Evaluasi Pemberian Probiotik Multispesies Melalui Media Budi Daya Ikan Lele Dumbo (Clarias Gariepinus) Untuk Pencegahan Penyakit Motile Aeromonads Septicemia.
EVALUASI PEMBERIAN PROBIOTIK MULTISPESIES
MELALUI MEDIA BUDI DAYA IKAN LELE DUMBO (Clarias
gariepinus) UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT MOTILE
AEROMONADS SEPTICEMIA
HILMA PUTRI FIDYANDINI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Evaluasi pemberian
probiotik multispesies melalui media budi daya ikan lele dumbo (Clarias
gariepinus) untuk pencegahan penyakit Motile Aeromonads Septicemia adalah
benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan
dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2015
Hilma Putri Fidyandini
C151130041
RINGKASAN
HILMA PUTRI FIDYANDINI. Evaluasi pemberian probiotik multispesies
melalui media budi daya ikan lele dumbo (Clarias gariepinus) untuk pencegahan
penyakit Motile Aeromonads Septicemia. Dibimbing oleh MUNTI YUHANA dan
ANGELA MARIANA LUSIASTUTI.
Salah satu penyakit yang sering menyebabkan kematian ikan lele
dumbo dan menyebabkan kegagalan panen adalah penyakit MAS (Motile
Aeromonads Septicemia) yang disebabkan oleh infeksi bakteri Aeromonas
hydrophila. Untuk mengatasi situasi ini perlu dilakukan upaya pencegahan dan
pengendalian penyakit. Salah satu cara yang aman dan ramah lingkungan
untuk mengontrol penyakit di lingkungan budi daya dan dapat diterima di
akuakultur adalah dengan menggunakan probiotik melalui media
pemeliharaan. Pemberian bakteri probiotik ke dalam media pemeliharaan
bertujuan untuk meningkatkan kesehatan ikan sebagai inang dengan cara menekan
populasi bakteri patogen, meningkatkan kualitas perairan atau membantu
mendegradasi limbah organik. Efektifitas probiotik dipengaruhi oleh
komposisi probiotik dan konsentrasi yang digunakan.
Penelitian ini telah dilaksanakan pada bulan September 2014 sampai
Januari 2015 di Instalasi Penelitian dan Pengembangan Pengendalian Penyakit
Ikan (IP4I), Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air Tawar (BPPBAT),
Depok. Penelitian ini terdiri dari 3 tahap yaitu: penyiapan kultur sel probiotik dan
patogen, uji in vitro (pemberian penanda resistensi antibiotik dan uji kultur
bersama) dan uji in vivo. Parameter yang diamati selama penelitian adalah tingkat
kelangsungan hidup, laju pertumbuhan spesifik, rasio konversi pakan, kadar
hematokrit, diferensial leukosit, respiratory burst activity, aktivitas lisozim,
monitoring populasi sel bakteri dan kualitas air. Penelitian terdiri dari 6 perlakuan
dengan 3 ulangan yaitu (A) penambahan bakteri dalam media dengan komposisi
AH26 NAR 103 CFU/mL, probiotik ND2 CefR 105 CFU/mL dan P23 CipR 105
CFU/mL ; (B) penambahan bakteri dalam media dengan komposisi AH26 NAR
103 CFU/mL, probiotik ND2 CefR 103 CFU/mL dan L1k TetR 103 CFU/mL; (C)
penambahan bakteri dalam media dengan komposisi AH26 NAR 103 CFU/mL,
probiotik P23 CipR 104 CFU/mL dan L1k TetR 104 CFU/mL; (D) penambahan
bakteri dalam media dengan komposisi AH26 NAR 103 CFU/mL, probiotik, ND2
CefR 105 CFU/mL, P23 CipR 105 CFU/mL dan L1k TetR 105 CFU/mL; (K+)
penambahan AH26 NAR 103 CFU/mL dalam media dan tanpa penambahan
probiotik sebagai kontrol positif; (K-) tanpa penambahan probiotik dan tanpa
AH26 NAR pada media sebagai kontrol negatif.
Hasil penelitian menunjukkan kombinasi antara probiotik ND2
CefR 103 CFU/mL dan L1k TetR 103 CFU/mL dapat menekan pertumbuhan A.
hydrophila sampai 40% dan meningkatkan respons imun (kadar hematokrit,
diferensial leukosit, respiratory burst activity dan aktivitas lisozim). Perlakuan
kombinasi tersebut juga menunjukkan SR tertinggi yaitu sebesar 89,33±4,62%,
laju pertumbuhan spesifik sebesar 1,75±0,08% dan rasio konversi pakan terendah
1,33±0,1. Pemberian probiotik multispesies dengan kombinasi probiotik Bacillus
subtilis ND2 dan Staphylococcus lentus L1k yang diaplikasikan melalui media
budi daya ikan lele dumbo dengan konsentrasi akhir sel di media pemeliharaan
masing-masing 103 CFU/mL dapat menekan populasi sel A. hydrophila sampai
40% dibandingkan kontrol positif dan dapat meningkatkan kelangsungan hidup,
laju pertumbuhan spesifik, respons imun dan menurunkan rasio konversi pakan
ikan lele dumbo.
Kata Kunci : Probiotik Multispesies, Clarias gariepinus, Motile Aeromonads
Septicemia
SUMMARY
HILMA PUTRI FIDYANDINI. Evaluation of Multispecies Probiotics
Addition in the Culture Medium of African Catfish (Clarias gariepinus) to
Prevent the Motile Aeromonads Septicemia Disease. Supervised by MUNTI
YUHANA and ANGELA MARIANA LUSIASTUTI.
One of infections disease that often led the mortality of catfish and
resulted in harvest failure is MAS (Motile Aeromonads Septicemia) disease
caused by the infection of Aeromonas hydrophila. To avoid this disease, the
prevention and control is very crucial. An environmentally friendly approach
acceptable in aquaculture is the use of probiotics. By giving probiotic bacterium in
the culture medium is to increase the host fish health by reducing the population
of pathogenic, improving water quality or helping the degrade of organic waste.
The effectiveness of probiotics application is influenced by probiotic
compositions and concentrations.
This research was conducted from September 2014 up to January 2015 in
Research Installation for Fish Health Control, Research and Development of
Freshwater Aquaculture, Depok.This research consisted of three steps: preparation
of probiotic cell culture and pathogenic strain , in vitro test ( giving the antibiotic
resistance marker and co-culture) and in vivo tests. The parameters observed
during this research were survival rate, specific growth rate, feed conversion ratio,
the level of hematocrit, differential leukocyte, respiratory burst activity, lysozyme
activity, monitoring of bacterial cell populations and water quality. This research
was consisted of 6 treatments with 3 replications, namely (A) addition of bacteria
in the medium with a composition of AH26 NAR 103 CFU/mL, probiotics ND2
CefR 105 CFU/mL and P23 CipR 105 CFU/mL; (B) addition of bacteria in the
medium with the composition of AH26 NAR 103 CFU/mL, probiotics ND2 CefR
103 CFU/mL and L1k TetR 103CFU / mL; (C) addition of bacteria in the medium
with the composition of AH26 NAR 103 CFU/mL, probiotics P23 CipR 104
CFU/mL and L1k TetR 104 CFU/mL; (D) addition of bacteria in the medium with
the composition of AH26 NAR 103 CFU/mL, probiotics, ND2 CefR 105 CFU/mL,
P23 CipR 105 CFU/mL and L1k TetR 105 CFU/mL; (K +) addition of AH26 NAR
103 CFU/mL in media and without the addition of probiotics as positive control;
(K-) Without the addition of probiotics and without AH26 NAR in the media as
negative control.
The results showed that the combination between probiotics ND2 CefR 103
CFU/mL and L1k TetR 103 CFU/mL can supressed the growth of A. hydrophila up
to 40% and improved the immune response (hematocrit level, differential
leukocyte, respiratory burst activity and lysozyme activity). The combination
treatment also showed the highests survival rate was 89,33±4,62%, the specific
growth rate was 1,75±0,08% and the lowest feed conversion ratio was 1,33±0,1.
By giving multispecies probiotic with combination probiotic of Bacillus subtilis
ND2 and Staphylococcus lentus L1k which applied through the medium of catfish
with the final concentration of cells in the respective culture media 103 CFU/mL
can supressed the population of A. hydrophila cell up to 40% compared with the
positive control and increased the survival rate, specific growth rate, immune
response and decreased feed conversion ratio of catfish.
Keywords: Multispecies Probiotics, Clarias gariepinus, Motile Aeromonads
Septicemia
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
EVALUASI PEMBERIAN PROBIOTIK MULTISPESIES
MELALUI MEDIA BUDI DAYA IKAN LELE DUMBO (Clarias
gariepinus) UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT MOTILE
AEROMONADS SEPTICEMIA
HILMA PUTRI FIDYANDINI
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Ilmu Akuakultur
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
Penguji luar komisi: Dr Sri Nuryati, SPi MSi
l./
Judul Tesis
Nama
NIM
:
Evaluasi Pemberian Probiotik Multispesies melalui Media Budi
Daya Ikpn Lele Durnbo (Clarias gariepinus) untuk Pencegahan
Penyakit Motile Aeramonad,r Septicemia
: Hilma Putri Fidyandini
: C151130041
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Dr Drh A.ngela Mariana L. MSi
Anggota
Dr Muirti Yuhana. SPi MSi
Ketua
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Ilmu Akuakultur
KW
;a7trXi{?
F7\Ergs{
Dr k Widanarni, MSi
Dr k Dahrul Syah, MScAgr
Tanggal Ujian:
27 Agustus 2015
Tanggal
Lulus:
1i
B SEP ?011
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah dengan judul Evaluasi Pemberian
Probiotik Multispesies melalui Media Budi Daya Ikan Lele Dumbo (Clarias
gariepinus) untuk Pencegahan Penyakit Motile Aeromonads Septicemia dapat
diselesaikan dengan baik. Ucapan terimakasih diberikan kepada :
1. Dr Munti Yuhana, SPi MSi dan Dr Drh Angela Mariana Lusiastuti, MSi
selaku pembimbing atas waktu, kesabaran, kebijaksanaan, serta bimbingan
dan arahan yang selalu diberikan hingga tesis ini dapat diselesaikan.
