Isolasi, pengklonan, dan konstruksi RNAi Gen Penyandi H+- ATPase membran plasma dari Melastoma malabathricum L.

Melastoma malabathricum

_L.

MUZUNI

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2011

PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN

SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi Isolasi, Pengklonan, dan

Konstruksi RNAi Gen Penyandi H

+

-ATPase Membran Plasma dari

Melastoma

malabathricum

L. adalah karya bersama saya dan pembimbing yang belum pernah

diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber

informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak

diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam

Daftar Pustaka.

Bogor, Februari 2011

Muzuni

NIM G361050051

ABSTRACT

MUZUNI. Isolation, Cloning, and RNAi construct of Gene coding Plasma

Membrane H

+

-ATPase from

Melastoma malabathricum

L. Under supervised of

SUHARSONO, DIDY SOPANDIE, and UTUT WIDYASTUTI SUHARSONO.

Melastoma malabathricum

L. is an Al-accumulating plant that grows in

acidic soils with high level of soluble aluminum in the tropics. One of the important

proteins in the detoxifying aluminum is a plasma membrane H

+

-ATPase, a most

abundant protein on the plasma membrane, encoded by

pma

gene. The objective of

this research is to isolate and characterize the gene encoding plasma membrane H

+

-ATPase from

M. malabathricum

L. (

Mmpma

) and to construct RNAi by using 3’UTR

of

Mmpma

. Total cDNA had been successfully isolated by using reverse

transcription with total RNA as template. Full length cDNA of

Mmpma

had been

successfully isolated through a gradual isolation of the gene. The 5’ end and

middle gene of

Mmpma

had been successfully isolated by PCR (

polymerase chain

reaction

) by using total cDNA as template and

pma

primers designed from some

plants, while the 3’ end of

Mmpma

had been isolated by 3’ RACE. The parts of the

gene had been successfully joined by PCR. The joining product was successfully

inserted into pGEM-T Easy and the recombinant plasmid was successfully introduced

into

E. coli

DH5α. Nucleotide sequence analysis showed that the length of

Mmpma

coding sequence was sized 2871 bp encoding 956 amino acids with a predicted

molecular weight of 105.29 kDa and p

I

value of 6.84. MmPMA has 10 transmembran

domains, 4 cytoplasm loops, 6 functional domains and 3 autoregulatory domains. In

the second cytoplasm loop (C2) contained conserved sequence TGES (phosphatase

activity

domain);

in the

C3

contained conserved sequences

DKTGTLT

(phosphorylation and transduction domain), KGAP (ATP-binding and/or kinase

activity domain), DPPR (ATP-binding domain), MITGD (ATP-binding domain) and

GDGVNDAPALK (ATP-binding domain); in the C4 contained 3 autoregulatory

domains:

QKDFGKEQRELQWAHAQRTLHGL, NHIAEEAKRRAEIARL,

and

YTV. Local alignment analysis based on nucleotide of mRNA showed that

Mmpma

is

82% identical to

pma Vitis vinifera

; 81% to

pma Juglans regia

,

pma Populus

tricocarpa

,

pma Sesbania rostrata

, and

pma Prunus persica

and 80% to

pma

Lycopersicon esculentum

. Based on deduced amino acid sequence, MmPMA is 94%

identical to PMA

Vitis vinifera

and PMA

Juglans regia

; 93% to PMA

Populus

trichocarpa

; 92% to PMA

Vicia faba

,

Lycopersicon esculentum

,

Solanum tuberosum

,

and

Arabidopsis thaliana

, AHA4.

One of the methods to study the important role of

Mmpma

gene is by

suppressing the gene expression through RNAi. The

Mmpma

gene can be

supposed in detoxifying Al and low pH, if the transgenic plants containing RNAi

became sensitive to Al and low pH. RNAi vector had been successfully constructed

using GATEWAY

TM

cloning technology with the 3’UTRMmpma was used as

double-stranded RNA (dsRNA) trigger sequence, pENTR

TM

/D-TOPO

®

as entry

vector, and pANDA plasmid as destination vector. The DNA coding RNAi had been

successfully introduced into

M. malabathricum

L. mediated by

A. tumefaciens

EHA101 to analyze the function of

Mmpma

gene in the detoxifying aluminum. Based

on the result of transgenic plants tolerance analyzes to Al stress showed that in the

nutrient solution including 3.2 mM Al stress (AlCl3.6H2O), pH 4 for 7 days, the

transgenic plants underwent growth suppression especially roots and leaves, whereas

non-transgenic plants underwent growth normally. We supposed that

Mmpma

gene

has an important role in the detoxifying aluminum in

Melastoma malabathricum

L.

RINGKASAN

MUZUNI. Isolasi, Pengklonan, dan Konstruksi RNAi Gen Penyandi H

+

-ATPase

Membran Plasma dari

Melastoma malabathricum

L. Dibimbing oleh

SUHARSONO, DIDY SOPANDIE, dan UTUT WIDYASTUTI SUHARSONO.

Melastoma malabathricum

L. adalah suatu tanaman akumulator Al yang

tumbuh pada tanah asam dengan tingkat kelarutan aluminium tinggi di daerah

tropis. Salah satu enzim penting dalam detoksifikasi Al adalah H

+

-ATPase

membran plasma, suatu protein yang paling melimpah pada membran plasma,

yang disandikan oleh gen

pma

. Tujuan penelitian ini adalah mengisolasi dan

mengkarakterisasi gen yang menyandikan H

+

-ATPase membran plasma dari

Melastoma malabathricum

L. (

Mmpma

) dan mempelajari peranan gen

Mmpma

melalui konstruksi RNAi dengan menggunakan fragmen 3’UTR

Mmpma

. cDNA

total telah berhasil disintesis dengan menggunakan transkripsi balik dengan RNA

total sebagai cetakan. cDNA

Mmpma

utuh telah berhasil diisolasi melalui isolasi

gen secara bertahap. Bagian ujung 5’ dan tengah gen

Mmpma

telah diisolasi

dengan PCR (

polymerase chain reaction

) menggunakan cDNA total sebagai

cetakan dan primer

pma

yang didesain dari beberapa tanaman, sedangkan bagian

ujung 3’gen

Mmpma

telah diisolasi dengan 3’ RACE. Bagian-bagian gen tersebut

telah berhasil digabung menggunakan PCR dan telah disisipkan ke dalam

pGEM-T Easy. Plasmid rekombinan tersebut telah berhasil diintroduksikan ke dalam

E.

coli

DH5α. Analisis sekuen nukleotida menunjukkan bahwa panjang sekuen

penyandi (CDS)

Mmpma

adalah 2871 pb yang menyandikan 956 asam amino

dengan prediksi berat molekul 105.29 kDa dan prediksi nilai p

I

sekitar 6.84.

MmPMA mempunyai 10 domain transmembran, 4

loop

sitoplasma, 6 domain

fungsional dan 3 domain autoregulator. Pada

loop

sitoplasma kedua (C2) terdapat

sekuen terkonservasi TGES (domain aktivitas fosfatase); pada C3 terdapat sekuen

DKTGTLT (domain fosforilasi dan transduksi), KGAP (domain pengikatan ATP

dan/atau aktivitas kinase), DPPR (domain pengikatan ATP), MITGD (domain

pengikatan ATP) dan GDGVNDAPALK (domain pengikatan ATP); pada C4

terdapat 3 domain autoregulator yang masing-masing mempunyai sekuen:

QKDFGKEQRELQWAHAQRTLHGL, NHIAEEAKRRAEIARL, dan YTV.

Analisis kesejajaran lokal berdasarkan nukleotida mRNA menunjukkan bahwa

Mmpma

mempunyai kemiripan 82% dengan

pma Vitis vinifera

; 81% dengan

pma

Juglans regia

,

pma Populus tricocarpa

,

pma Sesbania rostrata

, dan

pma Prunus

persica

dan 80% dengan

pma Lycopersicon esculentum

. Berdasarkan deduksi

sekuen asam amino, MmPMA mempunyai kemiripan 94% dengan PMA

Vitis

vinifera

dan PMA

Juglans regia

; 93% dengan PMA

Populus trichocarpa

; 92%

dengan PMA

Vicia faba

,

Lycopersicon esculentum

,

Solanum tuberosum

, dan

Arabidopsis thaliana

.

Salah satu cara untuk mempelajari peranan gen

Mmpma

adalah dengan

menekan ekspresi gen tersebut melalaui RNAi. Gen

Mmpma

dapat diduga

berperan dalam detoksifikasi Al dan pH rendah apabila tanaman transgenik hasil

transformasi RNAi menjadi peka terhadap Al dan pH rendah. Vektor RNAi telah

berhasil dikonstruksi menggunakan teknologi pengklonan GATEWAY

TM

dimana

fragmen 3’UTRMmpma digunakan sebagai sekuen pemicu RNA utas ganda

(dsRNA), pENTR

TM

/D-TOPO

®

sebagai

entry vector

dan vektor pANDA sebagai

destination vector

. DNA penyandi RNAi telah diintroduksikan ke tanaman

M.

malabathricum

L. melalui

A. tumefaciens

EHA101 untuk mempelajari peranan

gen

Mmpma

dalam detoksifikasi Al. Hasil uji toleransi tanaman transgenik

terhadap cekaman Al menujukkan bahwa pada larutan hara yang mengandung 3.2

mM AlCl

3

.6H

2

O dan pH 4 selama 7 hari, tanaman transgenik mengalami

hambatan pertumbuhan terutama pertumbuhan akar dan daun, sedangkan

non-transgenik tidak mengalami hambatan. Hal ini menjelaskan bahwa gen

Mmpma

diduga berperanan sangat penting dalam detoksifikasi Al pada

Melastoma

malabathricum

L. Penelitian tentang isolasi, pengklonan, dan uji peranan gen,

merupakan penelitian yang masih jarang dilakukan. Saat ini, isolasi gen penyandi

H

+

-ATPase membran plasma dari

Melastoma malabathricum

L. dan pengujian

peranan gen tersebut terhadap cekaman Al dan pH rendah pada

M. malabathricum

L. dengan menggunakan RNA

interference

(RNAi) merupakan penelitian yang

belum pernah dilakukan oleh peneliti lain di dunia. Oleh karena itu, kedua topik

penelitian di atas adalah kebaruan (

novelty

) dalam penelitian ini.

© Hak Cipta milik IPB, Tahun 2011

Hak Cipta dilindungi Undang-undang

1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa

mencantumkan atau menyebutkan sumber.

a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian,

penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau

tinjauan suatu masalah.

b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar bagi IPB.

2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh

ISOLASI, PENGKLONAN, DAN KONSTRUKSI RNAi GEN

PENYANDI H

+

-ATPase MEMBRAN PLASMA DARI

Melastoma malabathricum

_L.

MUZUNI

Disertasi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Doktor pada

Program Studi Biologi

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2011

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tertutup, 18 Januari 2011:

1. Dr. Ir. Aris Tjahjoleksono, DEA

2. Dr. Ir. Nurul Khumaida, M.Si.

Penguji Luar Komisi pada Ujian Terbuka, 10 Februari 2011:

3. Dr. Ir. Darda Efendi, M.Sc.

Judul Disertasi : Isolasi, Pengklonan, dan Konstruksi RNAi Gen Penyandi H

+

-ATPase Membran Plasma dari

Melastoma malabathricum

L.

Nama

: Muzuni

NIM

: G361050051

Disetujui

Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Suharsono, DEA

Ketua

Prof. Dr. Ir. Didy Sopandie, M.Agr.

Dr. Ir. Utut W. Suharsono, M.Si.

Anggota

Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi Biologi

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr. Ir. Dedy Duryadi S., DEA

Prof.Dr.Ir. Khairil Anwar Notodiputro, MS.

PRAKATA

Alhamdulillah, segala puji hanya untuk Allah SWT yang telah

memberikan rahmat dan kemudahan sehingga penulis dapat menyelesaikan

penelitian maupun penulisan disertasi ini. Disertasi ini disusun berdasarkan hasil

penelitian yang dilakukan selama tiga tahun di Laboratorium

Biotechnology

Research Indonesia – The Netherland

(BIORIN) Pusat Penelitian Sumberdaya

Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB dan Laboratorium

Plant Molecular

Genetics

(PMG),

Nara Institute of Science and Technology

(NAIST), Japan.

Disertasi ini memuat hasil penelitian tentang isolasi, pengklonan, dan konstruksi

RNAi gen penyandi H

+

-ATPase membran plasma dari

Melastoma malabathricum

L., dan selanjutnya diajukan sebagai syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada

Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.

Pada kesempatan ini, penulis menyampaikan penghargaan dan terima

kasih yang tak terhingga kepada Bapak Dr. Ir. Suharsono, DEA selaku ketua

komisi pembimbing, Bapak Prof. Dr. Ir. Didy Sopandie, M.Agr. dan Ibu Dr. Ir.

Utut Widyastuti Suharsono, M.Si selaku anggota komisi pembimbing, atas segala

jerih payah dan waktu yang telah disediakan dengan penuh keikhlasan, kesabaran,

dan kelembutan hati dalam memberi bimbingan, nasehat, arahan, dan dorongan

mulai dari tahap perencanaan, pelaksanaan, hingga penulisan hasil penelitian.

Demikian pula penulis menyampaikan terima kasih dan penghargaan yang tinggi

kepada Prof. Dr. Ko Shimamoto dan Dr. Wong Hann Ling dari

Nara Institute of

Science and Technology

(NAIST), Japan atas bantuan alat dan bahan penelitian

serta teknis pelaksanaan penelitian biologi molekuler selama penulis

melaksanakan penelitian di Laboratorium

Plant Molecular Genetics

(PMG),

NAIST, Japan. Kepada Tim Beasiswa Pendidikan Pascasarjana (BPPS) dan

Program Sandwich dari Ditjen Dikti Depdiknas, serta Tim Hibah Kompetensi a/n

Dr Suharsono, terima kasih atas bantuannya dalam menyediakan biaya

pendidikan.

Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Rektor dan Dekan

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Haluoleo Kendari,

atas izin yang diberikan kepada penulis untuk melanjutkan pendidikan di SPs IPB;

Rektor IPB, Dekan Sekolah Pascasarjana (SPs) IPB, dan Ketua Program Studi

Biologi SPs IPB, atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk mengikuti

pendidikan di SPs IPB Bogor. Kepada seluruh staf pengajar dan administrasi SPs

IPB, penulis menyampaikan banyak terima kasih atas ilmu dan kelancaran

administrasi selama penulis menjadi mahasiswa di SPs IPB. Penulis juga

menyampaikan terima kasih kepada staf PPSHB IPB dan PMG NAIST, atas

bantuannya dalam kelancaran pelaksanaan penelitian di laboratorium.

Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada rekan-rekan mahasiswa

Indonesia di NAIST; rekan-rekan mahasiswa seperjuangan yang masih aktif di

laboratorium BIORIN, yaitu Ibu Sri Listyowati, Ibu Yohana, Bu Hannum, Pak

Ulung, Pak Radite, Bu Ratna, Muhdar, Anita, Nurul, Lita, Ila, Fajri, dan Indah,

serta yang sudah lulus, yaitu Firdaus, Pa Hadi, Yasinta, Niken, Yassier, Ulfa, dan

Jaya; rekan-rekan mahasiswa seperjuangan pada program studi Biologi dan

Agronomi; serta rekan-rekan yang tergabung dalam

Under Tree Badminton Club

,

atas dorongan dan kerjasamanya. Terima kasih disampaikan kepada Pak Abdul

Mulya, Pak Adi, Mbak Pepy Elvavina, Mbak Nia, Mbak Sarah, Pak Asep, dan

Pak Iri atas bantuan dan kerjasamanya.

Secara khusus, penulis sampaikan terima kasih yang tulus ikhlas kepada

istri tercinta, Nun Santi, SE dan ananda tercinta Nurul Fitriah Muzuni, atas segala

bentuk pengorbanan, kesetiaan, kesabaran, pengertian, dorongan moril, dan doa

sehingga penulis mempunyai semangat kerja yang tinggi untuk menyelesaikan

pendidikan S3. Kepada keempat orang tua penulis: Ibunda Wakanima dan

Ayahanda Laubi Mane (almarhum), serta Ibunda Zamlia dan Ayahanda Amin

Indi, yang tanpa mengenal lelah selalu memanjatkan doa demi keberhasilan

puteranya; penulis menyampaikan rasa hormat dan terima kasih yang tulus.

Semoga Allah SWT menyayanginya seperti menyayangi penulis. Kepada seluruh

keluarga yang berada di Mawasangka, Bau-Bau, dan Kendari, penulis

mengucapkan terima kasih atas segala perhatian, kasih sayang, dan simpati yang

diberikan kepada penulis selama ini.

Akhirnya, penulis berharap semoga tulisan ini bermanfaat dan dapat

memberikan sumbangan bagi perkembangan biologi molekuler di Indonesia.

Bogor, Februari 2011

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Mawasangka, Buton, Sulawesi Tenggara pada

tanggal 7 April 1971 sebagai anak pertama dari pasangan Laubi Mane (almarhum)

dan Wakanima. Pendidikan sarjana ditempuh pada Jurusan Kimia, Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor, lulus tahun

1996. Pada tahun 1998, penulis diterima sebagai mahasiswa program magister

sains pada Program Studi Bioteknologi dan lulus pada tahun 2001. Selanjutnya,

pada tahun 2005 penulis diterima kembali sebagai mahasiswa program doktor di

Program Studi Biologi, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.

Sejak tahun 2002, penulis bekerja sebagai staf pengajar pada Fakultas

MIPA Universitas Haluoleo Kendari. Mata kuliah yang menjadi tanggung jawab

penulis adalah pengantar bioteknologi, genetika molekuler, mikrobiologi terapan,

dan biokimia.

Selama mengikuti program doktor, penulis pernah menjadi Ketua

Himpunan Mahasiswa Pascasarjana Sulawesi Tenggara (tahun 2006-2007), dan

pengurus HIWACANA IPB (tahun 2006). Sebuah artikel ilmiah telah diterbitkan

pada Jurnal Agronomi Indonesia Volume 38, No. 1, Tahun 2010, sedangkan dua

artikel lainnya telah penulis siapkan untuk diterbitkan pada jurnal ilmiah yang

terakreditasi. Ketiga artikel tersebut ialah:

1. Muzuni, Didy Sopandie, Utut Widyastuti Suharsono dan Suharsono. 2010.

Isolasi dan pengklonan fragmen cDNA gen penyandi H

+

-ATPase membran

plasma dari

Melastoma malabathricum

L.

J. Agron. Indonesia

. 38 (1): 67-74.

2. Muzuni, Didy Sopandie, Utut Widyastuti Suharsono, Wong Hann Ling, Ko

Shimamoto, Suharsono. Isolasi dan pengklonan gen penyandi H

+

-ATPase

membran plasma dari

Melastoma malabathricum

L.

3. Muzuni, Didy Sopandie, Utut Widyastuti Suharsono, Wong Hann Ling, Ko

Shimamoto, Suharsono. Konstruksi RNAi dari fragmen 3’UTR gen penyandi

H

+

-ATPase membran plasma dari

Melastoma malabathricum

L.

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL ... xv

DAFTAR GAMBAR ... xvi

DAFTAR LAMPIRAN ... xviii

PENDAHULUAN

Latar Belakang ... 1

Tujuan Penelitian ... 4

Strategi Penelitian ... 4

Manfaat Penelitian ...

5

TINJAUAN PUSTAKA

Toksisitas Aluminium ...

6

Penyerapan dan Distribusi Al pada Akar dan Daun ...

7

Lokalisasi Al Subseluler ...

8

Sensitivitas Seluler terhadap Al ... 9

Mekanisme Utama Toksisitas Al ... 10

Gejala dan Pengaruh Umum Toksisitas Aluminium pada Tanaman ... 12

Mekanisme Seluler Toleransi Aluminium ... 13

Eksudasi Senyawa-senyawa Pengkelat Aluminum ... 14

Ekspresi Gen-gen yang Diinduksi oleh Cekaman Al ... 17

Penyerapan Aluminium pada Tanaman

M. malabathricum

L. ... 18

Pengaruh yang Ditimbulkan oleh Penyerapan Aluminium pada

Tanaman

M. malabathricum

... 20

H

+

-ATPase Membran Plasma ... 23

Peranan Fisiologi H

+

-ATPase Membran Plasma ... 25

Struktur H

+

-ATPase Membran Plasma ... 27

Siklus Katalitik ... 30

Regulasi Enzim ... 32

Pengaruh Logam terhadap Aktivitas Enzim ... 33

RNA Interference (RNAi) ... 35

ISOLASI DAN PENGKLONAN FRAGMEN cDNA GEN PENYANDI

H

+

-ATPase MEMBRAN PLASMA DARI

Melastoma malabathricum

L.

Abstrak ... 38

Abstract ... 38

Pendahuluan ... 39

Bahan dan Metode ... 40

Hasil dan Pembahasan ... 43

ISOLASI DAN KARAKTERISASI GEN PENYANDI H

+

-ATPase

MEMBRAN PLASMA DARI

Melastoma malabathricum

L.

Abstrak ... 51

Abstract ... 51

Pendahuluan ... 52

Bahan dan Metode ... 54

Hasil dan Pembahasan ... 59

Kesimpulan ... 65

KONSTRUKSI RNAi DARI FRAGMEN 3’UTR GEN PENYANDI

H

+

-ATPase MEMBRAN PLASMA DARI

Melastoma malabathricum

L.

Abstrak ... 66

Abstract ... 66

Pendahuluan ... 67

Bahan dan Metode ... 69

Hasil dan Pembahasan ... 74

Kesimpulan ... 82

PEMBAHASAN UMUM ... 84

KESIMPULAN DAN SARAN UMUM ... 89

DAFTAR TABEL

Halaman

1 Kompartementasi dan bentuk Al di daun dari beberapa tanaman

akumulator Al ... 23

2 Hasil penyejajaran sekuen asam amino beberapa domain dari

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1

Diagram alir percobaan isolasi, pengklonan, dan konstruksi

RNAi gen penyandi H

+

-ATPase membran plasma dari

Melastoma malabathricum

L ... 5

2

Interaksi A1

3+

dengan saluran yang permeable terhadap efluks

malat pada membran plasma ... 16

3

Peranan asam organik dalam pertumbuhan melastoma ... 22

4

Transport primer dan sekunder melintasi membran plasma ... 25

5

Skema H

+

-ATPase membran plasma AHA2 ... 28

6

Motif sekuen yang terkonservasi pada

loop

kecil dan besar sitoplasma

H

+

-ATPase membran plasma

N. plumbaginifolia

PMA2 ... 29

7

Situs pengikatan Mg-ATP (substrat H

+

-ATPase membran plasma)

pada loop besar sitoplasma yang melibatkan motif III, IV, V, dan VI ... 30

8

Siklus reaksi H

+

-ATPase membran plasma ... 31

9

Hasil PCR menggunakan cDNA total sebagai cetakan dan pasangan

primer

ActF

–

ActR

untuk mendapatkan fragmen aktin yang berukuran

450 pb dan AF2 – AR2 untuk mendapatkan fragmen

Mmpma

... 43

10 Urutan nukleotida fragmen cDNA

Mmpma

... 44

11 Deduksi asam amino fragmen Mmpma ... 44

12 Situs pemotongan enzim restriksi endonuklease fragmen

Mmpma

... 45

13 Model topografi transmembran dan loop sitoplasma dari H

+

-ATPase

membran plasma... 46

14 Profil hidrofobisitas PMA

Sesbania rostrata

, srha5 (A), fragmen

PMA

Sesbania rostrata

(B) dan fragmen MmPMA (C) ... 49

15 RNA Total dari daun

Melastoma malabathricum

... 59

16 Hasil amplifikasi cDNA menggunakan primer

Act

F dan

act

R ... 60

17 Hasil isolasi bagian-bagian gen penyandi H

+

-ATPase membran

plasma dari

M. malabathricum

... 60

18 Hasil pengurutan nukleotida utuh (

full length

) gen penyandi

H

+

-ATPase membran plasma dari

M. malabathricum

(

Mmpma

)

yang diperoleh dari penggabungan urutan nukleotida

Mmpma

5’,

Mmpma

m, dan

Mmpma

3’ berukuran 3155 pb ... 61

19 Peta plasmid pMmpma (6141 pb) yang terdiri dari vektor

pGEM-T Easy (3015 pb) dan cDNA

Mmpma

(3126 pb) ... 62

21 Deduksi asam amino gen penyandi H

+

-ATPase membran plasma

dari

M. malabathricum

... 64

22 Profil hidrofobisitas MmPMA dan PMA

Juglans regia

(AHA1)

menggunakan skala Kyte & Doolittle... 64

23 Vektor pANDA digunakan untuk konstruksi RNAi berukuran 20 kb ... 70

24 Peta fisik plasmid dan situs pengklonan pENTR

TM

/D- TOPO

®

... 71

25 Hasil amplifikasi pMmpma3’ dengan menggunakan primer 3’UTR-F

dan 3’UTR-R ... 74

26 Hasil rekombinasi antara vektor pANDA dan pENTR/D- TOPO

®

yang

membawa fragmen 3’UTR dari

M. malabathricum

L. menghasilkan

vektor RNAi, pANDA/3’UTRMmpma ... 75

27 Hasil PCR menggunakan pANDA/3’UTRMmpma sebagai cetakan

dan pasangan Ubq-F dan Gus-R serta Gus-F dan Nos-R sebagai

primer... 75

28 Penyejajaran hasil sekuensing dari 6 konstruksi 3’UTR Mmpma ke

dalam vektor pANDA yang menggunakan primer Gus-R... 76

29 Penyejajaran hasil sekuensing dari 6 konstruksi 3’UTR Mmpma ke

dalam vektor pANDA yang menggunakan primer Gus-F ... 76

30 Fragmen 3’UTR gen penyandi H

+

-ATPAse membran plasma dari

M. malabathricum

L. membentuk orientasi berulang terbalik yang

diselingi oleh fragmen dari gen

gus

... 77

31 Hasil PCR terhadap koloni

A. tumefaciens

hasil elektroporasi ... 78

32 Hasil PCR menggunakan 4 tanaman transgenik independen

(kolom 2-5), DNA tanaman kontrol (kolom 1), dan DNA vektor

RNAi sebagai cetakan dan pasangan UbiF1 – GusR1 sebagai primer ... 79

33 Tanaman trangenik hasil transformasi RNAi yang membawa

fragmen 3’UTRMmpma dengan konstruksi berulang terbalik

(A1 – A4) dan tanaman non-transgenik (B) yang berumur 3

bulan setelah aklimatisasi... 79

34 Akar tanaman transgenik (A) dan non-transgenik (B) setelah

perlakuan 3.2 mM Al dan pH 4 dalam larutan hara selama 6 hari ... 81

35 Pertumbuhan akar tanaman transgenik dan non-transgenik

pada media hara yang mengandung 3.2 mM AlCl

3

.6H

2

O dan

pH 4 selama 7 hari ... 82

36 Tanaman transgenik yang diperlakukan dengan 3.2 mM AlCl

3

.6H

2

O

dan pH 4 (A) dan tanaman non-transgenik (B) dalam larutan hara

selama 5 hari (A1) dan 7 hari (A2, A3, A4, dan B)... 82

37 Strategi yang digunakan untuk mengisolasi gen penyandi H

+

-ATPase

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1

Kromatogram pengurutan DNA fragmen

Mmpma

m dengan

menggunakan primer T7 dan SP6 ... 109

2

Hasil pengurutan DNA fragmen

Mmpma

m menggunakan primer

T7 dan SP6 ... 112

3

Kromatogram pengurutan DNA fragmen

Mmpma

5’ dengan

menggunakan primer T7 dan SP6 ... 113

4

Hasil pengurutan DNA fragmen

Mmpma

5’ menggunakan primer

T7 dan SP6 ... 116

5

Kromatogram pengurutan DNA fragmen

Mmpma

3’ dengan

menggunakan primer T7 dan SP6 ... 117

6

Hasil pengurutan DNA fragmen

Mmpma

3’ menggunakan primer

T7 dan SP6 ... 120

7

Kromatogram pengurutan DNA gen

Mmpma

dengan menggunakan

primer T7 dan SP6 ... 121

Latar Belakang

✁✂ ✄✂ ☎ ✆✝ ✞✝ ✂✟ ✠ ✡☛ ☞ ✆ ✌✄✟ ✁✠ ✞✝✂ ✄✝ ✂ ☛ ✝✟ ✝ ✞☛ ✄✍✝✟ ✝ ✄☛ ✁✂ ☎✝ ✂ ✎ ✁✏✝✆☞ ✆✝ ✂ ✟ ✠ ✡☎ ✠✝ ✎

