11
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan dari Juni 2009 sampai Juli 2010 di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan dan Mikologi Tumbuhan, dan lahan percobaan
Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
1. Eksplorasi Bakteri Kitinolitik
Bakteri kitinolitik diisolasi dari rizosfir tanaman kelapa sawit yang diambil dari PTPN XIV Sulawesi Selatan dan PT Astra Agrolestari Sulawesi Barat.
Akar digerus kemudian dilakukan pencawanan untuk setiap seri pengenceran. Sedangkan suspensi tanah dibuat dengan menambahkan 5g tanah ke dalam 50 ml
phospat buffer saline, diratakan dengan menggunakan inkubator bergoyang shaker dengan kecepatan 150 rpm selama 1 jam, dan dilakukan pencawanan
untuk setiap seri pengenceran pada media nutrien agar. Koloni bakteri yang muncul diinokulasikan pada media luria-bertaini LB 10 dengan penambahan
serbuk kitin 1 bv sebagai induksi awal bakteri kitinolitik dan ditumbuhkan selama ±12 jam. Setelah itu sebanyak 10 µl kultur bakteri diteteskan ke dalam
media kitin dan diinkubasi pada suhu ruang. Koloni yang menghasilkan zona bening pada media kitin adalah bakteri kitinolitik yang dipilih untuk pengujian
berikutnya yaitu uji patogenitas isolat bakteri dengan metode hipersensitif pada tanaman tembakau. Pengujian ini dilakukan dengan menyuntikan suspensi bakteri
pada daun tembakau dengan menggunakan syringe steril. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya gejala nekrotik pada daun tembakau yang disuntik
dengan suspensi bakteri setelah 24 jam Schaad et al. 2001. Isolat bakteri yang positif kitinolitik dan tidak patogen tersebut kemudian
dikarakterisasi dengan uji gram. Pengujian dilakukan dengan menggunakan KOH 3, untuk mengetahui sifat bakteri apakah gram positif atau negatif. Satu tetes
larutan KOH 3 diteteskan pada gelas objek kemudian inokulum bakteri kitinolitik umur 24 jam dari biakan pada media padat diletakan diatasnya
menggunakan jarum ose. Kemudian diaduk selama 5-10 detik dan jarum ose
12 diangkat-angkat keatas dari tetesan tersebut. Reaksi positif ditunjukkan dengan
larutan KOH 3 menjadi kental dan cairan mengikuti jarum ose sampai 0.5-2 cm atau lebih, bila jarum tersebut di angkat. Hal tersebut menunjukan bahwa bakteri
uji adalah gram negatif sebaliknya jika slime atau cairan kental tidak berbentuk atau tidak mengikuti jika jarum ose diangkat maka reaksi adalah negatif, dan
bakteri diindikasikan bersifat gram positif Schaad et al. 2001.
2. Uji Indeks Kitinolitik
