DETEKSI METILASI GEN P14ARF KARSINOMA SEL SKUAMOSA RONGGA MULUT PADA PENDERITA DI RS DR MUWARDI SURAKARTA.
Dr. Pradipto Subiyantoro, drg., Sp., BM
NIP 195706291984031003
Sebagai Staf Pengajar pada Fakultas Kedokteran
Lahir di Malang, 29 Juni 1957
FK
8
Riwayat Pendidikan:
S-1. Universitas Airlangga, 1982
Bidang Ilmu: Ilmu Kedokteran Gigi
S-2/Sp. Universitas Gadjah Mada, 1995
Bidang Ilmu: Sp. Bedah Mulut
S-3. Universitas Airlangga, 2010
Bidang Ilmu: Ilmu Kedokteran
Judul Disertasi
DETECTION OF GENE P14ARF METHYLATION IN ORAL SQUAMOUS
CELL CARCINOMA IN PATIENTS AT DR MUWARDI HOSPITAL,
SURAKARTA
DETEKSI METILASI GEN P14ARF KARSINOMA SEL SKUAMOSA RONGGA MULUT
PADA PENDERITA DI RS DR MUWARDI SURAKARTA
Oral squamous cell carcinoma is the
sixth cancer disease in the world. It
presents as a genetic and epigenetic
accumulation commonly occurs in
cigarette smokers. The gene p14ARF is a
tumor suppressor gene that is able to
bind MDM protein whose function is to
destroy
the
protein
p53.
The
hypermethylation of exon 1 produces
the inactivation of the gene, as had
been reported in several cancers,
including oral cancer. However, up to
the
moment
the
role
of
gene
methylation in the carcinogenesis of
oral squamous cell carcinoma remains
unclear.
This
was
a
laboratory
explorative study with a general
objective to disclose the carcinogenesis
of oral squamous cell carcinoma by
detecting the occurrence of p14ARF gene
methylation in oral squamous cell
carcinoma in patients of Dr Muwardi
Hospital, Surakarta.
Samples were fresh tissues from
patients diagnosed with oral squamous
cell carcinoma in Dr Muwardi Hospital,
Karsinoma sel skuamosa rongga mulut
adalah penyakit kanker ke enam di dunia yang
merupakan akumulasi genetik dan epigenetik
yang biasanya terjadi pada perokok. Gen p14ARF
adalah tumor supressor gene yang dapat
mengikat
protein
MDM
yang
berfungsi
menghancurkan protein p53. Hipermetilasi exon
1β dari p14ARF menghasilkan inaktifasi gen
tersebut, seperti yang telah dilaporkan pada
beberapa kanker termasuk kanker rongga mulut,
tetapi sampai saat ini peranan metilasi gen
dalam karsinogenesis karsinoma sel skuamosa
rongga mulut masih belum jelas.
Penelitian
ini
adalah
penelitian
eksploratif labolatorik yang secara umum
bertujuan menjelaskan karsinogenesis karsinoma
sel skuamosa rongga mulut dengan cara
mendeteksi kejadian metilasi gen p14ARF pada
karsinoma sel skuamosa rongga mulut pada
penderita di Rumah Sakit Dr Muwardi Surakarta.
Sampel penelitian adalah jaringan segar
dari pasien dengan diagnosis karsinoma sel
skuamosa rongga mulut di Rumah Sakit Dr
Muwardi Surakarta dengan karakteristik umur
antara 33-70 tahun, 2 wanita 2 pria dengan
lokasi tumor pada lidah, dengan tipe kanker
karsinoma sel skuamosa. Sampel karsinoma sel
Surakarta, with age characteristics
between 33 and 70 years, 2 males and 2
females with tumor site on the tongue,
and with cancer type of squamous cell
carcinoma. The samples of oral
squamous cell carcinoma from the
operation were divided into two parts.
One was delivered to Department of
Anatomic Pathology, and the other was
kept within freezer in -80oC until being
used. In addition, blood sample was
also taken from healthy non-cancer
patients.
The identification of p14ARF gene
was performed from oral squamous cell
carcinoma tissue, which was including
DNA extraction, DNA level, PCR, and
electrophoresis. DNA extraction was
performed
using
Genomic
DNA
Purification Kit (Fermentas). p14ARF
gene was identified with p14ARF forward
and p14ARF reverse primers from Sato
(2002). The analysis of p14ARF gene was
performed with bisulfite modification
using Methylcode Bisulfite Conversion
Kit (Invitrogen) and analyzed with
specific methylated PCR (MSP) method
using published primer (Sato, 2002)
with fully methylated positive control
using CpG methyl transferase sss I
(New England Biolab) from blood
samples of healthy individuals. MSP
was performed with annealing, as that
of Sato (2002), which was in 58oC.
