnya
ialah satu fragmen cDNA yang berukuran
sekitar 250 pb (Gambar 4).
M MmMt2

0.303

0.162

1.87

242.4

0.315

0.190

1.66

252.0

Kualitas RNA total dianalisis dengan
melakukan elektroforesis di gel agarosa
terdenaturasi oleh formaldehida dengan
buffer MOPS 1x. Hasil elektroforesis tersebut
menunjukkan adanya 2 pita dominan yang
merupakan RNA ribosomal (rRNA) 28S dan
18S (Gambar 2).

250 pb
Gambar

4

Fragmen MmMt2 hasil PCR
menggunakan cDNA MD2 sebagai
cetakan.

Pengklonan cDNA MmMt2 ke dalam
pGEM®-T Easy
Setelah 16 jam di media seleksi, E.coli
yang ditransformasi dengan hasil ligasi antara
pGEM®-T Easy dan cDNA MmMt2
menghasilkan koloni putih dan biru (Gambar
5).

15

koloni putih
koloni biru
Gambar

5

1 M

Koloni E. coli
DH5
yang
ditransformasi dengan hasil ligasi
pGEM®-T Easy
dan cDNA
MmMt2 yang tumbuh di media
seleksi
yang
mengandung
ampisilin, X-gal dan IPTG.

cDNA MmMt2 yang menyisip pada
pGEM®-T Easy di dalam koloni E. coli putih
dikonfirmasi dengan PCR yang selanjutnya
disebut PCR koloni. PCR koloni terhadap
koloni
putih
menghasilkan
fragmen
berukuran sekitar 250 pb yang sama dengan
cDNA MmMt2 hasil isolasi dengan PCR
(Gambar 6A). Selain itu, konfirmasi cDNA
sisipan juga dilakukan dengan pemotongan
DNA plasmid rekombinan yang telah
Analisis cDNA MmMt2
Berdasarkan urutan nukleotida dari
kodon awal (ATG) sampai dengan kodon
akhir, diperoleh cDNA MmMt2 yang
1

diisolasi dari koloni putih menggunakan
enzim EcoR1 yang mengapit daerah
penyisipan.
Pemotongan
tersebut
menghasilkan dua fragmen yaitu fragmen
berukuran sekitar 3000 pb yang merupakan
vektor pGEM®-T Easy dan fragmen
berukuran sekitar 250 pb (Gambar 6B).
M

2
3000 pb

250 pb

250 pb
A

B

Gambar 6 Hasil analisis sisipan cDNA
MmMt2 dengan PCR koloni
(A) dan pemotongan DNA
plasmid rekombinan dengan
EcoR1 (B).

berukuran 246 pb ORF yang menyandikan
81 asam amino dengan 14 Cys (Gambar 7).

1

ATG TCT TGC TGT GGA GGA AAC TGC GGA TGT GGA TCT GGC TGC AAG
Met Ser Cys Cys Gly Gly Asn Cys Gly Cys Gly Ser Gly Cys Lys

45
15

46
16

TGC GGC AAC GGT TGT GGA GGT TGC AAA ATG TAC CCT GAC TTG GGA
Cys Gly Asn Gly Cys Gly Gly Cys Lys Met Tyr Pro Asp Leu Gly

90
30

91
31

TTC TCC GGC GAG ACA ACC ACA ACT GAG ACT TTT GTC TTG GGC GTT
Phe Ser Gly Glu Thr Thr Thr Thr Glu Thr Phe Val Leu Gly Val

135
45

136
46

GCA CCG GCG ATG AAG AAT CAG TAC GAG GCT TCA GGG GAG AGT AAC
Ala Pro Ala Met Lys Asn Gln Tyr Glu Ala Ser Gly Glu Ser Asn

180
60

181
61

AAC GCT GAG AAC GAT GCT TGC AAG TGT GGA TCT GAC TGC AAG TGT
Asn Ala Glu Asn Asp Ala Cys Lys Cys Gly Ser Asp Cys Lys Cys

225
75

226
76

GAT CCT TGC ACC TGC AAG TGA
Asp Pro Cys Thr Cys Lys End

246

Gambar 7 Urutan nukleotida cDNA MmMt2 dari kodon awal (ATG) sampai dengan kodon akhir serta
deduksi asam aminonya.

