Biosensor Superoksidamenggunakan Ekstrak Protein Deinococcus Radiodurans Diimobilisasi Dengan Ikat Silang Glutaraldehid.

i

BIOSENSOR SUPEROKSIDA MENGGUNAKAN EKSTRAK
PROTEIN Deinococcus radiodurans DIIMOBILISASI
DENGAN IKAT SILANG GLUTARALDEHID

MUHAMMAD RIDHO AFIFI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

iii

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Biosensor Superoksida
Menggunakan Ekstrak Protein Deinococcus radiodurans Diimobilisasi dengan
Ikat Silang Glutaraldehid adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi

mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Februari 2016
Muhammad Ridho Afifi
NIM G451130321

RINGKASAN
MUHAMMAD RIDHO AFIFI.Biosensor SuperoksidaMenggunakan
Ekstrak Protein Deinococcus radiodurans Diimobilisasi Dengan Ikat Silang
Glutaraldehid. Dibimbing oleh DYAH ISWANTINI, NOVIK NURHIDAYAT
dan DEDEN SAPRUDIN.
Antioksidan sangat diperlukan oleh tubuh manusia, pada dasarnya tubuh
manusia memiliki antioksidan endogen yaitu enzim katalase, peroksidase,
superoksida dismutase (SOD), dan glutationa S-transferase. Namun jika terjadi
paparan radikal bebas yang berlebih ke dalam tubuh, diperlukan antioksidan
eksogen yang biasanya bersumber dari makanan dan bahan alam. Kapasitas
antioksidan adalah kemampuan suatu bahan dalam mengukur senyawa penangkal

radikal bebas. Pengukuran antioksidan menggunakan metode spektrofotometri
terkendala dalam preparasi sampel dan memerlukan waktu pengukuran yang lama.
Oleh karena itu, dibutuhkan metode yang lebih mudah, akurat, cepat, dan sensitif
dalam penentuan kapasitas antioksidan seperti metode biosensor.
Biosensor superoksida menggunakan ekstrak protein dari mikroba
Deinococcus radiodurans yang diimobilisasi pada matriks karboksimetilselulosagelatin-zeolit diikat silang glutaraldehid (CMC-G-Z-glutaraldehid) merupakan
salah satu cara untuk mengoptimumkan kinerja biosensor Superoksida sehingga
dapat digunakan secara efektif. Tujuan penelitian ini adalah menghasilkan
stabilitas yang lama.
Ekstrak protein dilisis dari D. radiodurans menggunakan metode
ultrasonikasi yang menghasilkan konsentrasi protein 1774.89 ppm. Proses
penghancuran dinding sel dibantu dengan penyinaran sinar UV yang berfungsi
untuk inisiasi protein SOD sehingga mampu ekstrak protein keluar dari inti sel.
Ekstrak protein diimobilisasi pada elektroda pasta karbon dengan CMC-gelatinzeolit diikat silang glutaraldehid. Biosensor ini dilakukan optimasi dengan variasi
konsentrasi zeolit, konsentrasi glutaraldehid, konsentrasi ekstrak protein dan pH
menggunakan software Minitab metode respon surface methode.
Hasil dari optimasi biosensor yang diperoleh yaitu konsentrasi zeolit 5
mg/ml, konsentrasi glutaraldehid 0.005M, konsentrasi ekstrak protein 1075 ppm
dan pH 7. Hasil optimasi tersebut digunakan untuk mengukur kinerja analitik dari
biosensor yang meliputi stabilitas, limit deteksi, limit kuantisasi dan linieritas.

Pengujian stabilitas elektroda dengan ikat silang glutaraldehidmenghasilkan waktu
stabilitas selama 24 jam dengan sisa aktivitas 67.74%, sedangkan elektroda tanpa
ikat silang glutaraldehid bertahan selama 12 jam dengan sisa aktivitas 65.66%.
Pengujian limit deteksi dengan elektroda pada CMC-G-Z-glutaraldehid dihasilkan
sebesar 77.84 M, dan limit kuantisasi sebesar 259.5 M. Linieritas dihasilkan
rentang pengukuran 0.1-0.8 mM xantina dengan persamaan y = 1.5549x + 0.1617
dan r2 = 0.9905. Penggunaan ekstrak protein dari D. radiodurans dimobilisasi
dalam matriks CMC-G-Z dengan ikat silang oleh glutaraldehid dapat menjadi
biosensor superoksida alternatif untuk pengujian rutin dan dapat dikembangkan
sebagai prototipe.
Kata

kunci

:

D.

radiodurans,

biosensor,

glutaraldehid,

imobilisasi

iii

SUMMARY
MUHAMMAD RIDHO AFIFI.Antioxidant Biosensor Using Deinococcus
radiodurans
Protein
Extract
Immobilized
with
Cross-linked
by
Glutaraldehyde.Supervised
byDYAHISWANTINI,
NOVIKNURHIDAYATandDEDENSAPRUDIN.

Antioxidants areneededby the human body, the humanbody actuallyhasan
endogen antioxidantenzymescatalaseie, peroxidase, superoxidedismutase (SOD),
andglutationS-transferase. But if there ismoreexposure to free radicalsin the body,
which
isnormallyrequiredexogenantioxidantsderived
from
foodandnaturalingredients. Antioxidant capacityisthe ability of amaterialto
measurefree
radical
antidotecompound.
Measurementof
antioxidantsusingspectrophotometricmethodshaveconstraints
insamples
preparationandtakemeasurementsof time.Therefore, it takes an easier method,
accurate, rapid, andsensitiveto determination ofantioxidant capacitysuch
asbiosensormethods.
AntioxidantsbiosensorusingproteinextractsofmicrobesDeinococcusradiodura
nsimmobilizedon a matrix ofcarboxymethylcellulose-gelatin-zeolitecross-linked
by
glutaraldehyde

is
one
wayto
optimize
theperformance
ofbiosensorsantioxidantsthatcan be used effectively. The purposeof thisresearchis
to producea longstabilityand performanceofthe biosensorfor the betterasthe
detection limit, quantitylimitandlinearity.
Proteins was extracted from D. radiodurans by ultrasonic method that
produce a protein concentration of 1774.89 ppm. Extract proteins was
immobilized on carbon paste electrodes (CPE) with CMC-gelatin-zeolites by
crosslinked glutaraldehyde. This biosensor optimization was performed by
variation the concentration of zeolite, glutaraldehyde, protein extracts and pH by
Minitab software method of response surface method.
The resultsofthe optimizationbiosensor wasobtained by theconcentration
ofzeolite5mg/ml, glutaraldehydeconcentration0.005M, the concentration ofthe
proteinextracts of1075ppmanda pH of7. Theresults ofsuch optimizationis usedto
measure theanalytical performanceof thebiosensorwhich includestability, limitof
detection, limit kuatisasiandlinearity. Testing the stability of the electrode with
glutaraldehyde resulted in a 24 hour period of stability during the rest of the

activity of 67.74%, while the electrodes without glutaraldehyde to survive for 12
hours with the remaining 65.66% of activity. Testing the limits of detection with
electrodes on the CMC-G-Z-glutaraldehyde generated at 77.84 M, and the limit
of quantitation of 259.5 M. Measurement linearity resulted range 0.1-0.8 mM
xanthine with the equation y = 1.5549x + r2 = 0.1617 and 0.9905.The use of
protein extracts of D. radiodurans were mobilized in a matrix CMC-G-Z with
crosslinked by glutaraldehyde can be a alternative antioxidant biosensor for
routine assay and can be developed as a prototype.
Keywords : D. radiodurans, biosensor, glutaraldehyde, prototype