✄✂ ✞✁✂ ✌✄✑ ✄ ✆✝✌✄ ✎✝☞ ✟ ☞ ✂ ✁ ✆✌ ✞✁✂ ✌ ✄✑ ✄ ✆✝✌✄✒ ✠ ✡☎ ✠✝✎ ✁✆ ✌✞ ✁✂ ✌✄✑ ✄ ✆✝ ✌✄ ☛ ✄✓✝ ☛✝ ✟ ✆✝✂ ✟ ✝ ☛✝

✆✡✂ ☛ ✄✌✄ ✏✝✓✝ ✂ ✔✝✂ ☎ ✝ ✌✝ ✎ ✒ ✕✁✂ ☞ ✠☞ ✞ ✖☞✗✝☎✔✡ ✘ ✙ ✚ ✛✒ ✜ ✢ ✣✣ ✤ ✥ ✦ ✞✝✂ ✝ ✓ ☞ ✏ ✞ ✄✌✡✏ ✔✝✂ ☎

✎ ✁✠☞ ✟ ✝ ✆✝✂✌✝ ✏✝✓ ✌✝ ✞☞✧✁✂ ✄ ✌✞✝ ✂ ✝ ✓☛ ✄★✂ ☛ ✡✂ ✁ ✌✄✝✎ ✁✎ ✟☞ ✂✔✝✄✌ ✁✗✝ ✠✝ ✂✏ ☞ ✝ ✌✎ ✁✂ ✍✝ ✟✝✄

✤✩ ✒ ✪ ✧☞ ✞✝ ✓✝✦ ✞✁ ✠☞ ✞✝✎✝ ✔✝ ✂ ☎ ✗✁ ✠✝ ✌✝ ✏ ☛✝✠ ✄ ✗✝✓✝ ✂ ☛✝✌✝✠ ✌✁☛ ✄✎ ✁✂ ✒ ✫ ✄✟ ✁ ✞ ✁ ✠✌✁✗☞ ✞

✎ ✁✎✄✏✄✆ ✄✟ ✬ ✔✝✂ ☎ ✌✝✂ ☎ ✝ ✞ ✠ ✁✂☛ ✝ ✓✦ ✗✁✠ ✆ ✄✌✝✠ ✟ ✝☛ ✝ ✟ ✬ ✤ ☛✝ ✂ ✎ ✁✎ ✄✏ ✄ ✆ ✄ ✆✝✂ ☛ ☞✂ ☎ ✝✂

✝✏ ☞✎✄✂ ✄☞✎ ✞✄✂ ☎☎ ✄✜ ✠✝✌✁ ✞✔✡✭ ✖☞ ✠ ✄✝☛ ✄ ✆✝✠ ✞✝ ✢ ✣ ✣ ✮✥✒ ✯✝ ✓✝✂ ✄✂ ✄ ✎ ✁✎✟ ☞✂✔✝ ✄✟ ✡✞ ✁✂ ✌✄

✔✝ ✂☎ ✌✝✂ ☎ ✝ ✞ ✗✁ ✌✝ ✠ ☞ ✂ ✞☞ ✆ ✟ ✁✂ ✄✂ ☎ ✆✝ ✞ ✆✝ ✂ ✟ ✠ ✡☛☞ ✆ ✌✄ ✟ ✁✠ ✞✝✂ ✄✝ ✂ ✒ ✰✆✝✂ ✞✁ ✞✝ ✟ ✄✦

✆✁✗✝✂✔✝✆✝✂✞✝✂ ✝✎✝ ✂✞ ✄☛ ✝ ✆☛ ✝✟ ✝✞✞☞ ✎✗☞ ✓✡✟ ✞✄✎✝ ✏✟ ✝ ☛✝ ✆ ✡✂☛ ✄ ✌✄✏✝ ✓✝ ✂✝ ✌✝ ✎☛ ✁✂ ☎ ✝✂

✆✁✏✝✠☞ ✞✝✂ ✰✏ ✔✝ ✂ ☎ ✞✄✂ ☎☎ ✄✒ ✝☛ ✝ ✆ ✡✂ ☛ ✄✌✄ ✝✌✝✎✦ ✟ ✁ ✠✞☞ ✎✗☞ ✓✝ ✂ ✞✝ ✂✝ ✎✝ ✂ ✎ ✁✂ ☎ ✝✏ ✝✎ ✄

☎✝ ✂☎ ☎ ☞✝ ✂ ✔✝✂ ☎ ☛ ✄ ✌✁✗✝✗✆✝ ✂ ✡✏✁✓ ✟ ✁✂ ☎ ✓✝ ✎✗✝ ✞✝✂ ✏✝ ✂ ☎ ✌☞ ✂ ☎ ✌✁✠✝ ✟✝ ✂ ✓✝✠✝ ✝✞✝ ☞

☎✝ ✂☎ ☎ ☞✝ ✂ ✑☞ ✂ ☎ ✌✄ ✌✁✏ ✝✆✝ ✠✦ ☛ ✝✂ ✓✝ ✏ ✄✂ ✄☛ ✝✟ ✝ ✞ ✞✁ ✠✧✝☛ ✄ ☛ ✝✏ ✝✎ ✱✝✆✞☞ ✲ ✳✢ ✧✝ ✎ ✌ ✁✞✁✏ ✝ ✓

✟ ✁ ✠✏✝✆☞ ✝ ✂ ✰✏✜✴✡✍ ✓ ✄✝ ✂✦✲ ✵ ✵ ✪✥✒ ✰✆ ✄✗✝ ✞✂✔✝✦ ✟ ✁✠ ✞☞ ✎✗☞ ✓✝ ✂ ☛ ✝✂ ✟ ✁ ✠ ✆✁✎✗✝✂ ☎✝ ✂ ✝✆✝✠

✞✁ ✠✓✝ ✎✗✝ ✞✦ ☛✝ ✂ ☛✝ ✏✝ ✎ ✧✝✂ ☎ ✆✝ ✟ ✝✂✧✝✂ ☎ ✝ ✆✝ ✂ ✎✁✎✟ ✁✂☎ ✝ ✠☞ ✓ ✄ ✟ ✁ ✠ ✞☞ ✎✗☞ ✓✝ ✂ ☛✝ ✂

✟ ✁ ✠ ✆✁✎✗✝✂ ☎ ✝✂✗✝☎ ✄✝ ✂✞✝✧☞ ✆✞✝ ✂ ✝✎✝ ✂ ✒

✁ ✠✞☞ ✎✗☞ ✓✝ ✂ ✞✝ ✂✝ ✎✝ ✂ ✟✝ ☛ ✝ ✞✝✂ ✝✓ ✝ ✌✝ ✎ ☛ ✁✂ ☎✝ ✂ ✆✁✏✝✠☞ ✞✝✂ ✝✏ ☞✎✄✂ ✄☞ ✎

✞✄✂☎ ☎ ✄☛ ✝✟ ✝ ✞☛ ✄✟ ✁ ✠✗✝✄✆ ✄☛ ✁✂ ☎✝ ✂✎ ✁✏✝✆☞ ✆✝✂✟ ✁ ✠✝✆ ✄✞✝ ✂ ✞✝✂ ✝✎✝ ✂✎ ✁✏ ✝✏ ☞ ✄✟ ✁ ✠✌✄✏✝ ✂ ☎✝ ✂

✆✡✂✶✁✂ ✌✄✡✂ ✝✏ ✔✝✂ ☎ ☛ ✄✄ ✆☞ ✞ ✄ ☛ ✁✂ ☎✝ ✂ ✌✁✏✁✆ ✌✄ ✌✁✌☞✝✄ ☛ ✁✂☎ ✝✂ ✌✄✑✝ ✞ ✆ ✁☞ ✂ ☎☎ ☞ ✏✝ ✂ ✔✝ ✂ ☎

☛ ✄ ✄✂ ☎ ✄✂ ✆✝✂ ✎ ✝☞ ✟ ☞✂ ✎ ✁✏ ✝✏ ☞ ✄ ✞✁ ✆✂ ✡✏ ✡☎ ✄ ✷✸✰ ✠ ✁✆ ✡✎✗✄✂ ✝ ✂ ✒ ✁✂☛ ✁ ✆✝✞✝ ✂ ✟ ✁✎☞ ✏✄✝✝ ✂

✆✡✂✶✁✂ ✌✄✡✂ ✝✏ ☛ ✄ ✓✝☛ ✝✟ ✆✝✂ ✟✝ ☛✝ ✞✁ ✠✗✝✞✝✌✂✔✝ ✌☞ ✎✗✁ ✠☛ ✝✔✝ ☎ ✁✂ ✁ ✞✄ ✆ ☞ ✂ ✞☞ ✆ ✞ ✡✏✁ ✠✝ ✂ ✌✄

✞✝ ✂✝ ✎✝ ✂✞✁ ✠ ✓✝☛ ✝✟ ✞✝ ✂✝✓✝✌✝✎☛ ✝ ✂✰✏ ✞ ✄✂ ☎ ☎ ✄✦ ✌✁ ✓✄✂☎ ☎ ✝✟ ✁✠✏ ☞☛ ✄✏✝✆☞ ✆✝✂✟ ✁✂ ☛ ✁ ✆✝ ✞✝ ✂

✞✁ ✆✂ ✡✏ ✡☎ ✄ ✷✸✰ ✠ ✁✆ ✡✎✗✄✂ ✝ ✂ ☞ ✂ ✞☞ ✆ ✎ ✁ ✠✝✆✄ ✞ ✞✝✂ ✝ ✎✝✂ ✞✠✝ ✂ ✌☎ ✁✂ ✄ ✆ ✔✝ ✂☎ ✞ ✡✏✁✠✝ ✂

✞✁ ✠✓✝ ☛✝ ✟ ✞✝ ✂ ✝ ✓ ✝✌✝✎ ☛ ✝✂ ✰✏ ✞✄✂ ☎☎ ✄✒ ✫✝ ✓✝✟ ☞ ✞✝✎✝ ✔✝ ✂☎ ✓✝✠☞ ✌ ☛ ✄✏ ✝ ✆☞ ✆✝ ✂ ☛ ✝✏ ✝✎

✟ ✁✂ ☛ ✁ ✆✝✞✝ ✂ ✄✂ ✄✝ ☛✝ ✏✝✓✎ ✁✂ ☎ ✄ ✌✡✏✝✌✄☎ ✁✂ ✳ ☎ ✁✂ ✔✝✂ ☎ ✞ ✁✠✏✄✗✝ ✞☛ ✝✏ ✝✎ ✞✡✏✁✠✝✂ ✌✄✞✝ ✂ ✝✎✝ ✂

✞✁ ✠✓✝ ☛✝ ✟ ✞✝ ✂✝✓✝ ✌✝ ✎ ☛✝ ✂ ✰✏ ✞ ✄✂ ☎ ☎ ✄✆✁✎☞ ☛ ✄✝ ✂ ✎✁✂ ☎ ✄✂ ✞✠ ✡☛ ☞ ✆ ✌✄ ✆✝ ✂ ☎ ✁✂ ✞✁ ✠✌ ✁✗☞ ✞✆ ✁

✞✝ ✂✝ ✎✝ ✂✗☞ ☛ ✄☛ ✝✔✝ ✒ ✹✁✗✁✠✝ ✟✝ ☎ ✁✂ ✔✝ ✂☎ ✞ ✁✠✏ ✄✗✝ ✞☛✝ ✏✝ ✎ ✞ ✡✏✁✠✝✂ ✌✄ ✞✝ ✂✝ ✎✝ ✂ ✞ ✁✠ ✓✝☛ ✝✟

✍✁ ✆✝ ✎✝✂ ✰✏☛ ✝✂ ✞✝ ✂✝✓✝ ✌✝✎ ✞ ✁✏✝✓✗✁ ✠✓✝✌✄✏ ☛ ✄ ✄✌✡✏✝✌✄ ✒✺✁✂ ✳ ☎ ✁✂ ✞✁✠ ✌✁✗☞ ✞✝ ✂ ✞✝✠✝ ✏✝✄✂

✝☛ ✝✏ ✝ ✓☎ ✁✂✟ ✁✂✔✝ ✂ ☛ ✄✻✘✙✚ ✛ ✛✼✙✽ ✾ ✼✿✘✾✿❀ ✾❁✘❂❃ ✼✙✘✾✿✜✕✫✥ ✦❄ ✼❅ ❆✚✿❄ ✾❃ ❁❂❃ ✼✙✘✾✿✚❇✘

❍ ■ ❏ ■❑ ▲ ▼ ◆ ❖ P◗❘

xide Dismutase

❍ ❙❚❯ ❑▲

Catalase

❱❲ ❳

Reticuline Oxygen

Oxidoreductase

❨❲❳❩ ❱❬❬ ❭❪ ❫❲ ❭❬ ❱❲ ❴ ❬ ❩ ❲❳❱❵ ❛ ❱❲❳ ❜❴❲ ❝ ❬ ❱❪ ❞❭ ❬❭ ❍ ❙ ❳❪ ❡❱ ❢ ❳ ❱❲ ❳ ❣❲❴ ❱ ❳❢❴ ❤ ✐ ✐❥ ❦ ❧ ❬♠ ♥❲ ❴ ❱❭

et al.

