Isolasi dan Karakterisasi Fragmen cDNA dari Gen Penyandi Sitrat Sintase pada Melastoma malabathricum

1

ISOLASI DAN KARAKTERISASI FRAGMEN cDNA
DARI GEN PENYANDI SITRAT SINTASE
PADA Melastoma malabathricum

ULFAH MUSHOFA

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011

2

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Isolasi dan Karakterisasi
Fragmen cDNA dari Gen Penyandi Sitrat Sintase pada Melastoma malabathricum
adalah karya bersama saya dengan komisi pembimbing dan belum diajukan
dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari

penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir tesis ini.
Bogor, Januari 2011
Ulfah Mushofa
NIM P055050041

3

ABSTRACT
ULFAH MUSHOFA. Isolation and Characterization cDNA Fragment of Gene
Encoding Citrate Synthase in Melastoma malabathricum . Supervised by
SUHARSONO and UTUT WIDYASTUTI SUHARSONO.
Melastoma malabathricum is one of tropical plant origin from South East
Asia, and grows well in the acid soil with high Aluminum (Al) solubility. Plant
chelating Al ion forms complex to deal with high Al solubility. Organic acid
could chelate soluble Al. In plant these organic acids usually are found as: citric
acid, oxalic acid, and malic acid. The objective of this research is to isolate and to
characterize cDNA of the gene encoding for Citrate Synthase in M.
malabathricum. We have successfully isolated total RNA from the root tips of M.
malabathricum. Total cDNA had been synthesized by reverse transcription by

using total RNA as template. By using specific primer designed based on
conserve region from Nicotiana tabacum, Beta vulgaris, Populus hybrid and
Daucus carota. We had successfully isolated the fragment of cDNA of the gene
encoding of Citrate Synthase (MmFCS) containing 885 nucleotides, deducing 295
amino acids. Local aligment analysis based on nucleotide showed that this
fragment is 80% identical to part of Citrate Synthase in Populus trichocarpa
(XM_002330859.1) and Populus hybrid (X84227.1), 79% to Vitis vinifera
(XM_002271415.1), Citrus sinensis (G03728 80.1), Citrus junos (AY428532.1)
and Arabidopsis lyrata (XM_002880061.1). Based on amino acid sequence, the
amino acid sequence deduced from the cDNA fragment is 99% identical to part
of Citrate Synthase of: Populus trichocarpa (XP_002330895.1), Citrus sinensis
(ACU42176.1), Citrus junos (AAR88248.1), Vitis vinifera (XP_002271451.1),
Arabidopsis thaliana (AAM62868.1), Populus hybrid (CAA59009.1), Prunus
persica (AAL11504.1), Beta vulgaris (CAA590 10.1), Sorghum bicolor
(XP_002453470.1), Nicotiana tabacum (CAA59008.1) and Oryza sativa
(AAG28777.1).
Keywords : Melastoma malabathricum, isolation, cDNA, citrate synthase,
alignment.

4

RINGKASAN
ULFAH MUSHOFA. Isolasi dan Karakterisasi Fragmen cDNA dari Gen
Penyandi Sitrat Sintase pada Melastoma malabathricum. Dibimbing oleh
SUHARSONO dan UTUT WIDYASTUTI SUHARSONO.
Sitrat sintase adalah enzim yang memiliki peranan penting di dalam
tanaman. Enzim ini memiliki fungsi untuk menyintesis sitrat. Sitrat adalah
senyawa utama yang diperlukan dalam siklus Krebs, oksidasi-β dari asam lemak,
lintasan glikolat fotorespirator dan pengkelatan ion beracun. Sitrat pada tanaman
mampu meningkatkan toleransi tanaman terhadap toksisitas Al, dimana toksisitas
menjadi permasalahan pada lahan asam. Untuk mengoptimumkan pemanfaatan
lahan marjinal yang asam dan memiliki kelarutan Al yang tinggi, varietas tanaman
yang toleran asam dan Al sangat diperlukan. Varietas unggul yang toleran dapat
diperoleh dengan perbaikan genetik, baik melalui penyilangan secara
konvensional maupun melalui teknologi DNA rekombinan. Melastoma
malabathricum adalah salah satu tanaman yang mampu tumbuh dengan baik pada
lahan asam dengan kelarutan Al yang tinggi. Salah satu gen yang diduga berperan
dalam ketahanan M. malabathricum terhadap pH rendah dan Al adalah gen
penyandi citrate sintase (CS).
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan isolasi dan karakterisasi fragmen

cDNA gen sitrat sintase dari tanaman M. malabathricum. Untuk itu RNA total
diisolasi dari akar M. malabathricum, lalu digunakan sebagai cetakan untuk
sintesis cDNA total. Isolasi gen sitrat sintase dilakukan dengan metode PCR
menggunakan primer yang didesain secara spesifik berdasarkan conserve region
dari sitrat sintase Nicotiana tabacum, Beta vulgaris, Populus hybrid dan Daucus
carota, menggunakan cDNA sebagai cetakan. Hasil isolasi RNA total dan isolasi
gen sitrat sintase divisualisasi dengan menggunakan elektroforesis pada gel
agarosa.
RNA total yang telah berhasil diisolasi dari akar M. malabathricum diuji
secara kuantitas dan kualitas, hasil yang diperoleh menunjukkan RNA total murni
terbebas dari protein, bebas kontaminasi DNA genom dan memiliki keutuhan
yang baik. Hasil pengurutan dari cDNA diperoleh nukleotida dengan panjang 885
pb yang menyandikan 295 asam amino. Kesejajaran lokal pada urutan nukleotida
dengan beberapa spesies lain menunjukkan kesamaan sebesar 80% dengan bagian
cDNA dari sitrat sintase: Populus trichocarpa (XM_002330859.1) dan Populus
hybrid (X84227.1), 79% dengan Vitis vinifera (XM_002271415.1), Citrus
sinensis (G0372880.1), Citrus junos (AY428532.1) dan Arabidopsis lyrata
(XM_002880061.1). Kesejajaran urutan asam amino menunjukkan kesamaan
sebesar 99% dengan bagian sitrat sintase Populus trichocarpa (XP_002330
895.1), Citrus sinensis (ACU42176.1), Citrus junos (AAR88248.1), Vitis vinifera

(XP_002271451.1), Populus hybrid (CAA59009.1), Prunus persica (AAL11
504.1), Arabidopsis thaliana (AAM62868.1), Beta vulgaris (CAA59010.1)
Sorghum bicolor (XP_002453470.1), Oryza sativa (AAG28777.1), dan Nicotiana
tabacum (CAA590 08.1). Hasil analisis tingkat protein menunjukkan bahwa
dalam sekuen tersebut terdapat domain terkonservasi dan daerah penanda sitrat
sintase.
Kata Kunci : Melastoma malabathricum, isolasi, cDNA, sitrat sintase, kesejajaran.

5

© Hak cipta milik IPB, tahun 2011
Hak cipta dilindungi Undang-Undang
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tesis tanpa
mencantumkan atau menyatakan sumber
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan
karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu
masalah.
b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar Institut
Pertanian Bogor.
2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh

tulisan dalam bentuk apa pun tanpa izin Institut Pertanian Bogor.