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB

v

Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

i

BIOSENSOR SUPEROKSIDA MENGGUNAKAN EKSTRAK
PROTEIN Deinococcus radiodurans DIIMOBILISASI
DENGAN IKAT SILANG GLUTARALDEHID

MUHAMMAD RIDHO AFIFI

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Kimia

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR

2016

Penguji Luar Komisi Pembimbingpada Ujian Tesis:Dr Akhiruddin Maddu

iii

Judul Tesis :Biosensor Superoksida MenggunakanEkstrak Protein Deinococcus
radiodurans Diimobilisasi dengan Ikat Silang Glutaraldehid
Nama
: Muhammad Ridho Afifi
NIM
: G451130321
Disetujui Oleh
Komisi Pembimbing

Prof Dr Dyah IswantiniP, MScAgr
Ketua

Dr Novik Nurhidayat
Anggota

Dr Deden Saprudin, MSi
Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi
Kimia

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof Dr Dyah Iswantini P, MScAgr

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian: 29 Januari 2016

Tanggal Lulus:

v

PRAKATA
Bismillahirrahmaanirrahiimi
Alhamdulillah puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu
wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan.
Shalawat serta salam tak lupa selalu tercurah kepada junjungan Nabi besar
Muhammad SAW, sahabat, keluarga dan pengikutnya hingga akhir zaman.
Ucapan terima kasih yang tak ternilai kepada Ayahanda dan Ibunda tercinta, Drs
Erwan Zaini dan Dra Emi Suryani, serta saudara saudari tercinta Rifa’atul
Mahmudah dan Hafidz Surya Afifi yang dengan kesabaran dan keikhlasan telah
memberikan dorongan moral, material dan doa yang tulus. Selain itu, penulis juga
menyampaikan rasa terima kasih yang dalam kepada Istri tercinta Zahratul Aini
S.Si.
Penulis mengucapkan terima kasih yang tulus kepada Prof Dr Dyah
Iswantini P M.Agr selaku Ketua Komisi Pembimbing, Dr Novik Nurhidayat dan
Dr Deden Saprudin M.Si selaku Anggota Komisi Pembimbing, atas segala
curahan waktu, bimbingan, arahan, serta dorongan moral kepada penulis. Tidak
lupa ucapan terima kasih kepada staf Laboratorium Bersama IPB, Laboratorium
Kimia Fisik IPB dan Laboratorium Genetik Puslit Biologi LIPI serta teman-teman
di Departemen Kimia IPB atas bantuan yang diberikan kepada penulis dalam
menyelesaikan tesis ini
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Ferbuari 2016
Muhammad Ridho Afifi

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

vi

DAFTAR GAMBAR

vi

DAFTAR LAMPIRAN

vi

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian

1
1
2
2
3
3

METODE
Bahan
Alat
Prosedur Analisis Data

3
3
3
4

HASIL DAN PEMBAHASAN
Pembuatan Nanopartikel Zeolit
Penumbuhan Sel D. radiodurans dan Lisis Ekstrak Protein
Pemilihan Elektroda Pasta Karbon (EPK)
Imobilisasi Ekstrak Protein D. radiodurans
Optimasi Biosensor
Stabilitas Elektroda Biosensor
Penentuan Parameter Analitik Elektroda

7
7
7
8
9
10
13
14

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran

16
16
16

DAFTAR PUSTAKA

16

LAMPIRAN

19

RIWAYAT HIDUP

24

vii

DAFTAR TABEL
1.

V
ariasi perlakuan ekstrak D. radiodurans

4

2.

A
nalisis pengaruh faktor terhadap arus

11

erbandingan parameter analitik biosensor bebasis mikroba

P
15

3.

DAFTAR GAMBAR
1.
kema imobilisasi ekstrak protein D. radiodurans
2.
erlakuan induksi penyinaran UV dan waktu sonikasi terhadap kosentrasi
protein
3.
oltamogram siklik pada pengukuran larutan K3[Fe(CN)6] 1mM
4.
oltamogram aktivitas ekstrak protein D. radiodurans
5.
a) Pengaruh konsentrasi glutaraldehid dengan konsentrasi protein,(b)
pengaruh pH dengan konsentrasi protein,(c) pengaruh konsentrasi zeolit
dengan konsentrasi protein terhadap perubahan arus puncak

S
5
P
8
V
9
V
10
(
12

6.

S
tabilitas elektrodabiosensor

7.
ubungan aktivitas ekstrak protein dengan konsentrasi xantina
8.
inieritas ekstrak protein terimobilisasi dan tidak imobilisasi

13
H
14
L
15

DAFTAR LAMPIRAN
1.

B
agan alir penelitian

19

asil pengujian PSA terhadap zaolit

20

2.

H

3.

H
asil pengukuran OD pada penumbuhan D. radiodurans dan konsentrasi
ekstrak protein dari D. radiodurans dengan spektrofotometer

20

ptimasi variabel bebas dari biosensor

21

asil stabilitas biosensor

22

4.

O

5.

H

6.

H
asil uji hubungan konsentrasi substrat xantina dengan aktivitas ekstrak
protein

22

erhitungan limit deteksi dan limit kuantisasi

23

7.

P

ix

1

PENDAHULUAN
Latar Belakang

Tubuh manusia memiliki antioksidan endogen yaitu enzim katalase,
peroksidase, superoksida dismutase (SOD), dan glutationa S-transferase. Namun
jika terjadi paparan radikal bebas yang berlebih ke dalam tubuh, diperlukan
antioksidan eksogen yang biasanya bersumber dari makanan. Oleh karena itu,
sangat dibutuhkan suatu metode pengukuran yang tepat untuk mengukur sifatsifat antioksidan pada berbagai jenis sampel baik antioksidan alami maupun
sintesis. Kapasitas antioksidan adalah kemampuan suatu bahan dalam mengukur
senyawa penangkal radikal bebas. Metode umum untuk penentuan kapasitas
metode spektrofotometri (Khalaf et al.2008). Pengukuran antioksidan
menggunakan metode spektrofotometri masih terkendala dalam preparasi sampel
dan memerlukan waktu yang lama. Oleh karena itu, dibutuhkan metode yang lebih
mudah, akurat, cepat, dan sensitif dalam penentuan kapasitas antioksidan seperti
metode biosensor.
Salah satu metode biosensor antioksidan menggunakan enzim superoksida
dismutase (SOD) yang memiliki korelasi yang baik seperti dengan metode
spektrofotometri dan spektrofluorimetri dalam menentukan kapasitas
antioksidan(Campanella 2004). Penggunaan enzim lebih banyak diaplikasikan
dalam biosensor karena spesifik aktifitas dan sensitif terhadap analit (Canbay et al.
2015). Salah satu kelemahan penggunaan enzim yaitu sangat mahal untuk
pengujian rutin (Byfield & Abuknesha 1994; Akyilmaz & Dinçkaya 2005). Oleh
karena itu penggunaan mikroba yang menghasilkan enzim tersebut adalah salah
satu solusi untuk menekan biaya karena tidak memerlukan pemurnian enzim
(Byfield & Abuknesha 1994). Mikroba menjadi alternatif dalam fabrikasi karena
dapat menghasilkan produk dengan jumlah yang besar melalui kultur sel (Byfield
dan Abuknesha 1994).
Salah satu mikroba di Indonesia yang berpotensi penghasil SOD yaitu
Deinococcus radiodurans (Iswantini et al. 2013). Mikroba ini tahan terhadap
banyak agen yang dapat menyebabkan mutasi pada DNA, seperti radiasi ion, sinar
ultraviolet, dan banyak lainnya. Protein D. radiodurans yang diimobilisasi pada
elektroda pasta karbon menghasilkan aktivitas SOD lebih tinggi daripada enzim
murni SOD. Weniarti (2011) melaporkan bahwa penggunaan nanokomposit zeolit
sebagai media imobilisasi protein D. radiodurans memberikan afinitas protein D.
radiodurans lebih rendah daripada enzim SOD sehingga tidak mudah jenuh oleh
substrat. Selain D. radiodurans, mikroba yang dapat digunakan sebagai biosensor
antioksidan yaitu E. coli. Namun stabilitas E. coli masih rendah jika dibandingkan
dengan D. radiodurans dalam biosensor antioksidan (Iswantini et al.2013).
Penelitian biosensor yang berbasis D. radiodurans secara berkala dilakukan
untuk mengoptimalkan aktivitas dan stabilitas yang lebih baik. Mateo et al. (2007)
menyatakan bahwa metode yang dapat digunakan untuk menjaga stabilitas enzim
adalah dengan melakukan imobilisasi pada nanomaterial. Penggunaan zeolit

