Uji efek antiinflamasi ekstrak herba rumput mutiara (Hedyotis corymbosa (L.) Lamk.) dengan metode Hen`s Egg Test Chorio Allantoic Membrane - USD Repository
UJI EFEK ANTIINFLAMASI EKSTRAK HERBA RUMPUT MUTIARA
(Hedyotis corymbosa (L.) Lamk.) DENGAN METODE HEN’S EGG TEST
CHORIOALLANTOIC MEMBRANE
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi Oleh :
Edward Wijaya Setiawan NIM : 088114100
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2012
UJI EFEK ANTIINFLAMASI EKSTRAK HERBA RUMPUT MUTIARA
(Hedyotis corymbosa (L.) Lamk.) DENGAN METODE HEN’S EGG TEST
CHORIOALLANTOIC MEMBRANE
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi Oleh :
Edward Wijaya Setiawan NIM : 088114100
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2012
Halaman Persembahan
Kupersembahkan Karya ini untuk: Tuhan Yesus Kristus dan Bunda Maria
Papa - Mama - Saudara-saudaraku Almamaterku
Dunia Kesehatan Indonesia
PRAKATA
Puji Syukur dan terima kasih penulis haturkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala berkat, rahmat, karunia dan penyertaan-Nya selama penelitian dan penyusunan skripsi ini sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini dengan baik. Skripsi dengan judul: “Uji Efek Antiinflamasi Ekstrak Herba Rumput Mutiara (Hedyotis corymbosa (L.) Lamk.) Dengan Metode Hen’s Egg Test
Chorioallantoic Membrane ” ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat untuk
memperoleh gelar Sarjana Strata Satu Program Studi Ilmu Farmasi (S.Farm.) di Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Dalam menyelesaikan skripsi ini, banyak dihadapi kesulitan. Namun, dengan adanya bantuan dari berbagai pihak, baik berupa dukungan moril maupun spirituil, maka pada akhirnya skripsi ini dapat diselesaikan dengan sebaik mungkin. Dengan penuh kerendahan hati, maka penulis ingin mengucapkan rasa terima kasih kepada :
1. Ipang Djunarko M. Sc., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
2. Yosef Wijoyo, M. Si. Apt., selaku dosen pembimbing yang dengan sabar dan bijaksana selalu memberikan bimbingan dan pengarahan kepada penulis, yang selalu ceria dengan canda tawanya ketika bimbingan.
3. Prof. Dr. C. J. Soegihardjo, Apt., selaku dosen penguji atas pengarahannya serta kesediaannya meluangkan waktu untuk menjadi penguji.
4. Phebe Hendra, M.Si., Ph. D., Apt., selaku dosen penguji atas kesediaannya
5. Sri Hartati Yulianti M.Si., Apt., atas pengarahannya serta kesediaannya meluangkan waktu untuk memberikan masukan dan semangat pada saya.
6. Seluruh dosen Fakultas Farmasi USD, atas ilmu yang diberikan dan kebersamaan selama kuliah di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.
7. Seluruh staf laboratorium, staf kebersihan, dan staf keamanan Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Terutama Mas Agung, Pak Musrifin, Mas Iswandi, dan Mas Otok yang telah membantu kelancaran penulis dalam menyelesaikan penelitian.
8. Rosita Secoadi, atas doa, dorongan, semangat, dan perhatiannya.
9. Teman Seperjuangan saya, Yuni Rogan, Elisa Aster, Franky Limawan, dan Natalia Windari sahabat saya yang telah memberikan doa, dukungan, bantuan, dan semangat serta pengalaman tak terlupakan selama penelitian dan penyusunan skripsi. Terima kasih atas saran dan masukkan yang diberikan.
10. Sahabat-sahabatku dan teman-temanku yang lain atas segala doa dan dukungannya.
11. Teman-Teman angkatan 2008, khususnya teman-teman FST atas suka duka dan kebersamaannya.
12. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang telah membantu penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.
Penulis menyadari bahwa dalam penyusunan dan penyelesaian skripsi ini masih banyak terdapat kesalahan dan kekurangan mengingat keterbatasan kritik dan saran yang membangun dari semua pihak. Akhir kata, semoga laporan ini dapat berguna bagi pembaca.
Penulis
INTISARI
Herba rumput mutiara (Hedyotis corymbosa (L.) Lamk.) biasa digunakan untuk pengobatan tradisional. Herba rumput mutiara mengandung zat aktif golongan saponin yaitu steroid yang memiliki daya antiinflamasi. Inflamasi merupakan respon protektif jaringan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui daya antiinflamasi ekstrak herba rumput mutiara menggunakan metode Hen’s Egg
Test-Chorioallantoic Membrane (HET-CAM) dinyatakan dengan IC 50 .
Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental murni. Penelitian diawali dengan determinasi simplisia, pembuatan serbuk, pembuatan ekstrak herba rumput mutiara dan standarisasi ekstrak. Metode HET-CAM menggunakan kontrol positif inflamasi SDS 1%, kontrol positif antiinflamasi hidrokortison asetat 1%, kontrol negatif aquabidest, konsentrasi ekstrak herba rumput mutiara 150, 300, dan 600 µg/ml. Hasilnya direkam selama 300 detik dicatat dalam satuan detik waktu koagulasi, lisis dan hemoragi pembuluh darah. Data digunakan untuk menentukan iritation score. Hasil irritation score dianalisis dengan uji Kruskal- Wallis, dilanjutkan uji Mann-Whitney dengan tingkat kepecayaan 95% untuk mengetahui beda tiap perlakuan. Daya antiinflamasi dilihat dari nilai IC
50 yang ditetapkan dengan regresi linear.
