2. Seleksi In vitro pada media Al dan pH rendah
Pada percobaan ini media seleksi Al yang akan digunakan terlebih dahulu disiapkan. Media yang digunakan adalah media MS yang dimodifikasi ditambah
dengan Al dalam bentuk AlCl
3
.6H
2
O dengan konsentrasi sesuai perlakuan, selanjutnya media ditera pada pH 4 Mariska et al, 2004. MS yang dimodifikasi
dimaksudkan untuk memunculkan sifat toksisitas dari Al pada media seleksi, caranya garam-garam makro dari media MS dimodifikasi MS md, yaitu kandungan NH
4
NO
3
ditingkatkan dari 1.650 mgl menjadi 2.400 mgl, CaCl
2
.2H
2
O diturunkan dari 440 mgl menjadi 15 mgl, dan KH
2
PO
4
diturunkan dari 170 mgl menjadi 13 mgl. Sebagai sumber Fe digunakan FeSO
4
28 mgl. Kalus embriogenik yang dihasilkan dari percobaan sebelumnya, kemudian
diseleksi secara In vitro pada media seleksi Al dan pH 4. Caranya kalus dipindahkan ke dalam botol yang mengandung media seleksi Al tersebut, selanjutnya botol
disimpan dalam ruang kultur dengan temperatur ruangan 19
o
C - 21
o
C dengan intensitas penyinaran 16 jam per hari.
Percobaan menggunakan Rancangan Acak Lengkap RAL dengan 2 faktor. Faktor pertama yaitu dosis iradiasi dengan 5 taraf : 0, 250, 500, 750 dan 1000 rad.
Faktor kedua adalah media MS modifikasi Ms md dengan konsentrasi perlakuan AlCl
3
.6H
2
O ppm yaitu : A. MS md tanpa AlCl
3
.6H
2
O B. MS md + AlCl
3
.6H
2
O 250 ppm C. MS md + AlCl
3
.6H
2
O 500 ppm D. MS md + AlCl
3
.6H
2
O 750 ppm E. MS md + AlCl
3
.6H
2
O 1000 ppm. Setiap perlakuan diulang berdasarkan jumlah kalus yang dihasilkan dari
percobaan sebelumnya. Uji lanjut pengaruh iradiasi dan media seleksi Al dilakukan dengan menggunakan Uji berganda Duncan taraf 5 .
Peubah yang diamati meliputi : Persentase kalus yang bertahan hidup, diameter kalus, jumlah tunas dan visual biakan kalus. Hasil yang diperoleh dari kalus
yang tetap tumbuh pada media seleksi diharapkan toleran pada Al dan pH rendah.
Percobaan 3. Regenerasi kalus terseleksi AlCl
3
.6H
2
O
Kalus-kalus dari percobaan kedua yang dapat membentuk bakal tunas organogenesis dan kalus yang masih hidup meskipun tidak membentuk bakal tunas
kemudian diregenerasikan pada media regenerasi MS yang ditambah dengan Vitamin Morel dan Weitmore VMW, diperkaya dengan BAP 3 mgl dan Ekstrak malt 500
mgl Husni, 2007. Untuk mendapatkan tunas yang banyak dan vigor maka tunas yang terbentuk dapat disubkulturkan pada media yang sama setiap 4 minggu.
Percobaan ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap RAL dengan 2 faktor yaitu berdasarkan taraf dosis iradiasi dan seleksi in vitro pada media Al dan pH
rendah hasil dari percobaan 2. Peubah yang diamati yaitu : Jumlah kalus beregenerasi, jumlah tunas, tinggi tunas, jumlah daun, jumlah akar dan visual
pertumbuhan kalus. Pada percobaan ini dilakukan pula analisis kromosom pada varian jeruk yang tumbuh sempurna untuk melihat jumlah kromosom jeruk JC setelah
diiradiasi dan diseleksi pada media seleksi Al. Analisis dilakukan pada bagian meristem akar yang baru tumbuh karena bagian ini masih aktif membelah. Prosedur
analisis kromosom menggunakan Metode Pra-Perlakuan Lengkap Sastrosumarjo, 2006 dapat dilihat pada Lampiran 7.
Dari ketiga tahapan percobaan di atas diharapkan dihasilkan varian batang bawah jeruk yang toleran Al dan pH rendah. Secara keseluruhan kerangka alur
penelitian dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3 Kerangka Alur penelitian
1. Mutasi iradiasi dan perbanyakan kalus
Kategori