Penentuan Keterulangan Biosensor Antioksidan dari Ekstrak Deinococcus radiodurans dan Perbandingan Metode Elektrokimia dengan Spektrofotometri

\
i

PENENTUAN KETERULANGAN BIOSENSOR
ANTIOKSIDAN DARI EKSTRAK Deinococcus radiodurans
DAN PERBANDINGAN METODE ELEKTROKIMIA
DENGAN SPEKTROFOTOMETRI

NIKE NURJANAH FERINDA

DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

ii

\
iii

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER
INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Penentuan
Keterulangan Biosensor Antioksidan dari Ekstrak Deinococcus radiodurans dan
Perbandingan Metode Elektrokimia dengan Spektrofotometri adalah karya saya
dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun
kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip
dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, September 2014
Nike Nurjanah Ferinda
NIM G44100012

iv

\

v

ABSTRAK
NIKE NURJANAH FERINDA. Penentuan Keterulangan Biosensor Antioksidan
dari Ekstrak Deinococcus radiodurans dan Perbandingan Metode Elektrokimia
dengan Spektrofotometri. Dibimbing oleh DYAH ISWANTINI PRADONO,
NOVIK NURHIDAYAT, dan DEDEN SAPRUDIN.
Metode elektrokimia biosensor antioksidan merupakan metode alternatif
dalam pengukuran kapasitas antioksidan. Metode ini memiliki sensitivitas yang
lebih tinggi, biaya yang lebih murah, dan instrumentasi lebih sederhana
dibandingkan metode spektrofotometri. Penelitian ini bertujuan melakukan
optimisasi aktivitas superoksida dismutase (SOD) dari ekstrak Deinococcus
radiodurans terimobilisasi zeolit, uji keterulangan, dan perbandingan limit
deteksi metode elektrokimia dengan spektrofotometri. Kondisi optimum aktivitas
antioksidan SOD dari ekstrak D. radiodurans adalah suhu 31 °C, pH 9, dan zeolit
137.5 mg. Arus optimum yang diperoleh dari keterulangan sebesar 1.749 µA
dengan simpangan baku 0.01 dan koefisien keragaman sebesar 0.59%. Nilai limit
deteksi untuk biosensor elektrokimia sebesar 1.76 ppm. Nilai tersebut lebih
rendah dibandingkan limit deteksi untuk spektrofotometri, yaitu 2.01 ppm.
Metode elektrokimia dapat mendeteksi analit dengan konsentrasi yang lebih

rendah.
Kata kunci : biosensor antioksidan, D. radiodurans, keterulangan, limit deteksi,
superoksida dismutase

ABSTRACT
NIKE NURJANAH FERINDA. Determination of Antioxidant Biosensor
Repeatability from Deinococcus radiodurans Extract and The Comparison
Methods between Electrochemical and Spectrophotometry. Supervised by DYAH
ISWANTINI PRADONO, NOVIK NURHIDAYAT, and DEDEN SAPRUDIN.
Biosensor electrochemical method for antioxidant is an alternative method
in measuring the capacity of antioxidant. This method has higher sensitivity,
lower cost and simple instrumentation compare to spectrophotometry. The
objective of this research was to optimize the activity of SOD extract of
immobilized zeolite-Deinococcus radiodurans, repeatabillity, and the comparison
of detection limit between electrochemical and spectrophotometry method. The
optimum condition of SOD antioxidant activity of D. radiodurans extract was
obtained at temperature of 31 °C, pH 9, and zeolites 137.5 mg. The optimum
current obtained from the repeatibility was 1.749 µA with standard deviation of
0.01, and coefficient of variation of 0.59%. Detection limit of electrochemical
biosensor was 1.76 ppm, while spectrophotometry has lower detection limit with

value of 2.01 ppm. Electrochemical method can be used to detect lower
concentrations analytes.

vi

Key words : antioxidant biosensor, D. radiodurans, repeatibility, limit of
detection, superokside dismutase

\
vii

PENENTUAN KETERULANGAN BIOSENSOR
ANTIOKSIDAN DARI EKSTRAK Deinococcus radiodurans
DAN PERBANDINGAN METODE ELEKTROKIMIA
DENGAN SPEKTROFOTOMETRI

NIKE NURJANAH FERINDA

Skipsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains
pada
Program Studi Kimia

DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

viii

\
ix

Judul Skripsi : Penentuan Keterulangan Biosensor Antioksidan dari Ekstrak
Deinococcus radiodurans dan Perbandingan Metode
Elektrokimia dengan Spektrofotometri
Nama
: Nike Nurjanah Ferinda

NIM
: G44100012

Disetujui oleh

Prof Dr Dyah Iswantini Pradono, MSc Agr
Pembimbing I

Dr Novik Nurhidayat
Pembimbing II

Dr Deden Saprudin, MSi
Pembimbing III

Diketahui oleh

Prof Dr Dra Purwantiningsih Sugita, MS
Ketua Departemen

x

Tanggal Lulus :

\
xi

xii

PRAKATA
Puji syukur saya panjatkan ke hadirat Allah SWT karena berkat izin-Nya
saya dapat menyelesaikan proposal penelitian ini. Shalawat serta salam saya
curahkan kepada Nabi besar Muhammad SAW, sahabat, dan pengikutya hingga
akhir zaman. Ucapan terima kasih yang sebesarnya kepada ayahanda dan ibunda
tercinta, Ceprison dan Afrida, kepada uda Rindo Ferindo, uni Fika Ferinda, uni
Wulan dari, dan uda Riko Putra yang dengan kesabaran dan keikhlasan telah
memberikan dorongan moral, material, dan doa yang tulus.
Penulis mengucapkan rasa terima kasih yang tulus kepada Prof Dr Dyah
Iswantini Pradono MSc Agr, Dr Novik Nurhidayat, dan Dr Deden Saprudin MSi
selaku komisi pembimbing. Terima kasih saya ucapkan juga untuk Bu Neri, Mbak
Ratih, pak Acun di PUSLIT Biologi LIPI Cibinong, Bu Ai, Pak Mail staf laboran

Kimia Fisik, Pak Eman dari Kimia Analitik. Ungkapan terima kasih juga
disampaikan kepada Kak Aji yang mengarahkan dalam proses penelitian,
sahabatku Ana, Uci, dan Dina yang memberikan semangatnya, Mita, Ali, Kinan,
Asri, dan teman-teman seperjuangan di Kimia.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, September 2014
Nike Nurjanah Ferinda

\
xiii

xiv

DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR

xv

DAFTAR LAMPIRAN

xv

PENDAHULUAN

1

BAHAN DAN METODE

3

Alat dan Bahan

3

Metode

3

HASIL DAN PEMBAHASAN

6

Penumbuhan Sel Deinococcus radiodurans dan Ekstraksi Enzim SOD

6

Pengukuran Arus Elektrode Pasta Karbon

6

Aktivasi Zeolit

7

Imobilisasi Enzim

7

Pengoptimuman Aktivitas SOD Terimobilisasi

9

Limit Deteksi dan Limit Kuantitatif dengan Metode Elektrokimia dan
Spektrofotometri
SIMPULAN DAN SARAN

10
13

Simpulan

13

Saran

13

DAFTAR PUSTAKA

13

RIWAYAT HIDUP

29

\
xv

DAFTAR GAMBAR
1

Voltamogram siklik pada pengukuran larutan K3Fe (CN)6 0.01M

7

2

Voltamogram siklik pada suhu 20 °C, bufer fosfat pH 9, dan zeolit
137.5 mg

8

3

Mekanisme pengukuran biosensor antioksidan

9

4

Alur kontur hubungan antara suhu dan pH (a), suhu dan zeolit (b),
dan pH dan zeolit (c) terhadap aktivitas antioksidan D. radiodurans.