Analisis keberadaan situs pemotongan
enzim restriksi pada cDNA MmMt2
menunjukkan bahwa pada cDNA MmMt2
mempunyai situs BbvI, BsaBI, BtsCI, TseI,
FokI, ApeKI, CspCI, HpyCH4III, PshAI,

BsrFI, SgrAI, AcuI, BtgZI, MboII, SfaNI,
Cac8I, danHpy188I (Gambar 8). Selain itu,
tidak ada situs restriksi yang terdapat pada
situs multi pengklonan (MCS: multiple
cloning sites). sites sites sites sites sites).

6
2

Gambar 8 Peta restriksi yang terdapat pada cDNA MmMt2.

Berdasarkan hasil analisis kesejajaran
lokal dengan program BLAST (Lampiran 4
dan 5), diambil Mt2 dari beberapa spesies
yang memiliki tingkat kesamaan (max indent)
lebih dari 70% termasuk MaMt2 dan GmMt2
(kedelai kultivar Slamet) untuk penyusunan
pohon filogenetik berdasarkan kesamaan
urutan nukleotida Mt2 dan deduksi asam
aminonya (Gambar 9 dan Gambar 10).
Berdasarkan pohon filogenetik tersebut,
cDNA MmMt2 memiliki kekerabatan yang
sangat dekat dengan AtMt2A dari Arabidopsis

thaliana, MaMt2 dari M. affine, GmMt2 dari
kedelai kultivar Slamet, BjMt2 dari Brassica
juncea, dan BoMt2 dari Brassica oleracea.
Selanjutnya, kelima spesies yang sangat dekat
kekerabatannya
tersebut
dianalisis
perbandingan motif asam amino Cys-nya
(Tabel 2) dan profil domain (Gambar 11).
MmMT2, AtMT2A, MaMT2, dan GmMT2
dimasukkan
dalam
satu
kelompok
(selanjutnya disebut kelompok MmMT2)
karena memiliki kesamaan urutan nukleotida
dan asam amino. dan asam amino.

Gambar 9 Pohon filogenetik berdasarkan urutan nukleotida dari Mt2 berbagai spesies.

27

Gambar 10 Pohon filogenetik berdasarkan urutan asam amino dari MT2 berbagai spesies.

Tabel 2 Perbandingan ORF dan motif asam amino Cys pada kelompok MmMT2 (MmMT2 dari M.
malabatrichum, AtMT2A dari A. thaliana, MaMT2 dari M. affine, dan GmMT2 dari kedelai
kultivar Slamet), BjMT2 dari B. juncea, dan BoMT2 dari B. oleracea

Kelompok
MmMT2

BjMT2

BoMT2

ORF aa 1
1 fragment(s)
1 – 246
1 aa
MSCCGGNCGCGSGCKCGNGCGGCKMYPDLGFSGETTTTETF
**
*x*
*x*
*xx*
VLGVAPAMKNQYEASGESNNAENDACKCGSDCKCDPCTCK*x*
*x* *x*
ORF aa 1
1 fragment(s)
1 – 243
80 aa
MSCCGGNCGCGSGCKCGNGCGGCKMYPDLGFSGESTTTETF
**
*x*
*x*
*xx*
VFGVAPAMKNQYEASGEGVAENDACKCGSDCKCDPCTCK*x*
*x*
*x*
ORF aa 1
1 fragment(s)
1 – 243
80 aa
MSCCGGNCGCGSGCKCGNGCGGCKMYPDLGFSGELTTTETF
**
*x*
*x*
*xx*
VFGVAPTMKNQHEASGEGVAENDACKCGSDCKCDPCTCE*x*
*x* *x*

38

1
2
Gambar 11 Perbandingan daerah domain asam amino terkonservasi antara MmMT2, MaMT2, GmMT2, dan
AtMT2A (1); serta BjMT2 dan BoMT2 (2).