6

ISOLASI DAN KARAKTERISASI FRAGMEN cDNA
DARI GEN PENYANDI SITRAT SINTASE
PADA Melastoma malabathricum

ULFAH MUSHOFA

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Bioteknologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011

7

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Prof. Dr. Ir. Iskandar Z. Siregar, M.For.Sc

8

Judul Tesis
Nama Mahasiswa
NIM
Program Studi

: Isolasi dan Karakterisasi Fragmen cDNA dari Gen
Penyandi Sitrat Sintase pada Melastoma malabathricum
: Ulfah Mushofa
: P055050041
: Bioteknologi

Disetujui
Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Suharsono, DEA
Ketua

Dr. Ir. Utut W. Suharsono, M.Si.
Anggota

Diketahui
Ketua Program Studi Bioteknologi

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr. Ir. Suharsono, DEA

Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, MS.

Tanggal Ujian : 31 Desember 2010

Tanggal Lulus :

9

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Blitar – Jawa Timur pada tanggal 21 Juni 1982 dari
pasangan M.H Imron Noor dan Hj. Ellys Budaya. Penulis merupakan putri bungsu
dari tiga bersaudari. Pada 18 Oktober 2008 penulis menikah dengan Teguh
Prasetyo.
Pendidikan sarjana ditempuh penulis di Program Studi Hortikultura,
Jurusan Budidaya Pertanian, Fakultas Pertanian, Universitas Brawijaya, Malang
dan lulus pada tahun 2005. Pada tahun yang sama, penulis terdaftar sebagai
mahasiswa program Magister Sains di Program Studi Bioteknologi, Sekolah
Pascasarjana Institut Pertanian Bogor dengan beasiswa mandiri.
Tahun 2008-2009 penulis mengambil cuti selama 1 tahun untuk mengikuti
training “Industrial Biotechnology” di Jerman dengan beasiswa dari Pemerintah
Republik Federal Jerman. Selama melaksanakan penelitian, penulis menjadi
asisten praktikum mata kuliah Genetika Dasar pada tahun ajaran 2009/2010, serta
mata kuliah Genetika Molekuler pada tahun ajaran 2007/2008 dan 2009/2010.
Tahun 2010, bersama dengan alumni training “Industrial Biotechnology” yang
lain, penulis berperan aktif dalam merintis organisasi AJI Biotek (Alumni Jerman
Indonesia Bioteknologi).

10

KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah pencipta alam semesta atas
segala limpahan rahmat-Nya sehingga penelitian dan penulisan tesis ini berhasil
diselesaikan. Tesis dengan judul Isolasi dan Karakterisasi Fragmen cDNA dari
Gen Penyandi Sitrat Sintase pada Melastoma malabathricum ini disusun sebagai
salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Prograsm Studi
Bioteknologi, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Selama menjalani perkuliahan hingga terselesaikannya tesis ini, penulis
banyak mendapat bantuan moral maupun material dari berbagai pihak. Oleh
karena itu penulis menyampaikan terimakasih kepada : Bapak Dr. Ir. Suharsono,
DEA dan Ibu Dr. Ir. Utut W. Suharsono, M.Si selaku komisi pembimbing atas
arahan dan bimbingan selama penelitian dan penulisan tesis dengan penuh
kesabaran dan ketelitian. Penulis juga menyampaikan terimakasih kepada Hibah
Kompetensi dari Ditjen Pendidikan Tinggi (DIKTI), Kementrian Pendidikan
Nasional dengan judul “Isolasi dan ekspresi gen dalam rangka perakitan tanaman
terhadap cekaman asam dan aluminium” dan JSPS-DGHE Joint Research Project
dengan judul “Molecular adaptation of Jatropha curcas to acid soil for
reforestation of tropical wasteland” atas nama Bapak Dr. Suharsono yang telah

membiayai penelitian ini. Terimakasih kepada Bapak Prof.Dr.Ir. Iskandar Z.
Siregar, M.For.Sc selaku Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis, yang telah
memberikan saran dan bantuan untuk perbaikan Tesis.
Ungkapan terimakasih juga disampaikan kepada seluruh dosen pengajar,
staf dan rekan mahasiwa Program Studi Bioteknologi terutama angkatan 2005.
Pak Muzuni dan Syarifin Firdaus, yang telah banyak membantu dalam penelitian
dan penulisan tesis. Pak Radite, Bu Ratna, Bu Hanum, Bu Srilis, Pak Ulung,
Mbak Pepy, Pak Mulya, Bahrelfi, Budi, Popy, Ammay, Mbak Agustin, Mbak
Niken, Bang Yassier serta seluruh anggota Biorin angkatan lama lainnya sampai
dengan angkatan terbaru, untuk proses saling menguatkan semangat.
Terimakasih penulis sampaikan kepada Ayahanda M.H Imron Noor,
Ibunda Hj. Ellys Budaya, suami tercinta Teguh Prasetyo, Syifa Noor Mz, Laili
Shofia dan seluruh keluarga Blitar atas dukungan do’a, moral sampai dengan
bantuan finansial. Semoga semua amal kebaikan akan dikembalikan oleh Allah
dengan berlipat ganda.
Penulis menyadari bahwa tesis ini masih belum sempurna. Namun penulis
berharap laporan tesis ini dapat bermanfaat.

Bogor, Januari 2011
Ulfah Mushofa

11

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... x
DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... xi
PENDAHULUAN .............................................................................................. 1
Latar Belakang........................................................................................... 1
Tujuan Penelitian ....................................................................................... 2
TINJAUAN PUSTAKA...................................................................................... 3
Lahan Asam dan Permasalahannya ............................................................ 3
Pengaruh Aluminium terhadap Tanaman ................................................... 4
Toleransi Tanaman Menghadapi Cekaman Aluminium .............................. 5
Peranan Asam Organik dalam Toleransi Tanaman terhadap Aluminium .... 6
Sitrat Sintase .............................................................................................. 8
Isolasi gen dari Melastoma malabathricum .............................................. 10
BAHAN DAN METODE ................................................................................. 13
Waktu dan Tempat Penelitian .................................................................. 13
Bahan Penelitian ...................................................................................... 13
Metode Penelitian .................................................................................... 13
Isolasi RNA Total ............................................................................ 13
Kuantifikasi dan kualifikasi RNA total ............................................ 14
Sintesis cDNA Total ........................................................................ 15
Isolasi Fragmen Gen Sitrat Sintase ................................................... 15
Analisis Fragmen Gen Sitrat Sintase ................................................ 16
HASIL DAN PEMBAHASAN .........................................................................
Isolasi RNA Total ....................................................................................
Sintesis cDNA Total ................................................................................
Isolasi Fragmen Gen Sitrat Sintase ...........................................................
Analisis MmFCS ......................................................................................
Analisis Domain MmFCS ........................................................................
Analisis Hidrofobisitas .............................................................................

17
17
17
18
19
22
23

KESIMPULAN DAN SARAN .........................................................................
Kesimpulan..............................................................................................
Saran .......................................................................................................
Ucapan Terimakasih ................................................................................

