Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal 1,1-Difenil-2-Pikrilhidrazil (DPPH) dan penetapan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah jeruk lemon (Citrus x limon (L.) Burm. f.) - USD Repository

  

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN RADIKAL

1,1-DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL (DPPH) DAN PENETAPAN

KANDUNGAN FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK

METANOL KULIT BUAH JERUK LEMON (Citrus x limon (L.) Burm. f.)

  

SKRIPSI

  Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

  Program Studi Farmasi Oleh:

  Wisnu Brahmana Putra NIM: 098114111

  

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

LEMBAR PERSEMBAHAN

  

PRAKATA

  Puji dan Syukur penulis panjatkan ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa atas kasih dan penyertaan yang diberikan hingga penuli dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul

  “UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN RADIKAL

1,1-DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL (DPPH) DAN PENETAPAN

KANDUNGAN FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK

  

METANOL KULIT BUAH JERUK LEMON (Citrus x limon (L.) Burm.

  f.) ”.Penelitian ini dilakukan untuk memenuhi salah satu syarat tugas akhir untuk

  mencapai gelar sarjana ilmu Farmasi bidang studi Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

  Penulis menyadari bahwa penulisan skirpsi ini tidak terwujud tanpa bimbingan, bantuan dan pengarahan berbagai pihak. Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada:

  1. Bapak Ipang Djunarko, M.Sc., Apt sebagai Dekan Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

  2. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si. sebagai Dosen Pembimbing utama skripsi ini atas segala kesabaran dan perhatian dalam memberikan bimbingan, pengarahan, tuntunan, dukungan dan motivasi selama penelitian dan penyusunan skripsi.

  3. Bapak Prof. Dr. C. J. Soegihardjo, Apt. sebagai Dosen Penguji skripsi atas bantuan, masukan, dan perhatian kepada penulis demi kemajuan skripsi ini.

  4. Dra. Maria Margaretha Yetty Tjandrawati, M.Si sebagai Dosen Penguji skripsi yang banyak memberikan saran demi kemajuan skripsi ini.

  5. Ibu Rini Dwiastuti, M.Si.,Apt. selaku Kepala Laboratorium Farmasi yang telah memberikan izin penggunaan fasilitas laboratorium guna penelitian

  6. Semua staf laboratorium Farmasi yang bersedia membantu selama penelitian berlangsung terkhusus laboran Laboratorium Farmakognosi- Fitokimia (Mas Wagiran) dan Kimia Analisis Instrumen (Mas Bimo).

  7. Theresia Nindy, Tri Pamulatsih, Yenny, Augustinus Teti, Febrin Nessy, Putut Wibisono untuk semua semangat saling menguatkan selama pengerjaan skripsi.

  8. Agustina Erni Purnamasari yang telah banyak membantu dan atas semua kesabarannya mendengarkan setiap keluh kesah.

  9. Semua pihak yang penulis tidak dapat sebutkan satu persatu yang turut membantu selama penyusunan skripsi ini.

  Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan, karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun dan bermanfaat demi pengembangan ilmu pengetahuan, serta menjadi acuan bagi penelitian-penelitian selanjutnya.

  Yogyakarta, 12 Juli 2013 Penulis

  

DAFTAR ISI

  HALAMAN JUDUL ...........................................................................................i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .................................................ii HALAMAN PENGESAHAN .............................................................................iii PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .............................................................iv LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS ..........................................................................v LEMBAR PERSEMBAHAN .............................................................................vi PRAKATA ..........................................................................................................vii DAFTAR ISI .......................................................................................................ix DAFTAR TABEL ...............................................................................................xiii DAFTAR GAMBAR ..........................................................................................xiv DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................................xv

  INTISARI ................................................................................................xvi

  

ABSTRACT ..........................................................................................................xvii

  BAB I. PENGANTAR ........................................................................................1 A. Latar Belakang ........................................................................................1

  1. Perumusan masalah ...........................................................................3

  2. Keaslian penelitian ............................................................................3

  3. Manfaat penelitian .............................................................................4

  2. Tujuan khusus ...................................................................................4

  BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA.................................................................5 A. Jeruk Lemon. ...........................................................................................5

  1. Keterangan botani .............................................................................5

  2. Morfologi ..........................................................................................6

  B. Antioksidan .............................................................................................6

  1. Radikal Bebas....................................................................................6

  2. Antioksidan .......................................................................................7

  C. Metode DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) ...........................................8

  D. Fenolik ....................................................................................................9

  E. Flavonoid ................................................................................................10

  F. Rutin ........................................................................................................11

  G. Ekstraksi ..................................................................................................12

  H. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ............................................................12

  I. Spektrofotometer Visible ........................................................................13 J. Validasi Metode ......................................................................................14 K. Landasan Teori ........................................................................................16 L. Hipotesis ..................................................................................................17

  BAB III. METODOLOGI PENELITIAN ..........................................................18 A. Jenis Penelitiandan Rancangan Penelitian ..............................................18 B. Variabel Penelitian ..................................................................................18