2

dalam matriks imobilisasi enzim biosensor telah banyak dilakukan karena
beberapa sifat dari zeolit yang mendukung seperti ukuran selektivitas, muatan,
interaksi hidrofobik/hidrofilik, dan kemampuan bertahan pada suhu tinggi, oleh
karena itu digunakan zeolit untuk lingkungan mikro enzim (Carvalho et al. 2007).
Zeolit alam banyak terdapat di Indonesia salah satunya zeolit bayah, yang sudah
banyak diaplikasikan sebagai absorben dalam beberapa penelitian. Zeolit bayah
mempunyai kandungan terbesar yaitu klipnotiloit dan mordenit. Disamping dari
kemampuan zeolit alam sebagai matriks imobilisasi, kelimpahan, mudah
diperoleh dan biaya murah dari zeolit alam menjadi pendukung dalam penelitian
ini untuk matriks imobilisasi. Penggunaan zeolit bayah juga sebagai biodiversitas
Indonesia sangat mendukung untuk diaplikasikan lebih luas dalam penelitianpenelitian.
Nanopartikel zeolit sebagai pengimobilisasi protein D. radiodurans yang
dilakukan oleh Wijayanti (2014) menghasilkan limit deteksi yang rendah dan
sensitivitas yang tinggi. Akan tetapi, stabilitas dari elektroda berbasis protein D.
radiodurans masih rendah sehingga perlu ditingkatkan dengan metode
penggabungan nanopartikel zeolit dan material lain sebagai pengimobilisasi
protein D. radiodurans. Kocabay et al. (2012) melakukan penelitian dengan
matriks imobilisasi menggunakan karboksimetil selulosa (CMC)-gelatinglutaradehid untuk enzim SOD menghasilkan waktu stabilitas yang lama.
Stabilitas yang bagus dihasilkan dari penelitian Kocabay karena enzim SOD di
ikat silang menggunakan glutaraldehida dan polimer (mengandung gelatin)
sehingga enzim SOD akan terimobilisasi lebih kuat. Pada penelitian ini
menggunakan polimer gelatin yang di ikat silang oleh glutaraldehida untuk
protein D.radiodurans sehingga menghasilkan stabilitas yang lebih bagus.
Keterbaruan biosensor untuk pengujian antioksidan berdasarkan D. radiodurans
diimobilisasi dengan ikat silang glutaraldehid mampu mengoptimalkan kinerja
biosensor terutama stabilitas sehingga dapat digunakan sebagai alat untuk
pengujian rutin kapasitas antioksidan yang murah dan dapat dikembangkan
sebagai prototipe.
Perumusan Masalah
Peningkatan stabilitas protein D.radiodurans pada matriks nanopartikel
zeolit hanya 8 jam dengan aktivitas 58.93% (Wijayanti 2014). Penggunaan
matriksCMC-gelatin-zeolit sebagai pengimobilisasi ekstrak protein D.
radiodurans dengan agen ikat silang glutaraldehid, apakah mampu meningkatkan
kinerja dan kestabilan biosensor berdasarkan ekstrak protein dari bakteri D.
radiodurans.
Tujuan Penelitian
Menentukan kapasitas biosensor berbasis proteinD. radioduransyang
diimobilisasi pada CMC-gelatin-zeolitikat silang glutaraldehid berdasarkan sifat
analitiknya yaitu stabilitas, sensitivitas, dan limit deteksi pengukuran

3

Manfaat Penelitian
Penelitian ini menggunakan fase padat yang berupa CMC-gelatin-zeolit
sebagai fase padat penyangga glutaraldehid sebagi agen ikat silang untuk ekstrak
protein D. radiodurans yang diharapkan dapat meningkatkan kinerja analitik
dalam biosensor. Pada berbagai aspek seperti konsenstrasi protein dari D.
radiodurans, stabilitas, linieritas, limit deteksi dan limit kuantisasi untuk dapat
membuat prototipe dari suatu model biosensor.
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian terdiri atas beberapa tahap yaitu pembuatan elektroda pasta,
aktivasi zeolit dan pembuatan nanopartikel, penumbuhan dan ekstraksi protein
dari D. radiodurans, imobilisasi protein dengan ikat silang glutaraldehiddan
pengukuran elektrokimia seperti stabilitas, linieritas, limit deteksi dan limit
kuantisasi.

2

METODE

PenelitiandilaksanakandaribulanOktober2014sampaidenganAgustus2015d
i Laboratorium Genetik Puslit Biologi LIPI, Laboratorium Kimia Fisikdan
Laboratorium Bersama Departemen Kimia Fakultas Pertanian IPB.
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sel bakteri D.
radiodurans, zeolit alam dari Bayah, gelatin, karboksimetilselulosa, glutaraldehid,
media cair LB untuk pertumbuhan bakteri D. radiodurans, grafit, ferosen,
parafin cair, dimetil sulfoksida (DMSO), membran dialisis, xantina oksidase,
xantina dan bufer fosfat.
Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah eDAQ Potensiostat–
Galvanostat yang dilengkapi perangkat lunak Echem v2.1.0 dengan sistem 3
elektroda (elektroda Ag/AgCl sebagai elektroda pembanding, elektroda pasta
karbon sebagai elektroda kerja, dan elektroda platina sebagai elektroda bantu),
Scanning Electron Microscope, Particle Size Analyzer, Planetary Ball Mill,
vakum, laminar air flow, inkubator, High Speed Refrigated Centrifuge KUBOTA
6500, autoklaf, Ultrasonic Homogenizer UH-150, Spektroscopy UV-Pharmaspec
1700, pipet mikro, batang gelas, sel elektrokimia dan alat-alat gelas lainnya.