24
24
24
24

DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................... 25
LAMPIRAN ..................................................................................................... 30

12

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 Reaksi pembentukan asam sitrat ...................................................................... 8
2 Tanaman Melastoma malabathricum, skala penggaris 30 cm......................... 10
3 Hasil elektroforesis RNA total dari akar M. malabathricum di gel agarosa .... 16
4 Hasil elektroforesis produk PCR aktin dengan menggunakan cDNA
sebagai cetakan ............................................................................................ 17
5 MmFCS hasil PCR dengan menggunakan cetakan cDNA .............................. 17
6 Hasil pengurutan nukleotida dari fragmen MmFCS........................................ 18
7 Filogenetik berdasarkan cDNA sitrat sintase beberapa spesies ....................... 19
8 Peta situs enzim restriksi yang terdapat dalam MmFCS ................................. 20
9 Deduksi asam amino dari MmFCS................................................................. 21
10 Domain terkonservasi yang berada pada MmFCS .......................................... 21
11 Urutan asam amino sitrat sintase dari berbagai spesies ................................... 22
12 Profil hidrofobisitas sitrat sintase utuh P. trichocarpa ................................... 23
13 Perbandingan hidrofobisitas antara MmFCS dengan fragmen sitrat sintase
P. trichocarpa. .............................................................................................. 23

13

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Hasil pengurutan nukleotida MmFCS menggunakan primer forward ............. 30
2 Hasil pengurutan nukleotida MmFCS menggunakan primer reverse ............. 33
3 Hasil analisis kesejajaran nukleotida MmFCS berdasarkan BLASTn ............. 36
4 Matrik kesamaan urutan nukleotida penyandi sitrat sintase dari beberapa
spesies .......................................................................................................... 37
5 Penyejajaran nukleotida MmFCS dengan nukleotida beberapa spesies lain .... 38
6 Hasil analisis kesejajaran urutan asam amino MmFCS berdasarkan
BLASTp ....................................................................................................... 43
7 Penyejajaran asam amino MmFCS dengan asam amino beberapa spesies lain 44

14

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Sitrat sintase merupakan enzim yang sangat penting, memiliki fungsi
mengkatalis reaksi kondensasi dari residu asetat berkarbon 2 dari asetil KoA dan
sebuah molekul oksaloasetat berkarbon 4 untuk membentuk sitrat berkarbon 6.
Sitrat sintase ditemukan hampir pada semua sel hidup, pada sel eukariot umumnya
terdapat pada bagian matriks mitokondria dan memiliki peranan yang penting di
dalam siklus Krebs. Selain dalam siklus Krebs sitrat memiliki peranan penting
dalam oksidasi-β dari asam lemak, lintasan glikolat fotorespirator dan pengkelatan
ion beracun (Zhang et al., 2005). Hasil penelitian menunjukkan bahwa sekresi
sitrat dari tanaman memegang peranan yang penting dalam toleransi terhadap
Aluminium (Al) (Hue et al., 1986; Kasim, 2000; Miyasaka et al., 1991; Ma et al.,
1998; Pellet et al., 1995;).
Secara umum mekanisme toleransi tanaman terhadap Al adalah dengan cara
melakukan kompartementasi pada bagian tertentu sehingga Al tidak bersifat
toksik dan atau dengan cara melakukan eksklusi Al keluar jaringan. Asam organik
seperti sitrat, malat dan oksalat memiliki peranan yang penting untuk mengelat Al
sehingga Al tidak lagi bersifat toksik bagi tanaman (Delhaize dan Ryan, 1995).
Peranan asam organik dalam toleransi Al dapat melalui toleransi internal maupun
toleransi eksternal. Sitrat sintase merupakan protein yang berperan untuk
membentuk asam organik sitrat.
Gen penyandi sitrat sintase dari beberapa tanaman telah berhasil diisolasi,
misal dari Nicotiana tabacum, Beta vulgaris, Populus hybrid (Takita et al.,
1999), Arabidopsis thaliana (Unger et al., 1989), Oryza sativa (Zhang et al.,
2005) dan Daucus carota (La Cognata et al., 1996).
Introduksi gen penyandi sitrat sintase juga telah dilakukan seperti over
ekspresi gen sitrat sintase dari bakteri Pseudomonas aeruginosa pada tanaman
pepaya dan tembakau, yang menghasilkan tanaman transgenik yang lebih toleran
terhadap Al dibanding tanaman kontrol (de la Fuente et al., 1997). Tanaman
Eucalyptus yang merupakan salah satu pohon utama dalam produksi kehutanan
juga telah berhasil ditransformasi dengan menggunakan gen penyandi sitrat

15

sintase dari Daucus carota. Hasil penelitian menunjukkan bahwa tanaman
transgenik lebih toleran terhadap Al dan sumber fosfat terbatas dibandingkan
tanaman kontrol (Kawazu et al.,2003).
Melastoma malabathricum adalah salah satu tanaman yang mampu tumbuh
dengan baik pada lahan asam dengan kelarutan Al yang tinggi, bahkan
pertumbuhannya dapat terpacu dengan adanya Al pada media tanam (Osaki et al.,
2003). Hasil penelitian Muhaemin (2008) menunjukkan bahwa M. malabathricum
mampu tumbuh pada pH 4 dengan kelarutan Al 3,2 mM. Gen-gen yang diduga
memegang peranan pada ketahanan M. malabathricum terhadap Al telah berhasil
diisolasi, antara lain metallothionein type 2 (Mt2) (Suharsono et al., 2008),
multidrug resistance associated protein (MRP) (Suharsono et al., 2009),
copper/zinc-superoxide dismutase (CuZn-SOD) (Hanum, 3 Juni Komunikasi
Pribadi) dan H+-ATPase membran plasma (MmPMA) (Muzuni et al., 2010).
Untuk mengoptimumkan pemanfaatan lahan marjinal yang asam dengan
kelarutan Al yang tinggi, varietas tanaman yang toleran asam dan Al sangat
diperlukan. Varietas unggul yang toleran pada lahan ini dapat diperoleh dengan
perbaikan genetik, baik melalui penyilangan secara konvensional maupun melalui
teknologi DNA rekombinan. Perakitan tanaman yang toleran asam dan Al ini
membutuhkan gen-gen ketahanan Al. Salah satu gen yang diduga memegang
peranan besar dalam toleransi Al adalah gen penyandi sitrat sintase. Dari hasilhasil penelitian sebelumnya maka dapat disimpulkan bahwa M. malabathricum
memiliki potensi yang kuat untuk dapat digunakan sebagai sumber daya genetik
dalam rangka memperoleh tanaman toleran Al.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan isolasi dan karakterisasi fragmen
cDNA gen sitrat sintase dari tanaman M. malabathricum.