10

5

Hubungan penurunan arus terhadap penambahan vitamin C

11

6

Hubungan penurunan arus terhadap penambahan ekstrak daun jambu
biji

11

7

Hubungan absorban terhadap penambahan vitamin C metode DPPH

12

8

Hubungan absorban terhadap penambahan ekstrak daun jambu biji
metode DPPH

12

DAFTAR LAMPIRAN
1

Bagan alir penelitian

16

2

Ekstraksi SOD

16

3

Kombinasi faktor-faktor peubah bebas bakteri D. radiodurans dengan
penambahan zeolit

18

4

Hasil optimasi bakteri D. radiodurans dengan penambahan zeolit

19

5

Keterulangan pengukuran hasil atioksidan D. radiodurans kondisi
optimum

20

6

Penentuan limit deteksi dan limit kuantitatif metode elektrokimia

21

7

Penentuan limit deteksi dan limit kuantitatif metode elektrokimia
menggunakan ekstrak daun jambu biji

23

8

Penentuan limit deteksi dan limit kuantitatif metode DPPH

25

9

Penentuan limit deteksi dan limit kuantitatif
menggunakan ekstrak daun jambu biji

27

metode DPPH

PENDAHULUAN

Radikal bebas merupakan molekul yang pada orbit terluarnya mempunyai
satu atau lebih elektron tak berpasangan, sifatnya sangat labil, dan sangat reaktif
sehingga diperlukan suatu senyawa untuk menangkap radikal bebas tersebut.
Antioksidan merupakan zat yang dapat menghambat reaksi oksidasi oleh radikal
bebas yang menyebabkan kerusakan. Substansi antioksidan dalam melindungi
tubuh dari serangan radikal bebas berfungsi menstabilkan radikal bebas dengan
melengkapi kekurangan elektron dari radikal bebas sehingga menghambat
terjadinya reaksi berantai (Windono dan Soediatmoko 2001). Oleh karena itu,
diperlukan metode atau teknik yang tepat dalam pengukuran sifat antioksidan.
Metode atau teknik yang dapat digunakan dalam menentukan sifat-sifat
antioksidan adalah teknik spektrofotometri, fluoresensi, kromatografi gas atau cair,
dan sebagainya (Campanella et al. 2000). Metode spektrofotometri telah
dikembangkan sebelumnya tetapi memiliki beberapa kelemahan diantaranya biaya
yang mahal karena menggunakan bahan kimia yang bermacam-macam dalam
jumlah yang banyak, waktu yang lama dalam preparasi sampel, dan kurang
sensitif terutama dalam menguji sampel berwarna serta sangat dipengaruhi oleh
kekeruhan atau turbiditas.
Metode alternatif yang dikembangkan dalam mengukur sifat-sifat
antioksidan adalah biosensor antioksidan. Metode ini memiliki kelebihan yaitu
waktu analisis cepat, biaya instrumen yang tidak mahal, dan operasi yang
sederhana yang tidak tergantung pada konsentrasi analat. Biosensor antioksidan
ada dua jenis yaitu biosensor amperometri untuk menguji kapasitas antioksidan
mono dan polifenol berbasis enzim tirosinase, laktase atau peroksidase dan
biosensor untuk pengujian kapasitas antioksidan berdasarkan penangkapan radikal
bebas. Berdasarkan aktivitas penangkapan radikal bebas tipe biosensor
dikembangkan menggunakan sitokrom c, dan enzim superoksida dismutase
(SOD) (Prieto-Simon et al. 2008). Biosensor antioksidan berbasis SOD lebih
sensitif dan spesifik, telah terbukti dapat mengukur kapasitas antioksidan berbagai
jenis bahan alam, produk makanan dan minuman, serta farmasi. Penggunaan SOD
murni memiliki kekurangan, yaitu harga yang mahal dan kestabilan enzim yang
rendah. Solusi dari kekurangan tersebut adalah penggunaan bakteri yang
menghasilkan SOD sebagai sensor. Bakteri yang digunakan adalah Deinococcus
radiodurans. Bakteri ini bersifat resisten terhadap radiasi ultraviolet, ionisasi,
desikasi, dan adanya ROS atau spesi oksigen reaktif. Bakteri D. radiodurans
menghasilkan enzim yang dapat diinduksi untuk meningkatkan aktivitasnya yaitu
Mn-SOD.
Biosensor berbasis SOD telah terbukti dapat mengukur kapasitas
antioksidan pada anggur merah dan anggur putih (Campanella et al. 2004), teh
(Gil 2011), dan minyak zaitun (Coban 2008). Pengukuran kapasitas antioksidan
anggur merah dan anggur putih yang dilakukan oleh Campanella et al. (2000)
menunjukkan metode biosensor lebih sensitif dibandingkan metode fluorimetri
dan spektrofotometri yang menghasilkan perbedaan kapasitas antioksidan yang
besar. Metode biosensor amperometri lebih teliti dengan nilai RSD = 7.9%.
Penelitian yang dilakukan oleh Safrizal (2011) membuat biosensor berbasis SOD
dan menghasilkan nilai r = 0.9761 dan R² = 95.28% pada rentang konsentrasi

2

xantina 0.200-0.275 mM. Kondisi optimum aktivitas SOD murni yang diperoleh
pada konsentrasi 10 unit dengan waktu respons 4 detik dan elektrode stabil
disimpan dalam larutan bufer pH 11 pada suhu 20 oC selama 72 jam.
Kestabilan enzim perlu dijaga untuk menghasilkan kerja yang maksimum,
salah satu caranya dengan melakukan imobilisasi pada nanomaterial.
Shumyantseva et al. (2005) menggunakan nanopartikel emas yang menghasilkan
sensitivitas yang tinggi dari biosensor kolesterol dengan sitokrom P450scc. Wang
(2009) membuat elektroda karbon dengan nanopartikel platinum untuk
menentukan kadar glukosa dan menghasilkan respon arus yang lebih besar
dibandingkan elektroda tanpa nanopartikel platinum. Esumi et al. (2003) juga
telah membuat biosensor antioksidan dari nanopartikel emas dengan kitosan yang
menunjukkan stablitas baik.
Imobilisasi enzim dapat dilakukan dengan menggunakan bahan anorganik
seperti tanah liat, alumina berpori, silika (Bhatia et al. 2000), dan zeolit (Balal et
al. (2009), Kirdeciler et al. (2011), Goriushkina et al. (2010) juga dapat digunakan
sebagai matriks imobilisasi enzim. Zeolit banyak terdapat di Indonesia yang
berpotensi sebagai matriks imobilisasi SOD. Zeolit alam merupakan senyawa
alumina silikat terhidrasi yang secara fisik dan kimia mempunyai kemampuan
sebagai penjerap, penukar kation, dan sebagai katalis. Karakteristik zeolit unik,
yaitu memiliki kemampuan katalitik yang dapat membantu mempercepat reaksi,
stabil pada suhu tinggi, tahan terhadap pelarut organik, dan sifat yang keras
membuat zeolit lebih stabil terhadap tekanan mekanik yang tinggi, sehingga
enzim yang terjerap lebih stabil. Rangka dan pori dari struktur zeolit yang
seragam menyebabkan selektivitas dan reprodusibilitas yang dihasilkan tinggi
(Valdes et al. 2006).
Penggunaan nanopartikel emas pada amina yang terfungsionalisasi pada
zeolit Na-Y untuk mengimobilisasi pepsin telah dilakukan Mukhopadhyay et al.
(2003) yang menghasilkan aktivitas katalitik baik, di atas tujuh kali penggunaan
kembali. Balal et al. (2009) menggunakan nanopartikel berupa zeolit
termodifikasi FeCl3 pada elektroda pasta karbon sebagai biosensor untuk
mengukur dopamine dan triptopan yang menghasilkan arus lebih tinggi
dibandingkan elektroda pasta karbon dengan mediator FeCl3 tanpa penambahan
zeolit. Gia (2012) melakukan imobilisasi enzim pada zeolit yang meningkatkan
aktivitas GDH pada biosensor glukosa berdasarkan nilai Imaks-nya. Selain itu,
Liyonawati (2012) juga menggunakan zeolit sebagai matriks untuk
mengimobilisasi ekstrak E.coli yang menghasilkan hasil lebih baik pada biosensor
antioksidan. Penelitian yang dilakukan oleh Iswantini et al. (2013) memaparkan
bahwa penggunaan zeolit sebagai matriks imobilisasi ekstrak D. radiodurans
meningkatkan aktivitasnya dalam biosensor antioksidan, tetapi masih perlu
ditingkatkan agar penggunaan biosensor dapat digunakan dalam jangka waktu
yang lama. Oleh karena itu, pada penelitian ini akan dibuat biosensor antioksidan
berbasis SOD dari bakteri D. radiodurans yang diimobilisasi pada zeolit dan
dilakukan optimasi campuran zeolit dengan enzim, suhu, dan pH dalam
pembuatan elektroda agar aktivitas dan stabilitasnya lebih baik. Penelitian ini
bertujuan
melakukan optimasi aktivitas SOD ekstrak D. radiodurans
terimobilisasi zeolit, uji keterulangan, dan perbandingan limit deteksi metode
elektrokimia dengan spektrofotometri.