❤ ✐ ✐♦ ❑ ♣ q❲❱❲ ❩❲❳ ❱❵ ❛ ▲❙❲❭ ❲ r❬

et al

♣ ❍●ss t ❑❝ ❢❴ ♥❲ ❭❬ ❫ ❛ ❢❳❩ ❬❭❪ ❫ ❲❭❬ ❩ ❢ ❳

almt

❤ ❨ ❲❳❩ ❛ ❢❳❨ ❲ ❳ ❱❬

aluminium-activated malate transporter

♣ q❲ ❱❲ ✉ ❢❛ ❝❲r❲❵ ❩ ❢❳ ❞ ❢❳❨❲❳ ❱❬ ❣❙ ✈▲ q❢❴ ❪ ✇ ❬ ❱❲❭ ❢ ❍ q①❧❑ ❱❲ ❳ ❣❯ q ❯❬ ❭❭❪ ♠❬❲ ✉ ❬❪ ❳

q❴❪ ✉❢❬❳❲ ❭ ❢ ②❳♥ ❬❝ ❬ ✉❪ ❴ ❭ ❍ ❣❯②❑ ✉❢❫ ❲♥ ❱❬❬ ❭❪ ❫❲ ❭❬ ❍ ①③❲ r❬

et al

♣ ❤ ✐✐④❑ ▲ ❭❢ ❱❲ ❳❩ r❲❳ ❞❲❱❲ ✉❲❳❲ ❛❲❳ r ❢❱ ❢❫❲❬▲ ❲ ❳✉❲ ❴ ❲ ❫ ❲❬❳ ⑤❴ ❲ ❩❛ ❢ ❳⑥ ⑤❴❲ ❩❛❢❳

gmali

❤ ❍

Glycine max aluminum

induced

❑ ▲

gmali

❤ t▲

gmali

t ✐ ❱❲❳

gmali

④s ▲ ❛❲ ❭❬ ❳❩ ⑥ ❛❲❭ ❬ ❳❩ ❛ ❢ ❳❨ ❲❳❱❬r❲❳ ⑦

⑧ ⑥

❜ ✈q❲❭ ❢ ❛❢❛ ❝❴ ❲ ❳ ❞❫ ❲❭❛❲▲ ❞ ❴ ❪✉❢❬ ❳ ♥ ❬❭ ✉❪ ❳ ⑦❥ ▲ ⑨❜❯⑦⑥ ❱❢♥ ❬ ❱❴ ❪❩ ❢❳❲ ❭ ❢ ❱❲ ❳

Auxin-induced Protein

✉ ❢❫❲ ♥ ❱❬❬ ❭❪❫ ❲ ❭❬❪❫❢♥ ❜ ❳ ❡❲❴❍ ❤ ✐ ✐✐ ❑ ♣ q❲❱❲ ❩❲❳ ❱❵ ❛♠⑩ q✈❶t❤ ❨❲❳❩ ✉❪ ❫ ❢❴ ❲ ❳✉ ❢❴ ♥❲❱❲ ❞❜❫✉❢❫ ❲♥❱❬ ❬ ❭❪❫ ❲ ❭❬❩ ❢❳❞ ❢❳❨❲❳ ❱❬❞ ❴❪ ✉❢❬❳❭ ❞ ❢❭❬ ⑤❬r❝ ❢❴ ❵ r❵❴ ❲❳④❤ r❯❲

❨❲❳❩ ✉❬❱❲ r ❲❱❲ ❞❲❱❲ r❵❫ ✉❬⑩❲ ❴ ❭ ❢❳❭❬ ✉❬⑤❜❫ ❍⑦❲❛ ❬❫ ✉❪ ❳

et al

♣ ●s s ❤ ❑♣ q❲❱❲

Melastoma

malabathricum

❷♣❩ ❢❳❨❲ ❳❩✉ ❢❴❫❬ ❝❲✉❱❲❫❲❛♠ ❢r❲❛❲ ❳❲ ❭❲❛ ❱❲ ❳❜❫✉❬❳❩❩ ❬ ▲❲❳✉❲❴ ❲❫❲❬ ❳ ❩ ❢❳❞ ❢❳❨❲ ❳ ❱❬

multidrug resistance associated protein

❍❸❧ q❑❍ ❙❵♥ ❲❴❭❪ ❳❪

et al

♣●ss♦ ❦ ❹❬❴ ❱❲❵ ❭ ●s s❺❑▲

metallothionein type

● ❍

Mt

●❑ ❍❙❵♥ ❲❴❭❪ ❳❪

et al

♣ ●ss ✐❑ ▲ ⑦

⑧

⑥❜ ✈q❲❭ ❢

❛ ❢❛❝❴ ❲ ❳ ❞ ❫❲❭❛❲ ❍

Mmpma

❑ ❍❸❵③❵ ❳❬

et al

♣ ●s❤ s ❑ ▲

major facilitator superfamily

❍

Mamfs

❑ ❍❻❬❱❨❲ ❴ ✉❬❳❬ ●s s❶❑ ▲ ❱❲❳ ❭❬ ✉❴ ❲✉ ❭❬❳✉❲ ❭ ❢ ❍

Mmsc

❑ ❍❸❵❭♥ ❪ ⑤❲ ●s❤ ❤ ❑ ✉ ❢❫❲♥ ❝ ❢❴ ♥❲ ❭❬ ❫❱❬❬❭❪ ❫❲❭❬ ♣

❙❲ ❫❲ ♥❭❲✉ ❵ ❩ ❢ ❳❨❲❳❩✉❢❴❫ ❬❝ ❲ ✉❱❲ ❫❲ ❛✉ ❪❫❢❴ ❲❳❭❬✉ ❲ ❳❲❛❲❳✉ ❢❴ ♥❲❱❲ ❞✉❲❳❲♥❲❭❲ ❛

❱❲❳ ❜❫ ✉❬❳❩❩ ❬ ❲ ❱❲ ❫❲ ♥ ❩ ❢❳ ❞ ❢ ❳❨❲❳❱❬ ⑦ ⑧

⑥ ❜ ✈q❲ ❭ ❢ ❛ ❢❛❝ ❴ ❲ ❳❞ ❫❲ ❭❛❲ ❍ ❜ ❳ ❡❲❴ ❤ ✐ ✐ ✐❦

❜♥ ❳

et al

♣ ●s s t ❑ ♣ ❣ ❢❳ ❬ ❳❬ ❝ ❢❴❵ r❵ ❴❲❳ ❥④s s ⑥ ❲ ❳ ❞❝ ❱❲ ❳ ❛ ❢ ❳❨❲❳❱❬r❲❳ ✐④ ❺ ❲❭❲ ❛ ❲❛❬❳❪ ♣ ⑦

⑧

⑥ ❜ ✈q❲ ❭ ❢ ❛❢❛❝ ❴ ❲ ❳ ❞ ❫❲ ❭❛❲ ❛ ❢❴ ❵ ❞❲r❲ ❳ ❞❴ ❪ ✉❢❬❳ ❨ ❲ ❳❩ ❞❲ ❫ ❬ ❳❩ ❛ ❢❫❬ ❛❞ ❲♥

❞❲❱❲ ❛ ❢❛ ❝❴ ❲❳ ❞ ❫❲ ❭❛❲ ❱❲❳ ✉❢❴ ❫ ❬❝ ❲✉ ❱❲ ❫❲ ❛ ❝❲❳❨❲r ❴ ❢❭❞❪ ❳❭ ♠ ❢ r❲ ❛❲❳♣ q❴❪ ✉❢❬❳ ❬❳❬

❛ ❢❳❩ ❲ r✉ ❬⑩❲❭❬ ❭ ❢❴ ❲ ❳❩ r❲ ❬❲❳ ✉❴ ❲ ❳❭❞ ❪ ❴ ✉ ❢❴ ❭ ❢r❵ ❳❱ ❢❴ ❱❢ ❳❩❲❳ ❛ ❢ ❳❩ ♥ ❲❭❬ ❫ r❲❳

proton

motive force

❨❲❳❩ ❱❲ ❞ ❲✉ ❛❢❳❩❩ ❢❴ ❲r r❲❳ ❝ ❲ ❳❨ ❲ r ❭❪ ❫ ❵✉▲ ❲ ❭❬ ❛❬❫ ❲✉ ▲ ❲ ✉❲❵ ❛ ❢✉ ❲❝ ❪❫ ❬✉ ❛ ❢❫ ❬❳✉ ❲❭❬❛❢❛❝ ❴ ❲ ❳❞ ❫❲ ❭❛❲❍❙❵ ❭❭❛ ❲ ❳❤ ✐ ✐ t ❑♣⑦

⑧

⑥❜ ✈ q❲❭ ❢❛ ❢❛ ❝❴ ❲❳❞ ❫❲ ❭❛❲✉❢❴ ❫ ❬❝ ❲✉

❱❲ ❫❲ ❛❴ ❢❩ ❵ ❫❲ ❭❬❴ ❢❭❞❪ ❳❭✉ ❢❴ ♥❲❱❲❞❝ ❢❴ ❝❲ ❩ ❲❬❴ ❲❳❩❭❲❳❩ ❲ ❳❫ ❬ ❳❩ r❵ ❳❩❲❳ ▲❭ ❢❞ ❢❴✉ ❬♠❢r❲ ❛❲ ❳

❜❫ ❍ ❜❳ ❡❲ ❴❤ ✐ ✐✐❦ ❜♥ ❳ ●ss t ❑ ▲♠❢ r❲ ❛❲ ❳ ⑨❲ ❏❫❍ ⑨❬❵

et al

♣ ❤ ✐ ✐❺❑ ▲ ❱❢ ⑤❬❭❬❢❳❭❬ ⑤❪ ❭ ⑤❲✉ ❍❼❲❳

et al

♣ ●s s●❑▲ ❱❲❳♠❢r❲ ❛❲ ❳ ❲ ❛❛❪ ❳❬❵ ❛❍❽❢❴ ❳ ❢❾♠ ❿ ❷❢❩ ❬❭❲ ●s s ❤ ❑ ♣❙ ❢❫❲ ❬ ❳❬ ✉❵ ▲ ⑦

⑧

⑥ ❜ ✈q❲ ❭ ❢❛ ❢❛❝ ❴❲❳❞❫ ❲❭❛❲ ❾❵❩ ❲✉ ❢❴ ❫ ❬❝ ❲✉ ❱❲❫❲ ❛❞ ❢❛❲❳❾❲❳❩ ❲ ❳❭ ❢❫❨ ❲❳❩❱❬ ⑤❲❭❬ ❫ ❬✉❲ ❭❬

❪❫❢♥ ❲ ❵ r❭❬❳ ❭ ❢❫ ❲❛❲ ❞ ❢❴ r❢❛❝ ❲ ❳❩ ❲ ❳ ❢❛ ❝❴ ❬ ❪ ❩❲❳❱❵ ❛ ❍ ❧ ❪❝ ❢❴ ⑥➀❫❢❝ ❢❴

et al

♣ ●s s❥ ❑ ▲ ❱❲❳✉ ❢❴❫ ❬❝ ❲ ✉❞ ❵❫ ❲❱❲❫ ❲❛♥ ❪ ❛ ❢❪❭✉ ❲❭❬ ❭❞⑦❭❬✉ ❪ ❞❫ ❲❭❛❲✉❲❳❲❛❲❳❍❼❪ ❵ ❳❩

et al

♣❤ ✐ ✐♦ ❑ ♣

➂➃➄ ➃➅➃➄ ➆➇➈ ➉ ➊ ➋➌ ➍ ➎➊ ➎ ➏ ➐➈ ➑ ➊➈ ➒➈ ➓ ➃➄ ➔ →➣ ↔↕ ➃➄ ➙ ➛ ➜↕ ➅➃➙ ➣ →➝➄ ➔ ➃➄ ➔ ➝➄ ➞ ➟

➠

➡ ➂➢ ➃➙ ➝ ➅ ➝➅➤↕ ➃➄ ➥ ➦➃➙ ➅➃ ➧ ➡➞➡➁➨ → ➃➥ ➃ ↔ ➅➝ ➅➥ ➝↕ ➤ ➃➣ ➩➣ ➥ ➝↕ ↔➫ ➅ ➤➫ ➭ ➃➄ ➥ ➃→ ➃ ➥➞

↕ ➝➄ →➃ ➭ ➙ ➝➦ ➃➅ ➃➥ ➝↕ ➩ ➝➅ ➤➃➄➔ ➃➄ ➩ ➝➯ ➃ ➅➤ ➃➭➧ ➲ ➜➫➄ ➔ ➳➏ ➈➑ ➵ ➸➺ ➺ ➻ ➨➵ ➡➞➡➁ ➅➝↕ ➫ ➥➃➩ ➃➄

➔ ➝➄ ➓ ➃➄➔ ↔➝↕ ➝➩ ➙ ➥↕ ➝➙➣ ➥ ➃ →➃ ➙ ➝➦➠ ➙ ➝ ➦ ➩ ➜➅ ➥➃➄ ➣ ➜➄ ➛ ➦ ➜➝ ➅➼ ➓ ➃➣↔➫ →➃ ➝↕ ➃ ➭ ➓ ➃➄ ➔

➤➝↕ ↔➃➄➔ ➔ ➫➄ ➔ ➽➃➾➃ ➤ → ➃ ➦➃➅ ➥ ➝➄ ➔ ➃➄ ➔➩ ➫ ↔➃➄ ➽➃↕ ➃➩ ➽ ➃➫ ➭ → ➃↕ ➣ ➔➫ ➦ ➃➼ ➭➃↕ ➃ → ➃➄ ➭ ➜↕ ➅➜➄ ➵

➚➦➜ ➝➅ ➅ ➝➅➥➫ ➄ ➓ ➃➣➥➞ ➻➼➪ ➃ ↔➃➫ ➦ ➝➤➣ ➭ ➙ ➝➭➣➄ ➔ ➔ ➃ ➦➝➤➣➭➙ ➝➄ ➙➣ ↔➣ ➛ ↔➝↕ ➭ ➃ →➃ ➥ ➥➞↕ ➝➄ → ➃ ➭➼

➙ ➝➭➣ ➄➔ ➔ ➃ →➃ ➝↕ ➃ ➭ ➣➄ ➣ ➅➝↕ ➫ ➥ ➃➩ ➃➄ ↔➃↕➔ ➝ ↔ ➫ ↔ ➃➅ ➃ ➥➞ ↕ ➝➄ →➃ ➭➵ ➶➩ ➙ ➥↕ ➝➙➣ ➔ ➝➄ ➡➞➡➁

➅➝➄ ➔ ➭➃➙➣➦➩ ➃➄ ➝➄➹➣ ➅ ➓ ➃➄ ➔ →➃ ➥ ➃↔ ➅➝➅ ➜➅ ➥➃ ➞ ➟

➩ ➝➦➫ ➃↕ ➙ ➝➦ ➙ ➝➭➣ ➄➔ ➔ ➃ ➥➞ →➃ ➥ ➃↔

→➣➥ ➝↕ ↔➃ ➭ ➃➄ ➩ ➃➄ ➥ ➃→ ➃➩ ➜➄ →➣➙➣ ➤ ➃➙ ➃➵➢ ➝➄➔ ➃➅ ➃↔➃➄ ↔➝↕ ➙ ➝➤➫ ↔➅➝➄ ➫ ➄➽ ➫ ➩ ➩ ➃➄➥➝↕ ➃➄ ➃➄ ➞ ➟

➠

➡ ➂➢ ➃➙ ➝ ➅➝➅ ➤↕ ➃➄ ➥ ➦➃➙ ➅➃ → ➃➦ ➃➅ ➭ ➜ ➅➝➜➙ ↔ ➃➙➣ ➙ ➥➞ ➙➣ ↔ ➜ ➥ ➦➃➙➅➃ ↔➃➄ ➃➅➃➄ ➧ ➲➜➫ ➄ ➔ ➳➏

➈➑ ➵➸➺➺ ➻ ➨➵

➂➫ ➅➤➫ ➭ ➃➄ ➘

.