However, the produced bands were not
clear in methylated and unmethylated
primers. By increasing the annealing
temperature to 65oC, clear band was
obtained in methylated primer, while
there was no band in unmethylated
primer.
Results
revealed
that
methylation occurred in 4 samples.
Results of interview revealed that there
were no cigarette smokers among the
patients, either passively or actively. All
patients were Javanese, and commonly
lived in rural area with averagely less
satisfactory oral hygiene. In such
condition, oral cancer methylation was
not caused by cigarette, as that found
in other studies in other countries. Less
adequate knowledge on nutrition and
presence
of
numerous
congenital
abnormalities in rural children allow
skuamosa rongga mulut hasil operasi dibagi
menjadi dua bagian yang dikirim ke Bagian
Patologi Anatomi dan bagian lainnya disimpan di
dalam freezer –800C sampai akan digunakan,
selain itu juga diambil sampel darah dari
penderita sehat non kanker.
Identifikasi gen p14ARF dilakukan dari
jaringan karsinoma sel skuamosa rongga mulut
yang meliputi ekstraksi DNA, pengukuran kadar
DNA, PCR dan elektroforesis. Ekstraksi DNA
dilakukan dengan menggunakan Genomic DNA
Purification Kit (Fermentas). Gen p14ARF
diidentifikasi dengan menggunakan primer
p14ARF forward dan p14ARF reverse yang diambil
dari Sato (2002).
Analisis metilasi gen p14ARF dilakukan
dengan
modifikasi
bisulfit
menggunakan
Methylcode Bisulfite Conversion Kit (Invitrogen)
dan dianalisa dengan metoda spesifik metilated
PCR (MSP) dengan menggunakan primer yang
telah dipublikasikan (Sato, 2002) dengan control
positive
yang
fully
metilated
dengan
menggunakan CpG methyl transferase sss I
(New England Biolab) dari sampel darah orang
sehat. MSP dilakukan dengan annealing yang
telah dilakukan Sato, 2002 yaitu 580C
menghasilkan band yang kurang jelas pada
primer methylated dan unmethylated. Dengan
menaikkan suhu annealing menjadi 650C
didapatkan band yang jelas pada methylated dan
tidak timbul band pada primmer unmethylated.
Hasil menunjukkan terjadi metilasi pada
4 sampel tersebut. Hasil interview dengan pasien
tidak ada pasien yang merokok baik aktif
maupun pasif, pasien semua dari ras jawa dan
umumnya hidup di pedesaan dengan kondisi
kebersihan mulut yang rata-rata kurang baik.
Pada keadaan ini metilasi kanker rongga mulut
tidak
disebabkan
oleh
karena
rokok
sebagaimana beberapa penelitian lain didunia.
Pengetahuan gizi yang kurang dan masih
banyaknya cacat bawaan pada anak-anak
dipedesaan memungkinkan terjadi kanker rongga
mulut disebabkan oleh karena kekurangan asam
folat. Peranan asam folat adalah pembentukan
pirimidin yang merupakan komponen dari DNA
yang menghasilkan protein sehingga sel yang
mengandung protein tersebut berfungsi. Apabila
terjadi kekurangan asam folat maka akan
meningkatkan resiko tidak terbentuknya pirimidin
sehingga dapat memungkinkan DNA strands
break. Akibat DNA damage yang terjadi maka
akan mempengaruhi produksi S Adenosine
methionin dan terjadi hipometilasi pada onkogen.
the occurrence of oral cancer, which is
caused by the insufficiency of folic acid.
The role of folic acid is in the formation
of
pyrimidine.
Pyrimidine
is
a
component of DNA that produces
protein, so the protein-containing cell
can perform its function. When the folic
acid is insufficient, there is an
increasing risk of no formation of
pyrimidine, allowing the breaking of
DNA strands. The result of this damage
in
DNA
may
affect
S-Adenosyl
methionine
production
and
hypomethylation will occur in the
oncogene. When hypermethylation also
occurs in p14ARF gene, the gene will not
be able to trigger apoptosis in the
mutated DNA. Therefore, this study will
address the following questions: 1.