Hasil penelitian menunjukkan ekstrak herba rumput mutiara memiliki daya antiinflamasi sebanding dengan hidrokortison asetat pada konsentrasi 600 µg/ml. Analisis regresi linear diperoleh IC 50 ekstrak herba rumput mutiara 311,65 µg/ml.
Kata kunci : ekstrak herba rumput mutiara, Hedyotis corymbosa (L.) Lamk., steroid, antiinflamasi, HET-CAM, iritation score, IC
50
ABSTRACT
Pearl Grass herb (Hedyotis corymbosa (L.) Lamk.) is used for traditional medicine. It’s contains active substances which fraction steroids that have anti- inflammatory action. Inflammation is a response protectif tissues. This study aims to determine the action of antiinflammatory herb gotu kola extract using Hen's Egg Test-Chorioallantoic Membrane (HET-CAM) method and expressed by IC 50 .
This research was purely experimental. The research began determination plants, making powder, making extracts and standardized extracts. HET-CAM method uses a positive control inflammation SDS 1%, the positive control anti- inflammatory hydrocortisone acetate 1%, a negative control aquabidest, extract concentration of 150, 300, and 600 µg/ml. The results recorded during 300 seconds, recorded of time of coagulation, lysis and hemorrhage of blood vessels. Data used to determine iritation score (IS). It was analyzed by Kruskal-Wallis test, and then Mann-Whitney test to determine differences for each treatment. Antiinflammatory action is obtained from linear regretion.
Extract has anti-inflammatory action but not statistically significantly different compared with hydrocortisone acetate at concentration of 600 µg/ml. regression analysis of diamond flower herb extract obtained IC 50 311,65 µg/ml.
Keyword : Diamond flower herb extract, Hedyotis corymbosa (L.) Lamk., steroid, antiinflammatory, HET-CAM, irritation score, IC
50
DAFTAR ISI
HALAMAN SAMPUL .......................................................................... i HALAMAN JUDUL ............................................................................. ii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ...................................... iii HALAMAN PENGESAHAN ................................................................ iv HALAMAN PERSEMBAHAN ............................................................. v PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ....... vi PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ................................................. vii PRAKATA ............................................................................................ viii
INTISARI .............................................................................................. xi
ABSTRACT ............................................................................................ xii
DAFTAR ISI ......................................................................................... xiii DAFTAR TABEL .................................................................................. xvi DAFTAR GAMBAR ............................................................................. xvii DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................... xviii BAB I PENGANTAR .............................................................................
1 A. Latar Belakang ...........................................................................
1
C. Tujuan penelitian .......................................................................
3 D. Manfaat penelitian .....................................................................
3 E. Keaslian Penelitian ....................................................................
4 BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ......................................................
5 A. Inflamasi ....................................................................................
5 B. Rumput Mutiara (Hedyotis corymbosa L.Lamk.) .......................
6 C. HETCAM .................................................................................
11 D. Hidrokortison asetat ..................................................................
14 E. Sodium Dodesil Sulfat ...............................................................
15 F. Ekstrak ......................................................................................
16 G. Landasan Teori .........................................................................
17 H. Hipotesis ....................................................................................
18 BAB III METODOLOGI PENELITIAN.................................................
19 A. Jenis dan Rancangan Penelitian .................................................
19 B. Variabel dan Definisi Operasional ..............................................
19 1. Variabel penelitian ...............................................................
19 2. Definisi operasional .............................................................
19 C. Bahan ........................................................................................
21 D. Alat ............................................................................................
21 E. Tata Cara Penelitian ..................................................................
21 1. Determinasi simplisia rumput mutiara .................................
21 2. Pembuatan serbuk herba rumput mutiara .............................
21
4. Uji antiinflamasi ekstrak herba rumput mutiara ....................
23 5. Analisis hasil ........................................................................
25 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................
26 A. Determinasi Simplisia ................................................................
26 B. Pembuatan Serbuk Herba Rumput mutiara .................................
26 C. Ekstraksi Serbuk Herba Rumput mutiara ....................................
28 D. Hasil Uji HET-CAM ..................................................................
28 E. Hasil Uji Kruskal Wallis dan Mann Whitney .............................
36 F. Penentuan IC 50 ..........................................................................
38 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN...................................................
39 A. Kesimpulan ...............................................................................
39 B. Saran .........................................................................................
39 DAFTAR PUSTAKA ............................................................................
40 LAMPIRAN ..........................................................................................
41 BIOGRAFI PENULIS ............................................................................
64
DAFTAR TABEL Tabel I. Tabel hasil perlakuan .............................................................
33 Tabel II. Hasil skor iritasi.....................................................................
34 Tabel III. Hasil Uji Mann Whitney ........................................................
36 Tabel IV. Skor Iritasi dan Persen Penghambatan ...................................
38
DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Respon tubuh terhadap antigen dan kerusakan jaringan .......