4

Prosedur Analisis Data
Pembuatan Elektroda Pasta Karbon (Trivadila 2011)
Elektroda pasta karbon dibuat dengan cara melarutkan 3 mg ferosena dalam
1 mL DMSO dan ke dalam larutan tersebut ditambahkan 100 mg grafit.
Campuran didiamkan selama 2 jam. Setelah 2 jam, pelarut dikeringkan dalam
oven suhu 105°C sampai kering. Kemudian campurkan antara grafit dan parafin
cair dengan perbandingan 2:1hingga membentuk pasta. Kemudian pasta karbon
dimasukkan ke dalam badan elektroda hingga memadat sampai ke permukaan
kaca. Permukaan kaca elektroda dihaluskan dan dibersihkan dengan ampelas dan
kertas minyak.
Pembuatan Nanopartikel Zeolit (Arif 2011)
Sebanyak 50 gram zeolit Bayah diaktivasi dengan menambahkan 250
mL HCl 3 M ke dalam gelas piala dan diaduk selama 1 jam. Zeolit
disaring, dan dicuci dengan akuades sampai pH netral. Setelah pH netral
dan bebas klorin, zeolit dikeringkan pada suhu 300 oC selama 3 jam. Zeolit
yang telah dikondisikan kemudian digerus dengan alat planetary ball mill.
Penumbuhan Sel D. radiodurans dan Lisis Protein (Chou dan Tan 1991)
D. radiodurans dari kultur murni ditumbuhkan pada 25 mL media LB cair.
Sebelum penumbuhan diberi perlakukan variasi penyinaran UV selama 0, 3, dan 5
menit. Bakteri diinkubasi pada 30 oC dan diukur pada panjang gelombang 600 nm
sampai nilai OD (Optical Density) 0.5 – 0.6. Selanjutnya sel dipanen dengan
sentrifugasi 7000 x G, 4 oC selama 10 menit untuk memisahkan sel mikrob
dengan media. Selanjutnya sel (pelet) dicuci sebanyak 3 kali ulangan dengan
menggunakan bufer fosfat pH 7.0 dan disuspensikan kembali dalam larutan bufer
fosfat pH 7.0. Suspensi sel diultrasonikasi pada denyut 80% untuk
menghancurkan dinding sel mikrob dengan variasi waktu selama 0, 2, dan 4
menit. Selama ultrasonikasi suspensi sel didinginkan dalam es. Sel disentrifugasi
10.000 x G, 4 oC selama 30 menit untuk memisahkan supernatan dengan pellet.
Ekstrak kasar (crude extract) protein berada di supernatant dan disimpan dalam
suhu 4 °C
Tabel 1Variasi perlakuan ekstrak D. radiodurans
No
1
2
3
4
5
6
7
8
9

Waktu Penyinaran UV (Menit) Waktu Ultrasonikasi (Menit)
0
0
0
2
0
4
3
0
3
2
3
4
5
0
5
2
5
4

5

Ekstrak sitoplasma hasil dialisis selanjutnya diukur nilai serapannya pada
panjang gelombang 260 dan 280 nm untuk mengetahui konsentrasi protein yang
mengandung protein enzim SOD. Perhitungan ekstrak protein menggunakan
persamaan sebagai berikut :
Kosentrasi protein (mg/mL) = 1.55D280 – 0.76D260
Imobilisasi Ekstrak Protein D. radiodurans (Modifikasi Kocabay et al. 2012;
Emregul et al. 2013)
Disiapkan campuran polimer (CMC-gelatin) dengan perbandingan (0,1 w/w)
dalam 10 ml buffer fosfat. Didispersikan 50-100 mg nanopartikel zeolit dalam
larutan polimer tersebut. Dicampur 30 µL CMC-G-Z, 60 µL protein D.
radiodurans (dalam buffer fosfat), 10µL glutaraldehid 0.005 M. Didiamkan
hingga pelarutnya menguap. Selanjutnya permukaan elektroda pasta karbon
dilapisi dengan membran dialisis, ditutup dengan jaring nilon, dan diikat
dengan parafilm.
+ Zeolit
02516797442516817922516807682516838402516828162516869122516
NH2 NH2 NH2
NH2 NH2 NH2
85888251684864
Gelatin + CMC

+
Glutaraldehid
CHO

CHO

CHO

C

C

C

NH2

NH2

NH2

+Protein D.
radiodurans

CHO

CHO

CHO

C

C

C

NH2

NH2

NH2

Gambar 1Skema Imobilisasi Ekstrak Protein D. radiodurans(modifikasiEmregulet
al.2013)
Pengukuran Elektrokimia
Pengukuran elektrokimia dilakukan dengan menggunakan seperangkat alat
potensiostat/galvanostat eDAQ dan komputer beserta perangkat lunak pengolah
data Echem v2.1.0. Elektroda yang digunakan yaitu elektroda Ag/AgCl, platina
dan elektroda pasta karbon berturut-turut sebagai elektroda standar, pembantu dan
kerja.

6

Parameter pengurukuran diatur sebagai berikut :
Mode : Cyclic
Initial E : 0 mV
Final E : 0 mV
Rate
: 200 mV/s
Step W : 12.5 ms
Upper E : 1000 mV
Lower E : 0 mV
Sebanyak 1.9 mL larutan bufer fosfat 0.05 M pH 7 ditambahkan ke dalam
sel elektrokimia dan puncak arus anoda yang terbentuk diamati sebagai blanko.
Selanjutnya ditambahkan 100 L larutan Xantina Oksidase 0.1 U/mL dan substrat
xantina 2.1 mM sebanyak 1 mL ke dalam sel elektrokimia. Setelah penambahan
setiap zat ke dalam larutan, perubahan arus yang terjadi diamati hingga mencapai
arus keadaan tunak secara runut. Sehingga akan terbentuk reaksi seperti dibawah :
Xantina + H2O + O2XOD Asam urat + 2H+ + O2.2H+ + O2.- SODH2O2 + O2
Optimasi Biosensor
Optimasi dilakukan dengan kombinasi pada variabel pH (7-9), konsentrasi
ekstrak protein (500-1500 g/ml), konsentrasi glutaraldehid (0-0.010M),
konsentrasi zeolit (5-10 mg/ml). Metode yang digunakan untuk optimasi
biosensor berbasis ekstrak protein dari D. radiodurans adalah Response Surface
Methode dengan memasukkan kombinasi factor-faktor peubah bebas pada suatu
perangkat lunak statistika MINITAB. Selanjutnya kombinasi yang telah
dimasukkan akan diolah sehingga dihasilkan beberapa kombinasi faktor peubas
bebas dan percobaan dilakukan sesuai dengan kombinasi faktor-faktor peubah
bebas seperti pada Lampiran 2.
Penentuan Stabilitas Elektroda (Fadhilah 2013)
Stabilitas elektroda ditentukan dari pengukuran 1 elektroda biosensor
dengan jarak waktu tertentu. Nilai aktivitas yang diperoleh pada pengukuran awal
dianggap 100%. Aktivitas diukur pada setiap waktu tertentu dengan aktivitas yang
tersisa.

Pengujian Parameter Analitik Elektroda
Kinerja elektroda biosensor diuji untuk EPK-CMC-G-Z-protein dan EPKCMC-G-Z-glutaraldehid-protein. Kinerja yang ditentukan adalah linearitas, limit
deteksi (LOD) dan limit kuantisasi (LOQ) (Harmita 2004).

7

Keterangan :
Sb
: Simpangan baku dari respon analitik
S
: Slope dari persamaan garis