\
3

BAHAN DAN METODE

Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan antara lain pipet mikro, pinset, batang gelas, sel
elektrokimia, neraca analitik, pH meter, oven, tanur, potensiostat-galvanostat
eDAQ yang dilengkapi dengan perangkat lunak Echem v2.1.0 dan Minitab 14,
laminar air flow, incubator, High Speed Refrigerated Centrifuge KUBOTA 6500,
Centrifuge 5415 R, autoklaf, Ultrasonic Homogenizer UH-150, spektrofotometer
ultraviolet tampak (berkas ganda), dan alat-alat gelas lainnya. Bahan-bahan yang
digunakan adalah media LB untuk pertumbuhan Deinococcus radiodurans, sel D.
radiodurans, grafit, ferosena, parafin cair, zeolit alam Bayah, xantina oksidase
(XO), xantina, dimetil sulfoksida (DMSO), bufer fosfat, HCl 3M, asam askorbat,
etanol 95%, ekstrak daun jambu biji, DPPH, AgNO3, membran dialisis, jaring
nilon, dan parafilm.
Metode
Penelitian ini terdiri atas beberapa tahap percobaan, yaitu penumbuhan sel
Deinococus radiodurans dan ektraksi SOD, aktivasi zeolit, pembuatan elektroda,
imobilisasi enzim, optimasi aktivitas antioksidan ekstrak D. radiodurans,
pengukuran keterulangan, penentuan limit deteksi (LOD) dan limit kuantisasi
(LOQ). Bagan alir penelitian secara umum dilampirkan pada Lampiran 1.
Penumbuhan sel Deinococcus radiodurans dan ekstraksi protein sitoplasma D.
radiodurans
Bakteri Deinococcus radiodurans ditumbuhkan pada media LB (Luria
Bertani) yang mengandung tripton 1% (b/v) , yeast extract 0.5% (b/v), glukosa 0.2%
(b/v), NaCl 0.5% (b/v), dan alcohol. Selanjutnya diinkubasi selama 48 jam pada
300C. Sel dipanen dengan sentrifugasi kecepatan 7000 rpm selama 10 menit untuk
memisahkan sel bakteri dengan media. Sel (pelet) dicuci beberapa kali dengan larutan
buffer posfat pH 9.0 dan disuspensikan kembali dalam larutan bufer fosfat pH 9.0.
Suspensi sel di sonikasi dengan pulsa 50% dan output 5 untuk memecahkan sel
bakteri yaitu dengan interval 2 × 10 menit dan interval berhenti 1 menit. Selama
sonikasi suspensi sel didinginkan dalam penangas es. Selanjutnya disentrifugasi
10000 rpm selama 30 menit untuk memisahkan supernatan dan pelet. Ekstrak kasar
(crude extract) enzim berada disupernatan. Ekstrak selanjutnya diukur nilai
serapannya pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm untuk mengetahui
konsentrasi protein yang dihitung melalui persamaan :
[Enzim]= (1.55 × Absorban 280 nm) - (0.76 × Absorban 260 nm) × 1000 × FP
(Wilfinger et al. 1997)

Pembuatan Elektroda Pasta Karbon Termodifikasi Ferosena
Elektroda dibuat dengan cara melarutkan 3 mg ferosena dalam 1 mL DMSO
dan ke dalam larutan tersebut ditambahkan 100 mg grafit. Campuran didiamkan
selama 2 jam kemudian pelarut diuapkan menggunakan pengering vakum
sehingga diperoleh grafit termodifikasi mediator ferosena. Grafit kemudian

4

dicampur dengan 35 L parafin cair hingga membentuk pasta. Pasta karbon
dimasukkan ke dalam badan elektroda hingga padat sampai permukaan.
Permukaan elektroda dihaluskan dan dibersihkan dengan amplas dan kertas
minyak (Trivadila 2011).
Aktivasi Zeolit
Sebanyak 50 gram zeolit Bayah dicuci dengan akuades sampai pH netral,
kemudian disaring dengan ayakan ukuran 50 mesh dan dikeringkan dalam oven
pada 105 °C selama 3 jam. Zeolit yang telah kering diaktivasi dengan
menambahkan 250 mL HCl 3 M ke dalam gelas piala dan diaduk selama 1 jam.
Zeolit yang telah diaktivasi disaring, kemudian dicuci menggunakan akuades
sampai pH netral. Larutan hasil saringan diuji kandungan klorida dengan AgNO3
dan dicuci kembali dengan akuades sampai tidak mengandung klorin. Setelah pH
netral dan bebas klorin, zeolit dikeringkan pada suhu 300 °C selama 3 jam. Zeolit
kemudian dihaluskan dan diayak dengan ayakan 100 mesh (Arif 2011).
Optimasi aktivitas SOD dari Bakteri Deinococcus Radiodurans terimobilisasi
Optimasi yang dilakukan adalah optimasi suhu (20-40 °C), pH (7-11), dan
konsentrasi zeolit (25-250 mg). Metode yang digunakan untuk pengoptimuman
aktivitas SOD adalah Response Surface Method. Metode ini dilakukan dengan
cara memasukkan kombinasi faktor-faktor peubah bebas pada perangkat lunak
statistika Minitab. Selanjutnya percobaan dilakukan sesuai dengan kombinasi
yang dihasilkan untuk mendapatkan nilai aktivitas optimumnya.
Imobilisasi Ekstrak Deinococcus radiodurans
Sebanyak 30 mg zeolit Bayah dicampur dengan 10 mL akuades dengan alat
vortex sehingga membentuk suspensi 3 mg/mL. sebanyak 20 L ekstrak
Deinococcus radiodurans dalam bufer fosfat pH 9.0 dicampur dengan 10 L
suspensi zeolit dan didiamkan selama 10 menit lalu diteteskan 10 L pada
permukaan elektroda, didiamkan hingga pelarutnya menguap, dilapisi dengan
membran dialisis, ditutup dengan jaring nilon, dan diikat dengan parafilm.
Elektroda dapat langsung digunakan untuk pengukuran aktivitas antioksidan
ekstrak D. radiodurans dengan metode voltametri siklik. Elektroda direndam
dalam bufer fosfat pH 9.0 pada suhu 4 °C ketika tidak digunakan untuk
memberikan keadaan yang sama dengan lingkungan sebenarnya (Dai et al. 2004).
Pengukuran Elektrokimia
Pengukuran elektrokimia dilakukan dengan metode voltametri siklik dengan
menggunakan eDAQ potensiostat galvanostat yang dilengkapi perangkat lunak
Echem v2.1.0. Elektroda yang digunakan adalah elektroda Ag/AgCl sebagai
elektroda rujukan, platina sebagai counter dan elektroda pasta karbon dan zeolit
sebagai elektroda kerja. Parameter pengukuran dibuat sebagai berikut :
Mode
: Cyclic
Initial
: 0 mV
Final
: 0 mV
Rate
: 125 mV/s
Step W
: 20 ms
Upper E
: 1000 mV

\
5
Lower E
: -500 mV
Range
:5V
Larutan bufer fosfat sebanyak 1.9 mL ditambahkan kedalam sel pengukuran
dan puncak arus anoda yang terbentuk diamati sebagai blanko. Kemudian
ditambahkan 100 L larutan XO 0.1 U/mLdan 1 mL larutan xantina 2.1 mM.
Selanjutnya diukur kembali perubahan atau kenaikkan puncak arus anoda yang
terjadi.
Pengukuran keterulangan elektrode pasta karbonsecara voltametri siklik
(A0AC 2002)
Keterulangan pengukuran ditentukan dengan melakukan pengukuran pada
enzim SOD pada konsentrasi optimum selama 10 kali, kemudian dihitung
simpangan baku (SB) menggunakan persamaan berikut:
SB =