7 Gambar 2. Biosintesis prostaglandin ....................................................
8 Gambar 3. Rumput mutiara ..................................................................
9 Gambar 4. Perkembangan embrio unggas ............................................
13 Gambar 5. Morfologi telur ...................................................................
14 Gambar 6. Struktur hidrokortison asetat ...............................................
15 Gambar 7. Struktur Sodium Dodesil sulfat ...........................................
16 Gambar 8. Pemberian kontrol negatif aquabidest .................................
30 Gambar 9. Pemberian kontrol positif inflamasi ....................................
31 Gambar 10. Kontrol positif antiinflamasi (hidrokortison+SDS1%) .........
31 Gambar 11. Hubungan perlakuan vs irritation score .............................
35 Gambar 12. Hubungan persentase penghambatan vs konsentrasi ...........
39
DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Surat pengesahan simplisia ..............................................
43 Lampiran 2. Penimbangan bahan .........................................................
44 Lampiran 3. Perhitungan Irritation score .............................................
49 Lampiran 4. Hasil Pengamatan ............................................................
57 Lampiran 5. Hasil Uji Kruskal Wallis, Mann Whitney dan Regresi Linear ..............................................................................
59
BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Herba rumput mutiara (Hedyotis corymbosa (L.) Lamk.) merupakan
tanaman yang biasa digunakan untuk pengobatan tradisional dan dikenal memilki efek antiinflamasi, hepatoprotektif dan antikanker (Cardenaz, Quesada, and Medina, 2004). Rumput mutiara dikembangkan dan diteliti serta dijadikan ramuan dalam berbagai obat tradisional.
Inflamasi adalah respon jaringan protektif terhadap cedera atau kerusakan jaringan, yang berfungsi menghancurkan, mengurangi, atau mengurung baik agen yang menyebabkan cedera maupun jaringan yang cedera itu. Ketika tubuh mendapatkan stimulus dari luar maka tanda awal yang muncul adalah rubor (memerah) disertai dengan kalor (panas), dolor (nyeri) dan pada akhirnya terjadi
tumor (bengkak) dan functio laesa (hilangnya fungsi) (Anonim, 1996). Kerusakan
sel akibat stimulus dari luar akan membebaskan mediator seperti histamin, bradikinin, prostaglandin dan leukotrien dimana mediator-mediator tersebut berperan dalam proses inflamasi (Mansjoer, 2003).
Dalam rumput mutiara, terdapat asam ursolat bersama asam oleanolat dan zat-zat lain (Anonim, 2010). Asam ursolat adalah senyawa triterpenoid pentasiklik yang termasuk dalam famili siklo-skualena, dan terdapat dalam berbagai tanaman obat (Cardenaz, et al, 2004). Dari berbagai penelitian, asam ursolat diketahui memiliki banyak khasiat seperti sebagai antibakteri, hepatoprotektor, imunomodulator, antiproliferatif, antitumor, dan antiinflamasi (Anonim, 2010).
Berdasar keterangan diatas maka perlu diteliti mengenai aktivitas antiinflamasi dari herba rumput mutiara sehingga dapat dikembangkan sebagai obat herbal yang aman dan efektif dalam mengobati inflamasi. Rumput mutiara yang kemudian dapat dikembangkan menjadi obat herbal yang diharapkan lebih aman daripada obat sintetis dalam mengobati inflamasi.
Rumput mutiara ini diekstraksi menggunakan etanol sehingga menghasilkan ekstrak kental rumput mutiara yang nantinya akan diuji aktivitas antiinflamasinya. Penggunaan etanol ini dipilih berdasarkan kelarutan dari asam ursolat yakni sebesar 5,1mg/ml (Schneider, Hosseiny, Szczotka, Jordan, and Schlitter, 2008).
Uji aktivitas antiinflamasi dapat dilakukan dengan berbagai metode salah satunya dengan metode HET-CAM (Hen’s Egg Test ChorioAllantoic Membrane).
Metode ini memiliki keuntungan yakni waktu pengamatan yang relatif singkat dan dengan objek uji telur berembrio ini, dapat teramati secara langsung perubahan pembuluh darah ketika terjadi inflamasi. Metode ini memiliki kelebihan, yaitu cepat dan sensitif sehingga dapat juga digunakan untuk screening awal suatu material yang memiliki aktivitas antiinflamasi.
Uji efek antiinflamasi ekstrak rumput mutiara (Hedyotis corymbosa) menggunakan metode HET-CAM (Hen’s Egg Test ChorioAllantoic Membrane).
Metode ini menggunakan telur ayam yang telah dibuahi kemudian dipaparkan terbentuk CAM. CAM ini terdapat pada lapisan mesodermis telur yang terdiri dari pembuluh darah.
Berdasarkan latar belakang tersebut maka dapat dilakukan uji aktivitas antiinflamasi untuk ekstrak herba rumput mutiara menggunakan metode HET- CAM.
B. Perumusan Masalah
Apakah ekstrak etanol herba rumput mutiara (Hedyotis corymbosa
Herba ) memiliki aktivitas antiinflamasi berdasarkan metode HET-CAM? C.
Tujuan
Mengetahui aktivitas antiinflamasi ekstrak etanol herba rumput mutiara (Hedyotis corymbosa Herba ) berdasarkan metode HET-CAM.
D. Manfaat
a. Manfaat teoritis Dari penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan teoritis mengenai aktivitas anti inflamasi ekstrak Hedyotis corymbosa
Herba.
b. Manfaat metodologis Penelitian ini diharapkan memberikan pengetahuan tentang metode yang baik untuk uji aktivitas antiinflamasi ekstrak Hedyotis
corymbosa .