3

HASIL DAN PEMBAHASAN
Pembuatan Nanopartikel Zeolit

Penelitian inimenggunakan zeolit alam dari Bayah yang berupa tipe zeolit
mordenit dan klinoptilolit dengan rasio Si:Al yaitu 5:1.Zeolit Bayah merupakan
zeolit alam yang masih terdapat banyak pengotor, sehingga perlu dilakukan
pengondisian untuk menghilangkan pengotor. Salah satunya dengan perlakuan
aktivasi menggunakan asam HCl 3 M. Proses aktivasi dengan menggunakan asam
dealuminasi dan dekationisasi yaitu keluarnya Al dan ion-ion anorganik dalam
zeolit sehingga akan bertambah luas permukaan zeolit karena berkurangnya ionion anorganik yang menutupi pori, selain itu dapat meningkatkan perbandingan
rasio Si:Al (Ertan dan Ozkan 2005) seperti pada reaksi di bawah.
Zeolit + HCl(aq)
zeolit + AlCl3(aq)
Selanjutnya dilakukan pembuatan nanopartikel zeolit dengan cara top down
dengan penggilingan menggunakan alat planetary ball milling (PBM) secara
basah menggunakan metanol dan ammonium serium sulfat 5% sebagai grinding
agent. Hasil yang diperoleh dari ukuran zeolit dengan ukuran rerata 386.7 nm.
Hasil ini lebih besar dari penelitian Wijayanti (2014) yang memperoleh ukuran
rerata 97.5 nm. Setelah proses penggilingan harus diperhatikan bahwa partikelpartikel kecil tersebut dapat teraglomerasi sehingga perlu dilakukan ultransonikasi
dan segera mungkin untuk dilakukan pengukuran ukuran partikel (dengan PSA).
Ukuran nanopartikel yang diperoleh cukup besar disebabkan partikel-partikel
setelah pengeringan mudah teraglomerasi sehingga ukurannya semakin besar
(Abdullah 2008).Penggilingan menggunakan PBM dapat menghasilkan panas,
panas tersebut dapat merusak struktur zeolit, sehingga perlu dilakukan
karakterisasi kristanilitas dan struktur zeolit.
Penumbuhan Sel D. radiodurans dan Lisis Ekstrak Protein
D. radiodurans ditumbuhkan dalam media LB cair selama ± 18 jam dengan
bantuan shaker (aerob) pada suhu ruang. Dilakukan beberapa variasi perlakuan
induksi penyinaran UV pada saat penumbuhan sel D. radiodurans dan waktu
ultrasonikasi untuk melisis sel sehingga diperoleh ekstrak protein. Pada Gambar 2
menjelaskan bahwa waktu induksi penyinaran UV dalam mempengaruhi
konsentrasi protein diperoleh yang optimum yaitu 3 menit. D.

8

radioduransmerupakan mikroba yang mampu bertahan dalam lingkungan ekstrim
seperti sinar radiasi UV, pemanasan, pengeringan dehidrasi dan lingkungan asam.
Gen eksogen (irrE) yang terdapat dalam D. radiodurans yang bertanggung jawab
pada regulasi ekspresi gen recA dan pprA yaitu gen yang memiliki kemampuan
bertahan dalam kondisi lingkungan ekstrim (Earl et al. 2002). D. radiophilus yang
juga dapat bertahan dalam lingkungan ekstrim dan menghasilkan Mn-SOD. MnSOD yang dihasilkan oleh D. radiophilus akan meningkat seiring dengan
meningkatnya tekanan lingkungan seperti penyinaran UV, namun apabila radiasi
sinar UV terlalu berlebih maka Mn-SOD yang dihasilkan yang menurun (Yun dan
Lee 2003). Oleh karena itu produksi Mn-SOD dalam sel bakteri D. radiodurans
dan juga aktivitasnya dapat diinduksi dengan lingkungan yang ekstrim seperti
induksi penyinaran UV. Pada induksi penyinaran UV selama 5 menit dapat
menghancurkan sel D. radiodurans sehingga pertumbuhan sel akan menurun,
dikarenakan penyinaran UV yang berlebihan.

Gambar 2 Perlakuan induksi penyinaran UV dan waktu sonikasi terhadap
kosentrasi protein
Waktu ultrasonikasi untuk memperoleh protein dari sel yang optimum, yaitu
2 menit dengan konsentrasi protein 1774.89 ppm. Pada perlakuan waktu
ultrasonikasi 0 menit tidak diperoleh protein yang tinggi dikarenakan protein MnSOD merupakan enzim intraselular sehingga perlu menggunakan ultrasonikasi.
Sedangkan pada perlakuan waktu ultrasonikasi 4 menit konsentrasi protein
menjadi turun, hal ini disebabkan protein dalam sel dapat terdenaturasi, sehingga
konsentrasi dari ekstrak protein menjadi turun. Umumnya sel bakteri diekstrak
dengan metode ultrasonikasi selama 30-60 detik, sedangkan untuk jamur (dinding
sel tebal) selama 2-10 menit (Ghosh R 2006). Dinding sel D. radiodurans
memiliki dinding sel yang tebal yang menyebabkan waktu ultasonikasi lebih lama
(Trivadila 2011).
Pemilihan Elektroda Pasta Karbon (EPK)
Elektroda kerja menggunakan elektroda pasta karbon (EPK) termodifikasi
ferosen dibuat dengan campuran komposisi 55 mg grafit, 35µL paraffin dan

9

ferosen, kemudia elektroda dikarakterisasi respon arusnya dengan menggunakan
K3[Fe(CN)6] 1mM dengan bantuan elektroda pembanding Ag/AgClyang memiliki
nilai potensial yang telah diketahui konstan dan elektroda pendukung Pt/TiO yang
berfungsi untuk memperkecil kesalahan dari tahanan sel dalam mengontrol
potensial elektroda kerja. Elektoda Pt/TiO tersebut digunakan untuk
meminimalkan kesalahan yang diakibatkan oleh adanya lapisan produk reaksi
yang ada pada elektroda. Lapisan ini akan mengakibatkan adanya hambatan
tambahan pada sel elektrokimia. Sehingga elektoda standard dan elektroda kerja
dapat melakukan pengukuran dengan hambatan sel yang minimal (Ekananda
2007).
Elektroda pasta karbon yang mempunyai respon arus yang konstan dan
terbaik yang akan dipilih untuk pengukuran selanjutnya menggunakan ekstrak
protein. Hasil pengamatan respon arus sebesar ± 6 µA dengan tegangan 0.3–0.4V,
penelitian yang dilakukan Weniarti (2011) menggunakan EPK menunjukkan
tegangan yang sama yaitu 0.3V. Pengukuran elektroda dengan K3[Fe(CN)6]
menggunakan sistem voltametri yang melibatkan reaksi reduksi dan oksidasi
seperti reaksi dibawah ini :
Reaksi reduksi [Fe(CN)6]3- + eReaksi oksidasi [Fe(CN)6]4-

[Fe(CN)6]4[Fe(CN)6]3- + e-

6 ,0 u
4 ,0 u
2 ,0 u

I (µA)

0 ,0
-2 ,0 u
-4 ,0 u
-6 ,0 u
-8 ,0 u
0 ,0

0 ,2

0 ,4

0 ,6

0 ,8

1 ,0

E (V )

Gambar 3Voltamogram siklik pada pengukuran larutan K3[Fe(CN)6] 1mM
Imobilisasi Ekstrak Protein D. radiodurans
Imobilisasi pada permukaan penyangga padat bertujuan untuk menjaga
aktivitas katalitiknya. Salah satu metode imobilisasi yaitu pada fase padat (CMCG-Z) dengan ikat silang menggunakan glutaraldehid.
Imobilisasi ekstrak protein dengan menggunakan CMC-G-Z dan
glutaraldehid bertujuan untuk meningkatkan stabilitas dan aktivitas dari ekstrak
protein. Proses imobilisasi yang dilakukan yaitu dengan ikat silang antara
glutaraldehid dengan ekstrak protein pada fase padat CMC-G-Z. Setelah proses
imobilisai elektroda pasta karbon dilapisi oleh membran dialisis yang berfungsi
sebagai perantara difusi substrat masuk menuju ekstrak protein dan untuk lebih
menjaga ekstrak protein keluar dari sistem imobilisasi.