2. Dr Sri Nuryati, SPi MSi selaku penguji luar komisi yang telah
memberikan saran dan masukan untuk kesempurnaan tesis ini.
3. Dr Ir Mia Setiawati, MSi sebagai Komisi Program Studi Ilmu Akuakultur
yang telah banyak memberikan bantuan selama menempuh pendidikan di
Institut Pertanian Bogor.
4. Seluruh jajaran pimpinan, peneliti, teknisi, administrasi dan rekan-rekan
di IP4I Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air Tawar Bogor
atas segala bantuan dan fasilitas yang diberikan.
5. Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi yang telah memberikan Beasiswa
selama mengikuti pendidikan S2.
6. Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air Tawar Bogor yang telah
memberikan dana penelitian.
7. Ayahanda Syaiful Anam, SKM dan Ibunda Siti Aminah, SPd MPd Bapak
Mertua Yoyon Sumaryono, SPd dan Ibu Mertua Anik Rohmawati, SP
yang telah memberikan cinta dan kasih sayang, doa serta semangat yang
tak pernah henti. Kakak dan adik Yufrida Khairani, AmdKeb, Vidi
Ardianto, Isma Dewi Nurrosyidah, keponakan Dastan Kenzie Atharizz
Rashdan serta seluruh keluarga besar yang selalu memberikan do`a,
dukungan dan semangat.
8. Suami drg Alif Chandra Aryono atas kasih sayang, pengertian, dukungan,
kesabaran, pengorbanan, dan doa yang diberikan. Sumber inspirasi dan
semangat Athaya Nafeeza Alfidyandra yang selalu menemani selama
studi.
9. Teman-teman Akuakultur 2012 (Faisal), Akuakultur 2013 (Putri, Dwi,
Mbak Novi, Kurnia, Andre, Wildan dan Fazril) yang selalu membantu
selama di Bogor.
10. Semua pihak yang tidak dapat disebut satu persatu yang telah memberikan
segala doa dan bantuan baik moril maupun materil.
Bogor, Agustus 2015
Hilma Putri Fidyandini
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
vi
vi
vi
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
1
1
2
2
3
2 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Prosedur Penelitian
Penyiapan Kultur Sel Probiotik dan Patogen
Pemberian Penanda Resistensi Antibitik
Uji Kultur Bersama
Uji In vivo
Desain Penelitian
Parameter Uji
Analisis Data
3
3
3
3
3
4
5
5
5
8
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Uji Kultur Bersama
Tingkat Kelangsungan Hidup
Laju Pertumbuhan Spesifik
Rasio Konversi Pakan
Kadar Hematokrit
Diferensial Leukosit
Respiratory Burst Activity
Aktivitas Lisozim
Monitoring Populasi Sel Bakteri
Parameter Kualitas Air
Pembahasan
8
8
8
9
9
10
11
11
13
14
14
15
16
4 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
20
20
20
DAFTAR PUSTAKA
20
LAMPIRAN
24
RIWAYAT HIDUP
25
DAFTAR TABEL
1 Kombinasi perlakuan uji penghambatan bakteri probiotik terhadap AH
NAR secara in vitro
2 Hasil perhitungan konsentrasi sel dari uji kultur bersama probiotik
multisepesies terhadap AH26 NAR
3 Kisaran hasil pengukuran kualitas air selama penelitian
4
8
16
DAFTAR GAMBAR
Tingkat Kelangsungan hidup ikan lele dumbo (C. gariepinus) yang
yang diinfeksi AH26 NAR dan dipelihara pada media yang
mengandung probiotik multispesies
2 Laju pertumbuhan spesifik ikan lele dumbo (C. gariepinus) yang
diinfeksi AH26 NAR dan dipelihara pada media yang mengandung
probiotik multispesies
3 Rasio konversi pakan pada ikan lele dumbo (C. gariepinus) yang
diinfeksi AH26 NAR dan dipelihara pada media yang mengandung
probiotik multispesies
4 Kadar hematokrit pada ikan lele dumbo (C. gariepinus) yang diinfeksi
AH26 NAR dan dipelihara pada media yang mengandung probiotik
multispesies
5 Persentase monosit darah ikan lele dumbo (C. gariepinus) yang
diinfeksi AH26 NAR dan dipelihara pada media yang mengandung
probiotik multispesies
6 Persentase neutrofil darah ikan lele dumbo (C. gariepinus) yang
diinfeksi AH26 NAR dan dipelihara pada media yang mengandung
probiotik multispesies
7 Persentase limfosit darah ikan lele dumbo (C. gariepinus) yang
diinfeksi AH26 NAR dan dipelihara pada media yang mengandung
probiotik multispesies
8 Respiratory Burst activity ikan lele dumbo (C. gariepinus) yang
diinfeksi AH26 NAR dan dipelihara pada media yang mengandung
probiotik multispesies
9 Aktivitas lisozim ikan lele dumbo (C. gariepinus) yang diinfeksi
AH26 NAR dan dipelihara pada media yang mengandung probiotik
multispesies
10 Kepadatan sel bakteri pada media pemeliharaan ikan lele dumbo
1
9
10
10
11
12
12
13
13
14
15
DAFTAR LAMPIRAN
1 Pengukuran kadar hematokrit
2 Penghitungan diferensial leukosit
3 Pengukuran Respiratory Burst activity
4 Pengukuran aktivitas lisozim
24
24
24
24
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Teknologi budi daya ikan lele dumbo (Clarias gariepinus) yang
digunakan di Indonesia adalah sistem budi daya intensif dengan padat tebar yang
tinggi dengan pemberian pakan tambahan yang optimal. Sama seperti usaha budi
daya perikanan lainnya, masalah utama dalam budi daya ikan lele dumbo adalah
serangan penyakit. Kematian ikan lele dumbo dan kegagalan panen akan dialami
jika serangan penyakit tidak segera ditanggulangi, untuk menghindari keadaan
ini, perlu dilakukan upaya pencegahan dan penanggulangan penyakit secara
tepat.
Salah satu penyakit yang sering menyebabkan kematian ikan lele
dumbo adalah penyakit MAS (Motile Aeromonads Septicemia) yang
disebabkan oleh infeksi bakteri Aeromonas hydrophila. A. hydrophila
merupakan bakteri Gram negatif, berbentuk batang, tidak berspora, bersifat
katalase dan oksidase positif, bergerak dengan flagela, dan termasuk bakteri
anaerobik fakultatif (Erdem et al. 2011). A. hydrophila termasuk dalam bakteri
patogen oportunistik dan merupakan mikroflora normal dalam perairan. Hal ini
sesuai dengan hasil penelitian Uddin dan Al-Harbi (2010) yang menyatakan
bahwa A. hydrophila merupakan bakteri patogen yang mendominasi jenis bakteri
pada air kolam budi daya ikan lele dumbo sebesar 25%, Vibrio cholerae 11,61%
dan Streptococcus sp. 4,46%. Uddin dan Al-Harbi (2012) juga menyebutkan
bahwa A. hydrophila juga mendominasi jenis bakteri pada air kolam budi daya
polikultur ikan lele dumbo dan ikan mas yaitu sebesar 29,93%, sedangkan
Streptococcus sp. sebesar 2,72% dan S. putrefaciens sebesar 12,25%.
Upaya untuk mencegah ikan agar tidak terserang penyakit adalah dengan
meningkatkan daya tahan tubuh ikan atau dengan mengontrol lingkungan budi
daya. Pengendalian lingkungan budi daya dapat dilakukan dengan cara
penambahan probiotik melalui media pemeliharaan. Pemberian bakteri probiotik
ke dalam media pemeliharaan bertujuan untuk meningkatkan kesehatan ikan
sebagai inang dengan cara menekan populasi bakteri patogen, meningkatkan
kualitas perairan atau membantu mendegradasi limbah organik (Irianto 2005).
Terdapat tiga cara kinerja probiotik, yaitu menekan populasi mikroba
melalui kompetisi dengan memproduksi senyawa-senyawa antimikroba atau
melalui kompetisi nutrisi dan tempat pelekatan di saluran pencernaan, merubah
metabolisme mikrobial dengan meningkatkan atau menurunkan aktivitas
enzim serta menstimulasi imunitas melalui peningkatan kadar antibodi atau
aktivitas makrofag (Irianto 2003). Probiotik merupakan mikroorganisme yang
memiliki kemampuan untuk memodifikasi komposisi populasi bakteri dalam
saluran pencernaan, air, sedimen serta dapat digunakan sebagai agen biokontrol
dan bioremediasi Sebagai agen biokontrol, probiotik berperan sebagai musuh
alami yang mencegah kerusakan yang disebabkan oleh mikroorganisme
merugikan sampai batas yang dapat ditoleransi (Nayak 2011). Efektivitas
probiotik dipengaruhi oleh jenis probiotik, konsentrasi sel yang digunakan dan
frekuensi pemberian (Fuller 1992). Sebagai agen bioremediasi, probiotik berperan
dalam memperbaiki kualitas air dengan cara menurunkan konsentrasi amonia.
2
Pemberian bakteri probiotik Staphylococcus lentus L1k melalui pakan
telah diteliti oleh Hasibuan (2013) dan Santoso (2013). Hasil penelitian Hasibuan
(2013) menunjukkan bahwa penggunaan probiotik L1k dan kombinasi probiotik
multispesies L1k dengan NB21b dapat meningkatkan respons imun dan dapat
mengurangi tingkat kematian ikan nila akibat infeksi Streptococcus agalactiae
serta pemberian probiotik L1k pada ikan nila melalui pakan menunjukkan
Survival Rate (SR) sebesar 100%, sedangkan perlakuan kombinasi multispesies
L1k dengan NB21b menunjukkan SR sebesar 95,56%. Pemberian probiotik
Bacillus subtilis ND2 dengan dosis 109 CFU/mL melalui media pemeliharaan ikan
nila menunjukkan SR sebesar 51,67% (Wijaya 2011). Pemberian probiotik
Bacillus cereus P23 melalui media pemeliharaan juga telah diteliti oleh Haditomo
(2011) yang menunjukkan bahwa pemberian probiotik sebesar 106 CFU/mL dapat
mempertahankan SR ikan mas sebesar 100%.