Pembahasan
RNA total yang diisolasi dalam
penelitian ini mempunyai kemurnian dari
kontaminan protein yang baik karena
mempunyai rasio OD260/OD280 berkisar antara
1.66 dan 1.87. Menurut Saunders & Parker
(1999), rasio OD260/OD280 sebesar 1.8 sampai
2.0 menunjukkan RNA total yang diisolasi
mempunyai
kemurnian
yang
tinggi.
Berdasarkan rasio tersebut, maka MD2 yang
mempunyai tingkat kemurnian paling tinggi
selanjutnya digunakan sebagai cetakan untuk
sintesis cDNA total. Hasil elektroforesis
RNA total (Gambar 2) menunjukkan adanya
dua pita dominan. Hal ini menunjukkan
bahwa RNA total mempunyai integritas yang
baik.
RNA total yang berhasil diisolasi
digunakan sebagai cetakan untuk sintesis
cDNA melalui reaksi transkripsi balik
(reverse
transcription/RT).
Oligo(dT)
digunakan sebagai primer spesifik reaksi ini
supaya hanya mRNA yang disintesis dan
diamplifikasi menjadi cDNA karena ciri khas
mRNA ialah memiliki ujung poli-A. PCR
dengan primer spesifik gen aktin digunakan
sebagai kontrol untuk melihat keberhasilan
sintesis cDNA dan kemurnian RNA total dari
kontaminan DNA genom. Amplifikasi DNA
genom ekson1-ekson2 akan menghasilkan
fragmen berukuran sekitar 600 pb karena
intron yang terdapat antara ekson1 dan
ekson2 ikut teramplifikasi. Teramplifikasinya
cDNA dengan primer ActF dan ActR dengan
ukuran 450 pb tersebut menunjukkan bahwa
sintesis cDNA total melalui proses transkripsi
balik telah berlangsung dengan baik. Hal ini
juga membuktikan bahwa RNA total yang
telah diisolasi mempunyai kualitas yang baik
karena terbebas dari kontaminasi DNA
genom.
E. coli galur DH5
yang
ditransformasi dengan hasil ligasi cDNA
MmMt2 dengan pGEM®-T Easy diseleksi
dalam media yang mengandung ampisilin, Xgal, dan IPTG. E. coli yang tumbuh dalam
media seleksi tersebut disebut transforman

(mengandung vektor plasmid pGEM®-T
Easy). Koloni E. coli putih ialah E. coli yang
mengandung plasmid rekombinan (plasmid
pGEM®-T Easy yang membawa cDNA
MmMt2), sedangkan koloni biru ialah E. coli
yang mengandung plasmid nonrekombinan
(hanya mengandung plasmid pGEM®-T
Easy) (Gambar 5). Gen lacZ menyandikan galaktosidase ( -gal) yang mengubah substrat
X-gal menjadi berwarna biru. Bila cDNA
MmMt2 berhasil menyisip pada gen lacZ,
maka gen lacZ tidak dapat berekspresi
sehingga muncul koloni E. coli yang
berwarna putih. Bila tidak terdapat fragmen
yang menyisip pada gen lacZ, maka gen lacZ
akan berekspresi membentuk koloni berwarna
biru.
Pengurutan nukleotida terhadap cDNA
MmMt2 dilakukan melalui dua arah
menggunakan primer T7 dan SP6 (Lampiran
1).
Berdasarkan
keseluruhan
urutan
nukleotida, hanya bagian yang diapit oleh
kodon awal (ATG) yang merupakan bagian
dari primer Mt2F dan kodon akhir (TGA)
yang merupakan bagian dari primer Mt2R,
yang akan digunakan untuk analisis lebih
lanjut.
Analisis situs restriksi menunjukkan
bahwa cDNA MmMt2 tidak mengandung
situs yang terdapat pada MCS pGEM®-T
Easy sehingga semua situs yang terdapat pada
MCS dapat digunakan untuk mengeluarkan
sisipan cDNA MmMt2 dari vektor pGEM®-T
Easy. Analisis situs restriksi sangat penting
untuk pemanfaatan cDNA ini dalam rekayasa
genetika.
Kesejajaran lokal nukleotida dan asam
amino dianalisis menggunakan program
BLAST. BLAST dapat digunakan sebagai
alat untuk menentukan identitas suatu
fragmen DNA yang belum diketahui
berdasarkan tingkat homologi dengan gen
atau fragmen DNA yang telah diketahui di
GeneBank (Mount 2001). Hasil analisis
kesejajaran lokal menunjukkan bahwa cDNA
MmMt2 memiliki kesamaan 100% dengan