10

Membran dialisis yang digunakan adalah Thermo ScienctificSnake Skin
Dialysis Tubing, 10K MWCO (Molecular Weight Cut Off) sehingga
ekstrakprotein yang mengandung enzim SOD akan tertahan karena memiliki
bobot molekul lebih dari 10 kDa. Namun pori-pori membran dialisis dapat
melewatkan substrat radikal superoksida dan berinteraksi dengan enzim SOD.
Voltamogram dari imobilisasi ekstrak protein dapat dilihat pada Gambar 4.
Aktivitas ekstrak protein dapat diketahui dengan adanya puncak anoda pada
tegangan 0.4V setelah ditambahkan Xantina dan Xantina oksidase pada larutan sel
elektrokimia. Perubahan arus yang lebih tinggi dihasilkan dari imobilisasi ekstrak
protein dengan menggunakan ikat silang glutaraldehid sedangkan tanpa
glutaraldehid dihasilkan arus yang lebih rendah. Peningkatan arus dengan
glutaraldehid dapat menjelaskan bahwa agen ikat silang dapat mengikat ekstrak
protein secara optimal sehingga aktivias dari ekstrak protein untuk bereaksi
dengan substrat lebih tinggi (Kocabay et al. 2012).
20,0u
18,0u
16,0u
14,0u

I (µA)

12,0u
10,0u
8,0u
6,0u
4,0u
2,0u
0,0
-2,0u
-4,0u
0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

E (V)

Gambar 4 Voltamogram aktivitas ekstrak protein D. radiodurans (—) EPKCMC-G-Z-Protein dan (—) EPK-CMC-G-Z-Glutaraldehid-Protein
Optimasi Biosensor
Optimasi dilakukan dengan menggunakan response surface method.
Perlakuan yang diuji terhadap arus yaitu pH, konsentrasi protein, konsentrasi
glutaraldehid, dan konsentrasi zeolit dapat disebut sebagai factor pada Tabel 2.
Tabel 2 menunjukkan hasil optimasi untuk faktor yang berpengaruh secara
signifikan terhadap arus yaitu konsentrasi protein dan pH dengan nilai p < 0.05.
Koefisien yang menunjukkan nilai positif berarti semakin besar nilai faktor akan
semakin besar nilai arus yang dihasilkan. Perlakuan pH dan konsentrasi protein
menunjukkan nilai p < 0.05 yang berarti dapat mempengaruhi nilai arus secara
signifikan, dan nilai koefisien yang negatif yang berarti semakin kecil nilai pH
atau konsentrasi protein dapat menaikkan nilai arus. Sedangkan nilai koefisien

11

glutaraldehid diperoleh positif yang berarti dengan penambahan konsentrasi
glutaraldehid dapat menaikkan nilai arus yang dihasilkan.
Tabel 2Analisis pengaruh faktor terhadap arus
Faktor
Koefisien
Konsentrasi protein
-3.59629
Konsentrasi zeolite
-0.29084
Glutaraldehida
0.04164
pH
-0.89256
R-Sq = 96.85%; R-Sq(pred) = 82.82%; R-Sq(adj) = 93.45%

Nilai p
0.001
0.107
0.813
0.000

Optimasi dilakukan dengan beberapa variasi konsentrasi protein,
konsentrasi glutaraldehid, konsentrasi zeolit dan pH menggunakan response
surface method pada software MINITAB 16.Optimasi diuji terhadap substrat
xantina 0.7 mM. Pengaruh konsenstrasi glutaradehid sebagai agen pengikat silang
dengan konsentrasi 0, 0.005 dan 0.01M pada Gambar 5(a) menghasilkan kondisi
optimum yaitu 0.005 M. Ketika konsentrasi glutaraldehid lebih tinggi maka akan
terjadi pengurangan arus karena akan terjadi pengikatan terhadap sisi aktif pada
ekstrak protein menyebabkan reaksi dengan substrat tidak terbentuk, dan pori-pori
permukaan elektroda akan menjadi lebih rapat yang dapat menyebabkan difusi
substrat lebih sulit. Peningkatan konsentrasi glutaradehid menyebabkan deaktivasi
dari molekul enzim dan bentuk gel akan rapat karena kelebihan agen pengikat
silang (Kocabay et al 2012, Emregul et al 2013). Glutaraldehid juga akan
membentuk steric hindrance menyebabkan masalah pada difusi substrat
(Akyilmaz & Dinçkaya 2005). Pada saat kosentrasi glutaraldehida lebih kecil pada
sistem imobilisasi, ektrak protein hanya akan terjerap ke dalam fase pada polimer
CMC-gelatin-zeolit, penjerapan ini bersifat fisik sehingga kondisi dari ekstrak
protein menghasilkan arus lebih kecil. Pendekatan dengan enzim murni SOD,
ekstrak protein yang digunakan menyerupai kondisi enzim murni walaupun
ekstrak protein yang digunakan masih banyak pengotor atau protein-protein lainya.
Variabel optimasi pH dimulai dari 7-9 yang mengahasilkan pH optimum
yaitu 7 dengan konsentrasi protein berkisar 1075 µg/ml pada Gambar 5(b).
Kondisi pH optimum sangat penting dikarenakan enzim sensitif terhadap pH.
Hasil pengujian Wijayanti (2014) menggunakan ekstrak protein D.radiodurans
yang diimobilisasi pada nanopartikel zeolit menghasilkan pH optimum 9.
Perbedaan pH optimum sangat dipengaruhi oleh factor imobilisasi, matriks
imobilisasi mempengaruhi dari sisi aktif enzim berubah posisi. Enzim murni SOD
yang diimobilisasi pada CMC-gelatin dengan ikat silang glutaraldehid
menghasilkan kondisi pH optimum 7 (Kocabay et al 2012).
Pada pengaruh konstrasi zeolit dihasilkan kondisi optimum yaitu pada
konsentrasi 5 mg/ml ditunjukkan pada Gambar 5(c), hal ini dikarenakan zeolit
yang ditambahkan masih belum berbentuk nanopartikel sehingga sulit untuk
membentuk sistem koloid dan keseragaman zeolit pada sistem menjadi lebih tidak
seragam. Namun zeolit yang berukuran nanopartikel sebagai pengimobilisasi
ekstrak protein D. radiorans dapat meningkatkan arus (Wijayanti 2014). Zeolit
sudah banyak digunakan sebagai matriks dalam sistem imobilisasi enzim, karena
zeolit mampu meningkatkan sifat katalitik dari enzim berdasarkan interaksi

12

hidrofobik atau hidrofilik, elektrostatik dan ikatan hidrogen. Kemampuan zeolit
dalam meningkatkan respon biosensor dipengaruhi oleh ratio Si/Al. Kirdeciler et
al. (2011) telah melakukan penelitian menggunakan zeolit sintetik sebagai matriks
imobilisasi dalam biosensor urea, pengaruh ratio Si/Al dapat mengubah respon
biosensor yaitu semakin tinggi ratio Si/Al maka akan semakin tinggi respon dari
biosensor.
Berdasarkan Gambar 5. pada setiap kontur yang menunjukkan konsentrasi
optimum untuk ekstrak protein D. radiodurans yaitu 1075 µg/ml. Penjelasan yang
dapat diusulkan pada hasil ini bahwa semakin tinggi konsentrasi ekstrak protein
maka keadaan enzim akan semakin jenuh di dalam pori matriks, yang
membatasisubstrat dan enzim (Emregul et al. 2005). Ekstrak protein dari D.
radiodurans mengandung banyak protein selain SOD, protein lain itu dalam
ekstrak protein dapat menyebabkan semakin sulit substrat untuk bereaksi dengan
enzim SOD (Trivadila 2011; Iswantini et al. 2013).
00

(a)

(b)

(c)
Gambar 5

(a) Pengaruh konsentrasi glutaraldehid dengan konsentrasi protein,
(b)pengaruh pH dengan konsentrasi protein,(c) pengaruh
konsentrasi zeolit dengan konsentrasi protein terhadap perubahan
arus puncak