�−�� 2
�−1

Persen RSD yang menunjukkan kesalahan pengukuran arus dihitung dengan
persamaan berikut:
��
%RSD = × 100%
�

Perbandinganlimit deteksi dan limit kuantisasi dengan metode elektrokimia
dengan Spektrofotometri.
Pengukuran dilakukan pada kondisi optimum. Elektrode ditempatkan dalam
sel pengukuran yang mengandung enzim 100 L xantin oksidase 0.1 Unit/mL,
kemudian 1 mL xantinaditambahkan secara bertahap dan setiap penambahan
diukur perubahan arus yang dihasilkan. Selanjutnya pengukuran diulang dengan
penambahan 0.5 mL vitamin C dengan variasi konsentrasi 1.25; 2.5; 5; 10; dan 20
ppm. Data kemudian diplot dalam kurva dengan sumbu-x adalah konsentrasi
vitamin C dan respon arus (mA) pada sumbu-y, sehingga diperoleh persamaan
redresi dengan kemiringan tertentu.
Perbandingan metode elektrokimia dengan metode spektrofotometri
dilakukan dengan melihat hasil yang diperoleh dari pengukuran menggunakan
spektrofotometer dan biosensor antioksidan. Spektrofofotometri dengan metode
DPPH dilakukan pengukuran kapasitas antioksidan vitamin C. Vitamin C dibuat
dengan konsentrasi 1.25; 2.5; 5; 10; dan 20 ppm. Sebanyak 4 mL DPPH 125 M
ditambahkan kedalam 2 mL masing-masing sampel tersebut. Selanjutnya,
dilakukan inkubasi selama 30 menit dalam suhu ruang. Diukur pada panjang
gelombang 517 nm. Nilai limit deteksi (LOD) dan (LOQ) hasil pengukuran
dengan metode elektrokimia dibandingkan dengan hasil yang diperoleh dari
spektrofotometri. Penentuan LOD dan LOQ :
3 × ��
10 × ��
LOD =
LOQ =
dengan sd adalah standar deviasi dan b adalah slope dari persamaan garis linear.

6

HASIL DAN PEMBAHASAN
Penumbuhan sel Deinococcus radiodurans dan ekstraksi enzim SOD
Pertumbuhan bakteri merupakan pertambahan jumlah volume, ukuran sel,
volume, dan ukuran sel serta bertambahnya jumlah sel. Pertumbuhan sel bakteri
mengikuti suatu pola tertentu berupa kurva pertumbuhan sigmoid yang
menunjukkan empat fase pertumbuhan, yaitu fase log (fase lambat), fase
eksponensial (fase cepat), fase stasioner (fase statis), dan fase kematian populasi.
Pada fase eksponensial komposisi sel dan konsentrasi metabolit relatif konstan.
Pertumbuhan bakteri memerlukan media nutrisi untuk memenuhi kebutuhan
energi, sebagai bahan pembangun sel, untuk sintesis protoplasma, dan bagianbagian sel lainnya. Media pertumbuhan yang digunakan pada penelitian adalah
media LB (Luria Bertani). Media ini mengandung campuran zat-zat makanan
(nutrisi) berupa tripton, NaCl, dan ekstrak khamir yang diperlukan bagi
pertumbuhan D. radiodurans. Penambahan tripton sebagai vitamin, NaCl sebagai
sumber mineral, dan ekstrak khamir sebagai nutrisi makanan bakteri.
Bakteri D. radiodurans ditumbuhkan dalam media LB cair selama 48 jam
dengan suhu 30 °C. Setelah tumbuh, bakteri dipindahkan ke dalam media LB cair
dan diinkubasi. Selanjutnya bakteri dipisahkan dari media tumbuhnya dengan cara
di sentrifugasi dan direndam dengan larutan NaCl 0.85% (b/v). Larutan NaCl
0.85% (b/v) berfungsi sebagai pelarut yang disamakan dengan habitat hidup
bakteri. Sel bakteri dipecah untuk mengekstrak protein sitoplasma yang
mengandung enzim SOD dengan menggunakan ultrasonic homogenizer. Protein
yang terkestrak memiliki konsentrasi sebesar 2141.67 g/ml (Lampiran 2).
Pengukuran Arus Elektrode Pasta Karbon

Elektrode pasta karbon yang telah dibuat harus seragam panjang kawat Cu,
besar diameter batang elektrode, dan tinggi grafit pasta karbon pada elektrode.
Elektrode pasta karbon tersebut dikarakterisasi dengan larutan K3[Fe(CN)6]
dengan larutan elektrolit pendukung KCl 0.1 M dengan teknik voltametrik siklik
untuk melihat adanya puncak dan arus oksidasi reduksi elektode yang dihasilkan.
Kelebihan teknik voltametri siklik adalah sensitifitasnya yang tinggi, limit deteksi
yang rendah, dan daerah linier yang lebar (Mulyani et al. 2012). Berikut adalah
reaksi redoks yang terjadi :
34(i)
[Fe(CN)6] + e
Reaksi oksidasi [Fe(CN)6]
34(ii)
Reaksi reduksi [Fe(CN) ] + e
[Fe(CN) ]
6

6

Arus oksidasi yang diperoleh sebesar 5.901 µA dengan potensial 0.585 V.
Elektrode pasta karbon yang menghasilkan puncak oksidasi dan reduksi
selanjutnya digunakan untuk pengukuran sebagai biosensor. Gambar 1 merupakan
bentuk voltamogram siklik elektroda pasta karbon. Garis pertama yang muncul
pada voltamogram menunjukan proses oksidasi dengan adanya puncak arus
oksidasi. Garis kedua menunjukan proses reduksi yang terjadi pada elektrode
pasta karbon. Elektrode yang memiliki puncak arus oksidasi-reduksi dan rentang

\
7
voltamogram yang cukup seragam digunakan untuk pengukuran optimasi,
keterulanagn, dan perbandingan aplikasi metode biosensor dengan
spektrofotometer.
10

Puncak
oksidasi

8
6
4
2

I(µA)

0
-2
-4
-6

Puncak
reduksi

-8
-10
-12
-0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

E (V vs Ag/AgCl)

Gambar 1 Voltamogram siklik pada pengukuran larutan K3Fe (CN)6 0.01M
Aktivasi Zeolit
Zeolit alam yang digunakan pada penelitian ini adalah zeolit Bayah yang
berasal dari Bayah, Jawa Barat. Zeolit Bayah adalah jenis klinoptilolit dengan
rumus molekul Na3 K3[Al6Si30O72]24.H2O. Zeolit alam mempunyai bentuk kristal
teratur dan pori yang tersebar merata. Zeolit Bayah diaktivasi secara fisika dan
kimia untuk mengilangkan pengotor. Aktivasi secara fisika mencuci zeolit dengan
akuabides untuk menghilangkan pengotor seperti debu dan tanah yang masih
terdapat dalam zeolit. Selanjutnya dikeringkan dalam oven pada suhu 105 °C
selama 3 jam membantu mengeluarkan pengotor dan menguapkan kotoran yang
masih tertahan di permukaan zeolit. Aktivasi secara kimia dilakukan dengan HCl
3 M untuk menghilangkan pengotor yang bersifat asam yang larut dalam HCl (Dai
et al. 2004). Selanjutnya dicuci sampai pH netral dan diuji AgNO3 untuk menguji
kandungan klorida pada zeolit hingga diperoleh zeolit Bayah ukuran 100 mesh.
Karakteristik zeolit yang stabil pada temperatur tinggi, tahan terhadap
pelarut organik, dan sifatnya yang keras sehingga lebih stabil terhadap tekanan
mekanik yang tinggi menyebabkan enzim yang terjerap akan lebih stabil. Rangka
dan pori dari struktur zeolit yang seragam menyebabkan selektivitas dan
reprodusibilitasnya yang dihasilkan tinggi (Valdes et al. 2006). Zeolit bersifat
hidrofilik dengan adanya gugus –OH disekitar pori sehingga cocok untuk
imobilisasi enzim yang menghasilkan arus yang kuat (Valdes et al. 2006). Zeolit
selain dapat digunakan sebagai material penyangga juga memiliki kemampuan
katalitik yang membantu mempercepat reaksi (Dai et al. 2004).