What is the correlation between folic
acid level in the body and the
occurrence of oral cancer? 2. Is there
any difference in folic acid level
between oral cancer patients and
normal? 3. Is there any correlation
between folic acid level and the type of
DNA damage?
The results of this study lead to
conclusions that: 1) Methylation in
p14ARF gene has a role and it is one of
many processes in oral carcinogenesis,
particularly
the
squamous
cell
carcinoma. 2) Optimum condition to
detect methylation with MSP in this
study was in annealing temperature of
65oC. 3) A different finding was found in
this study. Methylation in p14ARF gene
was found in all oral squamous cell
carcinoma patients participating in this
study, while these patients were not
cigarette smokers. Whereas, studies in
other countries revealed that majority
of p14ARF gene methylation occurred in
cigarette smokers. Therefore, factors
other than being a cigarette smoker
should be considered as the cause of
squamous cell carcinoma.
Apabila juga terjadi hipermetilasi pada gen
p14ARF maka gen tersebut tidak dapat memicu
terjadinya apoptosis terhadap DNA yang
mengalami mutasi tersebut, sehingga dalam
penelitian ini timbul pertanyaan 1. Bagaimana
kaitan kadar asam folat tubuh dengan terjadinya
kanker rongga mulut? 2. Apakah ada perbedaan
kadar asam folat penderita kanker rongga mulut
dan normal? 3. Apakah ada kaitan antara kadar
asam folat dengan jenis DNA damage ?
Berdasarkan hasil penelitian ini dapat
disimpulkan bahwa: 1) Metilasi pada gen p14ARF
mempunyai peranan dan merupakan salah satu
dari banyak proses dalam karsinogenesisrongga
mulut terutama untuk karsinoma sel skuamusa.
2) Kondisi optimum untuk mendeteksi metilasi
dengan MSP pada penelitian ini yaitu pada suhu
annealing 650C. 3) Hasil yang berbeda dari
penelitian ini yaitu metilasi pada gen p14ARF
terjadi pada semua penderita karsinoma sel
skuamusa rongga mulut peserta penelitian ini
dan semua penderita tersebut bukan perokok,
sedangkan hasil penelitian di negara lain
menunjukkan bahwa mayoritas metilasi pada
gen p14ARF terjadi pada perokok sehingga perlu
dipertimbangkan faktor lain selain perokok
sebagai penyebab karsinoma sel skuamosa.
NIP 195706291984031003
Sebagai Staf Pengajar pada Fakultas Kedokteran
Lahir di Malang, 29 Juni 1957
FK
8
Riwayat Pendidikan:
S-1. Universitas Airlangga, 1982
Bidang Ilmu: Ilmu Kedokteran Gigi
S-2/Sp. Universitas Gadjah Mada, 1995
Bidang Ilmu: Sp. Bedah Mulut
S-3. Universitas Airlangga, 2010
Bidang Ilmu: Ilmu Kedokteran
Judul Disertasi
DETECTION OF GENE P14ARF METHYLATION IN ORAL SQUAMOUS
CELL CARCINOMA IN PATIENTS AT DR MUWARDI HOSPITAL,
SURAKARTA
DETEKSI METILASI GEN P14ARF KARSINOMA SEL SKUAMOSA RONGGA MULUT
PADA PENDERITA DI RS DR MUWARDI SURAKARTA
Oral squamous cell carcinoma is the
sixth cancer disease in the world. It
presents as a genetic and epigenetic
accumulation commonly occurs in
cigarette smokers. The gene p14ARF is a
tumor suppressor gene that is able to
bind MDM protein whose function is to
destroy
the
protein
p53.
The
hypermethylation of exon 1 produces
the inactivation of the gene, as had
been reported in several cancers,
including oral cancer. However, up to
the
moment
the
role
of
gene
methylation in the carcinogenesis of
oral squamous cell carcinoma remains
unclear.
This
was
a
laboratory
explorative study with a general
objective to disclose the carcinogenesis
of oral squamous cell carcinoma by
detecting the occurrence of p14ARF gene
methylation in oral squamous cell
carcinoma in patients of Dr Muwardi
Hospital, Surakarta.
