acutatum, P. sorghi dan Ca. L. asiaticus

19 PCR untuk

C. acutatum, P. sorghi dan Ca. L. asiaticus

Proses PCR selanjutnya adalah amplifikasi DNA target dengan menentukan komposisi dari komponen PCR yaitu di antaranya pasangan primer spesifik dan pengaturan siklus amplifikasi DNA sesuai dengan target yang diinginkan Tabel 1 dan komposisi volume reaktan standar amplifikasi PCR Tabel 2. RT-PCR untuk Bean common mosaic virus Reaksi transkripsi balik PCR dengan dua tahap tabung terpisah yaitu tahap pertama 1.5 µL nuclease free water, 1 µL 10 µM µL -1 Primer BlC-cpr, dan 3 µ L RNA total dengan total volume 5.5 µL, dipanaskan di 65 ºC selama 5 menit, segera didinginkan. Tambahkan 2 µL bufer RT 5x, 0.5 µL dNTP 10 mM, 1 µL DTT Dithiothreitol 0.1 µM, 0.5 µL RNase inhibitor Thermo Scientific 40 U uL -1 , 0.5 µL Reveraid Reverse Transcriptase M-MuLV Thermo Scientific 200 U µL -1 dengan total volume 10 µL dalam tabung mikro. Reagen RT diinkubasi pada suhu 42 ºC selama 1 jam. Hasil akhir reaksi transkripsi balik adalah produk cDNA 1 µL yang digunakan pada tahap kedua yaitu amplifikasi cDNA. Pasangan primer, urutan nukleotida dan siklus PCR dapat dilihat pada tabel 1. Reaksi PCR dilakukan dengan menggunakan mesin thermal cycle AB Applied Biosystem Veriti dengan komponen reaksi PCR untuk keempat patogen dapat dilihat pada tabel 2. Optimasi PCR Optimasi PCR dilakukan untuk mendapatkan PCR yang baik, di antaranya modifikasi konsentrasi komponen-komponen atau kondisi PCR dari metode yang diacu. Komponen PCR yang dioptimasi pada penelitian ini adalah konsentrasi primer target. Konsentrasi cetakan DNA atau RNA yang digunakan dalam optimasi adalah 15 ng µL -1 . Khusus untuk optimasi metode FTA-card, cetakan DNA terlebih dahulu diteteskan pada punch FTA-card, untuk selanjutnya digunakan pada uji PCR. Untuk mengevaluasi keberhasilan isolasi asam nukleat patogen kecuali P. sorghi digunakan primer kontrol internal Rubisco L. Optimasi dilakukan dengan tiga proses PCR. Proses pertama PCR menggunakan tanpa konsentrasi primer optimum dan cetakan DNA dari biakan murni cendawan atau tanaman yang bergejala dari contoh pertama. Tahap tersebut dilakukan untuk memastikan DNA keempat patogen bisa teramplifikasi. Proses kedua PCR menggunakan konsentrasi cetakan DNA 15 ng µL -1 dan beberapa konsentrasi primer 0.4, 0.6, 0.8 dan 1 µM untuk mendapatkan konsentrasi primer optimum. Proses ketiga PCR menggunakan salah satu konsentrasi primer yang optimum dengan konsentrasi cetakan DNA 15 ng µ L -1 dari biakan murni cendawan atau tanaman yang bergejala dari contoh kedua dan ketiga. 20 Tabel 1 Primer dan siklus PCR yang digunakan untuk deteksi keempat patogen Primer Urutan nukleotida 5’3’ dan siklus PCR Amplikon dan target gen Sumber C. acutatum CaInt2 GGGGAAGCCTCTCGCGG ±500 pb Gen ITS1, 2528S- rDNA Brown et al. 1996 ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC [95 °C 5 min; 40X 95 °C 30 sec, 60 °C 30 sec, 72 °C 1 min; 72 °C 7 min, 4 ˚C] P. sorghi PsUF CCAGCAACTCCAGTTATGGAA ±154 pb Gen Cytochrome oxidase 2 COII Rustiani et al. 2015a PsUR CATGTACAATGGTRCTTGGAA [94 °C 2 min; 30X 94 °C 30 sec, 56 °C 1 min, 72 °C 1 min; 72 °C 5 min, 4 ˚C] Ca. L. asiaticus A2 TATAAAGGTTGACCTTTCGAGTTT ±703 pb Gen protein rplKAJL- rpoB operon Hocquellet et al. 1999 J5 ACAAAAGCAGAAATAGCACGAAC AA [94 °C 2 min; 35X 94 °C 20 sec, 45 °C 30 sec, 68 °C 1.5 min; 68 °C 5 min, 4 ˚C] BCMV BlC- CPf TCAGGAACTGGGCAGCCGCAAC ±850 pb Gen protein selubung CP Anggraini Hidayat 2014 BlC- CPr CTGCGGGGAACCCATGCCAAG 35X [94 °C 2 min, 68 °C 1 min, 72 °C 1 min; 72 °C 10 min, 4 ˚C] Kontrol internal Rubisco L RBCL F535 CTTTCCAAGGCCCGCCTCA ±171 pb Gen Ribulose biphosphate carboxylase oxygenase Nassuth et al. 2000 RBCL R705 CATCATCTTTGGTAAAATCAAGTC CA Tabel 2 Reaktan standar PCR Reaktan Volume L Konsentrasi akhir 2X Dream taq green Thermo Scientific Primer Forward 10 M Reverse 10 M Rubisco Forward 10 M Reverse 10 M DNA cetakan Air bebas nuklease 12.5 1.0 1.0 0.5 0.5 1.0 8.5 1x 0.4 M 0.4 M 0.2 M 0.2 M 15 ng µL -1 - Total volume 25 Ket. Optimasi konsentrasi finalnya 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 M Kecuali untuk P. sorghi tidak menggunakan primer kontrol internal 21 Elektroforesis Gel Agarosa dan Visualisasi Asam Nukleat Elektroforesis menggunakan agarosa 1.5, dalam larutan penyangga TAE 1X, pada 50 V, 70 mA, selama 50 menit. Gel agarosa diwarnai dengan larutan EtBr 10 selama 30 menit. Elektroforesis DNA total hasil isolasi dari jaringan tanaman hanya dilakukan untuk penyakit huanglongbing dengan volume cetakan DNA 5 µL. Elektroforesis DNA amplikon PCR dan RT-PCR dilakukan dengan volume 5 µL dan 7.5 µL. Gel agarosa yang telah dibilas dengan akuades kemudian dipapar UV pada transiluminator Ultra-Lum untuk visualisasi DNA dan dokumentasi dengan kamera digital. 22 4 HASIL DAN PEMBAHASAN Penyakit-penyakit Tanaman yang Menjadi Objek Isolasi Asam Nukleat untuk Dideteksi dengan Teknik PCRRT-PCR Penelitian tentang deteksi patogen tanaman ini dilakukan terhadap empat jenis penyakit dengan golongan atau tipe patogen yang berbeda-beda. Masing- masing jenis tanaman sakit di lapangan diidentifikasi berdasarkan pengamatan gejala simtomatologi. Contoh tanaman sakit kemudian diambil dan dibawa ke laboratorium untuk diamati tanda patogennya jika ada dan dilakukan konfirmasi penyakitnya untuk selanjutnya digunakan dalam isolasi dan pengujian PCR atau RT-PCR. Berikut ini adalah ciri dan sifat secara ringkas tentang masing-masing keempat penyakit. Penyakit Antraknosa pada Cabai oleh

C. acutatum