  C. Definisi Operasional................................................................................19

  D. Bahan dan Alat Penelitian .......................................................................20

  1. Bahan penelitian ................................................................................20

  2. Alat penelitian ...................................................................................20

  E. Tata Cara Penelitian ................................................................................20

  1. Determinasi tanaman .........................................................................20

  2. Pemilihan dan pengumpulan sampel .................................................21

  3. Pembuatan simplisia .........................................................................21

  4. Ekstraksi dan fraksinasi simplisia .....................................................21

  5. Penetapan aktivitas antioksidan ........................................................22

  a. Kualitatif .....................................................................................22

  b. Kuantitatif ...................................................................................22

  6. Penetapan kadar fenolik dalam ekstrak .............................................25

  F. Analisis Hasil ..........................................................................................26

  BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ...........................................................27 A. Hasil Determinasi ....................................................................................27 B. Hasil Preparasi Sampel ...........................................................................27

  1. Hasil ekstraks sampel ........................................................................27

  2. Hasil fraksinasi ekstrak metanol kulit lemon ....................................29

  C. Hasil Uji Kualitatif Flavonoid dengan Metode KLT ..............................31

  D. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan .................................34

  antioiksidan .......................................................................................35

  E. Hasil Validasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan ..................................36

  1. Linearitas ...........................................................................................39

  2. Presisi ................................................................................................40

  3. Spesifitas ...........................................................................................41

  F. Hasil Penentuan Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH .............42

  G. Hasil Optimasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total ................45

  1. Penentuan operating time (OT) .........................................................45

  2. Penentuan panjang gelombang maksimum .......................................46

  H. Hasil Validasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total .................46

  1. Linearitas ...........................................................................................48

  2. Presisi ................................................................................................48

  3. Spesifitas ...........................................................................................49

  I. Hasil Penetapan Kandungan Fenolik Total .............................................49

  BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN .............................................................53 A. Kesimpulan .............................................................................................53 B. Saran ........................................................................................................53 DAFTAR PUSTAKA .........................................................................................54 LAMPIRAN ........................................................................................................57 BIOGRAFI PENULIS ........................................................................................77

  DAFTAR TABEL

  Tabel I. Rentang Accuracy yang Diperbolehkan ........................................ 15 Tabel II. Rentang CV yang masih Diterima................................................. 15 Tabel III. Hasil Scanning Panjang Gelombang Maksimum DPPH .............. 36 Tabel IV. Hasil Pengukuran Absorbansi Seri Baku Rutin yang

  Direaksikan dengan Radikal DPPH .............................................. 37 Tabel V. Hasil Pengukuran Absorbansi Seri Fraksi Etil Asetat yang

  Direaksikan dengan Radikal DPPH .............................................. 38 Tabel VI. Nilai % CV Uji Aktivitas Antioksidan Rutin dan Fraksi

  Etil Asetat ...................................................................................... 40 Tabel VII. Hasil Perhitungan IC

  50 Rutin dan Fraksi Etil Asetat Ekstrak

  Metanol Kulit Buah Lemon........................................................... 43 Tabel VIII. Tingkat Kekuatan Antioksidan Senyawa Uji dengan

  Metode DPPH ............................................................................... 43 Tabel IX. Hasil Scanning Panjang Gelombang Maksimum Penetapan

  Kandungan Fenolik Total pada Asam Galat ................................. 46 Tabel X. Hasil Pengukuran Absorbansi Baku Asam Galat .......................... 48 Tabel XI. Nilai % CV Penetapan Kandungan Fenolik Total .......................... 49 Tabel XII. Kadar Asam Galat dan Absorbansinya Setelah Direaksikan dengan Pereaksi Folin-Ciocalteu yang Diukur pada

  DAFTAR GAMBAR

  Gambar 1. Reaksi Radikal DPPH dengan Antioksidan ................................... 9 Gambar 2. Struktur Hesperidin dan Naringin .................................................. 11 Gambar 3. Struktur Rutin ................................................................................. 11 Gambar 4. Hasil Kromatogram Uji Kualitatif dengan Uap Ammonia ........... 32 Gambar 5. Hasil Kromatogram Uji Kualitatif dengan Semprot Besi (III)

  Klorida ............................................................................................ 33 Gambar 6. Grafik Penentuan OT Rutin............................................................ 34 Gambar 7. Grafik Penentuan OT Fraksi Etil Asetat ........................................ 35 Gambar 8. Kurva Persamaan Regresi Linear Aktivitas Antioksidan Rutin ..... 38 Gambar 9. Kurva Persamaan Regresi Linear Aktivitas Antioksidan Fraksi

  Etil Asetat ...................................................................................... 39 Gambar 10. Grafik Penentuan OT Asam Galat ............................................... 45 Gambar 11. Grafik Penentuan OT Fraksi Etil Asetat ...................................... 45 Gambar 12. Kurva Persamaan Regresi Linear Penentapan Kadar Fenolik