Fyzul et al. (2007) menyatakan bahwa Bacillus subtilis AB1 efektif
sebagai probiotik untuk menghambat infeksi Aeromonas sp. pada rainbow trout.
Hasil penelitian Ravi et al. (2007) menyebutkan bahwa probiotik dari jenis
Paenibacillus sp., Bacillus cereus dan P. polymyxa yang diaplikasikan lewat air
dapat menghambat pertumbuhan Vibrio pada larva udang windu (Penaeus
monodon). Penelitian mengenai aplikasi probiotik multispesies sebagai biokontrol
patogen pada budi daya ikan lele dumbo (Clarias gariepinus) belum banyak
dilakukan, sehingga penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh
penambahan probiotik untuk meningkatkan kinerja budi daya, serta menentukan
kombinasi probiotik multispesies yang efektif untuk menekan populasi A.
hydrophila pada media budi daya ikan lele dumbo.
Perumusan Masalah
Kontrol jumlah bakteri dalam lingkungan perairan diperlukan untuk
menekan jumlah bakteri dalam perairan, terutama yang bersifat patogen. Salah
satu cara untuk mengontrol jenis bakteri dalam perairan yaitu dengan
menggunakan probiotik sebagaimana konsep probiotik sebagai agen biokontrol
lingkungan. Manipulasi terhadap populasi mikroba yang berada di perairan guna
pencegahan sebelum terjadinya serangan bakteri yang bersifat mematikan perlu
dilakukan sebagaimana konsep probiotik sebagai biokontrol.
Penggunaan probiotik sebagai biokontrol ini diharapkan dapat
menurunkan jumlah bakteri patogen dalam perairan terutama A. hydrophila,
sehingga kondisi perairan budi daya berada dalam kondisi optimal. Dengan
optimalisasi pemberian probiotik yang tepat sebelum terjadi peningkatan
kepadatan A. hydrophila yang dapat memicu timbulnya serangan penyakit pada
ikan di media budi daya, maka besar kemungkinan untuk menekan kerugian
akibat serangan Motile Aeromonads Septicemia dan meningkatkan keuntungan
usaha budi daya perikanan.
Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini yaitu untuk mengevaluasi pengaruh pemberian
probiotik multispesies melalui media budi daya ikan lele dumbo sebagai pencegah
penyakit Motile Aeromonads Septicemia.
3
Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai
kombinasi probiotik multispesies untuk menekan pertumbuhan A. hydrophila dan
menjadi alternatif pemecahan masalah penyakit Motile Aeromonads Septicemia
pada budi daya ikan lele dumbo secara aman dan ramah lingkungan.
2 METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini telah dilaksanakan pada bulan September 2014 sampai
Januari 2015 di Instalasi Penelitian dan Pengembangan Pengendalian Penyakit
Ikan (IP4I), Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air Tawar (BPPBAT),
Depok.
Metode
Penyiapan Kultur Sel Probiotik dan Patogen
Probiotik yang digunakan dalam penelitian ini adalah probiotik Bacillus
subtilis (ND2), Bacillus cereus (P23) dan Staphylococcus lentus (L1k), sedangkan
patogen yang digunakan adalah A. hydrophila (AH26). Isolat ND2, P23 dan
AH26 merupakan koleksi dari Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air
Tawar Bogor, sedangkan isolat L1k merupakan koleksi Laboratorium Kesehatan
Ikan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Kultur sel
probiotik dilakukan dengan cara mengambil koloni kemudian dikultur dalam
media Tryptone Soya Agar (TSA) dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 28oC.
Probiotik yang telah dikultur pada media TSA diinokulasikan ke dalam media cair
Tryptone Soya Broth (TSB) 10 mL, diinkubasi selama 24 jam pada suhu 28 oC.
Kultur sel patogen A. hydrophila AH26, dilakukan dengan menggunakan media
selektif yaitu Rimler Shotts (RS). A. hydrophila yang tumbuh pada media RS
diinokulasikan ke media TSA dan diinkubasi selama 24 jam di dalam inkubator
pada suhu 28 oC. A. hydrophila yang telah di kultur pada media TSA dipindah dan
diinokulasikan ke dalam media cair TSB 10 mL dan diinkubasi selama 24 jam
pada suhu 28 oC.
Uji in vitro
Pemberian Penanda Resistensi Antibiotik
Antibiotik yang digunakan dalam pemberian penanda ini adalah Nalidixic
Acid (NA) untuk bakteri AH26, Cefadroxil (Cef) untuk ND2, Ciprofloxacin (Cip)
untuk P23 dan Tetrasiklin (Tet) untuk L1k dengan dosis antibiotik tersebut
masing-masing 100 μg/mL. Pemberian penanda dilakukan dengan cara
mengkultur masing-masing isolat bakteri pada media TSB setelah 24 jam masing-
4
masing isolat di kultur kedalam TSB yang mengandung antibiotik dengan dosis
masing-masing 100 µg/mL, kemudian ditumbuhkan pada media TSA yang
mengandung antibiotik dengan dosis yang sama dan dilakukan Total Plate Count
(TPC) pada semua isolat bakteri dan ditentukan dengan metode cawan sebar
menurut Madigan et al. (2011).
Uji Kultur Bersama
Uji kultur bersama dilakukan untuk mengetahui potensi kombinasi bakteri
probiotik ND2 CefR, P23 CipR, L1k TetR dalam menghambat pertumbuhan bakteri
patogen AH26 NAR. Setiap kombinasi bakteri pada perlakuan A, B, C dan D
diinokulasikan pada media TSB (Bernard et al. 2013), perlakuan E hanya
menginokulasikan AH26 NAR pada media TSB sebagai kontrol dan diinkubasi
selama 24 jam pada suhu 28 °C. Penghitungan bakteri dilakukan dengan metode
hitungan cawan (Madigan et al. 2011). Media yang digunakan pada perlakuan A
sampai E berupa media RS yang merupakan media selektif untuk A. hydrophila.
Perlakuan F, G, H diinokulasikan pada media TSA menggunakan metode dual
culture dengan menggunakan kertas cakram untuk mengetahui aktivitas gabungan
antar bakteri probiotik bersifat antagonis atau sinergis (Kalaiselvi dan
Panneerselvam 2011). Kombinasi perlakuan pada uji kultur bersama secara in
vitro dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1 Kombinasi perlakuan uji penghambatan bakteri probiotik terhadap AH26
NAR secara in vitro
Probiotik (CFU/mL)
Bakteri AH26 NAR
Perlakuan
R
R
R
ND2 Cef
P23 Cip
L1k Tet
(CFU/mL)
3
3
10
10
0
A
104
104
0
103
5
5
10
10
0
3
10
0
103
4
B
10
0
104
103
105
0
105
3
0
10
103
C
0
104
104
103
0
105
105
3
3
10
10
103
D
104
104
104
103
5
5
5
10
10
10
E
0
0
0
103
6
6
F
10
10
0
0
G
106
0
106
0
6
6
H
0
10
10
0
Keterangan :
(A) perlakuan probiotik ND2 CefR dan P23 CipR; (B) perlakuan probiotik ND2 CefR dan L1k
TetR; (C) perlakuan probiotik P23 CipR dan L1k TetR; (D) perlakuan probiotik ND2 CefR, P23
CipR dan L1k TetR; (E) Kontrol positif; (F) uji dual culture probiotik ND2 CefR dan P23 CipR ; (G)
uji dual culture probiotik ND2 CefR dan L1k TetR; (H) uji dual culture probiotik P23 CipR dan
L1k TetR; (0) tidak diinokulasikan.
5
Uji in vivo
Uji in vivo ini merupakan aplikasi, setelah mendapatkan hasil konsentrasi
terbaik masing-masing probiotik dengan AH26 NAR secara in vitro, selanjutnya
diimplementasikan secara in vivo. Sebelum dilakukan uji in vivo, dilakukan uji
Postulat Koch terlebih dahulu. Uji Postulat Koch dilakukan untuk mengetahui
sifat patogen dari isolat bakteri dan meningkatkan patogenitas (Madigan et al.
2011) dalam hal ini adalah isolat AH26 NAR yang diujikan pada ikan lele dumbo.
Ikan lele dumbo yang digunakan berukuran 3-4 cm dengan berat 2-3 gram
dipelihara dalam akuarium berukuran 56x39x34 cm3, diisi air dengan volume 30
liter dengan padat tebar 10 ekor. Isolat AH26 NAR (106 CFU/mL) diinjeksikan ke
ikan uji dengan volume 0,1 mL/ekor. Pengamatan gejala klinis dilakukan selama
24 jam.
Desain Penelitian
Ikan lele dumbo yang digunakan memiliki berat 1,97±0,7 gram/ekor
dipelihara dalam akuarium berukuran 56x39x34 cm3, diisi air dengan volume 30
liter dengan padat tebar 25 ekor. Konsentrasi yang diberikan pada uji in vivo
merupakan hasil konsentrasi terbaik kombinasi probiotik dengan AH26 NAR
secara in vitro melalui uji kultur bersama. Pemberian probiotik dilakukan setiap
hari selama 28 hari. Probiotik dan patogen diberikan pada media pemeliharaan.