16

TINJAUAN PUSTAKA
Lahan Asam dan Permasalahannya
Ultisol merupakan salah satu jenis tanah yang memiliki sebaran luas di
Indonesia, yaitu 45.798.000 ha, meliputi hampir 25% dari total daratan Indonesia
(Subagyo et al., 2004). Tanah Ultisol umumnya mempunyai nilai kejenuhan basa
< 35%, reaksi tanah ini pada umumnya sangat asam (pH 3,10 – 5). Nilai
kejenuhan Al yang tinggi terdapat pada tanah Ultisol dari bahan sedimen dan
granit, mencapai > 60%. Seperti yang dijelaskan oleh Prasetyo dan Suriadikarta
(2006), kesuburan alami tanah Ultisol umumnya terdapat pada horizon A yang
tipis dengan kandungan bahan organik yang rendah. Unsur hara makro seperti
fosfor dan kalium yang sering kahat, reaksi tanah asam hingga sangat asam, serta
Al jenuh yang tinggi merupakan sifat-sifat tanah Ultisol yang sering menghambat
pertumbuhan tanaman. Toksisitas Al juga menjadi masalah utama yang
menghambat produktifitas pertanian pada lahan asam di dunia, dimana luasan
lahan asam mencapai 40% dari luasan bumi (Kochian, 1995).
Konsentrasi mikromolar senyawa Al yang larut dalam tanah sudah dapat
mengakibatkan toksisitas yang serius pada tanaman. Produksi tanaman juga dapat
menurun secara drastis karena uptake air dan unsur hara terganggu (Kochian,
1995). Tidak semua bentuk dari Al bersifat toksik, masing-masing bentuk
memiliki tingkat toksisitas yang berbeda. Pada umumnya kation trivalen bersifat
toksik bagi tanaman dan Al3+ merupakan bentuk yang paling toksik, meskipun Al
dalam bentuk divalen dan monovalen juga bersifat toksik. Larutan dengan pH
yang lebih rendah dari 5,0 menyebabkan ion Al berada dalam bentuk oktahedral
heksahidrat, Al(H2O)63+, sering disingkat dengan Al3+. Pada pH 5 – 7 Al(H2O)63+
mengalami deprotonasi menjadi Al(OH)2+ dan Al(OH)2+. pH yang meningkat
akan mengakibatkan Al berbentuk solid Al(OH)3 dan mengendap. Pada keadaan
basa Al akan membentuk tetrahedral, Al(OH) 4- (Delhaize dan Ryan, 1995;
Kochian, 1995).
Keracunan ion Al3+ merupakan hambatan yang paling nyata terhadap
produksi pertanian di tanah asam. Keracunan Al ini mampu mengakibatkan
produksi tanaman menurun 25% sampai 85% (Kochian, 1995). Rendahnya

17

produktivitas menyebabkan tanah asam yang luas ini masih belum bisa
dimanfaatkan secara optimal sebagai lahan pertanian.
Pengaruh Aluminium terhadap Tanaman
Keracunan Al merupakan salah satu kendala dalam produksi tanaman pada
tanah asam. Pada kondisi tersebut umumnya ketersediaan hara dan kemampuan
tanaman untuk menyerap hara sangat terbatas. Dari beberapa percobaan diketahui
bahwa penyerapan P, Ca, Mg, dan K oleh tanaman berkurang secara nyata. Pada
tanaman barley yang ditanam pada media yang mengandung Al, kandungan Ca 2+
dan K+ hanya setengahnya jika dibandingkan dengan kontrol (Matsumoto et
al.,1988). Defisiensi P dapat diinduksi oleh kandungan Al yang tinggi. Komplek
Al-fosfat yang berada di larutan tanah ataupun di dalam sel, mengakibatkan P
tidak tersedia bagi tanaman. Kation trivalen Al3+ juga menghambat transpor Ca2+
secara efektif ke dalam akar, protoplas dan membran. Hasil studi pada lapisan
lipida menunjukkan bahwa Al dapat memblok Ca 2+ dan saluran K+ (Ryan et al.,
1997). Kelebihan konsentrasi Al dalam larutan tanah pada umumnya berakibat
buruk terhadap pertumbuhan tanaman, kecuali beberapa tanaman seperti teh yang
mampu bertahan pada konsentrasi Al tinggi. Menurut Jansen et al. (2002) selain
teh ada tanaman lain yang toleran terhadap Al yaitu Melastomataceae yang
merupakan tanaman akumulator unsur logam diantaranya adalah Al.
Gangguan penyerapan hara mineral di dalam tanah asam disebabkan dua hal
yang sangat berkaitan, yaitu efek langsung yaitu penghambatan penyerapan hara,
dan efek tidak langsung dengan menghambat pertumbuhan akar melalui
penghambatan penyerapan hara (Marschner, 1995).
Aluminium dapat mengubah struktur dan fungsi membran plasma serta
menghalangi pembelahan sel pada ujung akar primer. Gejala awal keracunan
aluminium yang paling mudah diamati adalah terhambatnya pertumbuhan akar,
yaitu ujung akar menebal dan pertumbuhannya memendek. Aluminium banyak
terakumulasi pada ujung akar yang menyebabkan daerah tersebut mengalami
banyak kerusakan fisik dibandingkan jaringan akar dewasa (Ryan et al., 1993).
Ion trivalen Al3+ tidak larut dalam lipid sehingga membran plasma
merupakan penghalang bagi masuknya Al ke dalam sitoplasma, namun beberapa
penelitian membuktikan Al juga terdapat dalam sitoplasma. Al yang terakumulasi

18

dalam sitoplasma inilah yang bersifat toksik, sehingga memberikan asumsi bahwa
toksisitas Al terjadi karena terbentuknya kompleks Al dengan ligan yang
menyebabkan terhambatnya fungsi penting dari molekul-molekul yang diikat
(misal : enzim, calmodulin, tubulin, ATP, GTP, DNA), atau kompleks Al-ligan
yang menghambat proses-proses metabolisme lainnya (Ryan et al., 1995).
Matsumoto (1991) menyatakan bahwa Al yang berada dalam bentuk ion trivalen
(Al3+) memiliki muatan positif yang besar serta memiliki banyak situs pengikatan.
Al3+ dapat mengikat fosfat pada kedua utas DNA, mengakibatkan gagalnya utas
ganda DNA berpisah pada saat replikasi.
Marschner (1995) melaporkan bahwa Al dapat menggantikan kedudukan Ca
pada lamela tengah dinding sel. Ikatan Al dengan gugus karboksil pada pektin
akan menimbulkan ikatan yang kuat dan kaku pada dinding sel sehingga tidak
dapat membesar. Al juga dapat menghambat transport Mg2+ yang merupakan
unsur penting pada proses fisiologis.
Toleransi Tanaman Menghadapi Cekaman Aluminium
Terdapat tiga kelompok tanaman toleran cekaman Al (Foy et al. 1978).
Kelompok pertama adalah kandungan Al di akar tanaman toleran lebih rendah
daripada tanaman yang sensitif sedangkan bagian atasnya sama, contohnya pada
gandum, barley dan kedelai. Kelompok kedua adalah tanaman toleran memiliki
kandungan Al lebih tinggi pada akarnya dan lebih rendah pada organ bagian atas,
contohnya padi dan alfalfa. Kelompok ketiga adalah tanaman toleran memiliki
kandungan Al sangat tinggi di bagian atas terutama pada daun, misalnya teh yang
mengakumulasi Al 600 mg.kg -1 berat kering daun muda (Matsumoto et al. 1976),
pada Hydrangea mencapai 3.000 mg.kg-1 berat kering sepal (Ma et al. 1997).
Mekanisme toleransi terhadap cekaman Al dikelompokkan menjadi
mekanisme eksternal (eksklusi Al ) dan internal (inklusi Al) (Taylor, 1991).
Mekanisme eksternal tanaman dilakukan dengan immobilisasi Al di dinding sel,
mengatur selektifitas membran plasma terhadap sel, meningkatkan pH di daerah
rizosfir atau apoplas akar serta melakukan eksudasi senyawa-senyawa pengkelat
dan effluks Al. Mekanisme internal meliputi kelatisasi Al di sitosol,
kompartementasi Al di vakuola, mensintesis protein spesifik pada membran
plasma yang akan menurunkan serapan Al maupun peningkatan effluks Al.