Imobilisasi Enzim
Imobilisasi enzim dilakukan pada permukaan material penyangga, yaitu
zeolit Bayah untuk menjaga fungsi katalitik enzim pada kondisi ekstrem. Enzim

8

dapat terdenaturasi oleh pH dan suhu yang ekstrem, pelarut organik, dan deterjen.
Enzim pada kondisi normal memiliki selektivitas dan sensitivitas yang tinggi.
Metode imobilisasi dilakukan untuk menghasilkan respon arus yang tinggi. Enzim
SOD diimobilisasi dengan zeolit yang diteteskan pada permukaan pasta karbon
termodifikasi ferosena.
Ferosena berfungsi meningkatkan arus yang dihasilkan karena bersifat stabil,
tidak bereaksi langsung dengan substrat enzim, potensial redoks yang lebih rendah
dari potensial oksidasi zat-zat pengganggu, tidak dipengaruhi oleh Ph dan efek
kekuatan ion pada media (Trivadila 2011). Penelitian ini, ferosena telah dicampur rata
dengan EPK (elektrode pasta karbon). Cara ini kurang efektif karena menghasilkan
arus yang lebih kecil daripada diteteskannnya ke dalam wadah pengukuran arus
elektrode. Gambar 2 merupakan salah satu contoh voltamogram siklik yang
dihasilkan
3
2
1

I (µA)

0
-1
-2
-3
Bufer
Bufer + XO + Xantina

-4
-5
-0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

E (V Vs Ag/AgCl)

Gambar 2 Voltamogram siklik pada suhu 20 °C, bufer fosfat pH 9, dan zeolit
137.5 mg
Pada penelitian ini, penambahan substrat xantina akan menghasilkan reaksi
enzimatis xantina dengan xantina oksidase (XO) yang menghasilkan radikal
superoksida :
xantina + H2O + O2

��

asam urat + 2H++ 2O2•-

(iii)

Selanjutnya, radikal tersebut akan didismutasi membentuk O2 dengan katalis SOD
dengan reaksi :
���

2H+ + 2O2•O2 + H2O2
(iv)
Mekanisme pengukuran biosensor antioksidan menggunakan elektrokimia
adalah radikal bebas yang terikat dengan enzim SOD menghasilkan elektron-elektron.
Elektron-elektron tersebut selanjutnya ditangkap oleh mediator sehingga terjadi reaksi
bolak-balik yang menghasilkan elektron bebas. Elektron bebas kemudian akan
ditangkap permukaan elektrode dan dikirimkan kepada transduser untuk diolah
menjadi data dalam bentuk voltamogram.

\
9

Gambar 3 Mekanisme pengukuran biosensor antioksidan
Pengoptimuman Aktivitas SOD Terimobilisasi
Optimasi aktivitas SOD dari bakteri D. radioduransdilakukan menggunakan
metode RSM (response surface method) pada minitab. Faktor kombinasi yang
dilakukan optimasi suhu pada rentang (20 ̵ 40 °C), pH (7 ̵ 11), dan zeolit (25 ̵ 250
mg) (Lampiran 3). Hasil analisis RSM menunjukkan plot kontur yang baik dengan
bulatan sempurna pada bulatan lebih gelap yang menjelaskan nilai arus tertinggi.
Kontur merupakan garis-garis yang menunjukan nilai ekspektasi respon aktivitas
berupa arus minimum hingga maksimum. Plot kontur menunjukan hold values
yang akan digunakan sebagai starting value pada response optimizer. Response
optimizer berfungsi untuk menganalisis kondisi optimum aktivitas antioksidan
dari sel bakteri. Hasil optimum yang diperoleh untuk sel bakteri dengan zeolit,
yaitu suhu 30 oC, pH 9, dan zeolit 137.5 mg (Lampiran 4).
Gambar 4 menunjukkan plot kontur hubungan parameter dengan respon
berupa arus. Dari kontur dapat terlihat suhu, pH, dan zeolit pada awalnya
meningkatkan arus, tetapi arus turun pada kondisi tertentu. Ini disebabkan karena
enzim bekerja optimal pada suhu dan pH tertentu. Suhu terlalu tinggi
menyebabkan enzim terdenaturasi sehingga rusak dan tidak dapat berfungsi lagi,
sedangkan suhu yang rendah menyebabkan enzim tidak dapat bekerja dengan
optimal. Ketika pH terlalu tinggi atau terlalu rendah dapat menyebabkan
penurunan kinerja enzim yang menyebabkan arus juga turun. Penggunaan zeolit
yang banyak menyebabkan sulitnya interaksi antara substrat dengan enzim karena
terhalangi oleh partikel-partikel zeolit sehingga arus menjadi turun. Penggunaan
zeolit yang terlalu sedikit juga akan memberikan respon arus yang kecil.
Contour Plot of I (µA) vs Suhu; [Zeolit]mg

Contour Plot of I (µA) vs Suhu; pH
I (µA)
< 0,00
0,00 – 0,25
0,25 – 0,50
0,50 – 0,75
0,75 – 1,00
1,00 – 1,25
1,25 – 1,50
> 1,50

Suhu

35

30

40

I (µA)
< 0,00
– 0,25
– 0,50
– 0,75
– 1,00
– 1,25
– 1,50
> 1,50

0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
1,25

35

Suhu

40

30

25

25

20

20
7

8

9
pH

10

(a)

11

50

100

150
[Zeolit]mg

(b)

200

250

10

Contour Plot of I (µA) vs pH; [Zeolit]mg
11

I (µA)
< 0,00
– 0,25
– 0,50
– 0,75
– 1,00
– 1,25
– 1,50
> 1,50

0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
1,25

pH

10

9

8

7
50

100

150
[Zeolit]mg

200

250

(c)
Gambar 4 Alur kontur hubungan antara suhu dan pH (a), suhu dan zeolit (b), dan
pH dan zeolit (c) terhadap aktivitas antioksidan D. radiodurans.
Hasil ini sedikit berbeda dengan penelitian yang telah dilakukan Trivadila
(2011) dimana daerah optimum ekstrak enzim SOD adalah pH 9, suhu 27.50C.
Weniarti (2011) dan Atmadi (2014) melakukan optimasi aktivitas SOD D.
radiodurans terimobilisasi menghasilkan daerah optimum pada pH 9, shu 30 °C, dan
zeolit 156.8 mg. Sedangkan Campanella et al. (2000) mengimobilisasi SOD pada
permukaan elektrode oksigen di antara membran dialisis dan membran selulosa
triasetat pada pH 7 dan suhu 20 °C. Proses imobilisasi yang berbeda akan
mempengaruhi pada suhu dan pH berapa daerah optimumnya.
Hasil uji keterulangan elektrode pasta karbon secara voltametri siklik
diperoleh nilai rerata arusnya 1.749 µA dengan standar deviasi 0.01 dan persen
RSD 0.59 (Lampiran 5). Hasil ini menunjukkan bahwa hasil yang diperoleh cukup
baik .
Limit Deteksi dan Limit Kuantitatif dengan metode elektrokimia dan
spektrofotometri
Penentuan limit deteksi (LOD) dan limit kuantitatif (LOQ) menggunakan
metode elektrokimia dan spektrofotometri. Limit deteksi dan limit kuantitatif
dilakukan dengan mengukur puncak arus yang dihasilkan dengan penambahan
vitamin C dengan berbagai konsentrasi. Penentuan limit deteksi dilakukan dengan
vitamin C sebagai standar dan sebagai contoh juga dilakukan menggunakan
sampel ekstrak daun jambu biji. Pengukuran ini dilakukan pada kondisi optimum
yaitu, suhu 30 ᵒC, pH 7 dengan zeolit 137.5 mg. Dibawah ini merupakan kurva
hubungan penurunan arus yang dihasilkan dengan penambahan vitamin C.
Semakin besar konsentrasi vitamin C yang ditambahkan maka arus yang
dihasilkan akan semakin kecil karena sifatnya antioksidan. Hubungan penurunan
arus terhadap penambahan vitamin C terlihat pada Gambar 5