49

bagian AtMt2A (Nomor aksesi: NM111773)
dan dengan bagian AtMt-K (U15108), 99%
dengan bagian AtMt1 (X62818), 99% dengan
bagian AtMt1G (D11394) dari Arabidopsis
thaliana, 90% dengan bagian BjMt2 (Y10850
dari Brassica juncea, dan 88% dengan
bagian BoMt (AF200712) dari B. oleracea.
Analisis kesejajaran lokal cDNA MmMt2
berdasarkan nukleotida dengan BLASTn
disajikan dalam Lampiran 3. Hasil analisis
kesejajaran lokal berdasarkan peptida
menunjukkan bahwa protein yang dideduksi
dari cDNA MmMt2 (MmMT2) memiliki
kesamaan 100% dengan bagian AtMT2A
(P25860) dari A. thaliana, 95% dengan
bagian BrMT2 (P69164) dari B. rapa, dan
95% dengan bagian BjMT2 (P69163) dari B.
juncea. Analisis kesejajaran lokal peptida
MmMT2 dengan BLASTp disajikan pada
Lampiran 4. MmMt2 juga memiliki kesamaan
urutan nukleotida dengan MaMt2 dari M.
affine (Suharsono et al. in press) dan GmMt2
dari kedelai kultivar Slamet (Anwar 2008).
Oleh karena urutan nukleotidanya sama,
maka urutan asam amino MmMT2, AtMT2A,
MaMT2, dan GmMT2 juga sama. Hal ini
menunjukkan bahwa MmMT2 memiliki
peranan yang sama dengan AtMT2A yaitu
mengikat dan mendetoksifikasi logam berat
serta membatasi kerusakan oksidatif pada
tanaman (Zhou & Goldsbrough 1995).
Hasil deduksi asam amino dari cDNA
MmMt2 (Tabel 2) menunjukkan bahwa motif
urutan asam amino Cys pada MmMT2 terdiri
atas Cys-Cys (residu 3-4), Cys-X-Cys (8-10,
14-16, 67-69, 73-75, 78-80) dan Cys-X-XCys (20-23). Ketiga motif tersebut
merupakan tipikal komposisi Cys pada
protein MT tipe 2 tanaman. Perbedaan
MmMT2, BjMT2, dan BoMT2 terletak pada
posisi motif Cys di dalam MT2. Pada BjMT2
dan BoMT2 posisinya ialah Cys-X-Cys (810, 14-16, 66-68, 72-74, 77-79).
Analisis
domain
terkonservasi
berfungsi untuk mengetahui pola konservasi
dan perbedaan protein dalam evolusi
molekular (Marchler-Bauer et al. 2002).
Analisis domain konservasi terhadap
MmMT2, MaMT2, GmMT2, dan AtMT2A
(kelompok MmMT2), BjMT2, dan BoMT2
menunjukkan
bahwa
domain
yang
terkonservasi adalah dari asam amino ke-25
sampai dengan asam amino ke-79 walaupun
mempunyai urutan yang berbeda (Gambar
11). Urutan asam amino kelompok MmMT2,
BjMT2, dan BoMT2 termasuk ke dalam
metallothionein 2 superfamily. Namun ada
perbedaan
letak
metallothionein
2

superfamily pada dua kelompok urutan asam
amino tersebut. Pada kelompok MmMT2,
metallothionein 2 superfamily dijumpai pada
asam amino ke-25 sampai urutan ke-80.
Sedangkan pada BjMT2 dan BoMt2,
metallothionein 2 superfamily dijumpai pada
asam amino ke-25 sampai urutan ke-79.

SIMPULAN
cDNA MmMt2 telah berhasil diisolasi
dengan ukuran 246 pb dan menyandikan 81
asam amino. MmMt2 ini memiliki urutan
nukleotida yang sama dengan AtMt2A dari A.
thaliana, MaMt2 dari M. affine, dan GmMt2
dari kedelai kultivar Slamet. MmMT2 diduga
memiliki peranan yang sama dengan
AtMT2A
yaitu
mengikat
dan
mendetoksifikasi
logam
berat
serta
membatasi kerusakan oksidatif pada tanaman.

SARAN
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut
untuk mengetahui ekspresi MmMt2. cDNA
MmMt2 yang telah berhasil diisolasi dapat
digunakan sebagai pelacak yang digunakan
dalam hibridisasi northern.

UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini didanai oleh DIPA
Biotrop
tahun
2005
dengan
judul
”Construction of Genomic Library and
Isolation of Gene Involved in the Plant
Tolerant to Low pH and High Solubility of
Aluminium from Melastoma” dengan
contract agreement No: 13.1/PSRP/SPPEN/IV/2005 atas nama Dr. Ir. Suharsono,
DEA.

