a. Persiapan Pereaksi dan Media Kultur Pembuatan larutan NH
4
Cl 0.85
Bubuk NH
4
Cl sebanyak 0.85 g dilarutkan dalam 100 ml aquabidest dan diaduk hingga homogen. Kemudian larutan tersebut disterilisasi dengan membran
sterilisasi 0.20 µm.
Pembuatan Phosphate Buffer Saline PBS
Satu tablet PBS dilarutkan dalam 200 ml aquabidest dan diatur hingga mencapai pH 7.4. Kemudian larutan tersebut disterilisasi dengan membran
sterilisasi 0.20 µm.
Pembuatan Indikator Tryphane Blue 0.20
Bubuk Tryphane Blue sebanyak 0.05 g dilarutkan dalam 20 ml PBS dan diaduk hingga homogen.
Pembuatan Larutan Media RPMI-1640 sebagai Medium Kultur Sel Limfosit
Medium yang digunakan untuk kultur dan pemeliharaan sel limfosit adalah RPMI-1640 bubuk 16.2 g yang telah mengandung L-glutamin dan 0.25 mM
HEPES. Komposisi lengkap medium RPMI-1640 dapat dilihat pada Lampiran 7. Bubuk ini dilarutkan dengan air bebas pirogen sehingga diperoleh 1 liter larutan
medium RPMI-1640. Kemudian ditambahkan 2 g NaHCO
3
dan 1 penisilin- streptomisin. Medium selanjutnya disterilisasi dingin dengan membran filter 0.20
µm dan digunakan sebagai medium pertumbuhan dan medium pencuci. Untuk medium kultur sel limfosit digunakan medium RPMI-1640 dengan penambahan
fetal bovine serum FBS 10 steril. Pembuatan medium dan tahap-tahap selanjutnya dalam isolasi sel limfosit dilakukan di dalam laminar flow yang steril
dengan sistem pengaliran udara laminar. Sebelum digunakan, laminar flow ini disinari dahulu dengan sinar UV selama 15 menit.
Pembuatan MTT 0.5
Bubuk MTT sebanyak 0.25 g dilarutkan dalam 50 ml PBS dan diaduk hingga homogen. Kemudian larutan disterilisasi dengan membran sterilisasi 0.20 µm.
Pembuatan Larutan HCl-isopropanol 0.04 N
HCl 37 p.a pekat dipipet sebanyak 23.4 µl dan ditambahkan 8.97 ml isopropanol p.a dan diaduk hingga homogen sehingga didapatkan larutan HCl-
isopropanol 0.04 N. Larutan ini harus dibuat segar tiap akan digunakan.
Pembuatan Larutan Ekstrak Daun Kumis Kucing dan Bunga Kenop serta Mitogen
Persiapan ekstrak daun kumis kucing dan bunga kenop dilakukan dengan terlebih dahulu membuat larutan stock ekstrak. Larutan stock dibuat dengan cara
mengekstraksi bubuk hasil pengeringan terbaik sesuai dengan dosis untuk pencegahan penyakit. Hasil ekstraksi disaring menggunakan saringan vakum dengan
kertas saring Whatman No. 41. Setelah itu hasil ekstraksi dikeringbekukan dengan freeze dryer. Tabung freeze dryer ditimbang X
1
, setelah itu hasil ekstrak dimasukkan ke dalam tabung freeze dryer selama 48 jam dan ditutup dengan
aluminium foil untuk menghindari terjadinya oksidasi. Hasil freeze dryer X
2
ditimbang untuk menentukan rendemen. Re ndemen didapatkan dari perhitungan: Berat bubuk sampel awal g
= W
1
Berat hasil freeze dryer g = X
2
– X
1
= W
2
00 1
x W
W basah
basis sampel
Rendemen
1 2
=
Rendemen yang diperoleh, digunakan untuk membuat larutan stock ekstrak dan menjadi dasar untuk perhitungan dosis yang akan dimasukkan ke dalam
kultur sel. Perhitungan selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 8. Pembuatan larutan stock ekstrak dan mitogen sebagai berikut :
Pembuatan larutan ekstrak daun kumis kucing dan bunga kenop
Sampel hasil freeze dryer sebanyak 1 g dilarutkan dengan medium RPMI-1640, kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 5 ml. Medium RPMI-1640 ditambahkan
sampai tanda tera, sehingga didapatkan larutan stock dengan konsentrasi 200 mgml.
Pembuatan larutan LPS dan Con-A
Sebanyak 1 mg bubuk LPS atau Con-A dilarutkan dengan medium RPMI- 1640, kemudian dimasukkan kedalam labu takar 5 ml. Medium RPMI-1640
ditambahkan sampai tanda tera, sehingga didapatkan larutan stock dengan konsentrasi 200 µ gml.
Pembuatan larutan Pokeweed
Sebanyak 0.005 g bub uk pokeweed dimasukkan ke dalam tabung eppendorf dan dilarutkan dengan medium RPMI-1640 sampai volume eppendorf 1 ml, sehingga
didapatkan larutan stock dengan konsentrasi 500 µgml. Pembuatan larutan ekstrak daun kumis kucing, bunga kenop dan mitogen LPS,
Con-A dan Pokeweed yang akan digunakan dalam kultur sel limfosit, dilakukan dengan cara mengencerkan larutan stock dengan medium RPMI-1640 sesuai dengan
konsentrasi yang akan diujikan pada kultur. Misalkan untuk membuat 1 ml V
2
ekstrak daun kumis kucing dengan konsentrasi C
2
=1.2 mgml M
2
maka larutan stock ekstrak dengan konsentrasi 200 mgml M
1
yang harus diambil V
1
adalah:
V
1
x M
1
= V
2
x M
2
V
1
x 200 mgml = 1 ml x 1.2 mgml V
1
= 0.006015 ml = 6.015 µl ≈
6 µ l Jadi sebanyak 6 µl larutan stock ekstrak diambil dan dimasukkan ke dalam tabung
eppendorf 1 ml dan ditambah dengan medium RPMI-1640 sampai tanda tera 994 µl larutan RPMI-1640.
b. Pengujian Proliferasi Sel Limfosit Secara in vivo, in vitro dan in vivo-in vitro
Kategori