  Total Asam Galat ......................................................................... 48 Gambar 13. Struktur Asam Galat ..................................................................... 51 Gambar 14. Reaksi Senyawa Fenol dengan Reagen Folin-Ciocalteu .............. 51 Gambar 15. Kurva Persamaan Regresi Linear Asam Galat ............................. 52

  DAFTAR LAMPIRAN

  Lampiran 1. Gambar Buah Jeruk Lemon ......................................................... 58 Lampiran 2. Perhitungan Rendemen ................................................................ 58 Lampiran 3. Data Penimbangan untuk Pengujian Aktivitas Antioksidan ....... 59 Lampiran 4. Perhitungan Rf Rutin dan Fraksi Etil Asetat ............................... 60 Lampiran 5. Data konsentrasi bahan untuk pengujian aktivitas antioksidan ... 61 Lampiran 6. Scanning Larutan Pengkoreksi untuk Pengujian Aktivitas ......... 63 Lampiran 7. Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan ............................... 66 Lampiran 8. Uji Aktivitas Antioksidan Menggunakan Radikal DPPH ........... 68 Lampiran 9. Perhitungan Nilai IC50 Rutin dan Fraksi Etil Asetat Ekstrak

  Metanol Kulit Lemon .................................................................. 71 Lampiran 10. Penimbangan Uji Kandungan Fenolik Total ............................. 72 Lampiran 11. Scanning Kontrol Asam Galat ................................................... 73 Lampiran 12. Optimasi Penentuan Kandungan Fenolik Total ......................... 75 Lampiran 13. Penentuan Kandungan Fenolik Total ........................................ 77 Lampiran 14. Uji Statistik dengan R 2.14.1 ..................................................... 75

  

Intisari

  Radikal bebas dapat berasal dari polusi, debu, maupun metabolisme dari dalam tubuh. Oleh karenanya diperlukan suatu substansi yang berfungsi untuk melindungi tubuh dari dampak negatif radikal bebas, yaitu antioksidan. Antioksidan alami dapat berasal dari buah dan sayuran salah satu sumber antioksidan adalah kulit jeruk lemon (Citrus x limon (L.) Burm. f.) yang diketahui mengandung senyawa golongan flavonoid yaitu naringin dan hesperidin. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antioksidan dan menetapkan kandungan fenolik total dari fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon.

  Pengujian aktivitas antioksidan menggunakan radikal 1,1-difenil-2- pikrilhidrazil (DPPH) dan dinyatakan dengan nilai Inhibition Concentration 50 (IC

  50 ). Keberadaan senyawa beraktivitas antioksidan akan mengubah warna

  larutan DPPH dari ungu menjadi kuning. DPPH memili ki λ maksimum di 516,0 nm. Ketika elektronnya berpasangan oleh keberadaan senyawa antioksidan, maka absorbansinya menurun secara stokiometri sesuai jumlah elektron yang diambil.

  Penentuan kandungan fenolik total dilakukan dengan pereaksi Folin-Ciocalteu dengan menggunakan baku standar asam galat. Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon mempunyai nilai IC

  50

  sebesar 407,5 ± 6,32 µg/mL dan memiliki kandungan fenolik total sebesar 6,8 ± 1,19 mg ekivalen asam galat per gram fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon.

  

Kata kunci: kulit jeruk lemon (Citrus x limon (L.) Burm. f.), antioksidan, DPPH,

  IC kandungan fenolik total

  50,

  Abstract Free radicals can derived from pollution, dust, and metabolism of the body. Therefore needed a substance that serves to protect the body from the negative effects of free radicals, which is an antioxidant. Natural antioxidants can be derived from fruit and vegetable sources of antioxidants is one of the lemon peel (Citrus x limon (L.) Burm. f.) Are known to contain flavonoid compounds that naringin and hesperidin. This study aims to determine the antioxidant activity and total phenolic content sets from ethyl acetate fraction of methanol extract of lemon peel.

  Radical antioxidant activity assays using 1,1-diphenyl-2-pikrilhidrazil (DPPH) and is expressed by the value Inhibition Concentration 50 (IC

  50 ). The

  existence of active antioxidant compounds will change DPPH solution color from purple to yellow. DPPH has a λ maximum at 516.0 nm. When the electron pairs by the presence of antioxidant compounds, the absorbance decreases corresponding stoichiometric number of electrons captured. Determination of total phenolic content performed by Folin-Ciocalteu reagent using gallic acid standarization. The results showed that the ethyl acetate fraction of methanol extract of lemon peel had IC

  50 values of 407,5 ± 6,32 µg/mL and has a total

  phenolic content of 6,8 ± 1,19 mg gallic acid equivalents per gram of ethyl acetate fraction of methanol extract of the lemon peel.

  Keywords:lemon peel(Citrus x limon (L.) Burm. f.), antioxidant, DPPH, IC 50 ,

  total phenolic content

BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Seiring berjalannya waktu makhluk hidup akan mengalami proses

  menjadi lebih tua secara alami, akan tetapi proses menjadi tua atau penuaan ini terkadang terlalu cepat yang disebabkan oleh banyak faktor, misalnya radikal bebas.