DAFTAR PUSTAKA
Anwar Y. 2008. Isolasi dan Karakterisasi
Fragmen cDNA dari Gen Penyandi
Metallothionein dari Kedelai Kultivar
Slamet [tesis]. Bogor: Sekolah
Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Chang S, Puryear J, Cairney J. 1993. A
simple and efficient method for
isolation RNA from pine trees. Plant
Mol Biol Rep 11:113-116.

510

Cobbett C, Goldsbrough PB. 2002.
Phytochelation and metallothionein:
roles in heavy metal detoxification and
homeostasis. Annu Rev Biol 53:159182.
Delhaize E, Ryan PR. 1995. Aluminum
toxicity and tolerance in plant. Plant
Physiol 107:315-321.
Duncan KER et al. 2006. Peptide folding
metal binding mechanism, and binding
site structure in metallothioein. Soc
Exp Biol Med 15:1488-1499.
Garcia-Hernandez M, Murphy A, Taiz L.
1998. Metallothionein 1 and 2 have
distinct but overlapping expression
patterns in Arabidopsis. Plant Physiol
118:387-397.
Guo WJ, Meetam M, Goldsbrough PB. 2008.
Examining the specific contributions
of
individual
Arabidopsis
Metallothioneins
to
copper
distribution and metal tolerance. Plant
Physiol 146(2):1697-1706.
Kagi
JHR.
1991.
Overview
of
metallothionein. Methods Enzymol
205:613-626.
Katoh K, Kuma K, Toh H, Miyata T. 2005.
Improvement in the accuracy multiple
sequence alignment program MAFFT.
Gen Infor 16(1):22-33.
Marchler-Bauer A et al. 2002. CDD: a
database of conserved domain
aligments with links to domain threedimensional structure. Nuc Acid Res
30(1):281-283.
Mulyani A, Hikmatullah, Subagyo H. 2003.
Karakteristik dan Potensi Tanah
Masam Lahan Kering di Indonesia.
Prosiding
Simposium
Nasional
Pemberdayaan Tanah Masam Buku I.
Bandar Lampung, 29-30 September
2003.
Puslitbang
Tanah
dan
Agroklimat
Balitbangtan
Deptan
Bogor.
Ozkuthu F, Sekeroglu N and Kara SM . 2006.
Monitoring
of
cadmium
and
micronutrients in spices commonly
consumed in Turkey. Res J Agric &
Biol Sci 2:223-226.
Promega. 1996. Protocol and Application
Guide. Ed. Ke-3. USA: Promega Co.
Richards KD, Schott EJ, Sharma EK, Davis
KR,Gardner RC. 1998. Aluminum
induced oxidative stress genes in
Arabidopsis thaliana. Plant Physiol
116: 409-418.

Saunders GC, Parker HP. 1999. Analytical
Molecular Biology: Quality and
Validation. Teddington: LGC Press.
Snowden KC, Richard KD, Gardner RC.
1995.
Aluminium-induced
genes
induction by toxic metals, low
cadmium, wounding and patterns of
expression in root tips. Plant Physiol
107: 341-348.
Soepandi D. 2006. Perspeksi Fisiologi Dalam
Pengembangan Tanaman Pangan di
Lahan Marginal. [Orasi Ilmiah Guru
Besar Tetap Fisiologi Tanaman].
Bogor: Fakultas Pertanian Institut
Pertanian Bogor.
Suharsono. 2002. Konstruksi pustaka genom
kedelai kultivar Slamet. Hayati (3):6770.
Suharsono,Trisnaningrum N, Sulistyaningsih
LD, Widyastuti U. 2008. Isolation and
cloning of cDNA of gene encoding for
metallothionein
type
2
from
Melastoma affine. Biotropia, in press.
Taylor GJ. 1991. Current views of the
aluminum stress response: the
physiological basis of tolerance. Curr
Trop in Plant Biochem and Physiol.
10:57-93.
Van Hoof NALM,Hassinen VH, Hakvoort H,
Ballintijn KF, Schat H. 2001.
Enhanced copper tolerance in Silene
vulgaris (Moench) Garcke populations
from copper mines is associated with
increased transcript levels of a 2b-type
metallothionein gene. Plant Physiol
126:1519–27.
Watanabe T, Osaki M, Yoshihara T, Tadano
T. 1998. Distribution and chemical
speciation of aluminium in the Al
accumulator
plant,
Melastoma
malabathricum L. Plant Physiol
201:165-173
Wong HL, Sakamoto T, Kawasaiki T,
Umemura K, shimamoto K. 2004.
Down-regulation of metallothionein, a
reactive oxygen scavenger, by the
small GTPase OsRac 1 in rice. Plant
Physiol 135:1447-1456.
Zhou J, Goldsbrough PB. 1995. Structure,
organization and expression of the
metallothionein gene family in
Arabidopsis. Mol Gen Genet 248:318328.