➴➈➑ ➈ ➉➈ ➏➐➇ ➊➷ ➬➴➮➵ ➓ ➃➄ ➔→➣ ↔ ➝➅➫➩ ➃➄↔ ➝↕ ➫ ↔➃ ➅➃→➣→➃ ➝↕ ➃ ➭↔↕ ➜➥➣ ➙ →➣→➫➔ ➃ ➅ ➝➅ ➥➫ ➄ ➓ ➃➣ ➙ ➣➙ ↔ ➝➅ → ➝↔ ➜➩ ➙➣ ➛➣ ➩ ➃➙➣ ➡ ➦ ➙➝➭➣➄ ➔ ➔ ➃ →➃ ➥ ➃↔ →➣➔ ➫➄ ➃➩ ➃➄ ➙ ➝ ➤ ➃➔ ➃➣

➙➫ ➅ ➤ ➝↕ ➔ ➝➄ ➫ ➄ ↔➫ ➩ ↔➜ ➦➝↕ ➃➄ ➙➣ ↔➃➄ ➃ ➅➃➄ ↔ ➝↕ ➭ ➃→ ➃ ➥ ↔ ➃➄ ➃➭ ➃➙ ➃➅ →➃➄ ➡ ➦ ↔➣➄ ➔ ➔ ➣➵

➂➫ ➅➤➫ ➭ ➃➄↔ ➝↕ ➙ ➝ ➤➫ ↔→ ➃ ➥➃ ↔↔➫ ➅ ➤➫ ➭→➝➄ ➔ ➃➄ ➤ ➃➣ ➩➥ ➃→ ➃↔ ➃➄ ➃ ➭➃➙ ➃ ➅➙ ➝ ➭➣ ➄ ➔➔ ➃➅➝➄➽➃→➣

➣➄ →➣➩ ➃↔ ➜↕ ↔➃➄ ➃ ➭ ➃➙ ➃ ➅➼ → ➃➄ → ➃ ➥➃ ↔ ➅➝➄➔ ➃➩ ➫ ➅➫ ➦➃➙➣ ➃ ➦➫ ➅➣➄ ➣➫ ➅ → ➃➦➃ ➅➽ ➫ ➅➦ ➃➭ ↔➣➄ ➔ ➔➣

→➣ →➃➫ ➄ → ➃➄ ➃➩ ➃↕ ➙ ➝ ➭➣➄ ➔➔ ➃ →➣➙➝➤➫ ↔ ➙ ➝ ➤➃➔ ➃➣ ➭➣ ➥ ➝↕ ➃➩➫ ➅➫ ➦➃ ↔➜↕ ➡ ➦ ➧➱➃ ↔➃➄ ➃ ➤➝ ✃

❐➙ ➃➩ ➣ ❒➪ ➪❒ ➃➨➵ ➢ ➃→ ➃ ➥➞ ❮➵➪ ➼ ➥ ➝↕ ↔➫ ➅➤➫ ➭➃➄ ➃➩ ➃↕ ➘

.

➴➈ ➑➈ ➉ ➈➏➐➇ ➊➷➬➴ ➮➵ ↔➣→ ➃➩ ↔➝↕➔ ➃➄➔ ➔ ➫➼ ➩ ➝➯➫ ➃ ➦➣ ➥ ➃→ ➃ ➥➞ ➁➵➪ ➓ ➃➄➔ ➭ ➃➄➓ ➃ ➃→ ➃ →➣ ➦➃ ➤ ➜↕ ➃ ↔➜↕ ➣➫ ➅ ➧❰➫ ➭ ➃➝ ➅➣ ➄

❒➪ ➪➻ ➨➵ ❰➝➄ ➫↕ ➫ ↔ ➱➃↔➃➄ ➃ ➤ ➝ ➳➏ ➈ ➑➵ ➧ ➸➺ ➺ ➻ ➃ ➨➼ ➘

.

➴➈ ➑➈ ➉ ➈➏➐➇ ➊➷➬➴ ➮➵ ➅➃➅ ➥➫ ➅➝➄ ➔ ➃➩ ➫ ➅➫ ➦➃➙➣ ➦ ➝➤➣ ➭ → ➃↕ ➣ ➸ ❮➵ ❮ ➔ ➡ ➦Ï➩ ➔ → ➃➫➄ ↔➫ ➃ →➃➄ ➦➝➤➣➭ → ➃↕ ➣ ➻➔ ➡ ➦Ï➩ ➔ → ➃➫ ➄

➅➫ →➃ ↔ ➃➄ ➥ ➃➅➝➄ ➔ ➃➦ ➃➅➣➩ ➝↕ ➃➯➫ ➄ ➃➄ ➵➡➄➃➦➣ ➙➣➙ ➃➩ ➫ ➅➫ ➦➃➙➣➡ ➦➥➃ → ➃ ➘➳➑ ➈ ➎➏➌➴➈➈ ÐÐ➊➒ ➳

Ñ➵Ñ➜➄➵

➧➙➣➄ ➜➄ ➣ ➅→➝➄➔ ➃➄ ➘➳➑ ➈ ➎➏➌➴➈ ➴➈ ➑➈➉ ➈ ➏ ➐➇ ➊➷ ➬➴ ➮➵ ➨➓ ➃➄ ➔ ➅➝➄ → ➃ ➥➃ ↔➯➝➩ ➃ ➅➃➄ ➁➵ ❒ ➅❰➡ ➦ ➥ ➃→ ➃➥➞ ❮ → ➃➦ ➃➅➅ ➝→➣ ➃➯ ➃➣↕ ➅➝➄ ➫➄ ➽➫ ➩ ➩ ➃➄ ➤ ➃➭ ➾➃ ➘

.

➈ Ð Ð ➊➒ ➳ Ñ➵ Ñ➜➄➵ ➅➃➅ ➥➫ ➅➝➄ ➔ ➃➩ ➫ ➅➫ ➦➃➙➣ ➻➵ ➻➸ ➔ ➡ ➦Ï➩ ➔ →➃➫ ➄ ↔➫ ➃ ➙➝↔ ➝➦➃ ➭ ❒ ➤➫ ➦➃➄ ➥ ➝↕ ➦➃➩ ➫ ➃➄

➧❰➫ ↔➣ ➃➙ ➃↕ ➣❒➪ ➪➻ ➨➵

Ò➝➤ ➝↕ ➃ ➥➃➩ ➃➽➣➃➄↔➝➄ ↔➃➄➔ ➝➩ ➜ ➛➣➙➣➜ ➦➜➔ ➣ ➃ →➃ ➥ ↔➃➙ ➣❰➝➦ ➃➙ ↔ ➜➅➃ ➥➃ →➃ ↔➃➄ ➃ ➭➃➙ ➃ ➅

→➝➄ ➔ ➃➄ ➩ ➝➦ ➃↕ ➫ ↔➃➄ ➡ ➦ ➓ ➃➄ ➔ ↔➣ ➄ ➔ ➔➣ ↔ ➝➦ ➃ ➭ →➣ ➦ ➃➩ ➫ ➩ ➃➄ ➜ ➦➝ ➭ ❐➙ ➃➩➣ ➳➏ ➈ ➑➵ ➧ ➸➺➺ ➻ ➨ → ➃➄

➱➃↔ ➃➄ ➃➤ ➝ ✃ ❐➙➃➩ ➣ ➧ ❒➪➪❒ ➃➨➼ ➙➝ →➃➄ ➔➩ ➃➄ ➩ ➃➽ ➣ ➃➄ ➙ ➝➯ ➃↕ ➃ ➅➜ ➦➝➩ ➫ ➦➝↕ ↔➝ ➦➃➭ →➣➦➃➩ ➫➩ ➃➄

➜➦➝ ➭ ❰➫ ➙ ➭ ➜➛ ➃ ➧ ❒➪➸ ➸ ➨➼ ❰➫➹➫ ➄➣ ➳➏ ➈➑➵ ➧❒➪➸➪➨➼ Ó➫ ➭ ➃↕ ➙➜➄ ➜ ➳➏ ➈ ➑➵ ➧ ❒➪ ➪➻Ô ❒➪➪➺ ➨➼

➱➣ →➓ ➃↕ ↔➣➄ ➣ ➧ ❒➪ ➪ Õ➨➼ →➃➄ ➚➣↕ → ➃➫ ➙ ➧ ❒➪ ➪ Ö➨ →➝➄ ➔ ➃➄ ➅➝➄➔ ➣➙ ➜➦ ➃➙➣ ➔ ➝➄ ➠➔ ➝➄ ➓ ➃➄➔ ↔➝↕ ➦➣➤➃↔

Ø ÙÚ ÙÛ Ø Ü Ý ÙÞß ÞÙà ßà Ûß Þ áâ ÝÙ Þß Þ Ùà Ü ãä ÝÙ ãÜ åâ à Ùà Û Ùæ Ù ÝÙÜà Ø âà å Ùà áâÝÙ Þß Þ Ùà

Úâ à ÙÚ Ü ãÙà Ûâæç ÙØ ÙÚ Ú ß ãÛ ÙÞ Ù åâ à ä á Ø Ùà Ú ß ãÛÙ ÞÙ èéêëì í îï ðñí òó ôõ ôö÷ ô

ø öù ú÷ û öüý þ üÿ ú

-Polymerase Chain Reaction

ì Ø Ùà íëñ ✁ ò

Rapid Amplification

cDNA Ends

✂ íëñ ✁ ÙØ ÙÝ Ùç ãÜà ÛâãÜãèéêë Øâ à å Ùà áâ àå å ßà Ù ÞÙà áíêë ãâ✄Ùå ÙÜ èâÛÙ ÞÙà Ø Ùà ãâ Þß âà Ü à Ûâ æà ÙÝ ☎ Ùà å ãßØ Ùç ØÜÞâÛÙç ßÜ ß æß ÛÙà àß Þ ÝâäÛÜØ Ùà☎Ù ãâ æ ÛÙ

ÙØ ÙÚ Ûâ æ Ú ÙØ Ù ß✆ß à å ✝ ✞ ÙÛ Ùß ✟ ✞ ãâ✄Ùå ÙÜ Ú æÜ áâ æ✂ í êëÜ ãÙà å Ù Û ✄â æ áÙà✠Ù ÙÛ ß à Ûß Þ

áâ áÚâÝÙ✆Ù æÜ✠ß à å ãÜãß Ù Ûß åâ à✂í êëÜ áâà ☎ â✄Ù✄Þ Ùà áí êë Ûâ æØ âå æ ÙØ Ù ãÜãâç Üà å å Ù

åâ àáâà✆ÙØ ÜÛÜØ Ù Þ✄âæ✠ß à å ãÜ✂ð ÙØ ÙÚ â àâÝÜÛÜÙàÜà ÜìÞ ÙáÜÛâÝÙçáâ Ý ÙÞß ÞÙàÜãä ÝÙãÜØ Ùà

Úâ à å Þ Ýäà Ùà å âà Ú âà ☎ Ùà Ø Ü ✡ ☛

ï ë îð Ù ãâ áâ á✄æ Ùà Ú ÝÙ ãáÙØ Ù æÜ

M. malabathricum

áâ Ý ÙÝß Üíîï ðñ íØ Ùà áâ ÛäØ âíëñ ✁ ãâæ ÛÙÞäà ãÛæß Þ ãÜ☞â Þ Û ä æßà Ûß Þâ Þ ãÚ æ ÙãÜí êëÜ

Ø Ùà Û æ Ùà ã✠ä æá ÙãÜ

Melastoma malabathricum

✌✂ Ø â àå Ùà í êëÜß à Ûß Þ áâáÚ â Ý Ù✆ÙæÜ Úâæ Ùà Ùàåâ à Ûâæãâ✄ß ÛØ ÙÝ ÙáÛ äÝâ æ Ùà ãÜ ÛÙà Ù áÙàØ ÙæÜèâ Þ Ù áÙàë ÝØ Ùàæâ àØ ÙçÚ ✡✂

Tujuan Penelitian

ðâ àâÝÜÛÜ ÙàÜ àÜ✄â æ Ûß✆ß Ùà ✍

✎✂ ✏âà å Ü ãä Ý ÙãÜ Ø Ùà áâà å ÞÝ äà ✠æ Ùå áâ à å â à Ú âà ☎ Ùà Ø Ü ✡ ☛

ï ë îð Ù ãâ áâ á✄æ Ùà

Ú ÝÙ ãáÙØ Ù æÜ

M. malabathricum

✌✂

✑✂ ✏âà å Ü ãä Ý ÙãÜ Ø Ùà áâ àå Þ Ýäà å âà Ú â à☎ÙàØ Ü ✡ ☛

ï ë îð Ù ãâ áâá✄æ Ùà Ú Ý ÙãáÙ

ò

Mmpma

ß ÛßçØ ÙæÜ

M. malabathricum

✌✂

✝ ✂ ✏â áÚâÝÙ✆Ù æÜ ÚâæÙà Ùà åâà

Mmpma

áâ Ý Ù Ýß Ü Þ äà ãÛ æß Þ ãÜ ☞âÞÛ ä æ âÞãÚ æâãÜ ß à Ûß Þ í êëÜ ✄â æØ ÙãÙ æÞ Ùà✝ ✞✒îíå â àÚ âà ☎ Ùà Ø Ü ✡

☛

ï ëîð Ùãâ áâ á✄æ ÙàÚ ÝÙ ãáÙØ Ù æÜ

M.

malabathricum

✌✂

× ✂ ✏â Ý ÙÞß ÞÙà Û æ Ùà ã✠ä æá ÙãÜ Û Ùà Ùá Ùà

M. malabathricum

✌✂Ø â àå Ùàå âà Úâ à ☎ Ùà ØÜ í êëÜ

Mmpma

áâÝÙ Ýß Ü

Agrobacterium tumefaciens

✁ ✡ë✎ ✓✎✂

Strategi Penelitian

✔Û æÙ Ûâ å Ü ☎ Ùà å Ø Ü åß à ÙÞ Ùà ß à Ûß Þ áâ à è ÙÚ ÙÜ Ûß✆ß Ùà ÙØ ÙÝ Ùç áâ á✄ÙåÜ

Úâ à â ÝÜ ÛÜ Ùà áâ à✆ÙØÜ✝ò ÛÜå Ù Ù ãÚâÞÞÙ✆ÜÙà ò✕ Ùá✄Ù æ✎ ì☎ ÙÜ Ûß✍

✎✂ ✖ãä ÝÙ ãÜ Ø Ùà Ú âà å Þ Ý äà Ùà ✄ÙåÜÙà Ûâ à å Ùç å âà Ú âà ☎ Ùà ØÜ ✡ ☛

ï ë îð Ù ãâ áâá✄æ Ùà

Ú ÝÙ ãáÙØ Ù æÜ

Melastoma malabathricum

✌✂ ✡ÙÝÜà ÜØ Ü Ý ÙÞß ÞÙàß à Ûß Þáâà ØâãÙÜà Ú æÜáâæ ãÚ â ãÜ✠Ü Þ Ùå Ù æ áâ àØ ÙÚ Ù ÛÞ Ùà ✄ÙåÜÙà ß✆ß àå ✟ ✞ Ø Ùà ✝ ✞ åâ à ãâç Ü àå å Ù

✘ ✙ ✚ ✛✜ ✢ ✣✛✤ ✥ ✣✦ ✧ ★✦ ✩ ✪✢✜ ✦ ✣✦ ✩ ★✦ ✧ ★✦ ✫ ✣✦ ✥✤ ✬ ✭

✮ ✯✰✱ ✣✛ ★ ✲ ★✲ ✳✴ ✣✦ ✧ ✢ ✣✛✲ ✣ ✥ ✣✴ ✤ ✵

.