19

Tanaman yang toleran terhadap keracunan Al memiliki kemampuan untuk
menekan pengaruh buruk keracunan Al tersebut. Kriteria tanaman yang toleran
terhadap Al antara lain: akar sanggup tumbuh terus dan ujung akar tidak rusak,
mengurangi kelebihan serapan ion Al oleh akar, memiliki berbagai cara untuk
menetralkan pengaruh racun Al setelah diserap tanaman, sanggup menciptakan
keadaan yang kurang asam di daerah perakaran, translokasi ion Al ke bagian atas
tanaman, sebagian besar ditahan di akar karena suatu mekanisme tertentu maka
ion aluminium tidak sanggup menghambat serapan Ca, Mg dan K (Matsumoto et
al.,1988).
Ujung akar merupakan bagian tanaman dimana gen-gen yang berperan
dalam mekanisme toleransi terhadap cekaman Al terekpresi. Detoksifikasi Al
pada ujung akar dapat dilakukan oleh tanaman dengan menghasilkan atau
mengekspresikan suatu molekul atau ligan yang dapat mengkelat Al3+,
mengimobilisasi Al pada dinding sel, meningkatkan pH di sekitar akar, serta
mengaktifkan transport Al ke luar sitoplasma (Taylor, 1991).
Mekanisme fisiologi toksisitas dan toleransi Al telah dipelajari dan dibagi
menjadi beberapa kelompok. Salah satu mekanisme toleransi tanaman terhadap Al
yang sudah banyak dipelajari adalah pengeluaran anion asam organik seperti
malat, sitrat dan oksalat, dari akar tanaman yang toleran Al. (Delhaize et al., 1993;
Pellet et al., 1996; Ma et al., 1998).
Peranan Asam Organik dalam Toleransi Tanaman terhadap Al
Beberapa asam organik dapat membentuk ikatan kompleks dengan Al3+,
sehingga Al tidak lagi bersifat racun bagi tanaman. Hue et al. (1986) menemukan
bahwa asam organik dengan gugus hidroksil dan karboksil mampu membentuk
ikatan yang stabil dengan Al3+. Peranan asam organik dalam toleransi Al dapat
melalui toleransi internal maupun toleransi eksternal.
Salah satu cara mekanisme eksklusi adalah sekresi substansi pengkelatan
Al. Al dalam bentuk kelat kurang toksik dibandingkan dengan bentuk ionik Al3+
(Hue et al., 1986). Asam organik berperan dalam eksklusi Al melalui
pelepasannya dari akar dan detoksifikasi Al dalam simplas dimana asam organik
tersebut dapat mengkelat Al dan mereduksi atau mencegah pengaruh racunnya

20

pada tingkat seluler (Pellet et al., 1995). Asam organik ini diduga mampu
mengkelat Al3+ di luar membran plasma yang selanjutnya dapat mencegah Al
masuk ke tanaman (Delhaize & Ryan, 1995). Hasil penelitian Kasim (2000)
terhadap

beberapa

jenis

kedelai,

menunjukkan

bahwa

Al

merangsang

terbentuknya asam sitrat dan malat baik yang diakumulasikan di dalam sel
maupun disekresikan. Genotipe-genotipe yang toleran menyintesis asam organik
lebih tinggi daripada genotipe

yang peka. Hanya genotipe toleran yang

menyekresikan malat walaupun dalam jumlah sedikit, sehingga sekresi malat
dapat dijadikan indikator untuk tingkat toleransi kedelai terhadap cekaman Al.
Beberapa genotipe tanaman adalah toleran Al karena dapat mengeluarkan
Al dari apikal akar. Gandum yang toleran mengakumulasi Al lebih sedikit
daripada gandum yang peka. Asam organik mengkelat Al sehingga akar
terlindungi dari toksisitas Al. Gandum mengeksudasi malat sebagi responnya
terhadap paparan Al, kedelai mengeksudasi sitrat dan malat, sedangkan oksalat
dieksudasi oleh buckwheat (Fagopyrum esculentum). Effluks asam organik
umumnya terjadi pada bagian apikal akar, karena bagian inilah yang paling rawan
terhadap toksisitas Al. Hal ini menjadi dasar mengapa jumlah asam organik yang
dieksudasi dari ujung akar tidak harus mampu mendetoksifikasi keseluruhan Al
yang berada di sekitar akar, namun cukup untuk mendetoksifikasi Al yang berada
di sekitar ujung akar saja (Ma et al., 1998). Hue et al. (1986) menyatakan bahwa
di dalam kultur in vitro, asam organik benar-benar mampu menurunkan efek
toksik dari Al, sitrat lebih efektif dibandingkan suksinat atau malat. Hasil
penelitian Miyasaka et al. (1991) menunjukkan bahwa setelah ditumbuhkan
selama 8 hari pada media yang mengandung Al, sistem akar pada tanaman buncis
kultivar resisten mengeluarkan sitrat 70 kali lebih banyak dibandingkan tanpa
perlakuan Al dan 10 kali lebih banyak dibandingkan kultivar peka.
Asam-asam organik telah dibuktikan memiliki kemampuan mengkelat atau
mendetoksifikasi Al, namun masih diperdebatkan apakah mekanisme tersebut
terjadi secara internal dan eksternal.

21

Sitrat Sintase
Sitrat sintase merupakan enzim yang sangat penting, memiliki fungsi
mengatalis reaksi kondensasi dari residu asetat berkarbon 2 dari asetil KoA dan
sebuah molekul oksaloasetat berkarbon 4 untuk menghasilkan sitrat berkarbon 6
(Gambar 1). Sitrat sintase ditemukan hampir pada semua sel hidup, pada sel
eukariot umumnya terdapat pada bagian matriks mitokondria. Sintesis sitrat
sintase terjadi di dalam sitosol dan kemudian ditransport ke mitokondria. Sitrat
sintase adalah kunci utama pada siklus asam sitrat atau siklus Krebs.