ISOLASI DAN KARAKTERISASI cDNA GEN PENYANDI
METALLOTHIONEIN TIPE 2 DARI Melastoma malabathricum L.

THESIAWATY DIAN FAUZIAH

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009

Judul : Isolasi dan Karakterisasi cDNA Gen Penyandi Metallothionein Tipe 2 dari
Melastoma malabatrhicum L.
Nama : Thesiawaty Dian Fauziah
NIM : G34102058

Menyetujui:

Pembimbing I,

Pembimbing II,

Dr. Ir. Suharsono, DEA.
NIP 131664393

Dr. Ir. Utut Widyastuti , M.Si.
NIP 131851279

Mengetahui:
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor

Dr. Drh. Hasim, DEA.
NIP 131578806

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Alhamdulillah, segala puji dan syukur hanya bagi Allah pemilik dan penguasa semesta alam
yang telah melimpahkan rahmat, petunjuk, dan nikmat-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan
karya ilmiah ini. Penelitian ini didanai oleh DIPA Biotrop tahun 2005 atas nama Dr. Ir. Suharsono,
DEA.
Terima kasih kepada penulis ucapkan kepada Dr. Ir. Suharsono, DEA. dan Dr. Ir. Utut
Widyastuti, M.Si. selaku pembimbing atas segala bimbingan, waktu, sarana dan prasarana yang
diberikan. Terima kasih kepada Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si. atas saran dan masukannya yang
bermanfaat dalam penyempurnaan karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan
kepada Pak Abdul Mulya, Mbak Pepi Elvavina, Mbak Niken Trisnaningrum, S.Ag., Pak Muzuni,
M.Si., Kak Yassier Anwar, M.Si., Pak Ulung Anggraito, M.Si., Mas Syarifin Firdaus, M.Si., dan
Mbak Ulfah Mushofah S.Ag. atas bantuan teknis dan arahan yang diberikan selama penulis
melakukan penelitian; Mbak Rina Kurnianingsih, M.Si., Mbak Laela Sari, M.Si., Ika A. Zahroh,
S.Si., Nindya Rachma Santi, S.Si., Ika Madona, S.Si., Bu Sri Listyowati, M.Si., dan Kak Akhmad
Amirullah, S.Si. selaku teman seperjuangan di laboratorium; Lulut, Teh Rina, Awi, serta temanteman Biologi 39 yang telah memberikan dorongan moril. Secara khusus, penulis sampaikan terima
kasih kepada orang tua, mertua, kakak, Mas Irfan, dan Nufail tersayang, atas kasih sayang, doa, dan
dukungan moril.
Penulis berharap semoga karya ilmiah ini dapat memberi manfaat.

Bogor, Desember 2008

Thesiawaty Dian Fauziah

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bojonegoro, Jawa Timur, pada tanggal 17 Januari 1984 sebagai anak ke
dua dari dua bersaudara, putri dari pasangan Saiful Bachri dan Sukarsih.
Penulis lulus pada tahun 2002 dari SMU Negeri 5 Surabaya dan diterima di Institut Pertanian
Bogor (IPB) pada Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam melalui
jalur Ujian Masuk Perguruan Tinggi Negeri (UMPTN).
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum mata kuliah
Mirobiologi Dasar pada semester genap tahun ajaran 2004/2005; mata kuliah Biologi Dasar dan
Agama Islam pada tahun 2005/2006; serta mata kuliah Anatomi dan Morfologi Tumbuhan dan
Genetika Dasar pada tahun ajaran 2006/2007. Penulis pernah menjadi staf
Divisi
Dekomposer/Kestari Himpunan Mahasiswa Biologi (Himabio) IPB pada tahun 2002/2003; tim
produksi dan bendahara pada Divisi Budidaya Jamur, Bioworld, Himabio pada tahun 2003/2004 dan
2004/2005; pengurus Biro Bina Anak Islam Terpadu (BAIT) DKM Al Ghifari IPB pada tahun
2004/2005; pengajar freelance bimbingan belajar AMPUH pada tahun 2005; serta sebagai ketua
Bidang Biosains Himabio, koordinator putri Biro Sains dan Kajian Islam Wahana Muslim Himabio,
dan pengurus Biro Syiar DKM Al Ghifari IPB pada tahun 2005/2006. Penulis pernah melakukan
Praktik Lapang dari Juli hingga Agustus 2006 di Pusat Penelitian dan Pengembangan Minyak dan
Gas Bumi (PPPTMGB) LEMIGAS, Cipulir, Jakarta Selatan. Pada tanggal 24 Maret 2007, penulis
menikah dengan Irfan Nur Rachman, SH. dan pada tanggal 3 Maret 2008 penulis melahirkan seorang
putra yang diberi nama Nufail Abdillah Shidiq.