✶✷ ✸✷ ✹ ✷ ✺✻ ✼✽ ✾✿ ✶❀ ✙❁ ✵✶❂ ✶✷ ❃✳ ★✴ ✥ ✣✛ ✣✴ ✪✣✦❄✴ ✣✩✲★✦ ✳✣✩✤✣✦ ❅ ★✦ ✩ ✣❆ ❅★✴ ✛ ★ ✳❇ ❅ ✙

❈ ✙ ❉✜✦ ✛ ❅✴ ❇ ✪✛✤ ❊ ❋✯✤ ✥ ✣✴ ✤ ❄✴ ✣✩✲★✦ ❈ ● ❍✰❊ ✩ ★✦ ✵✶❂ ✶✷ ❇ ✦ ❅❇ ✪ ✲★✲ ✧ ★✢ ✣■ ✣✴✤

✧ ★✴ ✣✦ ✣✦✩ ★✦ ❅★✴ ✛ ★✳❇ ❅✙

Manfaat Penelitian

✱ ★✦ ★✢✤❅✤ ✣✦✤ ✦✤✳★✴ ✲ ✣✦ ❄ ✣✣ ❅❇ ✦ ❅❇ ✪❏

❑✙ ▲★✲ ✧ ★✢ ✣ ■✣✴✤❅✜ ✢ ★✴ ✣✦ ✛✤❅ ✣✦ ✣✲✣✦❅★✴ ❆ ✣ ✥✣✧✪★✴ ✣▼❇ ✦ ✣✦✣✢ ❇ ✲✤✦ ✤ ❇✲ ✙

✘ ✙ ✱ ★✴ ✳ ✣✤✪✣✦ ✩ ★✦ ★❅✤ ✪ ❅✣✦ ✣✲ ✣✦ ✥★✦✩ ✣✦ ✲ ★✴ ✣✪✤ ❅ ❅✣✦ ✣✲✣✦ ✫ ✣✦ ✩ ❅✜ ✢ ★✴ ✣✦ ❅ ★✴ ❆ ✣ ✥✣✧

▼★ ✪✣✲ ✣✦✣✢❇ ✲✤✦ ✤❇ ✲✲ ★✢ ✣✢ ❇✤✧ ★✦ ✥★ ✪✣ ❅✣✦❅★ ✪✦ ✜✢ ✜✩ ✤◆❋✯✴ ★ ✪✜ ✲ ✳✤ ✦ ✣✦ ✙

❖P ◗❘ P ❙❚ ❯ ❱❲P ❳ ❙P◗ P ❨❲ ❙ ❩❬ ❙❭❪ ❘ PP ❫ ❲❴❪ ❨P❴❲ ❵ ❩❬❫❳❛ ❨❪ ❫P❫ ❵ ❜P❫ ❛ ❪ ❫❴ ❝ ❙❞ ❛ ❴❲ ❡❢ ❣❲ ❳❬ ❫ ❩❬ ❫❤P ❫ ❜❲ ✐

❥

❦❣❧ ♠P ❴❬ ◗❬◗❘ ❙P ❫ ❩❨P❴ ◗P ❜P ❙❲ ♥♦ ♣q rst ✉ q✉ q ♣q✈ q s✇ ①② ③④ ✉ ⑤❯ ❡ ❣⑥⑦❵ ⑧ q⑨ ②⑩ q ✉⑨ ♣② ❶② ③ qs② t ❷ ③❸❹ ❺ ♦❷⑩ r❻ ❼ ❽❾❧❡❵ ❼ ❽ ④❷ s① q ❷ r♣q s♦ ⑩ ① ♦❿ ② t ❷❻ ❡❢ ❣❲ ❵⑧ ❹ ❺② ❷s♦ ① ❶♦ ①♦ ❷ ③♦❯

Disain primer

spesifik

PM H

+

_{-ATPase bagian}

tengah

PM H

+

-ATPase bagian

ujung 5’

3’RACE

Konstruksi RNAi

Pembentukan cDNA

melalui transkripsi balik

Isolasi RNA total

PCR dengan

primer spesifik

Disain primer spesifik

untuk isolasi ujung 5’

Disain primer spesifik

untuk isolasi ujung 3’

PM H

+

-ATPase bagian

ujung 3’

PM H

+

-ATPase

Full Length

3’UTR

Transformasi

pada Melastoma

Uji toleransi tanaman terhadap

cekaman aluminium

Percobaan I

Percobaan II

Toksisitas Aluminium

Aluminium merupakan logam yang mempunyai kelimpahan tinggi ketiga

di kulit bumi (Orvig 1993). Secara normal, aluminium (Al) berada dalam bentuk

oksida dan kompleks aluminosilikat yang tidak larut dan tidak toksik. Aluminium

mempunyai muatan ionik tinggi dan radius ionik rendah, dengan rasio muatan

terhadap radius (z/r) sebesar 5.9 sehingga Al dapat mempolarisasi molekul air.

Aluminium membentuk ikatan koordinasi dengan enam molekul air dalam

konfigurasi oktahedral. Derajat polarisasi ikatan O-H yang tinggi dapat dihasilkan

tergantung pada pH media, melalui disosiasi satu atau lebih proton:

Al(H

2

O)

6

3+



Al(H

2

O)

5

2+

+ H

+

Aluminium selanjutnya mengalami seri hidrolisis yang tergantung pH (Orvig

1993). Bentuk Al tersebut sering disingkat menjadi Al

3+

atau Al(OH)

n

3-n

.

Pada pH netral, Al membentuk kompleks dengan ion hidroksida, Al(OH)

3

,

yang tidak larut, sedangkan pada pH asam, Al berada dalam bentuk Al

3+

yang

merupakan bentuk Al yang paling toksik. Pada larutan dengan pH yang lebih

rendah dari 5.0, ion Al berada dalam bentuk oktahedral heksahidrat, Al(H

2

O)

6

3+

,

sering disingkat dengan Al

3+

. Pada larutan yang keasamannya berkurang,

Al(H

2

O)

6

3+

mengalami deprotonasi menjadi Al(OH)

2+

dan Al(OH)

2

+

. Pada larutan

netral menyebabkan Al(OH)

3

mengendap dan larut kembali pada larutan basa

dengan membentuk formasi tetrahedral, Al(OH)

4

-

(Delhaize & Ryan 1995;

Marschner 1995). Pada kondisi rasio Al

3+

/OH

-

tinggi, spesies polinuklear seperti

polikation tridekamerik, Al

13

, terbentuk dari Al(OH)

2+

(Parker & Bertsch 1992).

Spesies kimia Al yang toksik adalah Al

3+

dan mononuklear hidroksida,

Al(OH)

2+

dan Al(OH)

2

+

(Kinraide 1991). Beberapa studi telah menunjukkan

bahwa polikation tridekamerik, Al

13

, merupakan spesies Al yang juga mempunyai

toksisitas tinggi.

Aluminium merupakan kation reaktif tinggi dengan rasio ionik terhadap

karakter kovalen yang tinggi. Oleh karena itu, Al akan berikatan dengan gugus

donor yang bermuatan negatif. Fluorida, anion yang paling elektronegatif,

merupakan ligan monodentat yang disukai. Akan tetapi, Al lebih cenderung

mengikat ligan yang mengandung oksigen, seperti –COOH (karboksil), –OH

(hidroksil), –CO (karbonil), dan –PO

3

(fosfat) (Orvig 1993). Amina biasanya juga

merupakan pengikat Al penting, antara lain pada bagian ligan multidentat seperti

nitrilotriacetic acid (NTA) dan ethylendiaminetetraacetic acid (EDTA).

Ukuran kation merupakan faktor yang paling penting dalam substitusi ion

logam (Williams, 2002). Ukuran ion Al (r = 0,054 nm) hampir sama dengan

ukuran ion Mg

2+

(r = 0,072 nm) dan Fe

3+

(r = 0,065 nm). Aluminium dapat

mengikat nukleosida trifosfat dengan tingkat asosiasi 10

7

kali dibandingkan

dengan Mg

2+

. Disamping itu, Al juga lebih kompetitif dalam pembentukan

kompleks dengan ligan-ligan kecil. Al mempunyai kecepatan pertukaran yang

rendah untuk masuk dan keluar lingkaran koordinasinya (Orvig 1993). Kecepatan

pertukaran ligan untuk Al adalah 1,3 per detik, 10

5

kali lebih rendah dibandingkan

dengan Mg

2+

(Martin 1992). Oleh karena itu, bila dalam sitoplasma mengandung

Al maka proses metabolisme menjadi terganggu karena posisi Mg

2+

sebagai

kofaktor dalam beberapa enzim akan tergantikan oleh Al

3+

sehingga aktivitas

enzim tersebut menjadi terganggu.

Berdasarkan konsentrasi kation dan ligan dalam sistem biologi, dalam

sitoplasma dengan pH sekitar 7.3, konsentrasi ion Al bebas terbatas sekitar 10

-10

M, sedangkan konsentrasi ion Mg, Ca, dan Fe bebas masing-masing 10

-3

, 10

-7

,

dan 10

-17

M (Williams 2002). Konsentrasi ion Al dalam sitoplasma lebih rendah

dibandingkan dengan ion Mg dan Ca. Hal ini disebabkan karena pH dalam

sitoplasma adalah netral dan Al mengendap pada kondisi tersebut, sedangkan ion

Mg dan Ca tetap larut. Pengikatan Al terhadap ligan dalam sitoplasma menjadi

terbatas selain disebabkan karena konsentrasinya sangat rendah, juga disebabkan

karena terjadi kompetisi dengan kation-kation lain.

Penyerapan dan Distribusi Al pada Akar dan Daun

Penyerapan Al pada banyak spesies tanaman, khususnya yang sensitif Al,

terbatas pada sistem perakaran. Daerah akar yang banyak mengakumulasi Al

adalah epidermis dan korteks bagian luar (Wagatsuma

➃➄➅➆

. 1987; Delhaize

➃➄ ➅➆

.

1993; Matsumoto

➇➈ ➉ ➊

.

1996). Endodermis bertindak sebagai barrier, sehingga

pengangkutan Al ke pucuk dan daun menjadi lebih kecil.

Akan tetapi, banyak spesies tanaman yang mengakumulasi Al di pucuk

(Jansen

➇➈ ➉ ➊

. 2002; Watanabe & Osaki 2002b). Umumnya, tanaman-tanaman ini

berasal dari daerah tropik atau subtropik dan sering disebut sebagai tanaman

hiperakumulator. Contoh tanaman hiperakumulator adalah tanaman teh (

➋➉➌➇ ➊➊➍➉ ➎➍➏ ➇ ➏➎➍➎

), hydrangea dan beberapa famili Rubiaceae. Namun demikian, belum

banyak informasi mengenai mekanisme, lokalisasi seluler, dan bentuk-bentuk

kimia Al yang terakumulasi dalam tanaman tersebut. Pada satu pengamatan

tentang bentuk kimia Al pada daun teh, banyak Al dikelat oleh gugus polifenol

(Nagata

➇➈ ➉ ➊

. 1992). Pada daun hydrangea, Al ditemukan membentuk kompleks

dengan sitrat (Ma

➇➈ ➉ ➊

. 1997a) dan pada hiperakumulator

➐➇➊ ➉➎➈➑ ➌➉ ➌➉➊ ➉➒➉➈➓ ➔➍→➣ ➌

, Al berikatan dengan oksalat (Watanabe

➇➈➉➊

. 1998a).

Lokalisasi Al Subseluler

Beberapa studi menunjukkan bahwa sebagian besar Al dilokalisasi pada

dinding sel (Marienfeld & Stelzer 1993; Ownby 1993; Marienfeld

➇➈➉ ➊

. 1995). Al

berikatan dengan molekul pektin dinding sel atau komponen dinding sel yang

bermuatan negatif pada sel-sel epidermis dan korteks akar (Delhaize

➇➈ ➉ ➊

. 1993;

Marienfeld

➇➈ ➉➊

. 2000; Schmohl & Horst 2000; Schmohl

➇➈ ➉ ➊

. 2000). Gugus

karboksil bebas molekul pektin yang bermuatan negatif mengikat ion aluminium

menyebabkan dinding sel menjadi kaku sehingga pemanjangan akar menjadi

terhambat (Schmohl & Horst 2000). Menurut Schmohl

➇➈ ➉ ➊

.

(2000), perlakuan

enzim pectin methylesterase (PME) pada suspensi sel

↔ ➇➉ ➌➉↕➎

menyebabkan

penurunan toleransi aluminium. Selanjutnya, overekspresi PME pada tanaman

kentang transgenik terbukti lebih sensitif terhadap aluminium daripada kultivar

toleran dan sensitif aluminium.

Berdasarkan penjelasan tersebut dapat

disimpulkan bahwa matriks pektin pada apoplas sel-sel apikal akar berperanan

penting dalam memfasilitasi sinyal stress pada sitoskeleton sel-sel tersebut.

Akumulasi aluminium yang tinggi dalam apoplas akar merupakan karakteristik

sensitifitas aluminium (Rincon & Gonzales 1992; Schmohl & Horst 2000). Ikatan

Al dengan gugus karboksil akan menimbulkan ikatan yang kuat sehingga sel tidak

dapat membesar (Marschner 1995).

Studi lain juga menunjukkan bahwa Al ditemukan pada membran sel yang

dapat menyebabkan perubahan atau kerusakan sifat permeabilitas membran sel.