Perlakuan yang diberikan pada uji in vivo yaitu:
(A) penambahan bakteri dalam media dengan komposisi AH26 NAR 103 CFU/mL,
probiotik ND2 CefR 105 CFU/mL dan P23 CipR 105 CFU/mL;
(B) penambahan bakteri dalam media dengan komposisi AH26 NAR 103 CFU/mL,
probiotik ND2 CefR 103 CFU/mL dan L1k TetR 103 CFU/mL;
(C) penambahan bakteri dalam media dengan komposisi AH26 NAR 103 CFU/mL,
probiotik P23 CipR 104 CFU/mL dan L1k TetR 104 CFU/mL;
(D) penambahan bakteri dalam media dengan komposisi AH26 NAR 103 CFU/mL,
probiotik, ND2 CefR 105 CFU/mL, P23 CipR 105 CFU/mL dan L1k TetR 105
CFU/mL;
(K+) penambahan AH26 NAR 103 CFU/mL dalam media dan tanpa penambahan
probiotik sebagai kontrol positif;
(K-) tanpa penambahan probiotik dan tanpa AH26 NAR pada media sebagai
kontrol negatif.
Parameter Uji
Parameter uji dalam penelitian ini meliputi parameter kinerja budi daya
antara lain parameter tingkat kelangsungan hidup (Effendi 2002), laju
pertumbuhan spesifik (Huisman 1987), rasio konversi pakan (Takeuchi 1988).
Parameter sistem imun yang meliputi kadar hematokrit (Anderson dan Siwicki
1995), diferensial leukosit (Blaxhall dan Daisley 1973), respiratory burst activity
(Secombes 1990) dan aktivitas lisozim (Ellis 1990). Monitoring populasi sel
bakteri dan parameter kualitas air.
6
Tingkat Kelangsungan Hidup
Kelangsungan hidup/Survival Rate (SR) dihitung berdasarkan Effendi
(2002) yaitu:
Nt
SR
100
No
Keterangan :
SR = Tingkat kelangsungan hidup (%)
Nt = Jumlah ikan yang hidup pada akhir pengamatan (ekor)
No = Jumlah ikan yang hidup pada awal uji tantang (ekor)
Laju pertumbuhan spesifik
Ikan diukur bobotnya pada awal dan akhir masa pemeliharaan. Laju
pertumbuhan spesifik (Specific Growth Rate/SGR) dihitung dengan menggunakan
rumus (Huisman, 1987):
ln Wt - ln Wo
x100
t
Laju pertumbuhan harian (%)
Log natural bobot ikan pada akhir pengamatan (gram)
Log natural bobot ikan pada awal pengamatan (gram)
Lama waktu pengamatan (hari)
SGR
Keterangan:
SGR
ln Wt
ln Wo
t
=
=
=
=
Rasio konversi pakan
Rasio konversi pakan dihitung dengan menggunakan rumus berdasarkan
Takeuchi (1988):
F
Bt - B0 Bd
= Rasio konversi pakan
= Jumlah pakan yang diberikan (g)
= Biomassa ikan pada hari ke-t (g)
= Biomassa ikan pada hari ke-0 (g)
= Biomassa ikan yang mati (g)
FCR
Keterangan:
FCR
F
Bt
Bo
Bd
Kadar Hematokrit
Kadar hematoktit diperiksa menurut Anderson dan Siwicki (1995)
menggunakan tabung mikro hematokrit kemudian dihitung dengan persamaan:
a
He 100
b
Keterangan:
He : Kadar hematokrit (%)
a : bagian darah yang mengendap (mm)
b : bagian seluruh darah dalam tabung mikro hematokrit (mm)
7
Diferensial Leukosit
Pengamatan diferensial leukosit menggunakan metode Blaxhall dan
Daisley (1973) dengan mengamati preparat ulas darah yang diwarnai dengan
pewarna Giemsa. Pengamatan dan penghitungan masing-masing jenis sel yaitu
monosit, neutrofil dan limfosit dilakukan hingga jumlah semua mencapai 100, dan
hasilnya dinyatakan dalam % .
Respiratory Burst Activity
Uji respiratory burst activity menggunakan reagen Nitro Blue Tetrazolium
(NBT) berdasarkan metode Secombes (1990). Darah dari ikan sampel diambil
sebanyak 50 µl dimasukkan dalam microplate, diinkubasi selama 1 jam suhu
37oC, kemudian supernatan dibuang dan dicuci PBS 50 µl sebanyak 3 kali,
ditambahkan 50 µl NBT 0,2% diinkubasi selama 1 jam suhu 37oC. Fiksasi
metanol 100% (50 µl) 2-3 menit lalu dibilas dengan metanol 30% (50 µl) 3 kali
dan dikering udarakan, kemudian ditambah KOH 60 µl + DMSO 70 µl dan
pengecekkan optical density (ELISA Reader 540nm).
Aktivitas Lisozim
Aktivitas lisozim diuji menggunakan serum ikan lele menggunakan
metode Ellis (1990) yang dapat dirumuskan sebagai berikut:
Aktivitas lisozim (UI/mL/menit) =[((OD30m– OD60m) x 1000) x (1/ s)]/t
Keterangan:
1000
= Konversi hasil absorbansi (OD) menjadi unit internasional (UI)
t
= waktu (menit)
s
= jumlah serum (ml)
OD30m = Pembacaan densitas optikal menit ke -30
OD60m = Pembacaan densitas optikal menit ke -60
Monitoring Populasi Sel Bakteri
Media yang digunakan untuk menghitung total bakteri adalah media TSA,
RS untuk menghitung total bakteri A. hydrophila, dan TSA+NA 100μg/mL untuk
menghitung total bakteri AH26 NAR, TSA+Cef 100μg/mL untuk menghitung
total bakteri probiotik ND2 CefR, TSA+Cip 100μg/mL untuk menghitung total
bakteri probiotik P23 CipR, TSA+Tet 100μg/mL untuk menghitung total bakteri
probiotik L1k TetR. Total bakteri dalam media pemeliharaan dihitung
menggunakan metode Total Plate Count (TPC) yang dilakukan setiap minggu
pada hari ke-0, 7, 14, 21, dan 28.
Parameter Kualitas Air
Parameter kualitas air yang diamati pada penelitian ini adalah pengukuran
suhu, pH, oksigen terlarut dan amonia yang diukur pada hari ke-0, 7, 14, 21, dan
28.
8
Analisis Data
Rancangan perlakuan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap
(RAL) dengan 6 perlakuan, dan masing-masing perlakuan diulang sebanyak 3
kali. Data tingkat kelangsungan hidup, laju pertumbuhan spesifik, rasio konversi
pakan, kadar hematokrit, diferensial leukosit, Respiratory Burst avtivity dan
aktivitas lisozim dianalisis menggunakan ANOVA dengan selang kepercayaan
95%, dan dilanjutkan dengan uji jarak berganda Duncan untuk menentukan jenis
perlakuan yang paling baik. Hasil monitoring populasi sel bakteri dalam air dan
parameter kualitas air dianalisis secara deskriptif dengan menggunakan tabel dan
grafik.
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Uji Kultur Bersama
Tabel 2 Hasil perhitungan konsentrasi sel dari uji kultur bersama probiotik
multispesies terhadap AH26 NAR
Probiotik (CFU/mL)
Bakteri AH26 NAR (CFU/mL)
Sinergis/
Perlakuan
ND2
P23
R
Antagonistik
L1k Tet
Awal*
Akhir**
CefR
CipR
103
103
0
107
nd
4
4
3
5
A
10
10
0
10
10
nd
105
105
0
nd
104
3
3
4
10
0
10
nd
10
4
4
3
5
B
10
0
10
10
10
nd
105
0
105
105
nd
3
3
6
0
10
10
10
nd
C
0
104
104
103
nd
104
5
5
7
0
10
10
10
nd
103
103
103
108
nd
4
4
4
3
8
D
10
10
10
10
10
nd
5
5
5
6
10
10
10
nd
10
E
0
0
0
103
1010
nd
6
6
F
10
10
0
0
0
Sinergis
G
106
0
106
0
0
Sinergis
6
6
H
0
10
10
0
0
Sinergis
Keterangan :
* : kepadatan AH26 NAR yang diinokulasikan awal inkubasi
** : kepadatan AH26 NAR yang tumbuh pada media RS setelah 24 jam inkubasi
nd : not determined
(A) perlakuan probiotik ND2 CefR dan P23 CipR; (B) perlakuan probiotik ND2 CefR dan L1k TetR;
(C) perlakuan probiotik P23 CipR dan L1k TetR; (D) perlakuan probiotik ND2 CefR, P23 CipR dan
L1k TetR; (E) Kontrol positif; (F) uji dual culture probiotik ND2 CefR dan P23 CipR ; (G) uji dual
culture probiotik ND2 CefR dan L1k TetR; (H) uji dual culture probiotik P23 CipR dan L1k TetR;
(0) tidak diinokulasikan.
9
Tabel 2 merupakan hasil uji kultur bersama probiotik terhadap AH26 NAR.
Hasil uji bakteri probiotik terhadap AH26 NAR secara in vitro menunjukkan
kombinasi isolat probiotik ND2 CefR dan P23 CipR dengan kepadatan masingmasing 105 CFU/mL, kombinasi isolat probiotik ND2 CefR dan L1k TetR dengan
kepadatan masing-masing 103 CFU/mL, kombinasi isolat probiotik P23 CipR dan
L1k TetR dengan kepadatan masing-masing 104 CFU/mL dan kombinasi isolat
probiotik ND2 CefR, P23 CipR dan L1k TetR dengan kepadatan masing-masing
105 CFU/mL mampu menghambat populasi AH26 NAR. Uji dual culture antar
masing-masing probiotik menunjukkan bahwa ketiga probiotik tersebut bersifat
sinergis, dengan demikian kedua isolat probiotik dapat digunakan secara
bersamaan untuk menghambat pertumbuhan A. hydrophila.