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL …………………………………………………………………….................. vii
DAFTAR GAMBAR …………………………………………………………………..................

vii

DAFTAR LAMPIRAN ………………………………………………………………..................

vii

PENDAHULUAN
Latar Belakang ......................................................................................................................
Tujuan ...................................................................................................................................

1
1

BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian ...............................................................................................
Bahan .....................................................................................................................................
Metode ...................................................................................................................................
Isolasi RNA total dari daun ............................................................................................
Kuantifikasi dan kualifikasi RNA total ..........................................................................
Sintesis cDNA ................................................................................................................
Amplifikasi fragmen cDNA MmMt2 dengan primer spesifik .......................................
Pengklonan cDNA MmMt2 ke dalam pGEM®-T Easy ..................................................
Seleksi koloni E. coli yang mengandung vektor rekombinan ........................................
Analisis cDNA sisipan ...................................................................................................
Pengurutan DNA dan analisisnya ..................................................................................

1
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3

HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil ......................................................................................................................................
Isolasi RNA total dari daun ............................................................................................
Sintesis cDNA ................................................................................................................
Amplifikasi fragmen cDNA MmMt2 dengan primer spesifik .......................................
Pengklonan cDNA MmMt2 ke dalam pGEM®-T Easy ..................................................
Analisis cDNA MmMt2 .................................................................................................
Pembahasan ...........................................................................................................................

4
4
4
4
4
5
8

SIMPULAN ....................................................................................................................................

9

SARAN ...........................................................................................................................................

9

DAFTAR PUSTAKA .....................................................................................................................

9

LAMPIRAN ...................................................................................................................................

11

DAFTAR TABEL
1
2

Halaman
Hasil isolasi RNA total ............................................................................................................ 4
Perbandingan ORF dan motif asam amino Cys pada kelompok MmMT2 (MmMT2 dari M.
malabatrichum, AtMT2A dari A. thaliana, MaMT2 dari M. affine, dan GmMT2 dari
kedelai kultivar Slamet), BjMT2 dari B. juncea, dan BoMT2 dari B. oleracea ...................... 7

DAFTAR GAMBAR
1

Halaman
2
Peta fisik plasmid pGEM®-T Easy ..........................................................................................

2

Elektroforesis RNA total dari daun muda MD1 (1), MD2 (2), dan MD3 (3) .........................

4

3

Hasil PCR aktin menggunakan cDNA total MD1 (1), MD2 (2), dan MD3 (3) sebagai
cetakan .....................................................................................................................................

4

4

Fragmen MmMt2 hasil PCR menggunakan cDNA MD2 sebagai cetakan ..............................

4

5

Koloni E. coli DH5 yang ditransformasi dengan hasil ligasi pGEM®-T Easy dan cDNA
MmMt2 yang tumbuh di media seleksi yang mengandung ampisilin, X-gal dan IPTG ..........

4

Hasil analisis sisipan cDNA MmMt2 dengan PCR koloni (A) dan pemotongan DNA
plasmid rekombinan dengan EcoR1 (B) .................................................................................

5

Urutan nukleotida cDNA MmMt2 dari kodon awal (ATG) sampai dengan kodon akhir serta
deduksi asam aminonya ...........................................................................................................

5

8

Peta restriksi yang terdapat pada cDNA MmMt2 ....................................................................

5

9

Pohon filogenetik berdasarkan urutan nukleotida dari Mt2 berbagai spesies .........................

6

10

Pohon filogenetik berdasarkan urutan asam amino dari MT2 berbagai spesies .....................

7

11

Perbandingan daerah domain asam amino terkonservasi antara MmMT2, MaMT2, GmMT2,
dan AtMT2A (1); serta BjMT2 dan BoMT2 (2) .....................................................

8

6

7

DAFTAR