Permeabilitas membran sel yang meningkat pada pH rendah berkorelasi dengan

penyerapan Al (Ishikawa

➙ ➛➜ ➝

. 2001; Ofei-Manu

➙➛➜ ➝

. 2001). Pada membran sel

akar barley, Al ditemukan berasosiasi dengan gugus fosfolipid membran yang

menyebabkan kerusakan struktur membran atau perubahan dalam permeabilitas

membran. Hal ini menyebabkan penyerapan hara yang dikatalisis oleh pompa

proton menjadi terhambat (Matsumoto 1991). Ion Al yang bermuatan positif dapat

berasosiasi dengan gugus fosfat dari ATP atau fosfolipid pada membran yang

akan mempengaruhi efektivitas transport proton.

Aluminium ditemukan dalam nukleus berikatan dengan DNA (Matsumoto

➙ ➛➜➝

. 1976). Sedangkan menurut Silva

➙➛➜➝

. (2000) bahwa Al dapat terakumulasi

dalam nukleus dengan konsentrasi yang rendah. Asosiasi antara Al dengan DNA

dapat menghentikan proses pembelahan sel meristem apikal (Matsumoto 1991).

Al dalam bentuk polimer memiliki muatan positif yang besar serta memiliki

banyak situs pengikatan. Polimer Al ini dapat mengikat fosfat yang ada pada

kedua utas DNA, mengakibatkan gagalnya kedua utas DNA berpisah (Matsumoto

1991).

Sensitivitas Seluler terhadap Al

Pada tanaman, gejala toksisitas berlangsung di ujung akar (Ryan

➙➛ ➜➝

.

1993). Sivaguru & Horst (1998) menunjukkan bahwa daerah akar yang paling

sensitif terhadap Al adalah bagian distal dari zona transisi (DTZ). Sel-sel yang

paling sensitif terhadap Al adalah epidermis (Ciamporova 2000; Ciamporova

2002). Rambut akar dan sel-sel epidermal yang berdekatan juga menunjukkan

sensitvitasnya terhadap Al (Jones

➙➛ ➜ ➝

. 1995b). Rambut akar umumnya sangat

sensitif terhadap Al, namun tingkat sensitivitasnya sangat tergantung pada

aktivitas fisiologisnya (Care 1995; Jones

➙ ➛ ➜ ➝

. 1998). Rambut akar yang

pemanjangannya telah lengkap, kurang sensitif terhadap Al (Sattelmacher

➙➛ ➜➝

.

1993).

Perbedaan sensitivitas Al antara ujung dan dasar akar dari kecambah

kacang-kacangan (Shen

➞ ➟➠ ➡

. 2004) dan kecambah padi (Nagasaka

➞➟➠ ➡

. 2003)

telah diuji. Perbedaan tersebut menyangkut eksudasi asam-asam organik.

Perbedaan sensitivitas Al sepanjang poros akar tidak dapat dijelaskan dengan

perbedaan eksudasi asam organik. Daerah akar yang paling sensitif terhadap Al,

mengeksudasi asam organik paling besar di apeks akarnya (Delhaize

➞➟➠ ➡

. 1993;

Pellet

➞ ➟ ➠ ➡

. 1995; Mariano & Keltjens 2003). Eksudasi asam organik dapat

menjelaskan perbedaan toleransi Al antar genotipe, tetapi tidak antara tipe sel

dalam akar yang sama.

Perbedaan sensitivitas Al dapat juga ditemukan pada kultur sel tanaman

sehingga dapat memberikan alternatif untuk akar. Sel-sel tembakau pada fase

pertumbuhan logaritmik adalah sensitif terhadap Al, tetapi sel-sel pada fase

stasioner tidak sensitif Al (Yamamoto

➞ ➟ ➠ ➡

. 1994; Vitorello & Haug 1996;

Sivaguru

➞ ➟ ➠ ➡

. 1999). Sensitivitas Al juga terjadi dengan memanipulasi

kandungan pektin dan aktivitas pektin metil esterase pada kultur sel

➢➞➠➤➠➥➦

dan

➧ ➨ ➡➠ ➩ ➫➤➟➫ ➭➞ ➯➨➦➫➤

(Schmohl & Horst 2000; Shmohl

➞ ➟➠ ➡

. 2000).

Mekanisme Utama Toksisitas Al

Penelitian tentang target utama kerusakan tanaman oleh Al dan

pemahaman yang lengkap tentang mekanisme toksisitas Al merupakan hal yang

penting dalam mempelajari toksisitas Al. Hipotesis tentang mekanisme toksisitas

Al paling tidak menyangkut pengaruhnya terhadap fosfat, metabolisme

nukleotida, struktur dan fungsi dinding sel, dinamika sitoskeletal, transduksi

signal, dan stress oksidatif.

Aluminium mampu mengikat DNA dengan kuat pada tulang punggung

fosfat atau pada daerah yang berasosiasi dengan histon (Matsumoto 1991). Hal ini

menyebabkan pembelahan sel terganggu karena adanya interaksi antara Al dengan

DNA inti. Al juga mempunyai afinitas tinggi terhadap nukleotida trifosfat bebas

dengan model toksisitas berdasarkan pada pengikatannya terhadap ATP dalam

sitoplasma (Pettersson & Bergman 1989).

Aluminium juga dapat merubah struktur membran plasma (Zhao

➲➳ ➵➸

.

1987) dan berpengaruh besar pada pergerakan ion melintasi membran, khususnya

penyerapan Ca

2+

(Liu & Luan 2001). Toksisitas Al sering berhubungan dengan

Ca

2+

(Rengel & Zhang 2003) karena Al mengganggu metabolisme Ca

2+

seluler,

atau karena Al menggantikan Ca

2+

dalam sel (Kinraide & Parker 1987). Beberapa

pengamatan ditemukan bahwa Al merubah struktur kalmodulin, suatu mediator

signal Ca

2+

intraseluler utama dalam sel (Haug &Vitorello 1996). Pengamatan lain

menunjukkan bahwa transduksi signal yang difasilitasi oleh

➺ ➻ ➼ ➽➺ ➻ ➼➾➚ ➼➽➾➳➾➪➲

,

suatu jalur yang juga melibatkan Ca

2+

sebagai perantara intraseluler (

➾➚➳ ➶➵➹ ➲➸➸ ➘ ➸ ➵ ➶ ➴➲➽➽➲➚ ➷➲ ➶

), merupakan salah satu situs utama toksisitas Al baik pada sel mamalia

(Haug

➲➳➵➸

.

1994) maupun pada sel tanaman (Jones & Kochian 1995; Jones

➲➳ ➵➸

.

1995a). Pada kedua kasus tersebut, perlakuan Al dapat menghambat aktivitas

phospholipase C atau menghambat aksi protein trimerik G.

Aluminium dapat meningkatkan stress oksidatif dalam sel. Pada tanaman,

bukti tentang ini meliputi peningkatan peroksidasi lipid (Cakmak & Horst 1991;

Yamamoto

➲➳➵➸

. 2001), dan ekspresi gen-gen stress oksidatif (Richard

➲➳➵➸

. 1998;

Milla

➲➳ ➵➸

. 2002). Perbaikan toleransi terhadap toksisitas Al pada tanaman

dilakukan oleh gen-gen stress oksidatif (Ezaki

➲➳➵➸

. 2000).

Stress oksidasi yang diinduksi Al paling umum berhubungan dengan

perubahan struktur membran oleh Al. Adanya Fe dapat meningkatkan peroksidasi

membran yang diinduksi oleh Al (Ono

➲➳ ➵➸

. 1995; Yamamoto

➲➳ ➵➸

. 1997).

Pengaruh Al pada sistem antioksidan sel tidak dapat dihilangkan (Devi

➲➳ ➵➸

.

2003; Guo

➲➳ ➵➸

. 2004). Aktivasi sistem antioksidan seluler merupakan sebuah

respon stress umum dan tidak spesifik terhadap toksisitas Al.

Hipotesis lain yang menarik adalah tempat utama toksisitas Al terletak

pada rangkaian

➬ ➲➸➸ ➮ ➵➸ ➸

–

➱➸ ➵➽➴➵ ✃ ➲➴❐ ➶➵➚➲

–

➬➳➼ ➽❒ ➲➸ ➲

y

➳➼➚

(CW-PM-CSK)

(Horst

➲➳ ➵➸

. 1999). Hal ini disebabkan karena dinding sel, membran plasma dan

sitoskeleton saling berhubungan satu sama lain, sehingga gangguan yang terjadi

pada salah satu komponen dapat mengganggu komponen lainnya. Hal ini dapat

menjelaskan fakta bahwa Al berinteraksi dengan dinding sel (Schmohl & Horst

2000), membran plasma (Ishikawa & Wagatsuma 1998), dan sitoskeleton

(Sivaguru

➲➳ ➵➸

. 1999). Rangkaian ketiga komponen tersebut di atas merupakan

target utama Al. Ekspresi

❮❰ Ï Ï Ð Ñ Ï Ï Ò Ñ ÓÓÔ ❮ ÕÑ Ö❰× Ø❰ ❮❰ Ù ÖÔ Ø Ú ÕÛ ÑÓ❰

(WAK) juga

diinduksi oleh Al (Sivaguru

❰ÖÑ Ï

. 2003).

Gejala dan Pengaruh Umum Toksisitas Aluminium pada Tanaman

Gejala toksisitas aluminium yang paling umum adalah penghambatan

pertumbuhan akar, yang terdeteksi dalam 30 menit hingga 2 jam, dalam

konsentrasi mikromolar Al (Barcelo & Poschenrieder 2002). Akan tetapi,

mekanisme penghambatan ini belum diketahui. Adanya kerusakan akar oleh Al

ditunjukkan oleh bentuk akar yang menjadi pendek dan gemuk, serta sering

berwarna coklat. Jumlah percabangan dan rambut akar menurun serta sistem

perakaran mengumpul. Pada apeks akar, keretakan akar mudah diamati pada

epidermis. Perluasan sel-sel korteks secara radial dan tidak merata menyebabkan

penebalan akar dan stress mekanik pada epidermis (Ciamporova 2002).

Sel-sel yang dipengaruhi oleh Al adalah antara lain tudung akar, meristem,

sel-sel pemanjangan, rambut akar, dan titik percabangan (Rengel 1996). Ujung

akar merupakan daerah yang paling sensitif terhadap cekaman Al (Ryan

❰ Ö Ñ Ï

.

1993). Dalam pengujian yang lebih detail, daerah distal zona transisi (

ÜÕÓ ÖÑ Ï ÖØÑ Û Ó ÕÖ ÕÔÛÝÔ Û❰

, DTZ) merupakan daerah apikal akar yang paling sensitif terhadap

Al (Sivaguru & Horst 1998). Pada tahap awal toksisitas, aktivitas pembelahan sel

menurun yang akan berakibat terhadap penghambatan pemanjangan sel dan pada

akhirnya menghambat pertumbuhan akar (Kochian 1995; Barcelo

&

Poschenrieder 2002; Ciamporova 2002).

Walaupun gejala toksisitas Al juga terjadi pada pucuk, hal ini biasanya

dipandang sebagai konsekuensi dari kerusakan yang terjadi pada sistem

perakaran. Respons yang paling umum pada pucuk terhadap toksisitas Al adalah

modifikasi seluler pada daun, menurunnya pembukaan stomata, penurunan

aktivitas fotosintesis, klorosis, dan nekrosis. Perlakuan Al dalam waktu lama

menyebabkan penghambatan pertumbuhan akar dan mengarah ke defisiensi unsur

hara, terutama P, K, Ca, dan Mg (Haug & Vitorello 1996). Pada tanaman barley

yang ditanam pada media yang mengandung Al, kandungan Ca

2+

dan K

+

hanya

setengahnya jika dibandingkan dengan kontrol (Matsumoto & Yamaya 1988). Al

dapat mengikat anion anorganik, seperti sulfat, fosfat, fluor, dan silikat

membentuk suatu kompleks yang mempunyai afinitas tinggi terhadap oksigen

atau air (Hodson & Evans 1995). Interaksi antara Al dengan anion tersebut

berpotensi untuk meningkatkan pH perakaran sekaligus dapat membuat rancu

pengaruh toksisitas Al dengan defisiensi unsur tertentu (seperti fosfat) karena

terbentuknya kompleks Al-fosfat (baik di larutan tanah maupun di dalam sel) yang

tidak tersedia bagi tanaman. Kemampuan tanaman untuk dapat memanfaatkan

kandungan P yang rendah secara efisien selalu dihubungkan dengan sifat toleransi

tanaman terhadap cekaman Al. Kation trivalen Al

3+

menghambat transpor Ca

2+

secara efektif ke dalam akar, protoplasma dan membran vesikel. Hasil studi pada

Þ ßà ßá â ßÞ ã äåæ

menunjukkan bahwa Al dapat memblok Ca

2+

dan saluran K

+

(Ryan

åç ã Þ

.

1997). Pada akar barley, perlakuan Al menurunkan kandungan Ca pada

membran sel hingga 50% (Matsumoto & Yamaya 1988) dan menyebabkan

penurunan aktivitas H

+

-ATPase dalam menghidrolisis ATP (Ahn

åçã Þ

. 2001).

Mekanisme Seluler Toleransi Aluminium

Secara umum, Taylor (1991) mengelompokkan mekanisme toleransi

terhadap cekaman Al menjadi dua kelompok, yaitu mekanisme eksternal dan

mekanisme internal. Mekanisme eksternal terdiri dari: (1) immobilisasi Al di

dinding sel, (2) selektifitas membran plasma terhadap Al, (3) induksi peningkatan

pH di daerah perakaran atau apoplas akar, (3) eksudasi senyawa-senyawa

pengkelat, dan (4) adanya mekanisme Al-

åèèÞéê

. Sedangkan mekanisme internal

terdiri dari: (1) kelatisasi Al di sitosol, (2) kompartementasi Al di vakuola, (3)

pengikatan Al oleh protein (

ëÞ â ßìá ßì í

-

àæî çåßì

), (4) sintesis enzim tertentu, dan

(5) peningkatan aktivitas enzim.

Tanaman yang toleran Al mempunyai kemampuan mensekresikan

senyawa-senyawa organik seperti asam sitrat, asam malat, asam oksalat, asam

fulvat (Ryan

åçãÞ

.

1995; Sopandie

åçã Þ

.

1996; Ma

åçãÞ

.

1998; Zeng 1998; Kasim

2000 dan Anoop

åçãÞ

.