Tingkat Kelangsungan Hidup/Survival Rate (SR)
Gambar 1 menunjukkan tingkat kelangsungan hidup ikan lele dumbo
selama 28 hari perlakuan. Perlakuan B menunjukkan tingkat kelangsungan hidup
yang tertinggi yaitu sebesar 89,33±4,62 dan berbeda nyata (P
MELALUI MEDIA BUDI DAYA IKAN LELE DUMBO (Clarias
gariepinus) UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT MOTILE
AEROMONADS SEPTICEMIA
HILMA PUTRI FIDYANDINI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Evaluasi pemberian
probiotik multispesies melalui media budi daya ikan lele dumbo (Clarias
gariepinus) untuk pencegahan penyakit Motile Aeromonads Septicemia adalah
benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan
dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2015
Hilma Putri Fidyandini
C151130041
RINGKASAN
HILMA PUTRI FIDYANDINI. Evaluasi pemberian probiotik multispesies
melalui media budi daya ikan lele dumbo (Clarias gariepinus) untuk pencegahan
penyakit Motile Aeromonads Septicemia. Dibimbing oleh MUNTI YUHANA dan
ANGELA MARIANA LUSIASTUTI.
Salah satu penyakit yang sering menyebabkan kematian ikan lele
dumbo dan menyebabkan kegagalan panen adalah penyakit MAS (Motile
Aeromonads Septicemia) yang disebabkan oleh infeksi bakteri Aeromonas
hydrophila. Untuk mengatasi situasi ini perlu dilakukan upaya pencegahan dan
pengendalian penyakit. Salah satu cara yang aman dan ramah lingkungan
untuk mengontrol penyakit di lingkungan budi daya dan dapat diterima di
akuakultur adalah dengan menggunakan probiotik melalui media
pemeliharaan. Pemberian bakteri probiotik ke dalam media pemeliharaan
bertujuan untuk meningkatkan kesehatan ikan sebagai inang dengan cara menekan
populasi bakteri patogen, meningkatkan kualitas perairan atau membantu
mendegradasi limbah organik. Efektifitas probiotik dipengaruhi oleh
komposisi probiotik dan konsentrasi yang digunakan.
Penelitian ini telah dilaksanakan pada bulan September 2014 sampai
Januari 2015 di Instalasi Penelitian dan Pengembangan Pengendalian Penyakit
Ikan (IP4I), Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air Tawar (BPPBAT),
Depok. Penelitian ini terdiri dari 3 tahap yaitu: penyiapan kultur sel probiotik dan
patogen, uji in vitro (pemberian penanda resistensi antibiotik dan uji kultur
bersama) dan uji in vivo. Parameter yang diamati selama penelitian adalah tingkat
kelangsungan hidup, laju pertumbuhan spesifik, rasio konversi pakan, kadar
hematokrit, diferensial leukosit, respiratory burst activity, aktivitas lisozim,
monitoring populasi sel bakteri dan kualitas air. Penelitian terdiri dari 6 perlakuan
dengan 3 ulangan yaitu (A) penambahan bakteri dalam media dengan komposisi
AH26 NAR 103 CFU/mL, probiotik ND2 CefR 105 CFU/mL dan P23 CipR 105
CFU/mL ; (B) penambahan bakteri dalam media dengan komposisi AH26 NAR
103 CFU/mL, probiotik ND2 CefR 103 CFU/mL dan L1k TetR 103 CFU/mL; (C)
penambahan bakteri dalam media dengan komposisi AH26 NAR 103 CFU/mL,
probiotik P23 CipR 104 CFU/mL dan L1k TetR 104 CFU/mL; (D) penambahan
bakteri dalam media dengan komposisi AH26 NAR 103 CFU/mL, probiotik, ND2
CefR 105 CFU/mL, P23 CipR 105 CFU/mL dan L1k TetR 105 CFU/mL; (K+)
penambahan AH26 NAR 103 CFU/mL dalam media dan tanpa penambahan
probiotik sebagai kontrol positif; (K-) tanpa penambahan probiotik dan tanpa
AH26 NAR pada media sebagai kontrol negatif.
Hasil penelitian menunjukkan kombinasi antara probiotik ND2
CefR 103 CFU/mL dan L1k TetR 103 CFU/mL dapat menekan pertumbuhan A.
hydrophila sampai 40% dan meningkatkan respons imun (kadar hematokrit,
diferensial leukosit, respiratory burst activity dan aktivitas lisozim). Perlakuan
kombinasi tersebut juga menunjukkan SR tertinggi yaitu sebesar 89,33±4,62%,
laju pertumbuhan spesifik sebesar 1,75±0,08% dan rasio konversi pakan terendah
1,33±0,1. Pemberian probiotik multispesies dengan kombinasi probiotik Bacillus
subtilis ND2 dan Staphylococcus lentus L1k yang diaplikasikan melalui media
budi daya ikan lele dumbo dengan konsentrasi akhir sel di media pemeliharaan
masing-masing 103 CFU/mL dapat menekan populasi sel A. hydrophila sampai
40% dibandingkan kontrol positif dan dapat meningkatkan kelangsungan hidup,
laju pertumbuhan spesifik, respons imun dan menurunkan rasio konversi pakan
ikan lele dumbo.
Kata Kunci : Probiotik Multispesies, Clarias gariepinus, Motile Aeromonads
Septicemia
SUMMARY
HILMA PUTRI FIDYANDINI. Evaluation of Multispecies Probiotics
Addition in the Culture Medium of African Catfish (Clarias gariepinus) to
Prevent the Motile Aeromonads Septicemia Disease. Supervised by MUNTI
YUHANA and ANGELA MARIANA LUSIASTUTI.
One of infections disease that often led the mortality of catfish and
resulted in harvest failure is MAS (Motile Aeromonads Septicemia) disease
caused by the infection of Aeromonas hydrophila. To avoid this disease, the
prevention and control is very crucial. An environmentally friendly approach
acceptable in aquaculture is the use of probiotics. By giving probiotic bacterium in
the culture medium is to increase the host fish health by reducing the population
of pathogenic, improving water quality or helping the degrade of organic waste.
The effectiveness of probiotics application is influenced by probiotic
compositions and concentrations.
This research was conducted from September 2014 up to January 2015 in
Research Installation for Fish Health Control, Research and Development of
Freshwater Aquaculture, Depok.This research consisted of three steps: preparation
of probiotic cell culture and pathogenic strain , in vitro test ( giving the antibiotic
resistance marker and co-culture) and in vivo tests. The parameters observed
during this research were survival rate, specific growth rate, feed conversion ratio,
the level of hematocrit, differential leukocyte, respiratory burst activity, lysozyme
activity, monitoring of bacterial cell populations and water quality. This research
was consisted of 6 treatments with 3 replications, namely (A) addition of bacteria
in the medium with a composition of AH26 NAR 103 CFU/mL, probiotics ND2
CefR 105 CFU/mL and P23 CipR 105 CFU/mL; (B) addition of bacteria in the
medium with the composition of AH26 NAR 103 CFU/mL, probiotics ND2 CefR
103 CFU/mL and L1k TetR 103CFU / mL; (C) addition of bacteria in the medium
with the composition of AH26 NAR 103 CFU/mL, probiotics P23 CipR 104
CFU/mL and L1k TetR 104 CFU/mL; (D) addition of bacteria in the medium with
the composition of AH26 NAR 103 CFU/mL, probiotics, ND2 CefR 105 CFU/mL,
P23 CipR 105 CFU/mL and L1k TetR 105 CFU/mL; (K +) addition of AH26 NAR
103 CFU/mL in media and without the addition of probiotics as positive control;
(K-) Without the addition of probiotics and without AH26 NAR in the media as
negative control.
The results showed that the combination between probiotics ND2 CefR 103
CFU/mL and L1k TetR 103 CFU/mL can supressed the growth of A. hydrophila up
to 40% and improved the immune response (hematocrit level, differential
leukocyte, respiratory burst activity and lysozyme activity). The combination
treatment also showed the highests survival rate was 89,33±4,62%, the specific
growth rate was 1,75±0,08% and the lowest feed conversion ratio was 1,33±0,1.
By giving multispecies probiotic with combination probiotic of Bacillus subtilis
ND2 and Staphylococcus lentus L1k which applied through the medium of catfish
with the final concentration of cells in the respective culture media 103 CFU/mL
can supressed the population of A. hydrophila cell up to 40% compared with the
positive control and increased the survival rate, specific growth rate, immune
response and decreased feed conversion ratio of catfish.
Keywords: Multispecies Probiotics, Clarias gariepinus, Motile Aeromonads
Septicemia
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
EVALUASI PEMBERIAN PROBIOTIK MULTISPESIES
MELALUI MEDIA BUDI DAYA IKAN LELE DUMBO (Clarias
gariepinus) UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT MOTILE
AEROMONADS SEPTICEMIA
HILMA PUTRI FIDYANDINI
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Ilmu Akuakultur
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
Penguji luar komisi: Dr Sri Nuryati, SPi MSi
l./
Judul Tesis
Nama
NIM
:
Evaluasi Pemberian Probiotik Multispesies melalui Media Budi
Daya Ikpn Lele Durnbo (Clarias gariepinus) untuk Pencegahan
Penyakit Motile Aeramonad,r Septicemia
: Hilma Putri Fidyandini
: C151130041
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Dr Drh A.ngela Mariana L. MSi
Anggota
Dr Muirti Yuhana. SPi MSi
Ketua
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Ilmu Akuakultur
KW
;a7trXi{?
F7\Ergs{
Dr k Widanarni, MSi
Dr k Dahrul Syah, MScAgr
Tanggal Ujian:
27 Agustus 2015
Tanggal
Lulus:
1i
B SEP ?011
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah dengan judul Evaluasi Pemberian
Probiotik Multispesies melalui Media Budi Daya Ikan Lele Dumbo (Clarias
gariepinus) untuk Pencegahan Penyakit Motile Aeromonads Septicemia dapat
diselesaikan dengan baik. Ucapan terimakasih diberikan kepada :
1. Dr Munti Yuhana, SPi MSi dan Dr Drh Angela Mariana Lusiastuti, MSi
selaku pembimbing atas waktu, kesabaran, kebijaksanaan, serta bimbingan
dan arahan yang selalu diberikan hingga tesis ini dapat diselesaikan.