Gambar 1 Reaksi pembentukan asam sitrat (Campbell et al., 2002).
Selain dalam siklus Krebs sitrat memiliki peranan penting dalam oksidasi-β
dari asam lemak, lintasan glikolat fotorespirator dan pengkelatan ion beracun
(Zhang et al., 2005).
Takita et al. (1999) telah berhasil mengisolasi gen penyandi sitrat sintase
dari tanaman wortel (Daucus carota), gen tersebut memiliki ukuran penuh
sepanjang 1.859 pb. La Cognata et al.(1996) juga telah berhasil mengisolasi gen
sitrat sintase dari N. tabacum, B. vulgaris dan P. hybrid. Secara berurutan memiliki nukelotida sepanjang 1.747 pb, 1.551 pb dan 1.387 pb. Arabidopsis
thaliana memiliki gen sitrat sintase utuh sepanjang 1416 pb (Unger et al., 1989).
Gen sitrat sintase pada tanaman padi juga telah berhasil diiosolasi dan
dikarakterisasi oleh Zhang et al. (2005). Gen utuh yang diperoleh memiliki ukuran
1.477 pb yang menyandikan 474 asam amino. Sekuen protein yang dihasilkan
memiliki kemiripan yang tinggi (lebih dari 70%) dengan Daucus carota, N.
tabacum, B. vulgaris, A. thaliana dan Citrus junos.
Larson et al. (2009) menyatakan bahwa protein sitrat sintase pada babi
memiliki ukuran 437 asam amino dan berat molekul sekitar 50 kDa. Sitrat sintase
tersusun dari sebuah domain alfa helik besar dan sebuah domain alfa helik kecil
(Larson et al., 2009; Arnott et al, 2000). Domain besar berfungsi dalam kontak

22

inter-subunit, sedangkan domain kecil memiliki fungsi katalitik (Arnott et al.,
2000).
Overekspresi gen sitrat sintase dari bakteri Pseudomonas aeruginosa pada
tanaman tembakau menghasilkan tanaman transgenik yang mengandung sitrat 10
kali lebih banyak dibanding tanaman non transgenik (kontrol) pada akarnya, dan
menyekresikan sitrat 4 kali lebih banyak dibandingkan kontrol (de la Fuente et
al,.1997). Penghambatan laju pertumbuhan akar pada tanaman transgenik juga
lebih rendah daripada kontrol.
Gen sitrat sintase telah diisolasi dari D. carota yang selanjutnya
diintroduksikan ke dalam tanaman A. thaliana

dengan menggunakan

Agrobacterium tumefaciens sebagai media transformasi (Koyama et al., 2000).
Tanaman transgenik yang dihasilkan menyekresikan sitrat sekitar 2,5 kali lipat
lebih tinggi dibanding tanaman kontrol dan tumbuh lebih baik pada media yang
mengandung fosfor terbatas dan Al.
Tanaman alfafa (Medicago sativa) adalah tanaman yang dikenal sangat
peka terhadap Al. Introduksi gen sitrat sintase dari P. aeruginosa pada tanaman
alfafa yang dilakukan oleh Barone et al. (2008) menunjukkan bahwa tanaman
alfafa transgenik yang ditumbuhkan pada tanah asam yang mengandung Al
mengekspresikan gen sitrat sintase

dan secara signifikan memiliki akar dan

pertumbuhan yang lebih baik dibandingkan kontrol. Hal ini kemungkinan
disebabkan oleh eksklusi Al3+ dari ujung akar. Peningkatan ekspresi gen sitrat
sintase dan aktifitas sitrat sintase pada media yang mengandung Al juga
ditunjukkan oleh tanaman kanola transgenik dibandingkan tanaman kontrol
(Anoop et al., 2003).
Introduksi gen sitrat sintase dari wortel pada Eucalyptus hybrid
menggunakan Agobacterium sebagai media transformasi juga telah dilakukan
oleh Kawazu et al. (2003). Hasil penelitian menunjukkan aktifitas sitrat sintase
pada daun dan akar tanaman transgenik meningkat 5 kali lipat dibandingkan
dengan tanaman kontrol. Konsentrasi sitrat sintase di dalam akar juga mengalami
peningkatan sebagaimana peningkatan aktifitas sitrat sintase. Tanaman transgenik
yang yang ditumbuhkan secara hidroponik pada media yang mengandung Alfosfat sebagai sumber tunggal unsur P, menunjukkan hasil yang sama

23

dibandingkan tanaman dengan media Na-fosfat, sedangkan pada tanaman kontrol
menunjukkan penurunan pertumbuhan akar.
Isolasi gen dari Melastoma malabathricum
M. malabathricum biasa disebut sengganen atau harendong (Jawa),
sikadoekdoek (Sumatera), atau cengkodok (Kalimantan). M. malabathricum
(Gambar 2) merupakan tanaman yang termasuk dalam superdivisi Spermatophyta
(tanaman berbiji), divisi Magnoliophyta (tanaman berbunga), group dikotil, ordo
Myrtales, famili Melastomaceae (PROSEA, 2010).
M. malabathricum adalah salah satu akumulator Al yang tumbuh di tanah
asam daerah tropis dan sub tropis dan merupakan salah satu dari spesies tanaman
berkayu yang mampu tumbuh pada tanah asam sulfat dengan keasaman yang
tinggi dan konsentrasi unsur hara yang sangat rendah (misal : N, P dan kation
basa). Biasanya tanaman ini tumbuh dengan baik di Asia, Australia dan Polysenia
(Osaki et al., 1998).

Gambar 2 Tanaman M. malabathricum
Mekanisme internal dari hiperakumulator Al di dalam M. malabathricum
telah banyak dipelajari (Watanabe et al., 1997, 1998, 2005a, 2005b). Konsentrasi
Al pada daun M. malabathricum seringkali tinggi, bahkan pada tanah gambut
dengan daya tukar Al yang rendah (Osaki et al., 1998). Hasil penelitian
Muhaemin (2008) menunjukkan bahwa M. malabathricum mampu tumbuh pada
pH 4 dengan kelarutan Al 3,2 mM. Tanaman diklasifikasikan sebagai akumulator
bila mengakumulasi sedikitnya 1.000 mg/kg

daun (Jansen et al, 2002). M.

24

malabathricum mampu mengakumulasi lebih dari 10.000 mg Al/kg pada daun tua
dan lebih dari 7.000 mg Al/kg pada daun muda tanpa mengalami keracunan
(Watanabe et al., 1997). Pertumbuhan M. malabathricum juga lebih cepat pada
media yang mengandung Al daripada yang tidak mengandung Al (Watanabe dan
Osaki, 2001).
Salah satu metode detoksifikasi Al di dalam M. malabathricum adalah
eksudasi asam organik dari akar ke daerah rizosfer, dimana Al dan asam organik
dapat membentuk ikatan yang stabil. Selain itu asam organik juga berfungsi untuk
toleransi internal di dalam M. malabathricum. Ada 2 senyawa di dalam akar M.
malabathricum yang dimungkinkan mampu membentuk kompleks dengan Al, Aloksalat merupakan bentuk yang berada di dalam daun dan Al-sitrat merupakan
bentuk yang digunakan untuk translokasi Al dari akar ke daun (Watanabe et al,
2005; Watanabe dan Osaki, 2001). Watanabe dan Osaki (2002) menyatakan
bahwa kompleks Al-sitrat memiliki ikatan 1:1 dan pada xylem sap M.
malabathricum ditemukan malat dengan konsentrasi yang tinggi apabila tidak ada
perlakuan Al, namun ketika diberi perlakuan Al maka ditemukan sitrat dengan
konsentrasi yang tinggi. Kemampuan toleransi Al yang tinggi pada M.
malabathricum ini menjadi dasar pemilihan tanaman ini sebagai sumber gen dan
model bagi ketahanan Al terutama pada tanaman dikotil.
Beberapa cDNA dari gen yang berhubungan dengan toleransi Al telah
diisolasi dari Melastomaceae. Gen penyandi metallothionein type 2 (Mt2)
(Suharsono et al., 2008), multidrug resistance associated protein (MRP)
(Suharsono et al., 2009), major facilitator superfamily (MFS) (Widyartini, 2007),
dan H+-ATPase membran plasma (MmPMA) (Muzuni et al., 2010) dan
copper/zinc-superoxide dismutase (CuZn-SOD) (Hanum 3 Juni 2010, komunikasi
pribadi) telah diisolasi dari M. malabathricum. Selain dari M. malabathricum, gen
penyandi Methallothionein tipe 2 telah diisolasi oleh

Fauziah (2009) dari

Tibouchina langsdorffiana, salah satu jenis melastoma. Selain cDNA, pustaka
genom M. malabathricum (Hadisunarso, 2009) dan T. langsdorffiana (Wulandari,
2009) juga telah dikonstruksi.