\

∆I (µA)

11
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0

y = 0.109x + 1.35
R² = 0.938
y = 0.118x + 1.241
R² = 0.913

Ulangan 1
Ulangan 2

y = 0.107x + 1.325
R² = 0.878
0,00

10,00

Ulangan 3
20,00

30,00

[Vitamin C] ppm
Gambar 5 Hubungan penurunan arus terhadap penambahan vitamin C

∆I (µA)

Nilai LOD dan LOQ rerata yang diperoleh dari pengukuran tersebut sebesar 1.76
ppm dan 5.88 ppm (Lampiran 6). Di bawah ini hubungan arus yang dihasilkan
terhadap penambahan ekstrak daun jambu biji dapat dilihat pada Gambar 6
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0

y = 0.014x + 1.78
R² = 0.994
y = 0.017x + 1.63
R² = 0.966

Ulangan 1

y = 0.014x + 1.84
R² = 0.970

Ulangan 2

Ulangan 3
0,00

50,00

100,00

150,00

[Ekstrak daun jambu biji] ppm
Gambar 6 Hubungan penurunan arus terhadap penambahan ekstrak daun jambu
biji
Nilai LOD dan LOQ rerata yang diperoleh dari pengukuran menggunakan sampel
ekstrak daun jambu biji sebesar 0.66 ppm dan 2.19 ppm (Lampiran 7).
Metode kedua untuk menentukan LOD dan LOQ adalah metode
penangkapan radikal bebas DPPH menggunakan spektrofotometri. Vitamin C dan
ekstrak daun jambu biji masing-masing dibuat kurva standar sehingga diperoleh
persamaan regresi linear. Nilai LOD dan LOQ ditentukan dari hubungan
absorbansi terhadap penambahan vitamin C/ekstrak daun jambu biji menggunakan
spektrofotometri. Gambar 7 menunjukkan hubungan absorban terhadap
penambahan vitamin C

12

0,700

y = 0.030x + 0.261
R² = 0.992

0,600

Absorban

0,500
0,400

y = 0.025x + 0.266
R² = 0.996

0,300

Ulangan 1
Ulangan 2

y = 0,031x + 0,240
R² = 0.995

0,200
0,100

Ulangan 3

0,000
0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

[Vitamin C] ppm
Gambar 7 Hubungan absorban yang dihasilkan dengan penambahan vitamin C

Absorban

Nilai LOD dan LOQ rerata yang diperoleh dari pengukuran menggunakan vitamin
C sebesar 2.01 ppm dan 6.70 ppm (Lampiran 8). Di bawah ini merupakan
hubungan absorban yang dihasilkan terhadap penambahan ekstrak daun jambu biji
dapat dilihat pada Gambar 8
0,800
0,700
0,600
0,500
0,400
0,300
0,200
0,100
0,000

y = 0.006x + 0.070
R² = 0.998
y = 0.007x + 0.073
R² = 0.997

Ulangan 1
Ulangan 2

y = 0.007x + 0.049
R² = 0.998
0

50

Ulangan 3

100

150

[Ekstrak daun jambu biji] ppm
Gambar 8 Hubungan absorban yang dihasilkan dengan penambahan ekstrak daun
jambu biji
Nilai LOD dan LOQ rerata yang diperoleh dari pengukuran menggunakan sampel
ekstrak daun jambu biji sebesar 1.21 ppm dan 8.35 ppm (Lampiran 9).
Tabel 1 Perbandingan nilai LOD dan LOQ yang diperoleh dengan kedua metode
Nilai

LOD (ppm)
LOQ (ppm)

Metode Elektrokimia
Vitamin Ekstrak daun
C
jambu biji
1.76
0.66
5.88
2.19

Metode Spektrofotometri
Vitamin
Ekstrak daun
C
jambu biji
2.01
1.21
6.70
8.35

Pengukuran kapasitas antioksidan menggunakan kedua metode
tersebutterlihat bahwa menggunakan biosensor jauh lebih sensitif dan tepat
dibandingkan dengan metode spektrofotometri. Limit deteksi yang dihasilkan

\
13
metode elektrokimia lebih kecil daripada menggunakan spektrofotometri. Metode
spektrofotometeri sangat dipengaruhi oleh kekeruhan larutan. Hal ini berbeda
dengan biosensor yang tidak dipengaruhi oleh kekeruhan larutan, sehingga tidak
diperlukan pengenceran berkali-kali yang dapat menyebabkan berkurangnya
ketelitian. Selain itu, ketika ekstrak daun jambu biji direaksikan dengan DPPH
harus diinkubasi selama 30 menit terlebih dahulu agar bereaksi sempurna. Metode
pengukuran dengan spektrofotometri memerlukan bahan kimia yang bermacammacam dan jumlah yang banyak. Menggunakan biosensor tidak diperlukan
inkubasi karena radikal adalah senyawa yang tidak stabil yang harus segera diukur.
Penggunaan biosensor lebih cepat, akurat dan menghasilkan limit deteksi yang
baik dibandingkan dengan spektrofotometri.

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Kondisi optimum bagi aktivitas SOD imobilisasi adalah pada pH 9, suhu 30
C, dan zeolit 137.5 mg. Hasil keterulangan optimasi pengukuran elektrode pasta
karbon diperoleh arus sebesar 1.749 µA dengan standar deviasi 0.01 dan RSD
0.59%. Hasil pengukuran LOD dan LOQ menggunakan metode elektrokimia lebih
kecil dibandingkan dengan spektrofotometri, sehingga dengan menggunakan
biosensor dapat mendeteksi suatu analit dengan konsentrasi yang lebih kecil.
Selain itu dengan menggunakan metode elektrokimia tidak memerlukan waktu
yang lama, jumlah bahan kimia yang digunakan juga lebih sedikit dibandingkan
metode spektrofotometri.
°

Saran
Perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk meningkatkan untuk melihat
parameter sensitivitas, linearitas, stabilitas, dan ketelitian. Perlu dilakukan juga
penentuan kapasitas antioksidan dari berbagai sampel seperti kedawung, ekstrak
buah, dan sebagainya.

DAFTAR PUSTAKA
[AOAC] Association of Official Analytical Chemists. 2002. AOAC Guidelines
for Single Laboratory Validation of Chemical Methods for Dietary
Supplements and Botanicals. [Internet]. [diunduh pada 2013 10 Juli].
Tersedia pada: http://www.aoac.org/Official_Methods/slv_guidelines.pdf.
Arif Z. 2011. Karakterisasi dan modifikasi zeolit alam sebagai bahan media
pendeteksi. [tesis]. Bogor: FMIPA, IPB.
Atmadi Waskitho. 2014. Aktivitas dan stabilitas superoksida dismutase dari
ekstrak D. radiodurans yang diimobilisasi pada zeolit alam sebagai