2. Dr Sri Nuryati, SPi MSi selaku penguji luar komisi yang telah
memberikan saran dan masukan untuk kesempurnaan tesis ini.
3. Dr Ir Mia Setiawati, MSi sebagai Komisi Program Studi Ilmu Akuakultur
yang telah banyak memberikan bantuan selama menempuh pendidikan di
Institut Pertanian Bogor.
4. Seluruh jajaran pimpinan, peneliti, teknisi, administrasi dan rekan-rekan
di IP4I Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air Tawar Bogor
atas segala bantuan dan fasilitas yang diberikan.
5. Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi yang telah memberikan Beasiswa
selama mengikuti pendidikan S2.
6. Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air Tawar Bogor yang telah
memberikan dana penelitian.
7. Ayahanda Syaiful Anam, SKM dan Ibunda Siti Aminah, SPd MPd Bapak
Mertua Yoyon Sumaryono, SPd dan Ibu Mertua Anik Rohmawati, SP
yang telah memberikan cinta dan kasih sayang, doa serta semangat yang
tak pernah henti. Kakak dan adik Yufrida Khairani, AmdKeb, Vidi
Ardianto, Isma Dewi Nurrosyidah, keponakan Dastan Kenzie Atharizz
Rashdan serta seluruh keluarga besar yang selalu memberikan do`a,
dukungan dan semangat.
8. Suami drg Alif Chandra Aryono atas kasih sayang, pengertian, dukungan,
kesabaran, pengorbanan, dan doa yang diberikan. Sumber inspirasi dan
semangat Athaya Nafeeza Alfidyandra yang selalu menemani selama
studi.
9. Teman-teman Akuakultur 2012 (Faisal), Akuakultur 2013 (Putri, Dwi,
Mbak Novi, Kurnia, Andre, Wildan dan Fazril) yang selalu membantu
selama di Bogor.
10. Semua pihak yang tidak dapat disebut satu persatu yang telah memberikan
segala doa dan bantuan baik moril maupun materil.
Bogor, Agustus 2015
Hilma Putri Fidyandini
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
vi
vi
vi
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
1
1
2
2
3
2 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Prosedur Penelitian
Penyiapan Kultur Sel Probiotik dan Patogen
Pemberian Penanda Resistensi Antibitik
Uji Kultur Bersama
Uji In vivo
Desain Penelitian
Parameter Uji
Analisis Data
3
3
3
3
3
4
5
5
5
8
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Uji Kultur Bersama
Tingkat Kelangsungan Hidup
Laju Pertumbuhan Spesifik
Rasio Konversi Pakan
Kadar Hematokrit
Diferensial Leukosit
Respiratory Burst Activity
Aktivitas Lisozim
Monitoring Populasi Sel Bakteri
Parameter Kualitas Air
Pembahasan
8
8
8
9
9
10
11
11
13
14
14
15
16
4 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
20
20
20
DAFTAR PUSTAKA
20
LAMPIRAN
24
RIWAYAT HIDUP
25
DAFTAR TABEL
1 Kombinasi perlakuan uji penghambatan bakteri probiotik terhadap AH
NAR secara in vitro
2 Hasil perhitungan konsentrasi sel dari uji kultur bersama probiotik
multisepesies terhadap AH26 NAR
3 Kisaran hasil pengukuran kualitas air selama penelitian
4
8
16
DAFTAR GAMBAR
Tingkat Kelangsungan hidup ikan lele dumbo (C. gariepinus) yang
yang diinfeksi AH26 NAR dan dipelihara pada media yang
mengandung probiotik multispesies
2 Laju pertumbuhan spesifik ikan lele dumbo (C. gariepinus) yang
diinfeksi AH26 NAR dan dipelihara pada media yang mengandung
probiotik multispesies
3 Rasio konversi pakan pada ikan lele dumbo (C. gariepinus) yang
diinfeksi AH26 NAR dan dipelihara pada media yang mengandung
probiotik multispesies
4 Kadar hematokrit pada ikan lele dumbo (C. gariepinus) yang diinfeksi
AH26 NAR dan dipelihara pada media yang mengandung probiotik
multispesies
5 Persentase monosit darah ikan lele dumbo (C. gariepinus) yang
diinfeksi AH26 NAR dan dipelihara pada media yang mengandung
probiotik multispesies
6 Persentase neutrofil darah ikan lele dumbo (C. gariepinus) yang
diinfeksi AH26 NAR dan dipelihara pada media yang mengandung
probiotik multispesies
7 Persentase limfosit darah ikan lele dumbo (C. gariepinus) yang
diinfeksi AH26 NAR dan dipelihara pada media yang mengandung
probiotik multispesies
8 Respiratory Burst activity ikan lele dumbo (C. gariepinus) yang
diinfeksi AH26 NAR dan dipelihara pada media yang mengandung
probiotik multispesies
9 Aktivitas lisozim ikan lele dumbo (C. gariepinus) yang diinfeksi
AH26 NAR dan dipelihara pada media yang mengandung probiotik
multispesies
10 Kepadatan sel bakteri pada media pemeliharaan ikan lele dumbo
1
9
10
10
11
12
12
13
13
14
15
DAFTAR LAMPIRAN
1 Pengukuran kadar hematokrit
2 Penghitungan diferensial leukosit
3 Pengukuran Respiratory Burst activity
4 Pengukuran aktivitas lisozim
24
24
24
24
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Teknologi budi daya ikan lele dumbo (Clarias gariepinus) yang
digunakan di Indonesia adalah sistem budi daya intensif dengan padat tebar yang
tinggi dengan pemberian pakan tambahan yang optimal. Sama seperti usaha budi
daya perikanan lainnya, masalah utama dalam budi daya ikan lele dumbo adalah
serangan penyakit. Kematian ikan lele dumbo dan kegagalan panen akan dialami
jika serangan penyakit tidak segera ditanggulangi, untuk menghindari keadaan
ini, perlu dilakukan upaya pencegahan dan penanggulangan penyakit secara
tepat.
Salah satu penyakit yang sering menyebabkan kematian ikan lele
dumbo adalah penyakit MAS (Motile Aeromonads Septicemia) yang
disebabkan oleh infeksi bakteri Aeromonas hydrophila. A. hydrophila
merupakan bakteri Gram negatif, berbentuk batang, tidak berspora, bersifat
katalase dan oksidase positif, bergerak dengan flagela, dan termasuk bakteri
anaerobik fakultatif (Erdem et al. 2011). A. hydrophila termasuk dalam bakteri
patogen oportunistik dan merupakan mikroflora normal dalam perairan. Hal ini
sesuai dengan hasil penelitian Uddin dan Al-Harbi (2010) yang menyatakan
bahwa A. hydrophila merupakan bakteri patogen yang mendominasi jenis bakteri
pada air kolam budi daya ikan lele dumbo sebesar 25%, Vibrio cholerae 11,61%
dan Streptococcus sp. 4,46%. Uddin dan Al-Harbi (2012) juga menyebutkan
bahwa A. hydrophila juga mendominasi jenis bakteri pada air kolam budi daya
polikultur ikan lele dumbo dan ikan mas yaitu sebesar 29,93%, sedangkan
Streptococcus sp. sebesar 2,72% dan S. putrefaciens sebesar 12,25%.
Upaya untuk mencegah ikan agar tidak terserang penyakit adalah dengan
meningkatkan daya tahan tubuh ikan atau dengan mengontrol lingkungan budi
daya. Pengendalian lingkungan budi daya dapat dilakukan dengan cara
penambahan probiotik melalui media pemeliharaan. Pemberian bakteri probiotik
ke dalam media pemeliharaan bertujuan untuk meningkatkan kesehatan ikan
sebagai inang dengan cara menekan populasi bakteri patogen, meningkatkan
kualitas perairan atau membantu mendegradasi limbah organik (Irianto 2005).
Terdapat tiga cara kinerja probiotik, yaitu menekan populasi mikroba
melalui kompetisi dengan memproduksi senyawa-senyawa antimikroba atau
melalui kompetisi nutrisi dan tempat pelekatan di saluran pencernaan, merubah
metabolisme mikrobial dengan meningkatkan atau menurunkan aktivitas
enzim serta menstimulasi imunitas melalui peningkatan kadar antibodi atau
aktivitas makrofag (Irianto 2003). Probiotik merupakan mikroorganisme yang
memiliki kemampuan untuk memodifikasi komposisi populasi bakteri dalam
saluran pencernaan, air, sedimen serta dapat digunakan sebagai agen biokontrol
dan bioremediasi Sebagai agen biokontrol, probiotik berperan sebagai musuh
alami yang mencegah kerusakan yang disebabkan oleh mikroorganisme
merugikan sampai batas yang dapat ditoleransi (Nayak 2011). Efektivitas
probiotik dipengaruhi oleh jenis probiotik, konsentrasi sel yang digunakan dan
frekuensi pemberian (Fuller 1992). Sebagai agen bioremediasi, probiotik berperan
dalam memperbaiki kualitas air dengan cara menurunkan konsentrasi amonia.
2
Pemberian bakteri probiotik Staphylococcus lentus L1k melalui pakan
telah diteliti oleh Hasibuan (2013) dan Santoso (2013). Hasil penelitian Hasibuan
(2013) menunjukkan bahwa penggunaan probiotik L1k dan kombinasi probiotik
multispesies L1k dengan NB21b dapat meningkatkan respons imun dan dapat
mengurangi tingkat kematian ikan nila akibat infeksi Streptococcus agalactiae
serta pemberian probiotik L1k pada ikan nila melalui pakan menunjukkan
Survival Rate (SR) sebesar 100%, sedangkan perlakuan kombinasi multispesies
L1k dengan NB21b menunjukkan SR sebesar 95,56%. Pemberian probiotik
Bacillus subtilis ND2 dengan dosis 109 CFU/mL melalui media pemeliharaan ikan
nila menunjukkan SR sebesar 51,67% (Wijaya 2011). Pemberian probiotik
Bacillus cereus P23 melalui media pemeliharaan juga telah diteliti oleh Haditomo
(2011) yang menunjukkan bahwa pemberian probiotik sebesar 106 CFU/mL dapat
mempertahankan SR ikan mas sebesar 100%.