25

BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan dari bulan Januari 2010 hingga Juni 2010 di
Laboratorium BIORIN (Biotechnology Research Indonesian – The Netherlands),
Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB Dramaga
Bogor. Pengurutan DNA dilakukan di Nara Institute of Science and Technology
(NAIST) Nara, Jepang.
Bahan Penelitian
Bahan tanaman yang digunakan untuk isolasi RNA adalah akar tumbuhan
M. malabathricum yang tumbuh di lahan asam daerah Jasinga – Bogor – Jawa
Barat. Agilent Plant RNA Isolation Kit digunakan untuk isolasi RNA total.
Primer aktin actF (5’-ATGGCAGATGCCGAGGATAT-3’) dan actR (5’GTTGTGCGACCACTTGCA-3’) didesain dari Shah et al. (1982) yaitu aktin
kedelai, digunakan sebagai alat untuk mengetahui hasil kemurnian cDNA total.
Primer spesifik cspF (5’-CTGTCACTGCTCATCCAATGACTCA-3’) dan cspR
(5’-CCATTGTAACACTCTTTGGCCTCTC-3’) yang didesain dari N. tabacum
(Nomor aksesi : X84226.1), B. vulgaris (X84228.1), P. hybrid (X84227.1) dan D.
carota (AB017159) digunakan untuk mengisolasi fragmen gen sitrat sintase.
Primer spesifik csp didesain berdasarkan daerah terkonservasi pada mRNA
penyandi sitrat sintase.
Metode Penelitian
Kegiatan penelitian ini meliputi lima tahapan utama, yaitu : (1) isolasi RNA
total, (2) kuantifikasi dan kualifikasi RNA total, (3) sintesis cDNA total , (4)
isolasi fragmen gen sitrat sintase, (5) analisis fragmen gen sitrat sintase.
Isolasi RNA Total.
Isolasi RNA mengikuti metode Agilent Plant RNA Isolation Mini Kit
(Agilent, 2005). Sampel berupa 100 mg akar M. malabathricum digerus sampai
menjadi serbuk halus di dalam mortar dengan menggunakan bantuan nitrogen
cair. Kemudian serbuk yang telah dimasukkan dalam tabung ditambah dengan 1

26

ml larutan ekstraksi (mengandung 1% β-mercaptoetanol). Larutan dimasukkan ke
dalam kolom prefiltrasi (berwarna bening) kemudian disentrifugasi dengan
kecepatan 16.000 xg selama 3 menit. Isopropanol dengan volume yang sama
ditambahkan pada larutan hasil filtrasi, dicampur sampai larutan menjadi
homogen dan diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit. Larutan disentrifugasi
menggunakan kolom isolasi dengan kecepatan 16.000 xg selama 30 detik. Kolom
dibilas dengan 500 µl larutan pencuci dan disentrifugasi dengan kecepatan 16.000
xg selama 30 detik. Kolom dicuci sekali lagi dengan 500 µl larutan pencuci dan
disentrifugasi dengan kecepatan 16.000 xg selama 2 menit. Kolom dipindahkan ke
dalam tabung 1,5 ml baru yang bebas RNAse, dan ditambahi 10-50 µl air bebas
nuklease, diinkubasi selama 1 menit dan kemudian disentrifugasi dengan
kecepatan 16.000 xg selama 1 menit.
Kuantifikasi dan kualifikasi RNA total.
Kemurnian dan kuantitas RNA total hasil isolasi ditentukan dengan
spektrofotometer UV-VIS (Cecil CE 2020) pada panjang gelombang 260 nm dan
280 nm. Konsentrasi RNA ditentukan dengan asumsi satu satuan absorban pada
panjang gelombang 260 nm setara dengan 40 μg/ml RNA (Manchester 1996).
Kemurnian RNA total dilihat melalui nilai perbandingan absorban pada panjang
gelombang 260 nm dengan 280 nm (rasio). RNA total yang murni memiliki nilai
rasio antara 1.8 sampai 2 (Manchester 1996; Wilfinger 1997). Kualitas dan
kuantitas hasil isolasi RNA dikonfirmasi dengan elektroforesis pada gel agarosa
1b/v (FMC, USA) terdenaturasi formaldehid dengan larutan penyangga MOPS
[4,2 g/l MOPS (3-(N-morpholino)propanesulfonic acid), 0,41 g/l Na-asetat, 0,37
g/l EDTA (2NA)H2O]. Untuk itu sebanyak 1 μl (0,25 μg) RNA dicampur dengan
12 μl larutan premiks [MOPS, 50% (v/v) formamida, 17,5% (v/v) formaldehid
dan 27,5% (v/v) air DEPC] dipanaskan 65 °C selama 10 menit, didinginkan di es
selama 5 menit dan diberi 1/6 kali volume loading dye (0,25% bromophenol blue,
0.25% xylene cyanol FF, 30% gliserol) dan dielektroforesis pada tegangan 100
volt selama 30 menit. Visualisasi RNA dilakukan di atas UV transluminator
GelDoc (Labquip) setelah diwarnai dengan EtBr (0,5 μg/ml) selama 10 menit dan
direndam dalam H2O selama 15 menit, kemudian difoto menggunakan kamera

27

digital. Adanya dua pita subunit RNA ribosom menunjukkan bahwa RNA total
memiliki integritas yang baik.
Sintesis cDNA Total.
cDNA total disintesis menggunakan SuperScript II RT (Invitrogen).
Komposisi sintesis cDNA total adalah 550 ng RNA total , 1X first strand buffer,
0,5 µM oligo(dT), 0,2 M DTT, 0,2 mM dNTP mix, 40 U enzim SuperScript TMII
RT, dan ddH2O yang diperlakukan DEPC sehingga mencapai volume akhir 20 µl.
Campuran direaksikan pada suhu 30 °C selama 10 menit, diikuti dengan 42 °C
selama 50 menit, 95 °C selama 5 menit, dan 15 °C selama 10 menit dengan menggunakan mesin PCR (MJ Research TM 100). Keberhasilan terbentuknya cDNA
dan kemurnian RNA total dari DNA genom diperiksa menggunakan PCR dengan
primer spesifik aktin. Komposisi reaksi PCR adalah 0,5 µl cDNA, 1X taq buffer
(Invitrogen), 0,2 mM dNTP mix, 4% DMSO, 1,25 U taq DNA polymerase
(Invitrogen), 0,5 µM primer ActF, 0,5 µM primer ActR dan ddH 2O hingga
mencapai volume akhir 10 µl. PCR dilakukan dengan kondisi pra-PCR 94 °C
selama 5 menit, denaturasi 94 °C selama 30 detik, penempelan primer 55 °C
selama 30 detik, pemanjangan 72 °C selama 1,5 menit, dengan 35 siklus, dan
pasca-PCR 72 °C selama 5 menit.
Isolasi Fragmen Gen Sitrat Sintase.
Fragmen cDNA sitrat sintase diisolasi dengan PCR dengan menggunakan
primer spesifik csp. Primer spesifik cspF (5’-CTGTCACTGCTCATCCAATGAC
TCA-3’) dan cspR (5’-CCATTGTAACACTCTTTGGCCTCTC-3’) yang didesain
dari N. tabacum, B. vulgaris, P. hybrid dan D. carota digunakan untuk
mengisolasi fragmen gen sitrat sintase. Dilakukan alignment pada sekuen mRNA
penyandi sitrat dari keempat spesies tersebut, sehingga ditemukan daerah
terkonservasi, kemudian dari daerah tersebut didesain primer spesifik untuk
mengisolasi gen penyandi sitrat sintase dari M. malabathricum. Komposisi reaksi
PCR adalah 1,5 µl cDNA, 1X taq buffer, 0,2 mM dNTP mix, 4% DMSO, 1,25 U
taq DNA polymerase (Fermentas), 0,5 µM primer cspF, 0,5 µM primer cspR dan
ddH2O hingga mencapai volume akhir 10 µl. Kondisi PCR adalah 94 °C selama 5
menit, denaturasi 94 °C selama 30 detik, penempelan primer 51 °C selama 30