E. Keaslian Penelitian
Berdasarkan sepengetahuan peneliti uji aktivitas antiinflamasi dari ekstrak rumput mutiara (Hedyotis corymbosa) dengan metode HET-CAM belum pernah dilakukan sebelumnya.
Penelitian mengenai rumput mutiara pernah dilakukan berkaitan dengan aktivitas hepatoprotektif yang dilakukan oleh Alawiyah (2006) dengan hasil rumput mutiara dapat menurunkan kadar SGPT dan SGOT tikus yang telah diinduksi parasetamol dengan pemberian ekstrak dengan dosis 400mg/kgBB.
Pengujian terhadap rumput mutiara terhadap pengaruh fagositosis makrofag pernah dilakukan oleh Azenda (2006). Penelitian mengenai efek antioksidan dan antikarsinogenik pernah dilakukan oleh Susi Erdini (2011) dengan isolasi sel kanker payudara MCF-7. Hasil Penelitian tersebut rumput mutiara memiliki aktivitas antioksidan dan sitotoksik yang sangat tinggi.
Metode HET-CAM yang sama digunakan oleh Alfonsus Rudianto (2010) untuk menguji aktivitas antiinflamasi dari ekstrak etanol pegagan. Pengujian tersebut didapat nilai IC 50 sebesar 158,79 µg/m.
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Inflamasi Inflamasi adalah respon jaringan protektif terhadap cedera atau
kerusakan jaringan, yang berfungsi menghancurkan, mengurangi, atau mengurung baik agen yang menyebabkan cedera maupun jaringan yang cedera tersebut.
Tanda klasik radang akut yaitu nyeri (dolor), panas (kalor), kemerahan (rubor), bengkak (tumor), dan hilangnya fungsi (functio laesa) (Anonim, 1996).
Inflamasi (radang) biasanya dibagi dalam 3 fase : inflamasi akut, repons imun, dan inflamasi kronis. Inflamasi akut merupakan respon awal terhadap cedera jaringan; hal tersebut terjadi melalui media rilisnya autacoid serta pada umumnya didahului oleh pembentukan respon imun. Sejumlah autacoid yang terlibat seperti histamin, serotonin, bradikinin, prostaglandin, dan leukotrien (Katzung, 2001).
Respon imun terjadi bila sejumlah sel yang mampu menimbulkan kekebalan diaktifkan merespon organisme asing atau substansi antigenik yang terlepas selama respon terhadap inflamasi akut serta kronis. Inflamasi kronis melibatkan keluarnya sejumlah mediator-mediator yang tidak menonjol dalam
1
respon akut. Beberapa diantaranya adalah interleukin-1, 2, 3, GM-CSF , TNF- α,
3 interferon dan PDGF (Katzung, 2001).
Kerusakan jaringan bisa disebabkan oleh senyawa kimia, agen penyebab rusaknya jaringan, inflamasi juga berfungsi untuk menginduksi perbaikan jaringan yang rusak dan juga memproteksi adanya kerusakan jaringan yang bisa menimbulkan efek yang lebih berbahaya. Inflamasi akut dan kronis dibedakan berdasarkan durasi dan tipe sel inflamasi yang dilepaskan. Inflamasi akut melibatkan perubahan pembuluh darah dalam detik yaitu adanya vasodilatasi dan permeabilitas pembuluh darah. Vasodilatasi meningkatkan laju aliran darah dan peningkatan suhu pada jaringan yang rusak sehingga tanda yang timbul akibat adanya inflamasi adalah rubor dan kalor. Meningkatnya permeabilitas pembuluh darah menyebabkan pelepasan protein plasma sehingga timbul tumor pada jaringan. Selain itu, meningkatnya permeabilitas akan memicu pelepasan leukosit (neutrofil) dan makrofag yang berfungsi untuk menghancurkan agen-agen penyebab cedera (Pearson, 2010). Respon tubuh terhadap antigen yang dapat menyebabkan kerusakan jaringan ditunjukkan pada Gambar 1.
Tubuh merespon adanya antigen yaitu mengaktifkan komplemen yang menyebabkan vasodilatasi dan meningkatnya permeabilitas pembuluh darah. Efek serupa juga ditimbulkan pada pelepasan mediator inflamasi yaitu brandikinin (Harrison, 2010).
Gambar 1. Respon tubuh terhadap antigen dan kerusakan jaringan
(Harrison, 2010).
Inflamasi akut melibatkan sel-sel dalam respon imun antara lain makrofag dan neutrofil. Makrofag adalah komponen sel utama sistem imunitas non spesifik yang memproduksi sitokin yaitu Tumour Necrosis Factor-
α (TNF-α) sebagai respon terhadap antigen (bakteri atau fragmen bakteri). TNF- α merupakan kemoatraktan dimana terlibat dalam meningkatkan migrasi leukosit dan inflamasi
(Bedoui , Velkoska, Bozinovski, Jones, Anderson, and Morris , 2005)
Fenomena inflamasi berkaitan dengan adanya pelepasan mediator nyeri dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2. Biosintesis prostaglandin (Harrison, 2010).