  Radikal bebas dapat berasal dari polusi, debu, maupun metabolisme dari dalam tubuh. Oleh karena itu diperlukan suatu substansi yang berfungsi untuk melindungi tubuh dari dampak negatif radikal bebas, yaitu antioksidan. Antioksidan dapat didefinisikan sebagai senyawa yang apabila dalam konsentrasi rendah berada bersama substrat yang dapat teroksidasi, dapat menunda atau menghambat oksidasi senyawa tersebut (Halliwell, 1994).

  Di dalam tubuh sudah terdapat antioksidan yang dihasilkan secara alami misalnya enzim SOD (superoxyde dismutase), glutation, dan katalase, akan tetapi diperlukan suplai antioksidan dari luar untuk melindungi tubuh dari radikal bebas dalam jumlah besar.

  Sumber-sumber antioksidan dapat berupa antioksidan sintetik maupun antioksidan alami. Tetapi saat ini penggunaan antioksidan sintetik mulai dibatasi karena ternyata dari hasil penelitian yang telah dilakukan bahwa antioksidan binatang percobaan dan bersifat karsinogenik. Oleh karena itu industri makanan dan obat-obatan beralih mengembangkan antioksidan alami dan mencari sumber- sumber antioksidan alami baru (Takashi dan Takayumi, 1997).

  Antioksidan alami dapat berasal dari buah dan sayuran. Salah satu sumber antioksidan adalah jeruk lemon. Berdasarkan penelitian sebelumnya telah diketahui adanya kandungan flavonoid naringin dan hesperidin pada jeruk, kulit, maupun biji (Tripoli, Guardia, Giammanco, Majo and Giamanco, 2007). Oleh karena itu peneliti ingin menggali informasi lebih spesifik yaitu apakah kulit buah jeruk lemon (Citrus x limon (L.) Burm. f.)memiliki daya antioksidan, dan seberapa besar kemampuannya dalam meredam dampak dari radikal bebas.

  Ekstraksi senyawa dilakukan dengan metode maserasi menggunakan pelarut metanol dan fraksinansi dengan etil asetat. Pemilihan pelarut ini didasarkan karena adanya gugus hidroksi yang terdapat pada senyawa fenolik yang larut dalam pelarut polar.

  Metode yang digunakan untuk pengujian antioksidan pada penelitian ini adalah metode DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil). Berdasarkan metode ini, kemampuan antioksidan suatu senyawa dinyatakan oleh nilai IC

  50 . Metode DPPH memberikan informasi reaktivitas senyawa yang diuji dengan suatu radikal bebas.

  DPPH memberikan serapan kuat pada panjang gelombang 517 nm dengan warna violet gelap. Penangkap radikal bebas menyebabkan elektron menjadi berpasangan yang kemudian menyebabkan penghilangan warna yang sebanding

1. Perumusan masalah

  Berdasarkan latar belakang diatas, maka rumusan masalah dari penelitian ini adalah sebagai berikut: a. Apakah fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah jeruk lemon memiliki aktivitas antioksidan? b. Berapa nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon dengan menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan dengan IC ?

  50

  c. Berapakah kadar fenolik total fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemonyang dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat?

2. Keaslian penelitian

  Uji aktivitas antioksidan kulit jeruk lemon ini berbeda dengan penelitian yang dilakukan oleh Rafaela Guimaraes, Lillian Barros, Joao Barreira, Mª Joao Sousa, Ana Maria Carvalho, Isabel Ferreira (2009) dengan judul penelitian Targeting Excessive Free Radicals with Peels and Juices of

  Citrus Fruits: Grapefruit, Lemon, Lime and Orange . Pada penelitian yang

  dilakukan oleh Guimaraes dkk.(2009) menggunakan metode liofilisasi untuk pengeringannya, sedangkan dalam penelitian ini dilakukan pengeringan denga n oven pada suhu 50˚C. Berdasarkan pengamatan penulis, modifikasi penelitian yang dilakukan belum pernah dikerjakan

3. Manfaat penelitian

  a. Manfaat teoritis Penelitian ini diharapkan dapat digunakan untuk pengembangan ilmu pengetahuan dan kesehatan masyarakat tentang penggunaan obat alternatif dalam bidang kesehatan.

  b. Manfaat praktis Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi kepada masyarakat tentang penggunaan dan manfaat kulit buah jeruk lemon sebagai antioksidan.

B. Tujuan Penelitian 1. Tujuan umum

  Memberi informasi tambahan baru tentang antioksidan alami dalam rangka pemanfaatan limbah dan ikut berpartisipasi dalam memberi sumbangsih dalam dunia penelitian.

