Isolasi, pengklonan, dan konstruksi RNAi Gen Penyandi H+ ATPase membran plasma dari Melastoma malabathricum L
iv
RINGKASAN
MUZUNI. Isolasi, Pengklonan, dan Konstruksi RNAi Gen Penyandi H+-ATPase
Membran Plasma dari Melastoma malabathricum L. Dibimbing oleh
SUHARSONO, DIDY SOPANDIE, dan UTUT WIDYASTUTI SUHARSONO.
Melastoma malabathricum L. adalah suatu tanaman akumulator Al yang
tumbuh pada tanah asam dengan tingkat kelarutan aluminium tinggi di daerah
tropis. Salah satu enzim penting dalam detoksifikasi Al adalah H+-ATPase
membran plasma, suatu protein yang paling melimpah pada membran plasma,
yang disandikan oleh gen pma. Tujuan penelitian ini adalah mengisolasi dan
mengkarakterisasi gen yang menyandikan H+-ATPase membran plasma dari
Melastoma malabathricum L. (Mmpma) dan mempelajari peranan gen Mmpma
melalui konstruksi RNAi dengan menggunakan fragmen 3’UTR Mmpma. cDNA
total telah berhasil disintesis dengan menggunakan transkripsi balik dengan RNA
total sebagai cetakan. cDNA Mmpma utuh telah berhasil diisolasi melalui isolasi
gen secara bertahap. Bagian ujung 5’ dan tengah gen Mmpma telah diisolasi
dengan PCR (polymerase chain reaction) menggunakan cDNA total sebagai
cetakan dan primer pma yang didesain dari beberapa tanaman, sedangkan bagian
ujung 3’gen Mmpma telah diisolasi dengan 3’ RACE. Bagian-bagian gen tersebut
telah berhasil digabung menggunakan PCR dan telah disisipkan ke dalam pGEMT Easy. Plasmid rekombinan tersebut telah berhasil diintroduksikan ke dalam E.
coli DH5α. Analisis sekuen nukleotida menunjukkan bahwa panjang sekuen
penyandi (CDS) Mmpma adalah 2871 pb yang menyandikan 956 asam amino
dengan prediksi berat molekul 105.29 kDa dan prediksi nilai pI sekitar 6.84.
MmPMA mempunyai 10 domain transmembran, 4 loop sitoplasma, 6 domain
fungsional dan 3 domain autoregulator. Pada loop sitoplasma kedua (C2) terdapat
sekuen terkonservasi TGES (domain aktivitas fosfatase); pada C3 terdapat sekuen
DKTGTLT (domain fosforilasi dan transduksi), KGAP (domain pengikatan ATP
dan/atau aktivitas kinase), DPPR (domain pengikatan ATP), MITGD (domain
pengikatan ATP) dan GDGVNDAPALK (domain pengikatan ATP); pada C4
terdapat 3 domain autoregulator yang masing-masing mempunyai sekuen:
QKDFGKEQRELQWAHAQRTLHGL, NHIAEEAKRRAEIARL, dan YTV.
Analisis kesejajaran lokal berdasarkan nukleotida mRNA menunjukkan bahwa
Mmpma mempunyai kemiripan 82% dengan pma Vitis vinifera; 81% dengan pma
Juglans regia, pma Populus tricocarpa, pma Sesbania rostrata, dan pma Prunus
persica dan 80% dengan pma Lycopersicon esculentum. Berdasarkan deduksi
sekuen asam amino, MmPMA mempunyai kemiripan 94% dengan PMA Vitis
vinifera dan PMA Juglans regia; 93% dengan PMA Populus trichocarpa; 92%
dengan PMA Vicia faba, Lycopersicon esculentum, Solanum tuberosum, dan
Arabidopsis thaliana.
Salah satu cara untuk mempelajari peranan gen Mmpma adalah dengan
menekan ekspresi gen tersebut melalaui RNAi. Gen Mmpma dapat diduga
berperan dalam detoksifikasi Al dan pH rendah apabila tanaman transgenik hasil
transformasi RNAi menjadi peka terhadap Al dan pH rendah. Vektor RNAi telah
berhasil dikonstruksi menggunakan teknologi pengklonan GATEWAYTM dimana
fragmen 3’UTRMmpma digunakan sebagai sekuen pemicu RNA utas ganda
(dsRNA), pENTRTM/D-TOPO® sebagai entry vector dan vektor pANDA sebagai
v
destination vector. DNA penyandi RNAi telah diintroduksikan ke tanaman M.
malabathricum L. melalui A. tumefaciens EHA101 untuk mempelajari peranan
gen Mmpma dalam detoksifikasi Al. Hasil uji toleransi tanaman transgenik
terhadap cekaman Al menujukkan bahwa pada larutan hara yang mengandung 3.2
mM AlCl3.6H2O dan pH 4 selama 7 hari, tanaman transgenik mengalami
hambatan pertumbuhan terutama pertumbuhan akar dan daun, sedangkan nontransgenik tidak mengalami hambatan. Hal ini menjelaskan bahwa gen Mmpma
diduga berperanan sangat penting dalam detoksifikasi Al pada Melastoma
malabathricum L. Penelitian tentang isolasi, pengklonan, dan uji peranan gen,
merupakan penelitian yang masih jarang dilakukan. Saat ini, isolasi gen penyandi
H+-ATPase membran plasma dari Melastoma malabathricum L. dan pengujian
peranan gen tersebut terhadap cekaman Al dan pH rendah pada M. malabathricum
L. dengan menggunakan RNA interference (RNAi) merupakan penelitian yang
belum pernah dilakukan oleh peneliti lain di dunia. Oleh karena itu, kedua topik
penelitian di atas adalah kebaruan (novelty) dalam penelitian ini.