28

detik, pemanjangan 72 °C selama 1 menit, dengan 35 siklus, dan pasca-PCR 72
°C selama 5 menit. Hasil PCR dapat dilihat dengan cara visualisasi menggunakan
metode elektroforesis pada gel agarosa.
Analisis Fragmen Gen Sitrat sintase.
Pengurutan DNA dilakukan dengan menggunakan mesin sekuenser.
Analisis kesejajaran lokal (local alignment) sitrat sintase berdasarkan nukleotida
dan asam amino dilakukan dengan menggunakan data yang ada di GeneBank,
dengan program BLAST (Basic Local Alignment Search Tools) yang disediakan
NCBI

(National

Center

for

Biotechnology

Information)

melalui

http://www.ncbi.nlm.nih. gov/blast. Analisis peta restriksi dilakukan dengan
menggunakan program NEBcutter (http://www.tools.neb.com/NEBcutter2/) dan
Bioedit versi 7.0.0. Domain konservatif dianalisis dengan menggunakan program
Conserved Domain (http://www.ncbi.nlmh. gov/Structure/cdd/). Domain potensial
dianalisis dengan program motif scan (http://au. expasy.org/prosite/). Filogenetik
disusun menggunakan program MEGA4. Hidrofobisitas asam amino dianalisis
dengan menggunakan program Bioedit versi 7.0.0.

29

HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi RNA Total
RNA total telah berhasil diisolasi dari akar M. malabathricum. Kuantifikasi
RNA total dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm
menunjukkan bahwa rendemen isolasi RNA adalah 250 µg tiap gram akar segar.
Nilai rasio OD260/OD280 dari RNA total pada hasil penelitian adalah 1,9. Hal ini
menunjukkan bahwa RNA total yang diisolasi dalam penelitian ini murni, tidak
terkontaminasi oleh protein. Manchester (1996) menyatakan bahwa rasio
OD260/OD280 dengan nilai antara 1,8 sampai 2,0 menunjukkan RNA total yang
diisolasi mempunyai kemurnian yang tinggi , bebas dari kontaminan protein.
Integritas RNA total dianalisis dengan melakukan elektroforesis pada gel
agarosa terdenaturasi oleh formaldehid. Hasil elektroforesis RNA total
menunjukkan adanya 2 pita RNA yang merupakan RNA ribosomal (rRNA) 28S
dan 18S (Gambar 1). Adanya pita rRNA pada RNA total akar berhubungan
dengan keutuhan rRNA yang tinggi. Kuantitas rRNA di dalam suspensi RNA total
adalah yang tertinggi dibandingkan dengan tRNA dan mRNA, sehingga rRNA
lebih mudah terdeteksi bilamana RNA total dimigrasikan di gel agarosa.

Gambar 3 Hasil elektroforesis RNA total dari akar M. malabathricum di gel
agarosa
Sintesis cDNA Total
RNA total yang telah berhasil diisolasi selanjutnya digunakan sebagai
cetakan cDNA melalui proses transkripsi balik (reverse transcription).
Transkripsi balik menggunakan primer oligo(dT) sehingga hanya mRNA yang
dapat disintesis menjadi cDNA, karena mempunyai ekor poly(A), sedangkan
rRNA dan tRNA tidak mempunai ekor poly(A). Keberhasilan sintesis cDNA
dikonfirmasi oleh hasil PCR dengan menggunakan primer spesifik untuk ekson1-

30

ekson2 dari gen aktin (actF dan actR), yang berukuran 450 pb (Gambar 4). Hasil
ini menunjukkan bahwa daerah yang diamplifikasi adalah cDNA ekson1-ekson2
dan bukan ekson1-ekson2 dari DNA genom. Amplifikasi ekson1-ekson2 dari
DNA genom akan menghasilkan pita dengan ukuran lebih besar dari 450 pb
karena diantara ekson1 dan ekson 2 terdapat daerah intron. Pita yang
menggunakan DNA genom sebagai cetakan akan menghasilkan pita berukuran
540 pb, karena adanya intron dengan ukuran 90 pb seperti pada kedelai (Shah et
al., 1982).
M

aktin

Gambar 4 Hasil elektroforesis PCR aktin dengan menggunakan cDNA sebagai
cetakan
Teramplifikasinya cDNA dengan primer actF

dan actR yang hanya

berukuran 450 pb menunjukkan bahwa sintesis cDNA total melalui proses
transkripsi balik telah berhasil dengan baik. Selain itu, hasil ini juga membuktikan
bahwa RNA total yang telah diisolasi mempunyai kualitas yang sangat bagus,
karena selain dapat digunakan untuk menyintesis cDNA juga terbebas dari
kontaminasi DNA genom.
Isolasi Fragmen Gen Sitrat Sintase
PCR dengan cDNA total sebagai cetakan dan primer spesifik cspF dan cspR
menghasilkan fragmen berukuran sekitar 900 pb (Gambar 5). Fragmen tersebut
selanjutnya disebut MmFCS (Melastoma malabathricum Fragmen Citrate
Synthase) yang merupakan kandidat fragmen gen penyandi itrat sintase dari M.
malabathricum. Adanya DNA yang berukuran sekitar 900 pb yang dihasilkan
oleh PCR menunjukkan bahwa sitrat sintase diekspresikan pada akar.
M

MmFCS

1.000 pb
850 pb

Gambar 5 MmFCS hasil PCR dengan menggunakan cetakan cDNA

31

Analisis MmFCS
Pengurutan

MmFCS

produk

PCR

menggunakan

primer

spesifik

menunjukkan bahwa cDNA target berukuran 885 nukleotida (Gambar 1,
Lampiran 1 dan Lampiran 2).
CTGTCACTGC TCATCCAATG ACTCAATTTG CATCTGGAGT GATGGCCCTT CAGGTTCAAA
GTGAATTCCA GCAAGCTTAT GAAAAGGGTA TTGCTAAATC