2. Tujuan khusus

  a. Mengetahuifraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah jeruk lemon memiliki daya antioksidan.

  b. Mengetahui kadar antioksidan yang terkandung dalam kulit buah jeruk lemon dengan menggunakan radikal DPPH yang dinyatakan dengan IC

  50 .

  c. Mengetahui nilai kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Jeruk Lemon 1. Keterangan botani Klasifikasi tanaman jeruk lemon menurut Anonim, 2012 sebagai

  berikut:

  a. Klasifikasi Kingdom : Plantae Subkingdom : Tracheobionta Super Divisi : Spermatophyta Divisi : Magnoliophyta Kelas : Magnoliopsida Sub Kelas : Rosidae Ordo : Sapindales Famili : Rutaceae Genus : Citrus Spesies : Citrus x limon (L.) Burm. f.

  b. Nama umum Sinonim : Citrus limon

  Indonesia :Jeruk asam

2. Morfologi tanaman

  Pohon lemon tingginya bisa mencapai 10 sampai 20 kaki (3- 6 meter) dan terdapat duri tajam pada rantingnya. Daunnya ketika masih muda berwarna kemerahan, tetapi ketika sudah tua menjadi hijau gelap pada bagian atas dan berwarna hijau terang pada bagian bawah. Bentuk daunnya lonjong, elips ataupun oval. Panjang dari daunnya 6,25 sampai 11,25 cm. Bunganya memiliki 4 atau 5 kelopak. Berwarna putih pada bagian dalam, sedangkan luarnya berwarna keunguan. Buahnya berbentu oval dengan panjang 7 sampai 12 cm dan terdapat tonjolan puting. Kulit buah lemon ini berwarna kuning bercahaya dengan kelenjar minyak. Biji buah lemon berbentuk oval, tetapi beberapa lemon tidak memiliki biji (Morton, 1987).

B. Antioksidan 1. Radikal bebas

  Radikal bebas adalah atom atau molekul yang memiliki elektron tidak berpasangan (unpaired electron). Adanya elektron yang tidak berpasangan menyebabkan senyawa tersebut sangat reaktif mencari pasangan, dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul yang berada di sekitarnya (Winarsi, 2007).

  Target utama radikal bebas adalah protein, asam lemak tak jenuh dan lipoprotein, serta unsur DNA termasuk karbohidrat. Dari molekul- merusak asam lemak tak jenuh ganda pada membran sel sehingga dinding sel menjadi rapuh, merusak basa DNA sehingga mengacaukan sistem genetika, dan berlanjut pada pembentukan sel kanker (Winarsi, 2007).

2. Antioksidan

  Antioksidan merupakan senyawa pemberi elektron (electron donor) atau reduktan. Senyawa ini mampu menginaktivasi berkembangnya reaksi oksidasi, dengan cara mencegah terbentuknya radikal (Winarsi, 2007).

  Antioksidan juga dapat didefinisikan sebagai senyawa yang apabila dalam konsentrasi rendah berada bersama substrat yang dapat teroksidasi, dapat menunda atau menghambat oksidasi senyawa tersebut (Halliwell, 1994).

  Secara garis besar, mekanisme penangkapan radikal bebas dapat dibedakan menjadi dua macam, yaitu secara enzimatik dan non-enzimatik.

  Enzim yang dapat berperan sebagai antioksidan adalah superoksida dismutase, katalase, glutation peroksidase, dan glutation reduktase (Winarsi, 2007).

  Secara non-enzimatik, senyawa antioksidan bekerja melalui empat cara, yaitu sebagai berikut: a) Penangkap radikal bebas, misalnya vitamin C dan vitamin E,

  b) Pengkelat logam transisi, misalnya EDTA, d) Kofaktor enzim antioksidan, misalnya selenium sebagai kofaktor glutation peroksidase (Huang, et al., 2005).

  Aktivitas senyawa polifenol (flavonoid) sebagai antioksidan meliputi tiga mekanisme sebagai berikut.

  a. Aktivitas penangkapan radikal seperti reactive oxygen species (ROS) ataupun radikal yang dihasilkan dari peroksidasi lipid seperti R·, RO·, dan ROO· dengan proses transfer elektron melalui atom hidrogen.

  b. Mencegah spesies senyawa reaktif produksi katalisis transisi metal seperti reaksi melalui khelasi metal.

  c. Interaksi dengan antioksidan lainnya, seperti lokalisasi dan penggabungan dengan antioksidan lainnya (Niki dan Noguchi, 2000).

C. Metode DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil)

  Metode yang paling sering digunakan untuk menguji aktivitas antioksidan tanaman obat adalah metode uji dengan menggunakan radikal bebas DPPH (Shivaprasad, et al., 2005).

  DPPH merupakan radikal bebas yang dapat bereaksi dengan senyawa yang dapat mendonorkan atom hidrogen, dapat berguna untuk pengujian aktivitas antioksidan komponen tertentu dalam suatu ekstrak (Dinis, Maderia, dan Almeida,1994).

  Karena adanya elektron yang tidak berpasangan, DPPH memberikan stokiometri sesuai jumlah elektron yang diambil. Keberadaan senyawa antioksidan dapat mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi kuning (Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel, dan Mohammad, 2009). _N N _{NH N}

• R _{O N}
_{2 NO 2} RH _{O N 2 NO 2} NO _{2 NO 2} DPPH DPPH-H

Gambar 1. Reaksi Radikal DPPH dengan Antioksidan (Windono et al.,2001).