RINGKASAN
MUZUNI. Isolasi, Pengklonan, dan Konstruksi RNAi Gen Penyandi H+-ATPase
Membran Plasma dari Melastoma malabathricum L. Dibimbing oleh
SUHARSONO, DIDY SOPANDIE, dan UTUT WIDYASTUTI SUHARSONO.
Melastoma malabathricum L. adalah suatu tanaman akumulator Al yang
tumbuh pada tanah asam dengan tingkat kelarutan aluminium tinggi di daerah
tropis. Salah satu enzim penting dalam detoksifikasi Al adalah H+-ATPase
membran plasma, suatu protein yang paling melimpah pada membran plasma,
yang disandikan oleh gen pma. Tujuan penelitian ini adalah mengisolasi dan
mengkarakterisasi gen yang menyandikan H+-ATPase membran plasma dari
Melastoma malabathricum L. (Mmpma) dan mempelajari peranan gen Mmpma
melalui konstruksi RNAi dengan menggunakan fragmen 3’UTR Mmpma. cDNA
total telah berhasil disintesis dengan menggunakan transkripsi balik dengan RNA
total sebagai cetakan. cDNA Mmpma utuh telah berhasil diisolasi melalui isolasi
gen secara bertahap. Bagian ujung 5’ dan tengah gen Mmpma telah diisolasi
dengan PCR (polymerase chain reaction) menggunakan cDNA total sebagai
cetakan dan primer pma yang didesain dari beberapa tanaman, sedangkan bagian
ujung 3’gen Mmpma telah diisolasi dengan 3’ RACE. Bagian-bagian gen tersebut
telah berhasil digabung menggunakan PCR dan telah disisipkan ke dalam pGEMT Easy. Plasmid rekombinan tersebut telah berhasil diintroduksikan ke dalam E.
coli DH5α. Analisis sekuen nukleotida menunjukkan bahwa panjang sekuen
penyandi (CDS) Mmpma adalah 2871 pb yang menyandikan 956 asam amino
dengan prediksi berat molekul 105.29 kDa dan prediksi nilai pI sekitar 6.84.
MmPMA mempunyai 10 domain transmembran, 4 loop sitoplasma, 6 domain
fungsional dan 3 domain autoregulator. Pada loop sitoplasma kedua (C2) terdapat
sekuen terkonservasi TGES (domain aktivitas fosfatase); pada C3 terdapat sekuen
DKTGTLT (domain fosforilasi dan transduksi), KGAP (domain pengikatan ATP
dan/atau aktivitas kinase), DPPR (domain pengikatan ATP), MITGD (domain
pengikatan ATP) dan GDGVNDAPALK (domain pengikatan ATP); pada C4
terdapat 3 domain autoregulator yang masing-masing mempunyai sekuen:
QKDFGKEQRELQWAHAQRTLHGL, NHIAEEAKRRAEIARL, dan YTV.
Analisis kesejajaran lokal berdasarkan nukleotida mRNA menunjukkan bahwa
Mmpma mempunyai kemiripan 82% dengan pma Vitis vinifera; 81% dengan pma
Juglans regia, pma Populus tricocarpa, pma Sesbania rostrata, dan pma Prunus
persica dan 80% dengan pma Lycopersicon esculentum. Berdasarkan deduksi
sekuen asam amino, MmPMA mempunyai kemiripan 94% dengan PMA Vitis
vinifera dan PMA Juglans regia; 93% dengan PMA Populus trichocarpa; 92%
dengan PMA Vicia faba, Lycopersicon esculentum, Solanum tuberosum, dan
Arabidopsis thaliana.
Salah satu cara untuk mempelajari peranan gen Mmpma adalah dengan
menekan ekspresi gen tersebut melalaui RNAi. Gen Mmpma dapat diduga
berperan dalam detoksifikasi Al dan pH rendah apabila tanaman transgenik hasil
transformasi RNAi menjadi peka terhadap Al dan pH rendah. Vektor RNAi telah
berhasil dikonstruksi menggunakan teknologi pengklonan GATEWAYTM dimana
fragmen 3’UTRMmpma digunakan sebagai sekuen pemicu RNA utas ganda
(dsRNA), pENTRTM/D-TOPO® sebagai entry vector dan vektor pANDA sebagai
v
destination vector. DNA penyandi RNAi telah diintroduksikan ke tanaman M.
malabathricum L. melalui A. tumefaciens EHA101 untuk mempelajari peranan
gen Mmpma dalam detoksifikasi Al. Hasil uji toleransi tanaman transgenik
terhadap cekaman Al menujukkan bahwa pada larutan hara yang mengandung 3.2
mM AlCl3.6H2O dan pH 4 selama 7 hari, tanaman transgenik mengalami
hambatan pertumbuhan terutama pertumbuhan akar dan daun, sedangkan nontransgenik tidak mengalami hambatan. Hal ini menjelaskan bahwa gen Mmpma
diduga berperanan sangat penting dalam detoksifikasi Al pada Melastoma
malabathricum L. Penelitian tentang isolasi, pengklonan, dan uji peranan gen,
merupakan penelitian yang masih jarang dilakukan. Saat ini, isolasi gen penyandi
H+-ATPase membran plasma dari Melastoma malabathricum L. dan pengujian
peranan gen tersebut terhadap cekaman Al dan pH rendah pada M. malabathricum
L. dengan menggunakan RNA interference (RNAi) merupakan penelitian yang
belum pernah dilakukan oleh peneliti lain di dunia. Oleh karena itu, kedua topik
penelitian di atas adalah kebaruan (novelty) dalam penelitian ini.