Asam arakidonat merupakan komponen normal yang disimpan pada sel dalam bentuk fosfolipid. Adanya stimulus menyebabkan asam arakidonat dilepaskan dari sel penyimpan lipid oleh asil hidrolase sebagai respon inflamasi. Asam arakidonat kemudian mengalami metabolisme menjadi dua alur. Alur siklooksigenase yang membebaskan prostaglandin (PGE
2 , PGF 2 , PGD 2 ),
prostasiklin, dan tromboksan dan alur lipooksigenase yang membebaskan leukotrien. Leukotrien dan prostaglandin merupakan mediator nyeri yang dilepaskan saat terjadi inflamasi (Mansjoer, 2003).
Secara in vitro terbukti bahwa prostaglandin E
2 (PGE 2 ) dan prostasiklin peningkatan aliran darah lokal. Migrasi leukosit ke jaringan radang merupakan aspek penting dalam proses inflamasi (Anonim, 1995a).
B. Rumput Mutiara (Hedyotis corymbosa L. Lamk.)
Gambar 3. Rumput mutiara
Divisi : Spermatophyta Sub Divisi : Angiospermae Kelas : Dicotyledoneae Ordo : Rubiales Famili : Rubiaceae Genus : Hedyotis Spesies : Hedyotis corymbosa L. (Anonim, 2010)
Rumput mutiara (Hedyotis corymbosa L. Lamk.) tumbuh pada tanah lembap. Rumput mutiara tumbuh setinggi 15 – 30 cm, memiliki batang bersegi, daun berhadapan bersilang, tangkai daun pendek, panjang daun 2 – 5 cm, berujung runcing, dan bertulang daun tunggal di tengah. Ujung daun mempunyai rambut yang pendek. Bunga ke luar dari ketiak daun, bentuknya seperti payung berwarna putih, berupa bunga majemuk 2-5, tangkai bunga (induk) keras seperti kawat, panjangnya 5 10 mm. Rumput mutiara memiliki kandungan kimia yaitu : asam ursolat, asam oleanolat, stigmasterol, beta-sitosterol, dan glikosida flavonoid (Anonim, 2010).
Rumput rnutiara merupakan tanaman gulma termasuk genus Rubiaceae-
(Oldenlandia) berdaun kecil, bunga berwarna putih, berbatang dua atau lebih
berbentuk panjang, reproduksi dengan biji dan hidup pada tanah yang lembab.Tanarnan ini dapat rnereduksi tumor, antiinflarnasi dan melindungi hati. Beberapa hasil penelitian rnenunjukkan bahwa tanaman dari genus Hedyotis banyak mengandung iridoid (Peng, Feng, and Liang, 1997).
Hedyotis rnengandung 10 senyawa iridoid yaitu asperulosid, skandosid
metil ester, asarn asperulosid, asam diasetil asperulosid, loganin, diasil asperulosid, asetil skandosid rnetil ester, 6 beta-hldroksigenipin, 6'- asetilasperulosid dan 6'-asetilasperulosid (Peng, Feng, and Liang, 1999).
Asam ursolat adalah golongan triterpenoid pentasiklik yang terdapat dalam berbagai jenis tanaman. Penelitian tentang asam ursolat menemukan aktivitas asam ursolat sebagai antikanker, anti mikroba, antiinflamasi, hepatoprotektif, antihiperlipidemi, dan antiviral (Liu, 1995).
Asam oleanolat adalah golongan triterpenoid pentasiklik yang merupakan isomer dari asam ursolat. Asam oleanolat memiliki aktivitas antitumor, antiinflamasi, antihiperlipidemi, dan hepatoprotektif (Liu, 1995).
Iridoid diketahui mempunyai efek biologis yang bervariasi seperti antimicrobial, antitumor, antihepatoksik, dan ernetik (Konno, Hirayama, Yasui, and Nakamura, 1999).
Iridoid glikosida kutkoside dan picroside dapat bertindak sebagai antioksidan dan memperbaiki efek hepatotoksik dari karbontetroklorida, tioacetamide, galaktosarnin, dan paracetamol (Schuppan, Dong, Brinkhaus, and Hahn, 1999).
C.
HET-CAM
Metode HET-CAM pertaman kali dikemukakan oleh Luepke (1985), menggunakan membran vaskuler dari fetus yaitu chorioallantoic membran dimana merupakan gabungan antara Chorion dan allantois (Anonim, 2009).
HET-CAM digunakan untuk meneliti sifat antiiritasi dari ektrak larut air pada tanaman yang pada akhirnya memiliki tujuan mencari substansi yang bertanggung jawab terhadap efek antiiritasi tersebut. Metode ini mengukur waktu onset dari tiga manifestasi iritasi pada membran yaitu hemoragi, lisis dan koagulasi dan dibandingkan dengan kontrol positif yang sudah ada (Wilson and Steck, 2000).
Metode pengujian dengan ChorioAllantoicMembrane/CAM merupakan metode evaluasi subyektif dari perubahan vaskuler(hemoragi dan obstruksi) dan nekrosis dari CAM, pembuluh vaskular dan membran respirasi yang berada di bawah lapisan cangkang telur (Hayes, 2001).