Fyzul et al. (2007) menyatakan bahwa Bacillus subtilis AB1 efektif
sebagai probiotik untuk menghambat infeksi Aeromonas sp. pada rainbow trout.
Hasil penelitian Ravi et al. (2007) menyebutkan bahwa probiotik dari jenis
Paenibacillus sp., Bacillus cereus dan P. polymyxa yang diaplikasikan lewat air
dapat menghambat pertumbuhan Vibrio pada larva udang windu (Penaeus
monodon). Penelitian mengenai aplikasi probiotik multispesies sebagai biokontrol
patogen pada budi daya ikan lele dumbo (Clarias gariepinus) belum banyak
dilakukan, sehingga penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh
penambahan probiotik untuk meningkatkan kinerja budi daya, serta menentukan
kombinasi probiotik multispesies yang efektif untuk menekan populasi A.
hydrophila pada media budi daya ikan lele dumbo.
Perumusan Masalah
Kontrol jumlah bakteri dalam lingkungan perairan diperlukan untuk
menekan jumlah bakteri dalam perairan, terutama yang bersifat patogen. Salah
satu cara untuk mengontrol jenis bakteri dalam perairan yaitu dengan
menggunakan probiotik sebagaimana konsep probiotik sebagai agen biokontrol
lingkungan. Manipulasi terhadap populasi mikroba yang berada di perairan guna
pencegahan sebelum terjadinya serangan bakteri yang bersifat mematikan perlu
dilakukan sebagaimana konsep probiotik sebagai biokontrol.
Penggunaan probiotik sebagai biokontrol ini diharapkan dapat
menurunkan jumlah bakteri patogen dalam perairan terutama A. hydrophila,
sehingga kondisi perairan budi daya berada dalam kondisi optimal. Dengan
optimalisasi pemberian probiotik yang tepat sebelum terjadi peningkatan
kepadatan A. hydrophila yang dapat memicu timbulnya serangan penyakit pada
ikan di media budi daya, maka besar kemungkinan untuk menekan kerugian
akibat serangan Motile Aeromonads Septicemia dan meningkatkan keuntungan
usaha budi daya perikanan.
Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini yaitu untuk mengevaluasi pengaruh pemberian
probiotik multispesies melalui media budi daya ikan lele dumbo sebagai pencegah
penyakit Motile Aeromonads Septicemia.
3
Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai
kombinasi probiotik multispesies untuk menekan pertumbuhan A. hydrophila dan
menjadi alternatif pemecahan masalah penyakit Motile Aeromonads Septicemia
pada budi daya ikan lele dumbo secara aman dan ramah lingkungan.
2 METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini telah dilaksanakan pada bulan September 2014 sampai
Januari 2015 di Instalasi Penelitian dan Pengembangan Pengendalian Penyakit
Ikan (IP4I), Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air Tawar (BPPBAT),
Depok.
Metode
Penyiapan Kultur Sel Probiotik dan Patogen
Probiotik yang digunakan dalam penelitian ini adalah probiotik Bacillus
subtilis (ND2), Bacillus cereus (P23) dan Staphylococcus lentus (L1k), sedangkan
patogen yang digunakan adalah A. hydrophila (AH26). Isolat ND2, P23 dan
AH26 merupakan koleksi dari Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air
Tawar Bogor, sedangkan isolat L1k merupakan koleksi Laboratorium Kesehatan
Ikan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Kultur sel
probiotik dilakukan dengan cara mengambil koloni kemudian dikultur dalam
media Tryptone Soya Agar (TSA) dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 28oC.
Probiotik yang telah dikultur pada media TSA diinokulasikan ke dalam media cair
Tryptone Soya Broth (TSB) 10 mL, diinkubasi selama 24 jam pada suhu 28 oC.
Kultur sel patogen A. hydrophila AH26, dilakukan dengan menggunakan media
selektif yaitu Rimler Shotts (RS). A. hydrophila yang tumbuh pada media RS
diinokulasikan ke media TSA dan diinkubasi selama 24 jam di dalam inkubator
pada suhu 28 oC. A. hydrophila yang telah di kultur pada media TSA dipindah dan
diinokulasikan ke dalam media cair TSB 10 mL dan diinkubasi selama 24 jam
pada suhu 28 oC.
Uji in vitro
Pemberian Penanda Resistensi Antibiotik
Antibiotik yang digunakan dalam pemberian penanda ini adalah Nalidixic
Acid (NA) untuk bakteri AH26, Cefadroxil (Cef) untuk ND2, Ciprofloxacin (Cip)
untuk P23 dan Tetrasiklin (Tet) untuk L1k dengan dosis antibiotik tersebut
masing-masing 100 μg/mL. Pemberian penanda dilakukan dengan cara
mengkultur masing-masing isolat bakteri pada media TSB setelah 24 jam masing-
4
masing isolat di kultur kedalam TSB yang mengandung antibiotik dengan dosis
masing-masing 100 µg/mL, kemudian ditumbuhkan pada media TSA yang
mengandung antibiotik dengan dosis yang sama dan dilakukan Total Plate Count
(TPC) pada semua isolat bakteri dan ditentukan dengan metode cawan sebar
menurut Madigan et al. (2011).
Uji Kultur Bersama
Uji kultur bersama dilakukan untuk mengetahui potensi kombinasi bakteri
probiotik ND2 CefR, P23 CipR, L1k TetR dalam menghambat pertumbuhan bakteri
patogen AH26 NAR. Setiap kombinasi bakteri pada perlakuan A, B, C dan D
diinokulasikan pada media TSB (Bernard et al. 2013), perlakuan E hanya
menginokulasikan AH26 NAR pada media TSB sebagai kontrol dan diinkubasi
selama 24 jam pada suhu 28 °C. Penghitungan bakteri dilakukan dengan metode
hitungan cawan (Madigan et al. 2011). Media yang digunakan pada perlakuan A
sampai E berupa media RS yang merupakan media selektif untuk A. hydrophila.
Perlakuan F, G, H diinokulasikan pada media TSA menggunakan metode dual
culture dengan menggunakan kertas cakram untuk mengetahui aktivitas gabungan
antar bakteri probiotik bersifat antagonis atau sinergis (Kalaiselvi dan
Panneerselvam 2011). Kombinasi perlakuan pada uji kultur bersama secara in
vitro dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1 Kombinasi perlakuan uji penghambatan bakteri probiotik terhadap AH26
NAR secara in vitro
Probiotik (CFU/mL)
Bakteri AH26 NAR
Perlakuan
R
R
R
ND2 Cef
P23 Cip
L1k Tet
(CFU/mL)
3
3
10
10
0
A
104
104
0
103
5
5
10
10
0
3
10
0
103
4
B
10
0
104
103
105
0
105
3
0
10
103
C
0
104
104
103
0
105
105
3
3
10
10
103
D
104
104
104
103
5
5
5
10
10
10
E
0
0
0
103
6
6
F
10
10
0
0
G
106
0
106
0
6
6
H
0
10
10
0
Keterangan :
(A) perlakuan probiotik ND2 CefR dan P23 CipR; (B) perlakuan probiotik ND2 CefR dan L1k
TetR; (C) perlakuan probiotik P23 CipR dan L1k TetR; (D) perlakuan probiotik ND2 CefR, P23
CipR dan L1k TetR; (E) Kontrol positif; (F) uji dual culture probiotik ND2 CefR dan P23 CipR ; (G)
uji dual culture probiotik ND2 CefR dan L1k TetR; (H) uji dual culture probiotik P23 CipR dan
L1k TetR; (0) tidak diinokulasikan.
5
Uji in vivo
Uji in vivo ini merupakan aplikasi, setelah mendapatkan hasil konsentrasi
terbaik masing-masing probiotik dengan AH26 NAR secara in vitro, selanjutnya
diimplementasikan secara in vivo. Sebelum dilakukan uji in vivo, dilakukan uji
Postulat Koch terlebih dahulu. Uji Postulat Koch dilakukan untuk mengetahui
sifat patogen dari isolat bakteri dan meningkatkan patogenitas (Madigan et al.
2011) dalam hal ini adalah isolat AH26 NAR yang diujikan pada ikan lele dumbo.
Ikan lele dumbo yang digunakan berukuran 3-4 cm dengan berat 2-3 gram
dipelihara dalam akuarium berukuran 56x39x34 cm3, diisi air dengan volume 30
liter dengan padat tebar 10 ekor. Isolat AH26 NAR (106 CFU/mL) diinjeksikan ke
ikan uji dengan volume 0,1 mL/ekor. Pengamatan gejala klinis dilakukan selama
24 jam.
Desain Penelitian
Ikan lele dumbo yang digunakan memiliki berat 1,97±0,7 gram/ekor
dipelihara dalam akuarium berukuran 56x39x34 cm3, diisi air dengan volume 30
liter dengan padat tebar 25 ekor. Konsentrasi yang diberikan pada uji in vivo
merupakan hasil konsentrasi terbaik kombinasi probiotik dengan AH26 NAR
secara in vitro melalui uji kultur bersama. Pemberian probiotik dilakukan setiap
hari selama 28 hari. Probiotik dan patogen diberikan pada media pemeliharaan.
