19
PCR untuk
C. acutatum, P. sorghi dan Ca. L. asiaticus
Proses PCR selanjutnya adalah amplifikasi DNA target dengan menentukan komposisi dari komponen PCR yaitu di antaranya pasangan primer spesifik dan
pengaturan siklus amplifikasi DNA sesuai dengan target yang diinginkan Tabel 1 dan komposisi volume reaktan standar amplifikasi PCR Tabel 2.
RT-PCR untuk
Bean common mosaic virus
Reaksi transkripsi balik PCR dengan dua tahap tabung terpisah yaitu tahap pertama 1.5 µL nuclease free water, 1 µL 10 µM µL
-1
Primer BlC-cpr, dan 3 µ L RNA total dengan total volume 5.5 µL, dipanaskan di 65 ºC selama 5 menit,
segera didinginkan. Tambahkan 2 µL bufer RT 5x, 0.5 µL dNTP 10 mM, 1 µL DTT Dithiothreitol 0.1 µM, 0.5 µL RNase inhibitor Thermo Scientific 40 U
uL
-1
, 0.5 µL Reveraid Reverse Transcriptase M-MuLV Thermo Scientific 200 U µL
-1
dengan total volume 10 µL dalam tabung mikro. Reagen RT diinkubasi pada suhu 42 ºC selama 1 jam. Hasil akhir reaksi transkripsi balik
adalah produk cDNA 1 µL yang digunakan pada tahap kedua yaitu amplifikasi cDNA. Pasangan primer, urutan nukleotida dan siklus PCR dapat dilihat pada
tabel 1.
Reaksi PCR dilakukan dengan menggunakan mesin thermal cycle AB Applied Biosystem Veriti dengan komponen reaksi PCR untuk keempat patogen
dapat dilihat pada tabel 2. Optimasi PCR
Optimasi PCR dilakukan untuk mendapatkan PCR yang baik, di antaranya modifikasi konsentrasi komponen-komponen atau kondisi PCR dari metode yang
diacu. Komponen PCR yang dioptimasi pada penelitian ini adalah konsentrasi primer target. Konsentrasi cetakan DNA atau RNA yang digunakan dalam
optimasi adalah 15 ng µL
-1
. Khusus untuk optimasi metode FTA-card, cetakan DNA terlebih dahulu diteteskan pada punch FTA-card, untuk selanjutnya
digunakan pada uji PCR. Untuk mengevaluasi keberhasilan isolasi asam nukleat patogen kecuali P. sorghi digunakan primer kontrol internal Rubisco L.
Optimasi dilakukan dengan tiga proses PCR. Proses pertama PCR menggunakan tanpa konsentrasi primer optimum dan cetakan DNA dari biakan
murni cendawan atau tanaman yang bergejala dari contoh pertama. Tahap tersebut dilakukan untuk memastikan DNA keempat patogen bisa teramplifikasi. Proses
kedua PCR menggunakan konsentrasi cetakan DNA 15 ng µL
-1
dan beberapa konsentrasi primer 0.4, 0.6, 0.8 dan 1 µM untuk mendapatkan konsentrasi primer
optimum. Proses ketiga PCR menggunakan salah satu konsentrasi primer yang optimum dengan konsentrasi cetakan DNA 15 ng µ L
-1
dari biakan murni cendawan atau tanaman yang bergejala dari contoh kedua dan ketiga.
20
Tabel 1 Primer dan siklus PCR yang digunakan untuk deteksi keempat patogen Primer
Urutan nukleotida 5’3’ dan siklus PCR
Amplikon dan target
gen Sumber
C. acutatum CaInt2 GGGGAAGCCTCTCGCGG
±500 pb Gen ITS1,
2528S- rDNA
Brown et al. 1996
ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC
[95 °C 5 min; 40X 95 °C 30 sec, 60 °C 30 sec, 72 °C 1 min; 72 °C 7 min, 4
˚C] P. sorghi
PsUF CCAGCAACTCCAGTTATGGAA
±154 pb Gen
Cytochrome oxidase 2
COII Rustiani et
al. 2015a PsUR
CATGTACAATGGTRCTTGGAA [94 °C 2 min; 30X 94 °C 30 sec, 56 °C
1 min, 72 °C 1 min; 72 °C 5 min, 4 ˚C]
Ca. L. asiaticus A2
TATAAAGGTTGACCTTTCGAGTTT ±703 pb
Gen protein rplKAJL-
rpoB operon Hocquellet
et al. 1999 J5
ACAAAAGCAGAAATAGCACGAAC AA
[94 °C 2 min; 35X 94 °C 20 sec, 45 °C 30 sec, 68 °C 1.5 min; 68 °C 5 min, 4
˚C] BCMV
BlC- CPf
TCAGGAACTGGGCAGCCGCAAC ±850 pb
Gen protein selubung
CP Anggraini
Hidayat 2014
BlC- CPr
CTGCGGGGAACCCATGCCAAG 35X [94 °C 2 min, 68 °C 1 min, 72 °C 1
min; 72 °C 10 min, 4 ˚C]
Kontrol internal Rubisco L
RBCL F535
CTTTCCAAGGCCCGCCTCA ±171 pb
Gen Ribulose biphosphate
carboxylase oxygenase
Nassuth et al. 2000
RBCL R705
CATCATCTTTGGTAAAATCAAGTC CA
Tabel 2 Reaktan standar PCR Reaktan
Volume L Konsentrasi akhir
2X Dream taq green Thermo Scientific Primer Forward 10
M Reverse 10
M Rubisco Forward 10
M Reverse 10
M DNA cetakan
Air bebas nuklease 12.5
1.0 1.0
0.5 0.5
1.0 8.5
1x 0.4
M 0.4
M 0.2
M 0.2
M 15 ng µL
-1
-
Total volume 25
Ket. Optimasi konsentrasi finalnya 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 M
Kecuali untuk P. sorghi tidak menggunakan primer kontrol internal
21
Elektroforesis Gel Agarosa dan Visualisasi Asam Nukleat
Elektroforesis menggunakan agarosa 1.5, dalam larutan penyangga TAE 1X, pada 50 V, 70 mA, selama 50 menit. Gel agarosa diwarnai dengan larutan
EtBr 10 selama 30 menit. Elektroforesis DNA total hasil isolasi dari jaringan tanaman hanya dilakukan untuk penyakit huanglongbing dengan volume cetakan
DNA 5 µL. Elektroforesis DNA amplikon PCR dan RT-PCR dilakukan dengan volume 5 µL dan 7.5 µL. Gel agarosa yang telah dibilas dengan akuades
kemudian dipapar UV pada transiluminator Ultra-Lum untuk visualisasi DNA dan dokumentasi dengan kamera digital.
22
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Penyakit-penyakit Tanaman yang Menjadi Objek Isolasi Asam Nukleat untuk Dideteksi dengan Teknik PCRRT-PCR
Penelitian tentang deteksi patogen tanaman ini dilakukan terhadap empat jenis penyakit dengan golongan atau tipe patogen yang berbeda-beda. Masing-
masing jenis tanaman sakit di lapangan diidentifikasi berdasarkan pengamatan gejala simtomatologi. Contoh tanaman sakit kemudian diambil dan dibawa ke
laboratorium untuk diamati tanda patogennya jika ada dan dilakukan konfirmasi penyakitnya untuk selanjutnya digunakan dalam isolasi dan pengujian PCR atau
RT-PCR. Berikut ini adalah ciri dan sifat secara ringkas tentang masing-masing keempat penyakit.
Penyakit Antraknosa pada Cabai oleh
C. acutatum