ChorioAllantoicMembrane dari ayam merupakan jaringan yang terbentuk
setelah tujuh hari masa inkubasi yang merupakan gabungan dari chorion dan
allantois . Secara struktural lapisan terluar adalah lapisan epitelium yang terbentuk
CAM analogis dengan retina dan pembuluh darahnya. CAM ayam yang sudah matang dapat dibagi menjadi beberapa lapisan yaitu : stratum primer, saluran kapiler atau pembuluh darah dan lapisan stratum yang tipis yang tersusun dari sel epitel yang memungkinkan adanya migrasi termasuk pertukaran gas dan absorbsi kalsium (Leng, et al., 2004). Keuntungan dari uji CAM adalah biaya rendah, simpel, dapat dipercaya, dan dapat digunakan untuk skrining dalam skala yang besar (Ribatti, Vacca, Roncali, and Dammacco, 2000).
CAM merupakan membran vaskular respirasi yang mengelilingi perkembangan embrio unggas. CAM tersusun atas lapisan ektodermal yang terdiri atas epitelium yang berupa dua atau tiga inti sel, lapisan mesodermal yang terdiri dari jaringan penghubung, ground substance, dan pembuluh darah dan juga terdapat lapisan endodermal. Pembuluh darah berada pada lapisan mesodermal CAM yang bercabang dari arteri dan vena embrio-allantoic (Anonim, 2003).
Pembuluh ini mengandung eritrosit dan leukosit yang dipercaya terlibat dalam respon inflamasi oleh karena adanya paparan stimulus dari luar. Hal ini diasumsikan bahwa efek akut diinduksi oleh zat uji pada pembuluh darah kecil dan protein pada membran jaringan membran efeknya sama dengan efek yang diinduksi dengan zat uji yang sama yang dipaparkan pada mata kelinci (Anonim, 2003).
Gambar 4. Perkembangan embrio unggas (Anonim, 2003)
Denaturasi (ditunjukkan sebagai koagulasi) digunakan sebagai indikator efek pada sel dalam CAM. Perubahan pada pembuluh darah CAM dimaksudkan untuk memprediksi keseluruhan toksisitas dan kerusakan conjuctiva pada mata (Anonim, 2006).
Telur yang digunakan telah diinkubasi selama 10 hari kemudian dilakukan peneropongan. Peneropongan bertujuan mengetahui apakah telur tersebut berembrio dan menandai ruang udara pada telur. Pada saat inkubasi posisi ruang udara berada di bagian atas. Telur yang digunakan berbobot 50-60 gram dan berembrio (Wilson and Steck, 2000).
Gambar 5. Morfologi telur (D’Arcy and Howard, 1966)
D. Hidrokortison Asetat Hidrokortison asetat merupakan ester asetat dari hidrokortison.
Hidrokortison asetat merupakan obat kelompok kortikosteroid. Kortikosteroid adalah kelompok obat yang memiliki aktivitas glukokortikoid dan mineralokortikoid. Secara umum efeknya dibedakan atas efek retensi Na, efek terhadap metabolisme karbohidrat (glukoneogenesis), dan efek antiinflamasi.
Umumnya efek antiinflamasi sejalan dengan efek terhadap metabolisme karbohidrat sehingga pengelompokan kortikosteroid didasarkan atas potensi untuk menimbulkan retensi Na (efek mineralkortikoid) dan efek antiinflamasi (efek glukokortikoid). Khasiat antiinflamasi dan glukoneogenesis merupakan ciri glukokortikoid (Anonim, 2000a).
Terapi menggunakan glukokortikoid menginduksi secara cepat penyusutan inflamasi pada tikus yang diberi injeksi subkutan berupa karagenin.
Hidrokortison asetat yang diinjeksikan pada kantung granuloma pada dosis yang lebih tinggi dari 3 mg/kg/hari selama 3 hari menyebabkan penyusutan maksimum (Hyun, Hideo, and Susumu, 1973).
Pengobatan pasien dengan inflamasi mempunyai 2 tujuan yang utama: 1) meringankan rasa nyeri, yang seringkali merupakan gejala awal yang terlihat dan keluhan utama yang terus-menerus dari pasien; 2) memperlambat atau (dalam teori) membatasi proses perusakan jaringan. Glukokortikoid memiliki efek antiinflamasi dan ketika pertama kali diperkenalkan dianggap sebagai jawaban terakhir untuk pengobatan artritis yang beradang (Katzung, 2001). Glukokortikoid bisa mempengaruhi respon peradangan oleh efek vaskularnya. Glukokortikoid menyebabkan vasokonstriksi bila dioleskan langsung ke pembuluh darah kemudian menurunkan permeabilitas kapiler (Katzung, 1989).
CH OCOCH
2
3 C O CH
3 OH OH CH
3 O
Gambar 6. Struktur hidrokortison asetat
E.
Natrium Lauril Sulfat
O O S O O Na
Gambar 7. Struktur Natrium Lauril Sulfat
Sodium dodecyl sulphate atau natrium lauril sulfat merupakan surfaktananionik yang digunakan secara luas pada formulasi sediaan non parenteral dan kosmetik. Sodium dodecyl sulphate (SDS) merupakan detergen dan wetting agent yang efektif dalam kondisi asam atau basa. Digunakan dalam teknik analisis elektroforesis SDS digunakan untuk analisis protein dan SDS digunakan untuk meningkatkan selektifitas micellar electrokinetic chromatography (Rowe, 2006).
SDS memiliki kemampuan untuk menginduksi inflamasi pada uji antiinflamasi menggunakan metode HET-CAM suatu alkaloid dari Adhatoda
vasica Neess. Indikasi terjadi inflamasi adanya pembuluh darah yang membentuk
bintang setelah diamati menggunakan kaca pembesaran (Chakraborty and Brantner, 2001).