Samples were fresh tissues from
patients diagnosed with oral squamous
cell carcinoma in Dr Muwardi Hospital,
Karsinoma sel skuamosa rongga mulut
adalah penyakit kanker ke enam di dunia yang
merupakan akumulasi genetik dan epigenetik
yang biasanya terjadi pada perokok. Gen p14ARF
adalah tumor supressor gene yang dapat
mengikat
protein
MDM
yang
berfungsi
menghancurkan protein p53. Hipermetilasi exon
1β dari p14ARF menghasilkan inaktifasi gen
tersebut, seperti yang telah dilaporkan pada
beberapa kanker termasuk kanker rongga mulut,
tetapi sampai saat ini peranan metilasi gen
dalam karsinogenesis karsinoma sel skuamosa
rongga mulut masih belum jelas.
Penelitian
ini
adalah
penelitian
eksploratif labolatorik yang secara umum
bertujuan menjelaskan karsinogenesis karsinoma
sel skuamosa rongga mulut dengan cara
mendeteksi kejadian metilasi gen p14ARF pada
karsinoma sel skuamosa rongga mulut pada
penderita di Rumah Sakit Dr Muwardi Surakarta.
Sampel penelitian adalah jaringan segar
dari pasien dengan diagnosis karsinoma sel
skuamosa rongga mulut di Rumah Sakit Dr
Muwardi Surakarta dengan karakteristik umur
antara 33-70 tahun, 2 wanita 2 pria dengan
lokasi tumor pada lidah, dengan tipe kanker
karsinoma sel skuamosa. Sampel karsinoma sel
Surakarta, with age characteristics
between 33 and 70 years, 2 males and 2
females with tumor site on the tongue,
and with cancer type of squamous cell
carcinoma. The samples of oral
squamous cell carcinoma from the
operation were divided into two parts.
One was delivered to Department of
Anatomic Pathology, and the other was
kept within freezer in -80oC until being
used. In addition, blood sample was
also taken from healthy non-cancer
patients.
The identification of p14ARF gene
was performed from oral squamous cell
carcinoma tissue, which was including
DNA extraction, DNA level, PCR, and
electrophoresis. DNA extraction was
performed
using
Genomic
DNA
Purification Kit (Fermentas). p14ARF
gene was identified with p14ARF forward
and p14ARF reverse primers from Sato
(2002). The analysis of p14ARF gene was
performed with bisulfite modification
using Methylcode Bisulfite Conversion
Kit (Invitrogen) and analyzed with
specific methylated PCR (MSP) method
using published primer (Sato, 2002)
with fully methylated positive control
using CpG methyl transferase sss I
(New England Biolab) from blood
samples of healthy individuals. MSP
was performed with annealing, as that
of Sato (2002), which was in 58oC.
However, the produced bands were not
clear in methylated and unmethylated
primers. By increasing the annealing
temperature to 65oC, clear band was
obtained in methylated primer, while
there was no band in unmethylated
primer.
Results
revealed
that
methylation occurred in 4 samples.
Results of interview revealed that there
were no cigarette smokers among the
patients, either passively or actively. All
patients were Javanese, and commonly
lived in rural area with averagely less
satisfactory oral hygiene. In such
condition, oral cancer methylation was
not caused by cigarette, as that found
in other studies in other countries. Less
adequate knowledge on nutrition and
presence
of
numerous
congenital
abnormalities in rural children allow
skuamosa rongga mulut hasil operasi dibagi
menjadi dua bagian yang dikirim ke Bagian
Patologi Anatomi dan bagian lainnya disimpan di
dalam freezer –800C sampai akan digunakan,
selain itu juga diambil sampel darah dari
penderita sehat non kanker.
Identifikasi gen p14ARF dilakukan dari
jaringan karsinoma sel skuamosa rongga mulut
yang meliputi ekstraksi DNA, pengukuran kadar
DNA, PCR dan elektroforesis. Ekstraksi DNA
dilakukan dengan menggunakan Genomic DNA
Purification Kit (Fermentas). Gen p14ARF
diidentifikasi dengan menggunakan primer
p14ARF forward dan p14ARF reverse yang diambil
dari Sato (2002).
Analisis metilasi gen p14ARF dilakukan
dengan
modifikasi
bisulfit
menggunakan
Methylcode Bisulfite Conversion Kit (Invitrogen)
dan dianalisa dengan metoda spesifik metilated
PCR (MSP) dengan menggunakan primer yang
telah dipublikasikan (Sato, 2002) dengan control
positive
yang
fully
metilated
dengan
menggunakan CpG methyl transferase sss I
(New England Biolab) dari sampel darah orang
sehat. MSP dilakukan dengan annealing yang
telah dilakukan Sato, 2002 yaitu 580C
menghasilkan band yang kurang jelas pada
primer methylated dan unmethylated. Dengan
menaikkan suhu annealing menjadi 650C
didapatkan band yang jelas pada methylated dan
tidak timbul band pada primmer unmethylated.