Perlakuan yang diberikan pada uji in vivo yaitu:
(A) penambahan bakteri dalam media dengan komposisi AH26 NAR 103 CFU/mL,
probiotik ND2 CefR 105 CFU/mL dan P23 CipR 105 CFU/mL;
(B) penambahan bakteri dalam media dengan komposisi AH26 NAR 103 CFU/mL,
probiotik ND2 CefR 103 CFU/mL dan L1k TetR 103 CFU/mL;
(C) penambahan bakteri dalam media dengan komposisi AH26 NAR 103 CFU/mL,
probiotik P23 CipR 104 CFU/mL dan L1k TetR 104 CFU/mL;
(D) penambahan bakteri dalam media dengan komposisi AH26 NAR 103 CFU/mL,
probiotik, ND2 CefR 105 CFU/mL, P23 CipR 105 CFU/mL dan L1k TetR 105
CFU/mL;
(K+) penambahan AH26 NAR 103 CFU/mL dalam media dan tanpa penambahan
probiotik sebagai kontrol positif;
(K-) tanpa penambahan probiotik dan tanpa AH26 NAR pada media sebagai
kontrol negatif.
Parameter Uji
Parameter uji dalam penelitian ini meliputi parameter kinerja budi daya
antara lain parameter tingkat kelangsungan hidup (Effendi 2002), laju
pertumbuhan spesifik (Huisman 1987), rasio konversi pakan (Takeuchi 1988).
Parameter sistem imun yang meliputi kadar hematokrit (Anderson dan Siwicki
1995), diferensial leukosit (Blaxhall dan Daisley 1973), respiratory burst activity
(Secombes 1990) dan aktivitas lisozim (Ellis 1990). Monitoring populasi sel
bakteri dan parameter kualitas air.
6
Tingkat Kelangsungan Hidup
Kelangsungan hidup/Survival Rate (SR) dihitung berdasarkan Effendi
(2002) yaitu:
Nt
SR
100
No
Keterangan :
SR = Tingkat kelangsungan hidup (%)
Nt = Jumlah ikan yang hidup pada akhir pengamatan (ekor)
No = Jumlah ikan yang hidup pada awal uji tantang (ekor)
Laju pertumbuhan spesifik
Ikan diukur bobotnya pada awal dan akhir masa pemeliharaan. Laju
pertumbuhan spesifik (Specific Growth Rate/SGR) dihitung dengan menggunakan
rumus (Huisman, 1987):
ln Wt - ln Wo
x100
t
Laju pertumbuhan harian (%)
Log natural bobot ikan pada akhir pengamatan (gram)
Log natural bobot ikan pada awal pengamatan (gram)
Lama waktu pengamatan (hari)
SGR
Keterangan:
SGR
ln Wt
ln Wo
t
=
=
=
=
Rasio konversi pakan
Rasio konversi pakan dihitung dengan menggunakan rumus berdasarkan
Takeuchi (1988):
F
Bt - B0 Bd
= Rasio konversi pakan
= Jumlah pakan yang diberikan (g)
= Biomassa ikan pada hari ke-t (g)
= Biomassa ikan pada hari ke-0 (g)
= Biomassa ikan yang mati (g)
FCR
Keterangan:
FCR
F
Bt
Bo
Bd
Kadar Hematokrit
Kadar hematoktit diperiksa menurut Anderson dan Siwicki (1995)
menggunakan tabung mikro hematokrit kemudian dihitung dengan persamaan:
a
He 100
b
Keterangan:
He : Kadar hematokrit (%)
a : bagian darah yang mengendap (mm)
b : bagian seluruh darah dalam tabung mikro hematokrit (mm)
7
Diferensial Leukosit
Pengamatan diferensial leukosit menggunakan metode Blaxhall dan
Daisley (1973) dengan mengamati preparat ulas darah yang diwarnai dengan
pewarna Giemsa. Pengamatan dan penghitungan masing-masing jenis sel yaitu
monosit, neutrofil dan limfosit dilakukan hingga jumlah semua mencapai 100, dan
hasilnya dinyatakan dalam % .
Respiratory Burst Activity
Uji respiratory burst activity menggunakan reagen Nitro Blue Tetrazolium
(NBT) berdasarkan metode Secombes (1990). Darah dari ikan sampel diambil
sebanyak 50 µl dimasukkan dalam microplate, diinkubasi selama 1 jam suhu
37oC, kemudian supernatan dibuang dan dicuci PBS 50 µl sebanyak 3 kali,
ditambahkan 50 µl NBT 0,2% diinkubasi selama 1 jam suhu 37oC. Fiksasi
metanol 100% (50 µl) 2-3 menit lalu dibilas dengan metanol 30% (50 µl) 3 kali
dan dikering udarakan, kemudian ditambah KOH 60 µl + DMSO 70 µl dan
pengecekkan optical density (ELISA Reader 540nm).
Aktivitas Lisozim
Aktivitas lisozim diuji menggunakan serum ikan lele menggunakan
metode Ellis (1990) yang dapat dirumuskan sebagai berikut:
Aktivitas lisozim (UI/mL/menit) =[((OD30m– OD60m) x 1000) x (1/ s)]/t
Keterangan:
1000
= Konversi hasil absorbansi (OD) menjadi unit internasional (UI)
t
= waktu (menit)
s
= jumlah serum (ml)
OD30m = Pembacaan densitas optikal menit ke -30
OD60m = Pembacaan densitas optikal menit ke -60
Monitoring Populasi Sel Bakteri
Media yang digunakan untuk menghitung total bakteri adalah media TSA,
RS untuk menghitung total bakteri A. hydrophila, dan TSA+NA 100μg/mL untuk
menghitung total bakteri AH26 NAR, TSA+Cef 100μg/mL untuk menghitung
total bakteri probiotik ND2 CefR, TSA+Cip 100μg/mL untuk menghitung total
bakteri probiotik P23 CipR, TSA+Tet 100μg/mL untuk menghitung total bakteri
probiotik L1k TetR. Total bakteri dalam media pemeliharaan dihitung
menggunakan metode Total Plate Count (TPC) yang dilakukan setiap minggu
pada hari ke-0, 7, 14, 21, dan 28.
Parameter Kualitas Air
Parameter kualitas air yang diamati pada penelitian ini adalah pengukuran
suhu, pH, oksigen terlarut dan amonia yang diukur pada hari ke-0, 7, 14, 21, dan
28.
8
Analisis Data
Rancangan perlakuan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap
(RAL) dengan 6 perlakuan, dan masing-masing perlakuan diulang sebanyak 3
kali. Data tingkat kelangsungan hidup, laju pertumbuhan spesifik, rasio konversi
pakan, kadar hematokrit, diferensial leukosit, Respiratory Burst avtivity dan
aktivitas lisozim dianalisis menggunakan ANOVA dengan selang kepercayaan
95%, dan dilanjutkan dengan uji jarak berganda Duncan untuk menentukan jenis
perlakuan yang paling baik. Hasil monitoring populasi sel bakteri dalam air dan
parameter kualitas air dianalisis secara deskriptif dengan menggunakan tabel dan
grafik.
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Uji Kultur Bersama
Tabel 2 Hasil perhitungan konsentrasi sel dari uji kultur bersama probiotik
multispesies terhadap AH26 NAR
Probiotik (CFU/mL)
Bakteri AH26 NAR (CFU/mL)
Sinergis/
Perlakuan
ND2
P23
R
Antagonistik
L1k Tet
Awal*
Akhir**
CefR
CipR
103
103
0
107
nd
4
4
3
5
A
10
10
0
10
10
nd
105
105
0
nd
104
3
3
4
10
0
10
nd
10
4
4
3
5
B
10
0
10
10
10
nd
105
0
105
105
nd
3
3
6
0
10
10
10
nd
C
0
104
104
103
nd
104
5
5
7
0
10
10
10
nd
103
103
103
108
nd
4
4
4
3
8
D
10
10
10
10
10
nd
5
5
5
6
10
10
10
nd
10
E
0
0
0
103
1010
nd
6
6
F
10
10
0
0
0
Sinergis
G
106
0
106
0
0
Sinergis
6
6
H
0
10
10
0
0
Sinergis
Keterangan :
* : kepadatan AH26 NAR yang diinokulasikan awal inkubasi
** : kepadatan AH26 NAR yang tumbuh pada media RS setelah 24 jam inkubasi
nd : not determined
(A) perlakuan probiotik ND2 CefR dan P23 CipR; (B) perlakuan probiotik ND2 CefR dan L1k TetR;
(C) perlakuan probiotik P23 CipR dan L1k TetR; (D) perlakuan probiotik ND2 CefR, P23 CipR dan
L1k TetR; (E) Kontrol positif; (F) uji dual culture probiotik ND2 CefR dan P23 CipR ; (G) uji dual
culture probiotik ND2 CefR dan L1k TetR; (H) uji dual culture probiotik P23 CipR dan L1k TetR;
(0) tidak diinokulasikan.
9
Tabel 2 merupakan hasil uji kultur bersama probiotik terhadap AH26 NAR.
Hasil uji bakteri probiotik terhadap AH26 NAR secara in vitro menunjukkan
kombinasi isolat probiotik ND2 CefR dan P23 CipR dengan kepadatan masingmasing 105 CFU/mL, kombinasi isolat probiotik ND2 CefR dan L1k TetR dengan
kepadatan masing-masing 103 CFU/mL, kombinasi isolat probiotik P23 CipR dan
L1k TetR dengan kepadatan masing-masing 104 CFU/mL dan kombinasi isolat
probiotik ND2 CefR, P23 CipR dan L1k TetR dengan kepadatan masing-masing
105 CFU/mL mampu menghambat populasi AH26 NAR. Uji dual culture antar
masing-masing probiotik menunjukkan bahwa ketiga probiotik tersebut bersifat
sinergis, dengan demikian kedua isolat probiotik dapat digunakan secara
bersamaan untuk menghambat pertumbuhan A. hydrophila.
Tingkat Kelangsungan Hidup/Survival Rate (SR)
Gambar 1 menunjukkan tingkat kelangsungan hidup ikan lele dumbo
selama 28 hari perlakuan. Perlakuan B menunjukkan tingkat kelangsungan hidup
yang tertinggi yaitu sebesar 89,33±4,62 dan berbeda nyata (P