  D.

  

Fenolik

  Senyawa fenolik adalah substansi organik dimana terdiri dari senyawa aromatik yang terikat dengan satu atau lebih substituen hidroksil (OH). Senyawa induk adalah fenol tetapi kebanyakan senyawa fenolik merupakan polifenol. Sumber senyawa fenolik sangat sedikit pada sumber hewani akan tetapi sangat melimpah pada sumber tumbuhan. Diantara 8000 senyawa polifenol tumbuhan yang diketahui, golongan yang terbanyak adalah flavonoid (Mann, Davidson, Hobbs, Banthorpe, dan Harborne, 1994).

  Sejauh ini, senyawa fenolik tumbuhan merupakan golongan mayoritas senyawa yang bertindak sebagai antioksidan atau penangkapan radikal fenolik total pada ekstrak tanaman yang telah dipilih (Veeru, Kishkar, dan Meennakashi, 2009).

  Mekanismenya melalui kemampuan gugus fenol menangkap radikal bebas dengan memberikan atom hidrogennya, sehingga senyawa fenolik berubah menjadi radikal fenoksil. Radikal fenoksil ini terstabilkan oleh resonansi ( Brunneton, 1999).

  E.

  

Flavonoid

  Aktivitas antioksidan dimiliki oleh sebagian besar flavonoid, hal inidisebabkan adanya gugus hidroksi fenolik dalam struktur molekulnya. Ketika senyawa-senyawa ini bereaksi dengan radikal bebas, mereka membentuk radikal baru yang distabilisasi oleh efek resonansi inti aromatik. Dengan demikian fase propagasi yang meliputi reaksi radikal berantai dapat dihambat (Cuvelier, Richards, and Besset, 1991). Menurut Peterson et al. (2006) flavonoid yang dominan dalam jeruk (citrus) adalah didymin, eriocitrin, hesperidin, naringin,

  narirutin, neoeriocitrin, neohesperidin, poncirin.

  Penyarian flavonoid dari dalam simplisia tumbuhan dapat dilakukan dengan menggunakan pelarut polar, semi polar, maupun non polar sesuai dengan kelarutan flavonoid yang diekstraksi. Kelarutan flavonoid berbeda-beda sesuai golongan dan substitusinya (Robinson, 1995). Pelarut yang kurang polar digunakan untuk mengekstraksi aglikon flavonoid, sedangkan pelarut yang lebih tidaktersubstitusi. Oleh karena itu, umumnya flavonoid cukup larut dalam pelarut polar seperti etanol, metanol, etil asetat, dimetilsulfoksida, dimetilformamid dan _HO air (Markham, 1998). _{CH 2 OH O O OH OCH 3 HO HO OH O O O OH HO HO} O _{OH O O OH O}

_HO

_{CH O}

₂

_{HO OH O OH O} hesperidin naringin

  

Gambar 2. Struktur Hesperidin dan Naringin (Peterson et al.,2006)

F.

   Rutin

  Rutin biasa disebut juga kuersetin-3-rutinoside karena merupakan gilkosida dari kuersetin, sehingga keduanya memiliki kemiripan struktur dan memiliki aktivitas antioksidan yang kuat karena memiliki tiga ciri pada strukturnya, yaitu: 3’,4’-dihidroksi pada cincin B; 2,3-ikatan rangkap pada cincin C. Rutin merupakan komponen yang terdapat pada asparagus, soba, dan keluarga jeruk (Astawan dan Leomitro, 2008).

  OH O OH B HO C A

C OR

OH O R= D- Glucose - L - Rhamnose

  

Rutin

Gambar 3. Struktur Rutin (Metodiewa, Kochman, and Karolczak, 2008)

G. Ekstraksi

  Penyarian merupakan peristiwa perpindahan mzat aktif yang semula berada dalam sel, ditarik oleh cairan penyari sehingga terjadi larutan zat aktif dalam cairan penyari tersebut (Trevor, 1995). Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi senyawa aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan (Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan RI,1995).

H. Kromatografi Lapis Tipis(KLT)

  Kromatografi lapis tipis adalah cara pemisahan dengan adsorbsi pada lapisan tipis adsorben. Kromatografi lapis tipis digunakan untuk memisahkan berbagai senyawa organik, komplek senyawa organik alam maupun sintetik. Metode pemisahan dengan kromatografi lapis tipis memiliki keuntungan yaitu waktu lebih cepat dan diperoleh pemisahan yang lebih baik dibandingkan kromatografi kertas (Sastrohamidjojo, 2007).

  Fase diam yang digunakan dalam KLT adalah bahan penjerap (adsorben). Dua sifat penting yang harus diperhatikan untuk KLT adalah besar dan kecilnya partikel penjerap serta homogenitasnya, sebab daya lekat pada pendukung sangat ditentukan oleh kedua sifat tersebut. Partikel yang kasar tidak dapat memberikan pemisahan yang baik dan untuk memperbaikinya dapat digunakan partikel yang halus (umumnya 1-25 µm). Beberapa macam penjerap

  Fase gerak adalah suatu medium angkut dan terdiri atas satu atau beberapa pelarut. Pemilihan fase gerak untuk KLT tergantung pada polaritas pelarut tersebut. Efek elusi dapat naik dengan kenaikan kepolaran pelarut, sedangkan laju rambat tergantung kepada viskositas pelarut (Sastrohamidjojo, 2007).