Hasil menunjukkan terjadi metilasi pada
4 sampel tersebut. Hasil interview dengan pasien
tidak ada pasien yang merokok baik aktif
maupun pasif, pasien semua dari ras jawa dan
umumnya hidup di pedesaan dengan kondisi
kebersihan mulut yang rata-rata kurang baik.
Pada keadaan ini metilasi kanker rongga mulut
tidak
disebabkan
oleh
karena
rokok
sebagaimana beberapa penelitian lain didunia.
Pengetahuan gizi yang kurang dan masih
banyaknya cacat bawaan pada anak-anak
dipedesaan memungkinkan terjadi kanker rongga
mulut disebabkan oleh karena kekurangan asam
folat. Peranan asam folat adalah pembentukan
pirimidin yang merupakan komponen dari DNA
yang menghasilkan protein sehingga sel yang
mengandung protein tersebut berfungsi. Apabila
terjadi kekurangan asam folat maka akan
meningkatkan resiko tidak terbentuknya pirimidin
sehingga dapat memungkinkan DNA strands
break. Akibat DNA damage yang terjadi maka
akan mempengaruhi produksi S Adenosine
methionin dan terjadi hipometilasi pada onkogen.
the occurrence of oral cancer, which is
caused by the insufficiency of folic acid.
The role of folic acid is in the formation
of
pyrimidine.
Pyrimidine
is
a
component of DNA that produces
protein, so the protein-containing cell
can perform its function. When the folic
acid is insufficient, there is an
increasing risk of no formation of
pyrimidine, allowing the breaking of
DNA strands. The result of this damage
in
DNA
may
affect
S-Adenosyl
methionine
production
and
hypomethylation will occur in the
oncogene. When hypermethylation also
occurs in p14ARF gene, the gene will not
be able to trigger apoptosis in the
mutated DNA. Therefore, this study will
address the following questions: 1.
What is the correlation between folic
acid level in the body and the
occurrence of oral cancer? 2. Is there
any difference in folic acid level
between oral cancer patients and
normal? 3. Is there any correlation
between folic acid level and the type of
DNA damage?
The results of this study lead to
conclusions that: 1) Methylation in
p14ARF gene has a role and it is one of
many processes in oral carcinogenesis,
particularly
the
squamous
cell
carcinoma. 2) Optimum condition to
detect methylation with MSP in this
study was in annealing temperature of
65oC. 3) A different finding was found in
this study. Methylation in p14ARF gene
was found in all oral squamous cell
carcinoma patients participating in this
study, while these patients were not
cigarette smokers. Whereas, studies in
other countries revealed that majority
of p14ARF gene methylation occurred in
cigarette smokers. Therefore, factors
other than being a cigarette smoker
should be considered as the cause of
squamous cell carcinoma.
Apabila juga terjadi hipermetilasi pada gen
p14ARF maka gen tersebut tidak dapat memicu
terjadinya apoptosis terhadap DNA yang
mengalami mutasi tersebut, sehingga dalam
penelitian ini timbul pertanyaan 1. Bagaimana
kaitan kadar asam folat tubuh dengan terjadinya
kanker rongga mulut? 2. Apakah ada perbedaan
kadar asam folat penderita kanker rongga mulut
dan normal? 3. Apakah ada kaitan antara kadar
asam folat dengan jenis DNA damage ?
Berdasarkan hasil penelitian ini dapat
disimpulkan bahwa: 1) Metilasi pada gen p14ARF
mempunyai peranan dan merupakan salah satu
dari banyak proses dalam karsinogenesisrongga
mulut terutama untuk karsinoma sel skuamusa.
2) Kondisi optimum untuk mendeteksi metilasi
dengan MSP pada penelitian ini yaitu pada suhu
annealing 650C. 3) Hasil yang berbeda dari
penelitian ini yaitu metilasi pada gen p14ARF
terjadi pada semua penderita karsinoma sel
skuamusa rongga mulut peserta penelitian ini
dan semua penderita tersebut bukan perokok,
sedangkan hasil penelitian di negara lain
menunjukkan bahwa mayoritas metilasi pada
gen p14ARF terjadi pada perokok sehingga perlu
dipertimbangkan faktor lain selain perokok
sebagai penyebab karsinoma sel skuamosa.