F. Ekstrak
Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi senyawa aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan.
Ekstrak tumbuhan obat yang dibuat dari simplisia nabati dapat dipandang sebagai bahan awal, bahan antara atau bahan produk jadi. Ekstrak sebagai bahan awal diproses menjadi produk jadi. Ekstrak sebagai bahan antara berarti masih menjadi bahan yang dapat diproses lagi menjadi fraksi-fraksi, isolat senyawa tunggal ataupun tetap sebagai campuran dengan ekstrak lain. Ekstrak sebagai produk jadi berati ekstrak yang berada dalam sediaan obat jadi siap digunakan oleh penderita (Anonim, 2000b).
Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan (Dirjen POM RI, 1995).
G. Landasan Teori
Inflamasi merupakan respon protektif tubuh terhadap adanya kerusakan jaringan. Adanya mediator-mediator inflamasi seperti prostaglandin menyebabkan rasa nyeri pada tubuh yang ditandai dengan adanya dolor, kalor, rubor, tumor dan
functio laesa . Asam arakidonat merupakan komponen normal yang disimpan pada
sel dalam bentuk fosfolipid. Adanya stimulus menyebabkan asam arakidonat kemudian mengalami metabolisme menjadi dua alur. Alur sikloosigenase yang membebaskan prostaglandin dan alur lipooksigenase yang membebaskan leukotrien. Leukotrien dan prostaglandin merupakan mediator nyeri yang dilepaskan saat terjadi inflamasi (Harrison, 2010)..
Asam ursolat memiliki khasiat seperti sebagai antibakteri, anti-angiogenik. Dengan adanya efek antiinflamasi maka asam ursolat dikembangkan sebagai penyembuh luka dan diharapkan dapat mengatasi efek inflamasi yang muncul ketika luka terjadi (Liu, 1995).
Asam ursolat sendiri berada dalam berbagai tanaman, salah satunya adalah rumput mutiara. Guna mendapatkan khasiat penyembuhan luka dari asam ursolat maka dilakukan ekstraksi dari rumput mutiara dengan menggunakan etanol.
HETCAM merupakan metode untuk meneliti efek iritasi dari suatu ekstrak dengan menggunakan Chorio Allantoic Membrane dari embrio ayam.
CAM sendiri merupakan jaringan yang terbentuk setelah 7 hari masa inkubasi yang terdiri dari chorion dan allantois dimana memiliki lapisan epitelium di bagian terluar yang melapisi allantois (Wilson and Steck, 2000).
Metode pengujian efek iritasi suatu ekstrak dengan metode HET-CAM memiliki keuntungan biaya yang rendah, simpel, dapat digunakan untuk skrining dalam skala besar karena waktu yang dibutuhkan untuk sekali skrining relatif cepat. Data yang didapat di penelitian ini adalah waktu pertama kali terjadinya hemoragi, lisis, dan koagulasi yang dirumuskan dalam skor iritasi. Pengamatan dilakukan selama 300 detik atau 5 menit.
H. Hipotesis
Ekstrak etanol herba rumput mutiara (Hedyotis corymbosa) memiliki aktivitas antiinflamasi.
BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Rancangan Penelitian Merupakan penelitian eksperimental dengan rancangan acak lengkap
pola searah. Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental karena dilakukan manipulasi terhadap subjek uji yaitu dengan pemberian ekstrak rumput mutiara pada telur atau CAM dengan pemilihan subjek uji secara random atau acak.
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional
a. Variabel bebas Sebagai variabel bebas dalam penelitian ini adalah: kadar ekstrak etanol Herba rumput mutiara (Hedyotis Corymbosa).
b. Variabel tergantung Sebagai variabel tergantung dalam penelitian ini adalah: waktu hemoragi, waktu hemolisis, waktu koagulasi.
c. Variabel pengacau terkendali Sebagai variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah: varietas dan pengotor yang berasal dari udara, sterilitas alat, suhu dan kelembapan relatif inkubasi telur, sumber atau habitat rumput mutiara. d. Variabel pengacau tak terkendali Sebagai variabel pengacau tak terkendali dalam penelitian ini adalah waktu dan lama pengeringan.
e. Definisi operasional variabel 1) Kadar ekstrak etanol rumput mutiara adalah jumlah ekstrak etanol rumput mutiara yang terlarut dalam volume tertentu yang digunakan dalam eksperimen. 2) Skor iritasi adalah nilai yang diperoleh dari perhitungan matematis yang diperoleh dari data waktu koagulasi, waktu lisis dan waktu hemoragi dalam detik menurut Spielmann (1995). 3) Inflamasi adalah perubahan pembuluh darah berupa hemoragi, hemolisis dan koagulasi akibat induksi dari agen inflamasi.
4) Waktu hemoragi adalah pendarahan yang terjadi pada CAM, ditandai dengan adanya bercak darah pada CAM.
5) Waktu hemolisis adalah pecahnya pembuluh darah pada CAM ditandai dengan adanya aliran darah yang deras maupun terlihat putusnya pembuluh darah. 6) Waktu koagulasi adalah penggumpalan protein pada telur akibat agen penginflamasi yang kuat.
7) Perhitungan IC dilakukan dengan cara analisis regresi linear, dimana
50 diperoleh melalui hubungan regresi konsentrasi vs persen penghambatan.
.