13

Stabilitas Elektroda Biosensor
Pada penelitian ini stabilitas elektroda diuji dengan menggunakan 1
elektroda yang di uji dengan waktu pertama dan seterusnya. Stabilitas elektroda
dapat dihitung berdasarkan perbandiangn arus pada setiap waktu (periode) dengan
arus awal pengukuran. Pada Gambar 6 stabilitas biosensor ekstrak protein
diimobilisasi menggunakan agen pengikat silang glutaraldehid menghasilkan
stabilitas elektroda lebih lama 2 kali lipat dibandingkan dengan tanpa
glutaraldehid dengan sisa aktivitas 65%.
Glutaraldehid mengikat ekstrak protein sehingga posisi sisi aktif tidak
berubah-ubah, hal ini menyebabkan kinerja ekstrak protein terhadap substrat
menjadi lebih optimal. Pada penelitian sebelumnya stabilitas ekstrak protein dari
D. radiodurans yang diimobilisasi dengan nanopartikel zeolit mampu bertahan 8
jam dengan sisa aktivitas hingga 58,93% (Wijayanti 2014).Berdasarkan hasil
grafik pada Gambar 8 dapat diamati bahwa memang terjadi penurunan arus antara
dengan glutaraldehid dan tanpa glutaraldehid, disebabkan sifat dari enzim yang
bereaksi dengan substrat menggunakan prinsip gembok kunci (key-lock). Saat sisi
aktif permukaan enzim sudah terpakai maka akan menurunkan aktifitas enzim,
namun proses imobilisasi mampu menyediakan sisi permukaan aktif enzim lebih
efektif sehingga penurunan lebih bertahan lama dan sisa aktivitas berkurang lebih
sedikit.

Gambar 6Stabilitas elektroda biosensor
Stabilitas ekstrak protein tidak hanya dipengaruhi oleh proses imobilisasi
tetapi juga dipengaruhi oleh keberadan protein lain yang terdapat dalam ekstrak
protein yaitu protease. Protease merupakan enzim yang dapat mendenaturasikan
protein, sehingga dikhawatirkan adanya protease dapat merusak enzim
superoksida dismutase di dalam ekstrak kasar protein. Hal ini yang menyebabkan
masih rendahnya stabilitas ekstrak protein dibandingkan dengan penggunaan
enzim murni SOD (Campanella et al. 2001; Kocabay et al. 2012). Penggunaan
matriks CMC-gelatin-zeolit memberikan fungsi sebagai membran pembatas untuk

14

ekstrak protein yang mengandung SOD akan masuk ke dalam matriks sedangkan
protease memiliki bobot molekul lebih besar akan tertahan.
Penentuan Parameter Analitik Elektroda
Pengaruh konsenstrasi xantina terhadap aktivitas ekstrak protein yang
terimobilisasi dan tidak terimobilisasi, maka dilakukan pengukuran aktivitas
dengan variasi konsenstrasi xantina dengan kisaran 0.1-1.0 mM pada kondisi
optimum. Gambar 7 menunjukan hubungan konsentrasi xantina dengan aktivitas
ekstrak protein yang diikat silang dengan glutaraldehid dan tanpa glutaraldehid.
Reaksi yang dikatalisis oleh enzim dengan berbagai konsenstrasi substrat
mengalami 2 fase yaitu fase pertama jika konsentrasi substrat masih rendah, sisi
aktif enzim tidak semuanya terikat pada substrat dan fase kedua jika konsentrasi
substrat meningkat maka sisi aktif enzim akan terikat keseluruhan. Fase pertama
pada konsenstrasi dibawah 0.8 mM, pada aktivitas optimum telah terjadi fase
kedua yang selajutnya terjadi penurunan dikarenakan semua sisi aktif ekstrak
protein telah terikat pada substrat. Aktivitas ekstrak protein pada EPK-CMC-G-Zglutaraldehid lebih tinggi terhadap konsentrasi xantina dibandingkan dengan
CMC-G-Z, hal ini disebabkan pada saat ekstrak protein diikat silang glutaraldehid
bagian sisi aktif akan terjaga tetap pada elektroda pasta karbon dan dapat bekerja
secara penuh terhadap substrat, sedangkan bagian sisi aktif ekstrak protein yang
tanpa glutaraldehid akan tidak terjaga pada elektroda pasta karbon. Hasil
pengukuran pada penelitian Trivadila (2011) bahwa maksimum aktivitas ekstrak
protein D. radioduransyang langsung diteteskan pada EPK memberikan hasil
konsentrasi substrat xantina 0.60 mM.

Gambar 7Hubungan aktivitas ekstrak protein dengan konsentrasi xantina
Biosensor ekstrak protein D. radiodurans yang diimobilisasi pada CMC-GZ dengan ikat silang glutaraldehid menghasilkan linieritas pengukuran sebesar 0.1
– 0.8 mM dan nilai r2 = 0.9905, dan tanpa glutaraldehid sebesar 0.1 – 0.8 mM
dengan nilai r2 = 0.9861 seperti pada Gambar 8. Limit deteksi dan limit kuantisasi
yang dihasilkan dengan adanya glutaraldehid yaitu 77.84 M dan 259.50 M
sedangkan tanpa glutaraldehid yaitu 94.39 M dan 283.16 M.

15

Gambar 8Linieritas biosensor superoksida
Perbedaan linieritas ekstrak protein dengan imobilisasi CMC-gelatinzeolit diikat silang glutaraldehid memberikan rentang linieritas lebih lebar
dan arus lebih tinggi daripada tanpa glutaraldehid. Hal ini menunjukkan
bahwa dengan terimobilisasinya ekstrak protein dapat meningkatkan
aktivitas dari ekstrak protein. Pada table 3 penggunaan Clostridium
difficile sebagai pengahasil Mn-SOD dengan menggunakan elektroda
gelas karbon menghasilkan rentang pengukuran 135.2 – 1160 M dan limit
deteksi 91.1 M (Ye et al. 2014). Kandungan dari mikroba yang lebih kompleks
sehingga difusi antara protein yang diinginkan dengan substrat akan lebih lama
dan sulit untuk membentuk reaksi katalitik (Mulchandani dan Rogers 1998).
Perbedaan jenis elektroda tergantung dari sifat penghantar arus listrik yang
digunakan juga dapat mempengaruhi hasil dari rentang pengukuran dan parameter
analitik lainnya (Thandavan et al. 2013; Emregul et al. 2013). Limit deteksi
memang lebih besar daripada Wijayanti (2014), namun untuk pengujian kapasitas
antioksidan masih dapat digunakan.
Tabel 3Perbandingan parameter analitik biosensor bebasis mikroba
Parameter Analitik
Rentang pengukuran
Linieritas
Limit deteksi
Limit kuantisasi
Stabilitas Elektroda

Penelitian ini
0.1- 0.8 mM
0.9905
77.84 M
259.50 M
24 Jam (67%)

Ye et al (2014)
0.135-1.160 mM
91.10 M
-

Wijayanti (2014)
0.001-0.007 mM
0.9919
0.50 M
8 Jam (59%)

16

4

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan

Biosensor superoksida yang menggunakan ekstrak protein dari D.
radiodurans yang diimobilisasi dalam matriks CMC-gelatin-zeolit dengan
ikat silang glutaraldehid mampu menghasilkan stabilitas elektroda yang
lama yaitu 2 kali lipat dibandingkan tanpa glutaraldehid. Teknik imobilisasi
ikat silang glutaraldehid dengan ekstrak protein D. radioduransmampu
meningkatkan kinerja dari biosensor dengan menghasilkan arus lebih
tinggi pada pengukuran terhadap substrat xantina. Limit deteksi yang
dihasilkan masih cukup besar namun untuk pengujian kapasitas
antioksidan dapat digunakan.
Saran
Saran yang diberikan untuk penelitian selanjutnya yaitu menghilangakan
protease yang dapat mengganggu kinerja ekstrak protein D. radiodurans.

