a. Tabung I
: dengan HCl 5 menghasilkan larutan berwarna hitam b.
Tabung II : dengan H
2
SO
4p
menghasilkan larutaan orange kekuningan c.
Tabung III : dengan Mg-HCl menghasilkan larutan berwarna merah muda d.
Tabung IV : dengan NaOH 10 menghasilkan larutan berwarna biru violet
3.3.2.3. Analisis Kromatografi lapis Tipis KLT
Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak klorofom dengan menggunakan fasa diam silika gel 60F
254
. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari pelarut yang sesuai didalam analisis kromatografi kolom. Pelarut yang digunakan
adalah campuran pelarut n-heksana : etil asetat 90:10 ; 80:20 ; 70:30 ; 60:40 vv, sehingga diperoleh perbandingan pelarut n-heksana : etil asetat yang sesuai untuk
kromatografi kolom. Pelarut yang digunakan berdasarkan pada jumlah bercak atau noda yang terpisah dengan baik dalam kromatografi lapis tipis.
Prosedur analisis kromatografi lapis tipis : Kedalam bejana kromatografi lapis tipis dimasukkan larutan fase gerak yaitu
campuran n-heksana : etil asetat dengan campuran 90:10 ; 80:20 ; 70-30 ; 60:40 vv. Kemudian ekstrak klorofom ditotolkan pada plat KLT. Lalu plat dimasukkan kedalam
bejana yang berisi pelarut yang dijenuhkan. Setelah dielusi, dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan. Noda terbentuk diamati dengan sinar ultraviolet dan difiksasi dengan
pereaksi FeCl
3
5. Kemudian dihitung dan dicatat harga Rf. Yang memberikan pemisahan bercak noda yang baik adalah perbandingan pelarut n-heksana : etil asetat
70:30 vv yang memberikan empat noda dengan harga Rf yaitu 0,6; 0,52; 0,48; dan 0,32.
3.3.3. Prosedur Untuk Memperoleh Senyawa Kimia dari Ekstrak daun tumbuhan iler
Serbuk daun tumbuhan iler ditimbang sebanyak 700 g, dimasukkan ke dalam bejana dan ditambahkan dengan pelarut metanol sampai semua sampel terendam oleh pelarut
dan dibiarkan selama 72 jam dan sesekali diaduk. Maserat disaring dan diperoleh
ekstrak berwarna hijau tua. Maserasi dilakukan berulang kali dengan menggunakan pelarut metanol sampai ekstrak metanol yang diperoleh memberikan hasil uji yang
negatif pada pereaksi untuk identifikasi senyawa flavonoida. Ekstrak metanol yang diperoleh dikumpulkan dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator
pada suhu 60 C sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol, kemudian diekstraksi
partisi dengan menggunakan pelarut n-heksana, sehingga terbentuk lapisan n-heksana dan lapisan metanol. Fraksi metanol ditampung dan dipekatkan kemudian dihidrolisa
dengan HCl 6. Kemudian disaring dan filtrat tersebut diekstraksi partisi dengan klorofom secara berulang-ulang. Ekstrak klorofom dipekatkan dengan menggunakan
alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat klorofom sebanyak 2 gram
3.3.4. Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoida secara kromatografi kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat klorofom daun tumbuhan iler yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan
adalah silika gel 40 70-230 mesh ASTM dan fasa gerak yaitu n-heksana 100 dan campuran pelarut n-heksana : etil asetat 90 : 10 ; 80 : 20 ; 70 : 30 ; 60 : 40vv.
Prosedur isolasi senyawa flavonoida dengan kromatografi kolom :
Dirangkai seperangkat alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 40 70-230 mesh ASTM dengan menggunakan n-heksana, diaduk-aduk
hingga homogen lalu dimasukkan ke dalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-heksan 100 hingga silika gel padat dan homogen.
Dimasukkan 2 g ekstrak klorofom daun tumbuhan iler ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel di puncak kolom, lalu ditambahkan fasa gerak
n-heksana-etil asetat mulai dari 90:10vv; 80:20vv; 70:30vv; 60:40vv, secara perlahan–lahan, dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama
banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas kolom. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 10 ml, lalu di KLT dan digabung fraksi dengan
harga Rf yang sama. Setelah itu diuji flavonoida dan diuapkan pelarutnya.
3.3.5. Pemurnian