Nilai persen penghambatan 50% merupakan konsentrasi IC
50
C. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi herba rumput mutiara yang didapat disekitar kampus Universitas Sanata Dharma di Paingan, etanol, telur ayam bebas antibiotik berumur 8-10 hari dari peternakan unggas di Wirobrajan, aquabidest, SDS, hidrokortison asetat.
D. Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi pinset, pisau kecil, spuit injeksi 1 ml, alat sokletasi, handycam, membran filter Whatman, inkubator, rotary vacum evaporator dan seperangkat alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium analisis.
E. Tata Cara Penelitian
1. Deteminasi simplisia rumput mutiara
Determinasi simplisia rumput mutiara dilakukan dengan melihat tanaman rumput mutiara kemudian dicocokan dengan kunci determinasi yang ada pada buku Flora of Java volume VI karangan Backer and van den Brink (1965).
2. Pembuatan serbuk herba rumput mutiara a.
Sortasi kering. Sortasi kering dilakukan dengan cara memisahkan komponen-komponen asing yang ada pada herba rumput mutiara.
b. Pembuatan serbuk. Herba rumput mutiara hasil sortasi dikeringkan di
bawah sinar matahari secara tidak langsung. Setelah bahan kering, diserbuk menggunakan alat serbuk (grinder).
3. Ekstraksi rumput mutiara
Sejumlah 20 g serbuk rumput mutiara dibungkus kertas saring dimasukan ke alat sokhlet ditambah etanol p.a sampai 3 kali sirkulasi (150 ml) kemudian dipanaskan sampai filtratnya jernih. Filtrat diuapkan menggunakan
rotary vacuum evaporator dengan pemanas waterbath suhu 70 C kemudian
didapatkan ekstrak kental dan dituang ke dalam cawan porselin, kemudian dikeringkan dengan cara dimasukan oven dengan suhu 50 C dan didapatkan ekstrak kental rumput mutiara.
4. Uji antiinflamasi ekstrak herba rumput mutiara a. Penyiapan telur
Telur ayam ayam kampung yang telah dibuahi dimasukkan dalam inkubator yang telah dibersihkan terlebih dahulu dengan suhu 37 C. Pastikan rongga udara telur berada disebelah atas. Pada hari ke sepuluh telur diteropong, telur yang tidak dibuahi atau tidak mengandung embrio hidup dibuang. Rongga udara telur ditandai. Telur yang telah berumur sepuluh hari kemudian ditimbang dan hanya telur dengan berat 50,0 – 60,0 g yang digunakan.
b. Pengaturan inkubator telur
Inkubator diatur temperatur dan kelembapan suhu yaitu untuk suhu kelembaban inkubator pada bagian bawah inkubator terdapat tampungan air yang berfungsi untuk mengatur kelembaban inkubator. Air yang digunakan untuk mengisi tampungan adalah air steril.
c. Pengujian HET-CAM
1. Kelompok perlakuan. Menggunakan lima telur untuk setiap kelompok perlakuan. Kelompok perlakuan dibagi menjadi:
1. Kontrol positif antiinflamasi (Hidrokortison asetat 1 %). Hidrokortison asetat ditimbang seksama kurang lebih sebanyak 0,01 gram dimasukkan dalam tabung Eppendorf selanjutnya timbang SDS 0,01 gram dan dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf tersebut ditambah dengan aquabidest steril hingga 1,0 ml.
2. Kontrol negatif (aquabidest). Aquabidest yang digunakan untuk kontrol negatif adalah aquabidest steril. Kemudian aquabidest ditambahkan dalam tabung Eppendorf hingga volume 1,0 ml.
3. Kontrol positif inflamasi (SDS 1%). Sodium dodecyl sulphate (SDS) sebanyak ditimbang seksama kurang lebih 0,01 gram kemudian dilarutkan dengan 1,0 ml aquabidest steril.
4. Ekstrak herba rumput mutiara 150
μg/ml. Timbang seksama
kurang lebih 15,0 mg ekstrak dilarutkan dalam 10,0 ml aquabidest steril kemudian diencerkan 10 kali lalu ditambah dengan 0,01 g SDS dalam volume 10,0 ml.
5. Ekstrak herba rumput mutiara 300 μg/ml. Timbang seksama kemudian diencerkan 10 kali lalu ditambah dengan 0,01 g SDS dalam volume 10,0 ml.
6. Ekstrak herba rumput mutiara 600
μg/ml. Timbang seksama
kurang lebih 60,0 mg ekstrak dilarutkan dalam 10,0 ml aquabidest steril kemudian diencerkan 10 kali lalu ditambah dengan 0,01 g SDS dalam volume 10,0 ml.
2. Hen’s Egg Test Chorio Allantoic Membran(HET-CAM). Masing-masing bahan yang telah dibuat kemudian diambil sebanyak 0,2 ml dengan menggunakan spuit. Suntikan pada daerah pada membran yang dekat dengan pembuluh darah. Amati perubahan pembuluh darah yang terjadi.
3. Pengamatan. Pengamatan reaksi CAM dilakukan selama 300 detik. Pengamatan dilakukan pada CAM dan dicatat saat timbul gejala- gejala inflamasi. Gejala-gejala yang diamati adalah hemoragi (pendarahan), vascular lysis (disintregasi pembuluh darah), koagulasi (denaturasi protein ekstra dan intra vaskular).
Hemorhage time, yaitu waktu yang dibutuhkan untuk terjadinya