14

biosensor antioksidan. 2014. [skripsi]. Bogor: Program Sarjana, Institut
Pertanian Bogor.
Balal K, Mohammad H, Bahareh , Ali B.Maryam H, Mozhgan Z. 2009. Zeolite
nanoparticle modified carbon paste electrode as a biosensor for
simultaneous determination of dopamine and tryptophan. J Chin Chem. 56 :
789-796.
Bhatia R, Gupta AK, Anup KS, Brinker CJ. 2000. Aqueous sol-gel process for
protein encapsulation. Chem Mater. 12: 2434-2441.
Campanella L, Favero G,Persi L, Tommaseti M. 2000. New biosensor for
superoxide radical used to evidence molecules of biomedical and
pharmaceutical interest having radical scavenging properties. J Pharm
BiomAn. 23: 69-76.
Coban S. 2008. Development of biosensors for determination of the total
antioxidant capacity. [thesis]. Izmir: Department of Chemical Engineering,
Izmir Institute of Technology.
Dai Z, Liu S, Ju H. 2004. Direct electron transfer of cytochrome c immobilized on
a NaY zeolite matrix and its application in biosensing. Electro Acta. 49 :
2139–2144.
Esumi K, Takei N & Yoshimura T. 2003. Antioxidant-potentiality of gold
chitosan nanocomposites. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 32 (2):
117–125.
Gil DM de Albuquerque. 2011. Biosensor evaluation of the antioxidant activity of
wines and teas, interference studies and comparison with other methods.
[thesis]. Lisbon: Chemical/Biochemical Department, Lisbon University.
Goriushkina TB, Kurç BA, Sacco A, Dzyadevych SV. 2010. Application of
zeolites for glucose oxidase in amperometric biosensors. Sens Elect &
Microsys Tech 1: 36-42.
Iswantini D, Nurhidayat N, Trivadila. 2013. Antioxidant biosensor using microbe.
Engineering and Technology 78: 232-246. DOI: 10.5454/mi.5.1.2
Kirdeciler SK, Soy E, Ozturk S, Kucherenko I, Soldatkin O, Dzyadevych S, Akata
B. 2011. A novel urea conductometric biosensor based on zeolite
immobilized urease. Talanta 85: 1435–1441.
Liyonawati. 2012. Aktivitas dan stabilitas superoksida dismutase dari ekstrak
Escherichia coli diimobilisasi pada zeolit alam sebagai biosensor
antioksidan. [skripsi]. Bogor: Program Sarjana, Institut Pertanian Bogor.
Mukhopadhyay K, Phadtare S, Vinod VP, Kumar A, Rao M, Chaudhari RV, and
Sastry M. 2003. Gold nanoparticles assembled on amine-functionalized
Na−Y zeolite: a biocompatible surface for enzyme immobilization.
Langmuir. 19 (9): 3858-3863.
Mulyani R, Buchari, Noviandri Indra, Ciptati. 2012. Studi voltametri siklikk
sodium dedocyl benzen sulfonat dalam berbagai elektroda dan elektrolit
pendukung. Journal of Waste Management Technology. 15: 131-144.
Prieto-Simon B, Cortina M, Campas M, Calas-Blanchard C. 2008.
Electrochemical biosensor as a tool for antioxidant capacity assessment.
SensActuators B 129: 459–466.
Safrizal BT. 2011. Penentuan konsentrasi optimum superoksida dismutase,
linearitas, dan stabilitas biosensor antioksidan menggunakan elektrode pasta
karbon. [skripsi]. Bogor: Departemen Kimia, Institut Pertanian Bogor.

\
15
Shumyantseva VV, Carrara S, Bavastrello V, Riley DJ, Bulko TV, Skryabin KG,
Archakov AI, & Nicolini C. 2005. Direct electron transfer between
cytochrome P450scc and gold nanoparticles on screen-printed rhodium–
graphite electrodes. Biosensors and Bioelectronics. 21: 217–22.
Trivadilla. 2011. Biosensor antioksidan menggunakan superoksida dismutase
Deinococcus radiodurans yang diimobilisasi pada permukaan elektrode
pasta karbon dan parameter kinetikanya [tesis]. Sekolah Pascasarjana,
Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Valdes MG, Perez-Cordoves AI, Diaz-Garcia ME. 2006. Zeolites and zeolite
based materials in analytical chemistry. J Trends Anal Chem 25: 24-30.
Wang K. 2009. Direct Electrochemistry and Electrocatalysis of Glucose Oxidase
Immobilized on Glassy Carbon Electrode Modified by Nafion and Ordered
Mesoporous. Journal of molecularCatalysis B: Enzymatic 58: 194–198
Weniarti. 2011. Biosensor antioksidan berbasis superoksida dismutase
Deinococcus radiodurans diimobilisasi pada nanokomposit zeolit alam
Indonesia.[tesis]. Bogor: Program Pacasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Wilfinger, W.W., Mackey, K. and Chomczynski, P. 1997. Effect of pH and ionic
strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity.
Biotechniques 22: 474-481.
Windono T, Soediatmoko SS. 2001. Uji Peredaman Radikal Bebas terhadap
DPPH dari Ekstrak Kulit Buah dan Biji Anggur (Vitis venifera L.)
Probolinggo Biru dan Bali. Surabaya (ID) : Artocarpus.

16

Lampiran 1 Bagan alir penelitian
Bakteri D.
Radiodurans

Media
LB cair
Inkubasi 48 jam dan
suhu 30 °C
Ekstrak
SOD
Sentrifugasi 7000
rpm, waktu 10 menit

Supernatan

Pelet
Sonikasi pulsa
50%, output 5
Pelet

Zeolit
bayah

Diimobilisasi
zeolit

Sentrifugasi 10000
rpm, waktu 10
menit

Ekstrak kasar
(crude extract)



Aktivitas
optimum SOD



Pelet

Keterulangan
LOD dan LOQ metode
elektrokimia
LOD dan LOQ metode
DPPH

\
17
Lampiran 2 Ekstraksi SOD
EkstrakSOD
Ulangan 1
Ulangan 2
Ulangan 3
Rerata

Absorbans 260
nm
0.353
0.358
0.349

Absorban 280
nm
0.240
0.248
0.239

[Enzim]
g/ml
2074.4
2246.4
2104.2
2141.667

[Enzim]= (1.55 × Absorban 280 nm) - (0.76 × Absorban 260 nm) × 1000 × FP
= (1.55 × 0.240) - (0.76 × 0.353) × 1000 × 20
= 2074.4 g/ml
[Enzim]rerata =

�� �� � 1+�� �� � 2+�� �� � 3

3
2074 .4 g/ml +2246 .4 g/ml +2104 .2 g/ml

=
= 2141.667 g/ml

3

18

Lampiran 3 Kombinasi faktor-faktor peubah bebas bakteri D. radiodurans dengan
penambahan zeolit
Suhu
(0C)
35.95
30.00
35.95
30.00
24.05
30.00
24.05
30.00
20.00
30.00
24.05
40.00
35.95
30.00
30.00
30.00
30.00
24.05
35.95
30.00

pH
10.19
9.00
7.81
9.00
10.19
9.00
7.81
9.00
9.00
11.00
10.19
9.00
7.81
7.00
9.00
9.00
9.00
7.81
10.19
9.00

Zeolit
(mg)
204.39
137.50
204.39
25.00
204.39
137.50
70.61
137.50
137.50
137.50
70.61
137.50
70.61
137.50
137.50
137.50
137.50
204.39
70.61
250.00

\
19
Lampiran 4 Hasil optimasi bakteri D. radiodurans dengan penambahan zeolit
Zeolit
I
(mg)
(µA)
35.95
10.19
204.39 0.009
30.00
9.00
137.50 1.721
35.95
7.81
204.39 -0.084
30.00
9.00
25.00 0.347
24.05
10.19
204.39 0.047
30.00
9.00
137.50 1.742
24.05
7.81
70.61 0.065
30.00
9.00
137.50 1.739
20.00
9.00
137.50 0.043
30.00
11.00
137.50 0.510
24.05
10.19
70.61 0.369
40.00
9.00
137.50 0.231
35.95
7.81
70.61 -0.009
30.00
7.00
137.50 0.068
30.00
9.00
137.50 1.736
30.00
9.00
137.50 1.728
30.00
9.00
137.50 1.741
24.05
7.81
204.39 0.081
35.95
10.19
70.61 0.421
30.00
9.00
250.00 -0.005
Daerah Optimum : Suhu 30 °C, pH 9, zeolit 137.5 mg
Suhu

pH

20

Lampiran 5 Keterulangan pengukuran hasil atioksidan D. radiodurans kondisi
optimum
Elektrode
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Irerata (µA)
Sd
%RSD
I rerata (µA)

Sd

�(µA)

=
�
= 1.749 (µA)
��−�

=

(�− )

= 0.0102827
��

%RSD =
�
= 0.59

I (µA)
1.738
1.751
1.734
1.740
1.749
1.745
1.761
1.748
1.767
1.755
1.749
0.01
0.59

\
21
Lampiran 6 Penentuan LOD dan LOQ metode elektrokimia
Tabel 2 Data arus oksidasi terhadap konsentrasi vitamin C
Vitamin C
(ppm)
1.25