2003) dan senyawa fenilpropanoid seperti asam kafeat dan

asam klorogenat (Yamamoto

åçãÞ

.

1998) ke dalam daerah perakaran membentuk

kompleks dengan Al dan mencegah serapan Al oleh tanaman. Selain itu, tanaman

yang toleran Al dapat meningkatkan kapasitas tukar kation dinding sel (Horst

1996) dan potensial listrik (depolarisasi) dinding sel (Papernik & Kochian 1997)

serta menginduksi peningkatan pH perakaran dan apoplas akar (Sopandie

ï ð ñ ò

.

1996) sehingga Al menjadi bentuk yang tidak toksik bagi tanaman. Tanaman yang

toleran Al juga mampu menstimulir peningkatan aktivitas senyawa antioksidan,

seperti: peroksidase (PER), superoxide dismutase (SOD), glutathion s-transferase

(GST) dan catalase (Snowden & Gardner 1993) serta Mg

2+

ó ôõò ö

x

melalui

peningkatan aktivitas Mg-transporter (McDiarmid & Gardner 1998). Selain itu,

tanaman toleran Al mampu meningkatkan aktivitas enzim H

+

-ATPase membran

plasma yang berperanan dalam pembentukan gradien elektrokimia untuk

mendorong ion melintasi membran dan menyebabkan sekresi senyawa-senyawa

organik (Anoop

ï ðñ ò

. 2003; Shen

ïðñ ò

. 2005a).

Semua mekanisme toleransi yang dijelaskan di atas belum banyak

dipelajari secara mendalam, tetapi paling sedikit dua mekanisme yang telah

diketahui dengan baik, yaitu sekresi asam organik (Kochian

ï ð ñ ò

. 2004) dan

peningkatan ekspresi gen-gen tertentu (Snowden & Gardner 1993; Richards

ï ðñò

.

1998; dan Sasaki

ïðñ ò

. 2004).

Eksudasi Senyawa-senyawa Pengkelat Aluminum

Bukti yang menjelaskan mekanisme eksudasi senyawa pengkelat Al

berasal dari tiga kelompok peneliti, yaitu Delhaize

ï ð ñò

. (1993), Basu

ïð ñ ò

.

(1994), dan Pellet

ï ð ñ ò

. (1995) yang menunjukkan bahwa sekresi asam malat

meningkat pada kultivar yang toleran Al dibandingkan dengan kultivar yang

sensitif Al.

Ekspresi gen sitrat sintase atau malat dehidrogenase yang diikuti dengan

eksudasi asam organik dapat meningkatan toleransi tanaman terhadap Al (de la

Fuente

ï ð ñò

. 1997; Koyama

ï ðñ ò

. 2000; Anoop

ïðñ ò

. 2003). Studi lain dengan

mengekspresikan gen-gen stress umum menghasilkan peningkatan toleransi Al

yang sangat rendah atau peningkatannya tidak

÷ï ø÷ù úö ûó üòï

(Delhaize

ïðñ ò

. 2001;

Ezaki

ïð ñ ò

. 2000; Basu

ïð ñ ò

. 2001). Hal ini menunjukkan bahwa toleransi Al

ditentukan oleh eksudasi asam organik.

Studi lain menunjukkan bahwa tanaman barley yang ditransformasi

dengan gen

ñ òýð

-1, yang diduga menyandi malat transporter, adalah lebih toleran

terhadap Al (Delhaize

ïðñ ò

. 2004). Hal ini dapat memberikan informasi bahwa

transformasi tersebut dapat meningkatkan eksudasi tanpa memerlukan perubahan

konsentrasi metabolit sitoplasma.

Asam organik mempunyai dua peranan yang sangat penting dalam

menghilangkan toksisitas Al, yaitu penolakan Al melalui pelepasan Al dari akar

dan detoksifikasi Al dalam simplas melalui pengkelatan Al oleh asam organik

sehingga pengaruh racunnya dapat direduksi atau dicegah pada tingkat seluler

(Pellet

þÿ ✁

. 1995; Kasim 2000; Anoop

þÿ ✁

.

2003). Beberapa senyawa organik

yang dihasilkan oleh tanaman dan dapat mengkelat Al antara lain: asam malat,

asam sitrat, asam oksalat, asam fulfat, asam humat dan fenolat.

Hasil penelitian pada tanaman

✂ ✄✄☎ ÿ✆ÿ

L. memperlihatkan hubungan

antara eksudasi asam sitrat dengan waktu pemberian Al. Eksudasi asam sitrat

sangat lambat selama empat jam pertama pemberian Al, namun setelah itu

meningkat dengan tajam. Jumlah asam sitrat yang dieksudasi meningkat dengan

penambahan konsentrasi Al yang diberikan secara eksternal (Ma

þÿ ✁

. 1998).

Pada tanaman taro (

✂ ✁✆ ✝ ✄☎ þ✄✝ ✞✁ þ✟ÿ

(L.) Schoott) juga banyak

ditemukan asam oksalat. Asam oksalat ini yang membuat tanaman taro toleran

terhadap cekaman Al, karena terjadi pembentukan kompleks Al-oksalat di rizosfir

(Ma & Miyasaka 1998).

Ryan

þÿ ✁

. (1995) menunjukkan bahwa efluks malat yang dirangsang oleh

Al dapat merupakan suatu mekanisme toleransi Al yang umum bagi tanaman

gandum. Malat yang dieksudasi akan melindungi tanaman dengan cara mengkelat

dan mendetoksifikasi Al pada bagian yang peka di ujung akar. Bukti yang

mendukung bahwa malat berperan dalam mekanisme toleransi Al adalah: (1)

efluks malat dirangsang secara spesifik oleh Al, (2) malat melindungi bagian

tanaman gandum yang peka Al di ujung akar ketika ditambahkan pada larutan

hara yang telah diberi perlakuan Al, (3) malat yang keluar dari akar dikendalikan

oleh gen yang terdapat pada lokus Almt1. Pada populasi gandum

✟þ ✠☎✄✆ ✡þ✟ ☎✝

,

malat yang dilepaskan oleh genotipe toleran Al lebih tinggi daripada genotipe

yang peka Al. Aktivitas saluran anion yang diakibatkan oleh Al merupakan

mekanisme yang kemungkinan berperan terhadap pelepasan asam organik yang

berlangsung dengan cepat (Delhaize & Ryan, 1995). Ada 3 kemungkinan

mekanisme yang diajukan (Gambar 2), yaitu: (1) Al berinteraksi langsung dengan

protein saluran, mengakibatkan konformasinya berubah sehingga waktu

pembukaan saluran menjadi lama; (2) Al berinteraksi dengan reseptor spesifik

pada permukaan membran atau dengan membran itu sendiri, yang selanjutnya

melalui serangkaian kurir sekunder di sitoplasma, merubah aktivitas saluran; (3)

Al masuk ke sitoplasma dan merubah aktivitas saluran secara langsung dengan

jalan menempel ke saluran atau secara tidak langsung melalui suatu lintasan

transduksi sinyal.

Sejumlah studi telah banyak dilakukan untuk mendukung mekanisme

toleransi yang melibatkan asam organik. Ternyata, tidak semua tanaman yang

toleran Al mempunyai mekanisme pertahanan dengan meningkatkan eksudasi

asam organik. Beberapa tanaman yang sensitif Al mempunyai level sekresi asam

organik yang tinggi (Kochian

☛ ☞✌ ✍

. 2004). Tanaman gandum tidak menunjukkan

peningkatan toleransi Al, walaupun efflux asam organik meningkat (Sasaki

☛☞✌ ✍

.

2004). Tanaman lain yang resisten Al, tetapi tidak menunjukkan peningkatan

eksudasi asam organik adalah tanaman

✎✏✌✑✒ ✓✌✏ ✓✌ ✔☛✑✕ ✖✗☛✘ ✙

(Wenzl

☛ ☞ ✌ ✍

.

2001).

Gambar 2. Interaksi A1

3+

dengan saluran yang permeable terhadap efluks malat

pada membran plasma (Delhaize & Ryan 1995).

Sitoplasma

pH 7.0

Luar sel

pH 4.0 – 5.0

Al

3+

K

+

1

2

3

Malat

2-

[Malat : Al]

Penyeimbang

perubahan ion

❜ ❝ ❝

❞ ❡❢❣ ❤ ✐ ❡❥❦❧♠♥ ♦ ♣q r♥ ♦ s

✇ ① ②

③④ ⑤⑥ ⑦⑧ ④ ⑨⑩❶ ❷❸ ❹ ❺❻ ❼❸ ❹❽

➁ ➂ ➃

➄➅ ➆➇ ➈ ➅➉➄➊ ➋➌➇ ➍ ➆➅ ➌➎➏➐ ➑➒ ➓ ➔→ ➣➒ ➓ ↔

↕ ➙ ➛

➜➝ ➞➟ ➠➡ ➝ ➢➤➥ ➦➧ ➨ ➩➫ ➭➧ ➨➯

➺ ➻ ➼

➽➾➚ ➪➶ ➹ ➾➘➴➷ ➬➮ ➱ ✃❐ ❒➮ ➱ ❮

Ñ ÒÓ TGACTGTCGCATGCTCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGAATTCGATAGAATGGGGG AGAAGCCTGAAGTACTGGAGGCAGTGCTGAAGGAAGCAGTGGATTTGGAGAACAT TCCTATTGAGGAAGTGTTTGAGAATCTGAGATGCAGCAAGGAGGGCCTGACCACC CAGTCCGCCGAGGAGCGCCTTGCGATTTTCGGCCAGAACAAGCTCGAGGAGAAGA AGGAGAGCAAGTTCTTGAAGTTCTTGGGGTTTATGTGGAATCCTCTGTCTTGGGT CATGGAAGCTGCAGCAATCATGGCCATTGCCCTGGCAAATGGAGGAGGGAAGCCT CCTGATTGGCAGGATTTTGTCGGTATCATAACTCTTCTCTTCATTAACTCGACGA TCAGCTTCATCGAGGAAAATAATGCGGGTAATGCTGCCGCTGCTTTGATGGCTCG TCTCGCCCCCAAGGCCAAGGTTCTACGAGATGGAAGGTGGAGTGAGGAAGACGCA GCTGTGCTAGTCCCTGGGGATATAATCAGCATTAAACTTGGAGACATAATTCCTG CTGATGCTCGCCTTCTTGAGGGAGATCCCTTGAAAATTGACCAGTCTGCACTCAC TGGTGAATCTCTGCCGGTCACCAAAGGCCCTGGAGATGGTGTTTATTCAGGTTCC ACATGTAAGCAAGGGGAAATTGAAGCTGTGGTTATTGCCACTGGTGTGCACACAT TCTTTGGCAAGGCGGCACACTTGGTGGATACCACTAATCAAGTGGGACATTTCCA GAAGGTTTTGACTGCAATTGGAAATTTCTGCATTTGCTCGATTGCTGTCGGGATG ATAATTGAAATTATTGTCATGTATCCGATTCAACGGAGGAAATATCGCCCTGGAA TCGACAATCTTCTTGTTCTTCTCATCGGAGGAATCCCTATAGCCATGCCTACCGT TCTTTCAGTCACCATGGCCATTGGCTCTCACAGGCTATCTCAGCAGGGAGCGATC ACCAAGAGAATGACAGCAATCGAAGAGATGGCTGGAATGGATGTCCTTTGCAGTG ACAAGACTGGGACTCTGACTTTGAACAAGCTTACTGTTGACAAAAATCTCATCGA GGTCTTTGCGAAA... ... CTTTTCCCACCCTTTCATTGGTTGCTGATCCTTTGCTATCCTTCCAATGATGGTT CCATCATGACAATTTTGAAGGATAGGGTGAAACCATCACCTTTTTTCCCGACAGC TGGAAGCTCGCAGAAATCTTCACTACTGGAATTGTTCTTGGCAGTTACCTGGCTA TGATGACGGTTATCTTCTTTTGGGCAGCCTACGAAACTAACTTCTTTCCCGAGAG TTTTTGGCGTAGCCACTCTTGAGAAGACTGCCCATGACGACTTCCGAAAGCTTGC CTCCGCGATATACTTGCAAGTGAGTACTATCAGTCAGGCCTTGATATTTGTGACA CGATCCAGGGGTTGGTCCTACGTCGAGCGTCCCGGGTTGTTGCTCATTGCGGCTT TTGTGATTGCTCAACTGATTGCTACTCTAATTGCGGTTTACGCGAGCTGGGGCTT TGCCGCTATCGAGGGGATTGGATGGGGTTGGGCCGGTGTCATCTGGCTTTATAAC ATCATCTTTTACATCCCGCTTGACTTCATCAAGTTCTTCATCCGTTATGCATTGA GTGGGAAGGCCTGGGATCTTGTTATCGAGCAGAGGATTGCATTCACGAGGCAAAA GGACTTTGGAAAAGAACAGCGCGAGCTTCAATGGGCACACGCACAAAGAACACTG CATGGGTTGCAACCACCCGACACAAAAATGTTCACTGAGCGTACTCGCTTCGCGG AACTCAATCATATTGCTGAAGAAGCTAAGAGAAGAGCCGAGATAGCGAGGTTGAG GGAACTGAATACCCTGAAAGGTCATGTGGAATCAGTTGTGAGACTGAAGGGACTT GACATAGAGACGATCCAGCAATCGTACACCGTCTGAGGAGAGCAACACGATCTTC TGTAGCTCCGGCTCTTATCATGGCATTCTTATCTGTGCTGAGGCCAATAAATCGT GTAATTAGCAGTGTGTCAACAGTTTCTGTCGTGGTAGCTTGGGCAATCCCCTATT CGCACCCTTGGAAAATGCCTCAAGAGGGACACCATGGCGAACTACTCTGTAAGCT TTGTCGAAGAGGCTTGAAACAACAGTACGGCCTACTTTTGTATTAATCTTATGCA ACTGTCGATTATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGAGA GTCCCAACGCGTTGGAGCA

ÔÕÖ Õ× Ø ÙÚ Ø ÙÛ Û ÜØ Ú ÝØ ÙÞØ× Ýß ÕàÖ á × â Û ã× Ýä Õ×ãåæÒç èÞØÙé êëìí çí Û îÕàïÕÙð ñò ñóâ Û îÝÖï ôõÕä áÖ á ÙÚ Ø Ùö÷ øíù úØ äõÝ×ØÙû üýØôÝþõÕÙÚï×ïÖ Ø Ùÿ æð ñò ñóä ÕÙÚ ÚïÙØà ØÙõ× ÝäÕ×ìÓÞØ Ùîã✁