DAFTAR PUSTAKA
Abdullah M, Virgus Y, Nirmin, Khairurrijal. 2008. Review : Sintesis
Nanomaterial. Jurnal Nanosains & Nanoteknologi 1 : 2
Akyilmaz E, Dinçkaya E. 2005. An amperometric microbial biosensor
development based on Candida tropicalis yeast cells for sensitive
determination of ethanol. Biosensor and Bioelectronics 20 : 1263 1269
Antolovich M, Prenzler PD, Patsalides E, McDonald S, Robards K. 2002.
Methods for Testing Antioxidant Activity. Analyst 127: 183-198
Arif Z. 2011. Karakterisasi dan modifikasi zeolit alam sebagai bahan media
pendeteksi studi kasus: kromium heksavalen [Tesis]. Bogor.
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut
Pertanian Bogor
Auchere F, Rusnak F. 2002. Superoxide scavenging by neelaredoxin: dismutation
and reduction activities in anaerobes, Journal of Biology Inorganic
Chemistry 7 : 667
Byfield MP, Abuknesha RA. 1994. Biochemical Aspects of Biosensor.
Biosensor & Bioelectronics 9 : 373-400
Campanella L, De luca S, Favero G, Persi L, Tomasetti M. 2001.
Superoxide dismutase biosensors working in non-aqueous solvent.
Fresenius Journal of Analitycal Chemistry369: 594-600
Campanella L, Bonanni A, Finotti E, Tomassetti M. 2004. Biosensors for
determination of total and natural antioxidant capacity of red and

17

white wines: comparison with other spectrophotometric and
fluorimetric methods. Biosensors and Bioelectronics 19: 641-651
Canbay E, Habip A, Kara G, Eren Z, Akyilmaz E. 2015. A microbial
biosensor based on Lactobacillus delbruecki sp. bacterial cells for
simulataneous determination of lactic acid and pyruvic acid. Food
Chemistry 169 : 197-202
Carvalho RH, Lemos F, Cabral JMS, Ribeiro FR. 2007. Influence of the
presence of NaY zeolite on the activity of horseradish peroxidase in
the oxidant of phenol. Journal of Molecular Catalysis B : Enzymatic
44:39-47
Chou FI, Tan ST. 1991. Salt-Mediated Multicell Formation in Deinococcus
radiodurans. Journal of Bacteriology 173(10): 3184-3190
Earl AM, Mohundro MM, Mian IS, Battista JR. 2002. The ire protein of
Deinococcus radiodurans R1 is a novel regulator of recA expression.
Journal of Bacterial 184 (22) : 6216-6224
Emregul E, Kocabay O, Derkus B, Yumak T, Emregul KC, Sinag A, Polat K.
2013. A novel carboxymethylcellulose-gelatin-titanium dioxidesuperoxide
dismutase
biosensor:
electrochemical
properties
ofcarboxymethylcellulose-gelatin-titanium dioxide-superoxide dismutase.
Bioelectrochemistry 90:8-17
Fadhilah R. 2013. Biosensor Glukosa Menggunakan GDH-FAD yang
Diimobilisasi pada Nanopartikel Zeolit secara Elektrokimia. [Tesis]
Bogor: Institut Pertanian Bogor.
Ghosh R. 2006. Principles of Bioseparations Engineering. World Scientific:
Canada
Hamlaoui ML, Bouyahi N, Jafferzic-Renault N. 2008. Development of a urea
biosensor based on a polymeric membrane including zeolite. Sciences &
Technologie B: 51-55.
Harmita. 2004. Petunjuk pelaksanaan validasi metode dan cara perhitungannya.
Majalah Ilmu Kefarmasian 1:117-135
Harvey D. 2000. Modern Analitycal Chemistry. Singapore: Mc Graw-Hill.
Iswantini D, Nurhidayat N, Trivadila. 2011. Glucose biosensor selected Indonesia
bacteria. Microbiology Indonesia 5(1): 9-14.
Iswantini D, Nurhidayat N, Trivadila, Nurcholis W. 2013. Antioxidant Biosensor
Using Microbe. World Academy of Science, Engineering and Technology
78:1272 - 1279.
Khalaf NA, Shakya AK, Al-Othman A, El-Agbar Z, Farah H. 2008. Antioxidant
activity of some common plants. Turkey Journal of Biology32:5155
Kirdeciler SK, Soy E, Öztürk S, Kucherenko I, Soldatkin O, Dzyadevych S, Akata
B. 2011. A novel urea conductometric biosensor based on zeolite
immobilized urease. Talanta 85 : 1435-1441
Kocabay O, Emregul E, Aras S, Emregul K.C. 2012. Carboxymethylcellulose–
gelatin–superoxidase dismutaseelectrode for amperometric superoxide
radical sensing. Bioprocess Biosystem Engeering. 35:923–930
Lu Wang, Wei Wen, Huayu Xiong, Xiuhua Zhang, Haoshuang Gu, Shengfu
Wang. 2013. A Novel Amperometric Biosensor for Superoxide Anion
based on Superoxide Dismutase Immobilized on Gold Nanoparticle-

18

Chitosan-Ionic Liquid Biocomposite Film. Analytica Chimica Acta.
758:66-71
Mateo C, Palomo J.M, Fernandez-Lorente G, Guisan J.M, Fernandez-Lorente G.
2007. Improvement of Enzyme Activity, Stability and Selectivity via
Immobilization Techniques. Enzyme and Microbial Technology 40: 14511463.
Mulchandani A, Rogers Kim R. 1998. Enzyme and Microbial Biosensors.
Totowa: New Jersey
Rebecca JD, Micossi E, McCarthy J, Moe E, Elspeth JG, Kozielski-Stuhrmann,
Leonard GA, McSweeney S. 2006. Structure of the manganese superoxide
dismutase from Deinococcus radiodurans in two crystal forms. Acta
Crystallographics Sextion F. F62:325-329
Tawaha K, Alali FQ, Gharaibeh M, Mohammad M, El-Elimat T. 2007.
Antioxidant activity and total phenolic content of selected Jordanian plant
species. Journal of Foodchemistry 104: 1372–1378.
Thandavan K, Gandhi S, Sethuraman S, Rayappan JBB. 2013. A novel nanointerface superoxide biosensor. Sensors and Actuators B: Chemical 176:
884-892
Trivadila. 2011. Biosensor antioksidan menggunakan superoksida dismutase
Deinococus radiodurans diimobilisasi pada permukaan elektroda pasta
karbon dan parameter kinetikanya. [Tesis]. Bogor: Program Pascasarjana,
Institut Pertanian Bogor.
Valko M,Leibfritz D, Moncol J, Cronin MT, Mazur M, Telser J. 2007. Free radicals
and antioxidants in normal physiological functions and human disease.
Journal of Biochemistry & Cell Biology 39: 44–84.
Wahyudi A, Amalia D, Sariman, Rochani S. 2010. Sintesis nanopartikel zeolit
secara top down menggunakan planetary ball mill dan ultrasonikator.
Mineral& Energi. 8: 1.
Weniarti. 2011. Biosensor antioksidan berbasis superoksida dismutase Deinoccos
radiodurans diimobilisasi pada nanokomposit zeolit alam Indonesia.
[Tesis] Bogor : Institut Pertanian Bogor.
Wijayanti. 2014. Biosensor antioksidan menggunakan enzim superoksida
dismutase dari bakteri deinococcus radiodurans terimobilisasi nanopartikel
zeolit. [Tesis] Bogor: Institut Pert