2.50

5.00

10.00

20.00

Ulangan

Xantina

Vitamin C

1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3

5.1
4.8
5.0
5.3
5.2
5.3
5.6
5.6
5.5
5.4
5.4
5.3
5.9
6.1
6.0

3.9
3.8
4.0
3.6
3.4
3.5
3.4
3.5
3.3
3.0
3.1
2.9
2.4
2.5
2.6

Y
(µA)
1.2
1.0
1.0
1.7
1.8
1.8
2.2
2.1
2.2
2.4
2.3
2.4
3.5
3.6
3.4

Tabel 3 Perhitungan kuadrat selisih arus elektrode 1, 2, dan 3 vitamin C
Absorban

Ulangan

Y

1
2
3
1i
2i
3i
(1i-1)
(2i-2)
(3i-3)
(1i-1)2
(2i-2)2
(3i-3)2

Yi

Yi-Y

(Yi-Y)2

1.25
1.2
1.0
1.0
1.486
1.389
1.459
0.286
0.389
0.459
8.19E-02
1.51E-01
2.10E-01

Vitamin C (ppm)
2.50
5.00
10.00
1.7
2.2
2.4
1.8
2.1
2.3
1.8
2.2
2.4
1.623
1.895
2.440
1.536
1.831
2.421
1.593
1.860
2.395
-0.077
-0.305
0.040
-0.264
-0.269
0.121
-0.208
-0.340
-0.005
6.01E-03 9.30E-02 1.60E-03
6.97E-02 7.24E-02 1.46E-02
4.31E-02 1.16E-01 2.50E-05

Contoh perhitungan:
 Yi dari persamaan garis y = 0.109x + 1.35
 Untuk x = 20 ppm, maka
Yi = 0.109(20) + 135
Yi= 1.486

20.00
3.5
3.6
3.4
3.530
3.601
3.465
0.030
0.001
0.065
9.00E-04
1.00E-06
4.22E-03

22




Yi-Y = 1.486- 1.2= 0.286
∑(Yi-Y)2 = (0.286)2 = 8.19E-02

Tabel 4 Perhitungan nilai LOD dan LOQ biosensor antioksidan dengan standar
vitamin C
Ulangan

∑(Yi-Y)2

Sd

1
2
3
Rerata

1.83E-01
3.08E-01
3.73E-01

0.04656940
0.05950032
0.08894619

LOD
(ppm)
1.28
1.51
2.49
1.76

LOQ
(ppm)
4.27
5.04
8.31
5.88

Contoh perhitungan:








Sd

��−�

=

(�− )

= 0.04656940
LOD = 3 SD b
= 3 × 0.04656940 0.109
= 1.28 ppm
Rerata LOD = 1.76 ppm
LOQ = 10 SD b
= 10 × 0.04656940 0.109
= 4.27 ppm
Rerata LOQ = 5.89 ppm
10

5

I (µA)

0

-5

20 ppm
40 ppm
60 ppm
80 ppm
100 ppm

-10

-15

-0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

E (V Vs Ag/AgCl)

Gambar 9 Profil voltamogram EPK kapasitas antioksidan vitamin C elektode 1

\
23
Lampiran 7 Penentuan LOD dan LOQ metode Elektrokimia menggunakan
ekstrak daun jambu biji
Tabel 5 Data arus oksidasi terhadap konsentrasi ekstrak daun jambu biji
Vitamin C
(ppm)
20

40

60

80

100

Ulangan

Xantina

Vitamin C

1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3

5.5
5.6
5.6
5.4
5.5
5.3
5.5
5.4
5.5
5.6
5.6
5.5
5.5
5.6
5.6

3.4
3.5
3.4
3.1
3.3
3.0
2.9
2.8
2.8
2.7
2.5
2.6
2.3
2.2
2.3

Y
(µA)
2.1
2.1
2.2
2.3
2.2
2.3
2.6
2.6
2.7
2.9
3.1
2.9
3.2
3.4
3.3

Tabel 6 Perhitungan kuadrat selisih arus elektrode 1, 2, dan 3 ekstrak daun jambu
biji
Absorban Ulangan
Y

Yi

Yi-Y

(Yi-Y)2

1
2
3
1i
2i
3i
(1i-1)
(2i-2)
(3i-3)
(1i-1)2
(2i-2)2
(3i-3)2

20
2.1
2.1
2.2
2.060
1.970
2.120
-0.040
-0.130
-0.080
1.60E-03
1.69E-02
6.40E-03

Ekstrak daun jambu biji (ppm)
40
60
80
2.3
2.6
2.9
2.2
2.6
3.1
2.3
2.7
2.9
2.340
2.620
2.900
2.310
2.650
2.990
2.400
2.680
2.960
0.040
0.020
0.000
0.110
0.050
-0.110
0.100
-0.020
0.060
1.60E-03 4.00E-04 0.00E+00
1.21E-02 2.50E-03 1.21E-02
1.00E-02 4.00E-04 3.60E-03

Contoh perhitungan:
 Yi dari persamaan garis y = 0.014x + 1.78

100
3.2
3.4
3.3
3.180
3.330
3.240
-0.020
-0.070
-0.060
4.00E-04
4.90E-03
3.60E-03

24






Untuk x = 20 ppm, maka
Y = 0.014(20) + 1.78
Yi= 2.060
Yi-Y = 2.060- 2.1= -0.040
∑(Yi-Y)2 = (-0.040)2 = 1.60E-03

Tabel 7 Perhitungan nilai LOD dan LOQ biosensor antioksidan dengan sampel
ekstrak daun jambu biji
Ulangan

∑(Yi-Y)2

Sd

1
2
3
Rerata

4.00E-03
4.85E-02
2.40E-02

0.00074833
0.00587878
0.00360000

LOD
(ppm)
0.16
1.04
0.77
0.66

LOQ
(ppm)
0.53
3.46
2.57
2.19

Contoh perhitungan:








Sd

�� −� 2

=

(�−1)

=0.00074833
LOD = 3 SD b
= 3 × 0.00074833 0.014
= 0.16 ppm
Rerata LOD = 0,66 ppm
LOQ =10 SD b
=10 × 0.00074833 0.014
= 0.53 ppm
Rerata LOQ = 2.19 ppm
15

10

5

I (µA)



0

-5

20 ppm
40 ppm
60 ppm
80 ppm
100 ppm

-10

-15
-0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

E (V Vs Ag/AgCl)

Gambar 10 Profil voltamogram EPK kapasitas antioksidan ekstrak daun
jambu biji elektode 1

\
25
Lampiran 8 Penentuan LOD dan LOQ metode DPPH
Tabel 8 Data absorban terkoreksi terhadap konsentrasi vitamin C
Vitamin C
(ppm)
1.25

2.50

5.00

10.00

20.00

Ulangan
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3

Absorban
Vitamin C blanko
0.990
1.248
0.975
1.263
0.979
1.236
0.952
1.248
0.964
1.263
0.971
1.236
0.884
1.248
0.899
1.263
0.914
1.236
0.818
1.248
0.818
1.263
0.827
1.236
0.590
1.248
0.604
1.263
0.604
1.236

Absorban
terkoreksi
0.258
0.288
0.257
0.296
0.299
0.265
0.364
0.364
0.322
0.430
0.445
0.409
0.658
0.659
0.632

Tabel 9 Perhitungan kuadrat selisih pengukuran kapasitas antioksidan vitamin C
dengan spektrofotometri
Absorban

Ulangan

Y

1
2
3
1i
2i
3i
(1i-1)
(2i-2)
(3i-3)
(1i-1)2
(2i-2)2
(3i-3)2

Yi

Yi-Y

(Yi-Y)2

Vitamin C (ppm)
1.25
2.50
5.00
10.00
20.00
0.258
0.296
0.364
0.430
0.658
0.288
0.299
0.364
0.455
0.659
0.257
0.265
0.322
0.409
0.632
0.299
0.336
0.411
0.561
0.861
0.297
0.329
0.391
0.516
0.860
0.279
0.318
0.395
0.550
0.860
0.041
0.040
0.047
0.131
0.203
0.009
0.030
0.027
0.061
0.201
0.022
0.053
0.073
0.141
0.228
1.64E-03 1.60