  KLT dapat digunakan untuk uji identifikasi. Parameter pada KLT yang digunakan untuk identifikasi adalah nilai Rf. Dua senyawa dikatakan identik jika mempunyai nilai Rf yang sama jika diukur pada kondisi KLT yang sama (Gandjar dan Rohman, 2010).

  Harga Rf dapat ditentukan sebagai berikut : Rf =

  Harga Rf ini adalah tetapan fisika yang dipengaruhi oleh bebrapa factor seperti tebal lapisan, kelembaban udara, fase gerak, bahan penjerap dan suhu (Sastrohamidjojo, 2007).

I. Spektrofotometri Visibel

  Instrumen yang digunakan untuk mempelajari serapan atau emisi radiasi elektromagnetik sebagai fungsi dari panjang gelombang disebut “spektrometer” atau spektrofotometer (Sastrohamidjojo, 2007).

  Prinsip spektrofotometri adalah adanya interaksi dari energi radiasi elektromagnetik dengan zat kimia. Dari interaksi ini dikembangkan teknik-teknik

  1. Sumber tenaga radiasi yang stabil,

  2. Sistem yang terdiri atas lensa-lensa, cermin, celah-celah, dan lain-lain,

  3. Monokromator untuk mengubah radiasi menjadi komponen-komponen panjang gelombang tunggal,

  4. Tempat cuplikan yang transparan, dan 5. Detektor radiasi yang dihubungkan dengan pencatat (Sastrohamidjojo, 2007).

  J.

  

Validasi Metode

  Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2004).

  Parameter-parameter validasi metode analisis yang diperlukan untuk menilai ketepatan metode analisis antara lain meliputi akurasi, presisi, linearitas, dan spesifitas.

  1. Akurasi Akurasi metode analisis adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar analit yang sebenarnya. Kecermatan dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan. Kriteria kecermatan sangat bergantung kepada konsentrasi analit dalam matriks sampel dan pada keseksamaan metode (RSD). Akurasi

  Analit pada matrik Rata-rata yang sampel diperboleh (%) 100 98-102

  >10 98-102 >1 97-103

  >0,1 95-105 0,01 90-107

  0,001 90-107 0,000.1 (1 ppm) 80-110

  0,000.01 (100 ppb) 80-110 0,000.001 (10 ppb) 60-115

  0,000.000.1 (1 ppb) 40-120

  2. Presisi Keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang homogen (Harmita, 2004).

  Presisi dinyatakan dalam standar deviasi atau Coeffisien of variant, dan tabel berikut merupakan syarat presisi yang dapat diterima berdasarkan kadar analit.

  

Tabel II. Rentang CV yang masih dapat Diterima (Harmita, 2004)

  Analit pada matrik CV (%) sampel

  >1 2,5 0,001

  5 0,000.1 (1 ppm)

  16 0,000.000.1 (1 ppb)

  32

  3. Linieritas Linieritas pada suatu metode analisis dari suatu prosedur analisis

  Persyaratan data linieritas yang bisa diterima jika memenuhi nilai koefisien korelasi (r) > 0,999 (Mulja dan Hanwar, 2003).

  4. Spesifitas Spesifitas suatu metode adalah kemampuan yang hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel. Spesifitas metode ditentukan dengan membandingkan hasil analisis sampel yang mengandung cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya atau pembawa placebo dengan hasil analisis sampel tanpa penambahan bahan-bahan tadi. Penyimpangan hasil merupakan selisih dari hasil uji keduanya (Harmita, 2004).

  K. Landasan Teori

  Radikal bebas adalah atom atau molekul yang memiliki elektron tidak berpasangan (unpaired electron). Adanya elektron yang tidak berpasangan menyebabkan senyawa tersebut sangat reaktif mencari pasangan, dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul sekitarnya misalnya protein, asam lemak tak jenuh, dan lipoprotein, serta unsur DNA termasuk karbohidrat.

  Antioksidan merupakan senyawa pemberi elektron (electron donor) atau reduktan yang mampu menginaktivasi terjadinya radikal. Kulit buah jeruk lemon

  

(Citrus x limon (L.) ini diduga memiliki daya antioksidan karena mengandung flavonoid yaitu naringin dan hesperidin. dapat bereaksi dengan senyawa yang dapat mendonorkan atom hidrogen. Keberadaan dari senyawa antioksidan ini akan menurunkan intensitas warna DPPH dari ungu menjadi kuning.

  L. Hipotesis

  Fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon mempunyai aktivitas antioksidan menggunakan radikal bebas DPPH. Kadar fenolik dalam fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon mempengaruhi aktivitasnya sebagai antioksidan.

BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis Penelitian dan Rancangan Penelitian Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental karena adanya perlakuan terhadap senyawa uji, dengan tahapan penelitian sebagai berikut.

  1. Pemilihan dan pengumpulan sampel,

  2. Pembuatan simplisia,

  3. Ekstraksi dan fraksinasi simplisia,

  4. Penetapan aktivitas antioksidan, 5. Penetapan kadar fenolik dalam fraksi etil asetat kulit buah jeruk lemon.

B. Variabel Penelitian 1. Variabel utama

  a. Variabel bebas: konsentrasi fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon.

  b. Variabel tergantung: aktivitas antioksidan (%IC) fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon.

2. Variabel pengacau

  a. Variabel pengacau terkendali: cara pengeringan dan pembuatan simplisia, dan jumlah (g) kulit lemon yang digunakan. b. Variabel pengacau tak terkendali: tempat tumbuh tanaman, waktu pemanenan, umur lemon yang dipanen, cara panen, cahaya matahari, cuaca atau musim, curah hujan, dan kelembaban ruang.

  C.

  

Definisi Operasional

  1. Kulit buah jeruk lemon adalah kulit dari buah jeruk lemon yang didapatkan dari salah satu supermarket di Yogyakarta, buah berbentuk oval dengan tonjolan puting pada bagian ujung buah, dan berwarna kuning.

  2. Ekstrak kulit buah lemon adalah ekstrak kental kulit buah jeruk lemonyang diperoleh dari hasil maserasi dengan metanol.

  3. Fraksi etil asetat adalah hasil fraksinasi ekstrak metanol kulit buah lemon dengan menggunakan etil asetat yang telah difraksinasi dengan air dan

  washbensin.

  4. Persen inhibition concentration (%IC) adalah kemampuan fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon untuk menangkap radikal DPPH yang dinyatakan dalam persen.

  5. Inhibition concentration 50 (IC

  50 ) merupakan nilai konsentrasi fraksi etil

  asetat ekstrak metanol kulit buah lemon yang mampu menangkap 50% radikal DPPH.

D. Bahan dan Alat Penelitian 1. Bahan penelitian

  Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: kulit buah lemon (Citrus x limon (L.) Burm. f.) yang didapatkan dari salah satu supermarket di Yogyakarta. Bahan kimia kualitas pro analitik (E.merck) meliputi metanol dan kloroform. Bahan kimia kualitas pro analitik Sigma.

  Co., USA meliputi DPPH, rutin, reagen Folin-Ciocalteu, asam galat. Bahan kimia kualitas teknis Brataco Chemica meliputi metanol, washbensin, dan etil asetat. Bahan kimia kualitas farmasetis berupa akuades.

2. Alat-alat penelitian

  Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini berupa vortex (junke &

  kunkel ), spetrofotometer UV-Vis Mini 1240, blender, corong, Buchner, oven,

  mikropipet 10-1000 µL, makropipet 1-10 mL, neraca analitik, vacum rotary

  evaporator (junke & kunkel), dan alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium analisis (Pyrex-Germany, dan Iwaki).

E. Tatacara Penelitian 1. . Determinasi tanaman

  Determinasi buah jeruk lemon dilakukan dengan membandingkan ciri- ciri buah lemon dengan ciri-ciri buah lemon yang disebutkan Morton (1987)

  2. Pemilihan dan pengumpulan sampel

  Sampel kulit buah jeruk lemon didapatkan dari salah satu supermarket di Yogyakarta. Kulit buah jeruk lemon yang digunakan adalah buah jeruk lemon yang siap dikonsumsi.

  3. Pembuatan simplisia Kulit buah jeruk lemon dicuci bersih, ditiriskan dan diiris tipis. o Kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 50 C selama 3 x 24 jam.

  Simplisia kering ditandai dengan kult jeruk yang telah menjadi rapuh kemudian diserbuk kasar dengan menggunakan mesin penyerbuk dan dilewatkan ayakan dengan ukuran 40 mesh.

  4. Ekstraksi dan fraksinasi simplisia

  Sebanyak 1 kg serbuk simplisia kulit buah lemon dimasukkan ke dalam bejana maserasi, ditambah dengan metanol sampai terendam sempurna dan dicampur homogen. Campuran dimaserasi pada suhu ruangan selama tiga hari. Filtrat diperoleh melalui penyaringan menggunakan kertas saring dengan bantuan corong Buchner dan pompa vakum. Ampas penyaringan diremaserasi dengan metanol kembali selama dua hari. Kemudian filtrat dicampur dengan filtrat terdahulu. Keseluruhan filtrat diuapkan pelarutnya dengan vacuum rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak metanol kental

  Ekstrak metanol kental kulit buah lemon dilarutkan dalam 300 ml air hangat dan dilakukan ekstraksi cair-cair menggunakan washbensin dengan perbandingan larutan ekstrak : washbensin (1:1 v/v), dihasilkan fraksi air dan

  washbensin . Kemudian fraksi air diekstraksi kembali menggunakan etil